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Inflammatory bowel disease; Faecal microbiota transplantation; Rat model of colitis Enfermedad inflamatoria intestinal; Trasplante de microbiota fecal; Modelo de colitis en ratas Malaltia inflamatòria intestinal; Trasplantament de microbiota fecal; Model de colitis en rates Background: Faecal microbiota transplantation (FMT) is a novel potential therapy for inflammatory bowel diseases, but it is poorly characterised. Methods: We evaluated the performance of the mouse and rat as a pre-clinical model for human microbiota engraftment. We then characterised the effect of a single human stool transfer (HST) on a humanised model of DSS-induced colitis. Colonic and faecal microbial communities were analysed using the 16S rRNA approach and clinical manifestations were assessed in a longitudinal setting. Findings: The microbial community of rats showed greater similarity to that of humans, while the microbiome of mice showed less similarity to that of humans. Moreover, rats captured more human microbial species than mice after a single HST. Using the rat model, we showed that HST compensated faecal dysbiosis by restoring alpha-diversity and by increasing the relative abundance of health-related microbial genera. To some extent, HST also modulated the microbial composition of colonic tissue. These faecal and colonic microbial communities alterations led to a relative restoration of colon length, and a significant decrease in both epithelium damage and disease severity. Remarkably, stopping inflammation by removing DSS before HST caused a faster and greater recovery of both microbiome and clinical manifestation features. Interpretation: Our results indicate that the rat outperforms the mouse as a model for human microbiota engraftment and show that the efficacy of HST can be enhanced when inflammation stimulation is withdrawn. Finally, our findings support a new therapeutic strategy based on the use FMT combined with anti inflammatory drugs. Study funded by the Instituto de Salud Carlos III/FEDER (PI17/00614), a government agency. The funder had no role in study design, data collection, data analysis, interpretation or writing of the report.

La fragilidad es un síndrome clínico de mayor vulnerabilidad a factores externos que pueden desencadenar efectos adversos y llevar a la muerte. La fragilidad es prevenible y parcialmente reversible si se diagnostica a tiempo. Actualmente no existe un biomarcador cuantitativo para el diagnóstico de fragilidad. Postulamos que la ecografía muscular junto con parámetros circulantes sería buen método para identificar pacientes con riesgo de fragilidad. Se realizaron ecografías musculares del compartimento anterior del muslo en pacientes ambulatorios y se extrajeron muestras de sangre para análisis bioquímico, medición de hormonas, citocinas y parámetros del estrés oxidativo. Los pacientes se dividieron en grupos en base a los criterios de fragilidad de Fried. Se desarrolló un protocolo de ecografía muscular con varios parámetros medidos en las cuatro cabezas del cuádriceps femoral. Nuestro objetivo era validar los parámetros ecográficos en cuanto a exactitud y precisión como biomarcadores de imagen y evaluar su potencial para uso clínico y, por otro lado, explorar sustratos biológicos para los hallazgos de imagen. Los resultados de este estudio confirman que la ecografía muscular podría utilizarse en pacientes ambulatorios como método de cribado y es posible diagnosticar sujetos en riesgo de fragilidad con una precisión de hasta el 95 % utilizando modelos de fragilidad que combinan parámetros ecográficos y bioquímicos.

El síndrome metabólico (SM) afecta a aproximadamente un cuarto de la población en los países industrializados y a más del 40% de la población de 50 o más años, habiéndose convertido en los últimos años en una de las principales preocupaciones para la Salud Pública debido a su relación con la enfermedad cardiovascular. Se trata de una entidad nosológica frecuente y compleja, que representa un conjunto de alteraciones cardiovasculares y metabólicas como la obesidad, la hipertensión, la hiperglucemia, unos niveles elevados de triglicéridos y una reducción de las lipoproteínas de alta densidad (HDL). El impacto y los riesgos adversos en el sistema cardiovascular aumentan en consonancia con el número de componentes del SM presentes, produciéndose un deterioro de la función vascular y causando daños irreversibles en diversos órganos, como es el caso del corazón. Además, se ha evidenciado un aumento del riesgo de muerte súbita de origen cardíaco mayor que el incremento del riesgo de sufrir infarto de miocardio en pacientes obesos y diabéticos, por lo que se ha sugerido la importancia de las complicaciones relacionadas con eventos arrítmicos no isquémicos. En efecto, los diferentes componentes del SM se han relacionado, de forma individual, con un incremento en la incidencia de arritmias ventriculares, pero los mecanismos subyacentes no son del todo conocidos. Asimismo, las investigaciones que han estudiado el efecto de la combinación de sus componentes sobre el remodelado eléctrico cardíaco son prácticamente inexistentes. El objetivo principal de la presente tesis doctoral es doble: por un lado, desarrollar un modelo experimental de SM en conejo y estudiar la progresión de sus diferentes manifestaciones durante el periodo de administración de una dieta alta en grasas y azúcares; por otro lado, investigar el impacto que la combinación de los diferentes componentes del síndrome metabólico ejerce sobre el remodelado estructural, funcional y eléctrico cardíaco, y su implicación en los procesos de instauración, mantenimiento y cese de la actividad arrítmica y fibrilatoria. Para ello, utilizamos un grupo de conejos de raza blanca Nueva Zelanda que fueron alimentados durante 28 semanas con una dieta alta en grasas y azúcares (n=13). Se utilizó un grupo control (n=12) que fue estabulado durante el mismo periodo de tiempo. Estudiamos el comportamiento de los componentes del síndrome metabólico durante las 28 semanas a través del registro de la presión arterial, la actividad electrocardiográfica, el peso y el análisis de diversos metabolitos en sangre (glucosa, colesterol y triglicéridos, entre otros), evaluando además la función cardíaca y algunas de las características electrofisiológicas del corazón “in vivo”. Después de las 28 semanas se analizaron las propiedades eléctricas ventriculares y la dinámica, la complejidad y las características de los episodios arrítmicos en un modelo de corazón aislado (tipo Langendorff) gracias a la utilización del mapeo óptico epicárdico de la actividad eléctrica cardíaca. Los resultados obtenidos en el primer subproyecto mostraron que la administración de una dieta alta en grasas y sacarosa durante 28 semanas indujo 1) obesidad central, 2) un estado de prediabetes caracterizado por una alteración de la glucosa en ayunas e intolerancia a la glucosa, 3) hipertensión leve, 4) alteraciones en el perfil lipídico, reveladas por un aumento de los triglicéridos y el colesterol LDL con una disminución de HDL (sin cambios en el colesterol total), 5) daño hepático, como lo demuestra el aumento de GOT-AST, relación GOT/GPT, ácidos biliares y bilirrubina, y 6) esteatosis hepática. De este modo, estos resultados corroboran el desarrollo de un modelo animal relevante y económico de SM inducido por la dieta que imita los principales cambios que ocurren en los seres humanos. En cuanto al segundo subproyecto, por lo que respecta al remodelado morfológico, funcional y eléctrico cardíaco “in vivo”, el estudio ecocardiográfico reveló una hipertrofia ventricular izquierda ya evidente en la semana 14 de administración de la dieta, a expensas de un aumento del grosor del septo interventricular y la pared posterior del ventrículo izquierdo en diástole, así como la masa normalizada del ventrículo izquierdo del grupo de animales con SM. También se encontró un aumento significativo en el diámetro de la aorta que suele acompañar a la hipertrofia ventricular. El estudio electrocardiográfico evidenció, además, un incremento en la duración de los intervalos PQ, QRS, QT corregido (QTc) y la onda T en el grupo de animales con SM, la mayoría de ellos ya evidentes en la semana 14 del protocolo experimental. Se observa, por tanto, un remodelado patológico con alteraciones en la conducción aurículo-ventricular y ventricular, así como en la repolarización ventricular, habiéndose relacionado algunos de ellos con una mayor predisposición a padecer eventos arrítmicos y muerte súbita cardíaca. Posteriormente, estudiamos el remodelado patológico en el órgano aislado y, por tanto, no sujeto a factores nerviosos y/o humorales extrínsecos, para investigar las modificaciones electrofísiológicas intrínsecas cardíacas que guardan estrecha relación con los procesos de desencadenamiento, instauración y mantenimiento de la actividad arrítmica y fibrilatoria. El mapeo óptico simultáneo de los ventrículos derecho e izquierdo nos permitió encontrar un acortamiento de la duración del potencial de acción óptico al 90% de la repolarización en el ventrículo derecho en el grupo de animales con SM, una mayor triangulación del mismo, así como una disminución en la longitud de onda del proceso de activación, lo cual podría ser considerado como un mecanismo electrofisiológico básico que promovería la actividad arrítmica y fibrilatoria. Por último, analizamos la dinámica y características de los procesos fibrilatorios, lo que nos permitió identificar un aumento en la frecuencia dominante del ventrículo derecho en el grupo de animales con SM, consecuencia del acortamiento de la refractariedad ventricular derecha, que mostró también una correspondiente disminución en la duración del intervalo VV al efectuar el análisis en el dominio del tiempo. Además, el gradiente fisiológico de frecuencias que se da entre los ventrículos derecho e izquierdo fruto de las diferencias regionales en la refractariedad se vio abolido en el grupo de animales con SM, lo cual podría tener importantes implicaciones en los procesos de instauración y mantenimiento de procesos arrítmicos y fibrilatorios.

La sepsis es un síndrome complejo que provoca una respuesta inmunitaria exacerbada como resultado a una infección, lo que puede causar disfunción orgánica y, en última instancia, la muerte. La sepsis puede avanzar a shock séptico (SS), caracterizado por una disfunción orgánica aguda que puede provocar una insuficiencia circulatoria y metabólica grave, aumentando el riesgo de mortalidad. Los pacientes con sepsis o SS ingresados durante al menos 7 días en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) que presentan disfunción orgánica y necesidad de ventilación mecánica se clasifican como enfermos críticos crónicos (ECC), los cuales, si están ingresados al menos 14 días y cumplen una serie de características inmunológicas y metabólicas específicas, se clasifican como pacientes con PICS (Síndrome de inflamación persistente, activación del catabolismo e inmunosupresión). Por lo tanto, la detección temprana de la sepsis es fundamental para el manejo de la enfermedad, y comprender los mecanismos moleculares que llevan a los diferentes fenotipos clínicos ayudará a predecir su evolución. La identificación de nuevos biomarcadores permite establecer protocolos de seguimiento adecuados para estos pacientes, con el objetivo de reducir la elevada mortalidad y mejorar la calidad de vida de los pacientes sépticos que sobreviven a una sepsis. En esta tesis doctoral se caracterizó, en un modelo de células endoteliales humanas, cómo afectan las histonas citrulinadas. Estas histonas son liberadas al torrente sanguíneo mediante procesos de la inmunidad innata, como la ETosis, siendo el tejido endotelial el primero en entrar en contacto con las histonas. Así mismo, se correlacionaron los niveles plasmáticos de histonas circulantes y citrulinadas con las características clínicas de los pacientes con sepsis y SS supervivientes y no supervivientes. Así, se identificó que las histonas citrulinadas no causan daño a las células endoteliales, aunque sí son capaces de activar respuestas inmunitarias mediadas por el endotelio, facilitando la respuesta inmune. Además, en los pacientes con SS, observamos que las histonas circulantes se relacionaron con factores de coagulación e inmunomodulación, mientras que las histonas circulantes citrulinadas correlacionaron negativamente con los eventos de coagulación. Por otro lado, se caracterizó cómo están involucrados los cambios de expresión de microRNAs y los patrones de metilación del DNA en la evolución de los pacientes con sepsis, ECC y PICS. Se observó que los niveles circulantes del miR-10395-3p, miR-122, let-7a-5p y miR-133a, así como los cambios de metilación de los genes IL12RB2, LEF1, TCF7, CD3G, PDCD1, DEFA4, IL10, TNFSF4 a tiempos iniciales indican qué pacientes evolucionarán a estos subgrupos clínicos. Así mismo, los microRNAs miR-150-5p y miRNA-335-5p sugieren una inflamación persistente, mientras que los microRNAs miR-27b y miR-4512, junto a los cambios de metilación de los genes PRTN3, CLEC2D, CD3D, PRF1 podrían ayudar a discernir qué pacientes sufrirán una inmunosupresión a largo plazo. Sepsis is a complex syndrome that causes an exaggerated immune response as a result of infection, which can lead to organ dysfunction and ultimately death. In some cases, sepsis can progress to septic shock, which is characterized by acute organ dysfunction that can result in severe circulatory and metabolic failure, increasing the risk of mortality. Patients with sepsis or septic shock who are admitted to the Intensive Care Unit (ICU) and experience organic dysfunction and need for mechanical ventilation for at least 7 days are classified as chronically critically ill (CCI). If they are hospitalized for at least 14 days and meet a series of specific immunological and metabolic characteristics, they are classified as patients with PICS (Persistent Inflammation, Activation of Catabolism, and Immunosuppression Syndrome). Therefore, early detection of sepsis is essential for disease management, and understanding which molecular and epigenetic mechanisms are altered in each group of patients can help predict their evolution. The identification of new biomarkers will allow the establishment of adequate follow-up protocols for these patients to reduce high mortality and improve the quality of life of septic patients who survive sepsis. In this doctoral thesis, the effect of citrullinated histones was characterized in a model of human endothelial cells. These histones are released into the bloodstream by innate immunity processes, such as ETosis (extracellular traps), and the endothelial tissue is the first to come into contact with the histones. Likewise, circulating and citrullinated histone levels were analyzed in plasma samples and correlated with the clinical characteristics of surviving and non-surviving patients with sepsis and SS. Thanks to this, we identified that citrullinated histones do not cause damage to endothelial cells, especially in comparison with those histones without induced modifications, and are capable of activating endothelium-mediated immune responses. In addition, we observed that in patients, histones were related to coagulation and immunomodulation factors, while citrullinated histones were negatively correlated with coagulation events. On the other hand, we characterized which microRNA expression changes and DNA methylation patterns are involved in the evolution of septic patients, CCI, and PICS. Thanks to this, we observed that the analysis of miR-10395-3p, miR-122, let-7a-5p, and miR-133a, or the gene methylation changes of IL12RB2, LEF1, TCF7, CD3G, PDCD1, DEFA4, IL10, and TNFSF4 will allow us to predict at early stages which patients will evolve into these clinical subgroups. Likewise, miR-150-5p and miRNA-335-5p will help discern which patients will present persistent inflammation, while miR-27b and miR-4512, together with the methylation changes of the PRTN3, CLEC2D, CD3D, PRF1 genes, would help discern whether patients who develop PICS will suffer long-term immunosuppression.

La distrofia muscular de cinturas tipo D2 (Limb-girdle muscular dystrophy type D2, LGMDD2) es una enfermedad genética ultra rara para la cual no existe tratamiento. Las principales características clínicas de la LGMDD2 son la debilidad y degeneración muscular progresiva que afecta a las cinturas pélvica y escapular de forma predominante. En 2013 se identificó la LGMDD2 como una miopatía autosómica dominante causada por una mutación en el gen de la transportina 3 (TNPO3), dando como resultado una proteína mutante con una extensión de 15 aminoácidos adicionales: TNPO3mut. TNPO3 es una β-importina responsable de la importación nuclear de proteínas ricas en serina/arginina (proteínas SR), involucradas principalmente en el splicing y metabolismo del RNA. Además, TNPO3 es una proteína esencial para la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. Al inicio de este trabajo apenas había información sobre la LGMDD2 y se desconocía el papel de TNPO3mut en el músculo esquelético de los pacientes. Esto se debía, en gran parte, a la inexistencia de modelos experimentales que permitieran profundizar sobre la enfermedad y los mecanismos involucrados en la degeneración muscular. Por ello, nos planteamos desarrollar modelos de LGMDD2 con los que identificar qué desencadena los síntomas de esta miopatía y sobre los que poder testar posibles terapias efectivas. En este trabajo hemos desarrollado dos modelos experimentales de LGMDD2, en mosca y mioblastos inmortalizados, este último en colaboración con el grupo de Patología Neuromuscular y Ataxias del Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, dirigido por el Dr. Vílchez. El estudio de ambos modelos ha demostrado que la mutación causante de LGMDD2 provoca un aumento de los niveles de TNPO3, degeneración muscular y capacidad locomotora reducida en la mosca y afecta a la diferenciación de los mioblastos derivados de paciente. Además, este trabajo aporta evidencias de que hay un exceso de activación de las vías catabólicas que desregulan la homeostasis muscular y de que hay una alteración del splicing alternativo y constitutivo en LGMDD2 que podría estar contribuyendo a la degeneración del músculo. Por otro lado, los modelos han sido utilizados para testar fármacos a gran escala y poder seleccionar 6 compuestos para su reposicionamiento contra la LGMDD2. Asimismo, se proporciona una prueba de concepto del potencial de la edición de TNPO3 mediada por CRISPR-Cas9 como enfoque terapéutico contra la LGMDD2. A su vez, la edición génica de la mutación de TNPO3 ha servido para identificar alteraciones claves a nivel del transcriptoma en LGMDD2 que también podrían estar contribuyendo a la patología. Con todo, la presente tesis aporta información sobre los mecanismos moleculares involucrados en la LGMDD2 que servirá para entender mejor cómo se desencadena la degeneración muscular en los pacientes y permite avanzar en la búsqueda de terapias válidas contra esta distrofia. Limb-girdle muscular dystrophy type D2 (LGMDD2) is an ultra-rare genetic disease for which there is no treatment. The main clinical features of LGMDD2 are weakness and progressive muscle wasting that predominantly affects the pelvic and shoulder girdles. In 2013, LGMDD2 was identified as an autosomal dominant myopathy caused by a mutation in the transportin 3 (TNPO3) gene, resulting in a mutant protein with an extension of 15 additional amino acids: TNPO3mut. TNPO3 is a β-importin responsible for the nuclear import of serine/arginine-rich proteins (SR proteins), mainly involved in RNA splicing and metabolism. In addition, TNPO3 is an essential protein for human immunodeficiency virus type 1 infection. At the beginning of this work, there was little information on LGMDD2 and the role of TNPO3mut in the skeletal muscle of patients was unknown. This was due, in large part, to the lack of experimental models that would allow us to delve into the disease and the mechanisms involved in muscle degeneration. For this reason, we considered developing LGMDD2 models with which to identify what triggers the symptoms of this myopathy and on which to test possible effective therapies. In this work, we have developed two experimental models of LGMDD2, in flies and immortalized myoblasts, the latter in collaboration with the Neuromuscular Pathology and Ataxias group of the Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, directed by Dr. Vílchez. The study of both models has shown that the causative mutation of LGMDD2 causes an increase in TNPO3 levels, muscle degeneration, and reduced locomotor capacity in the fly and affects the differentiation of patient-derived myoblasts. In addition, this work provides evidence that there is an excess activation of catabolic pathways that deregulate muscle homeostasis and that there is an alteration of alternative and constitutive splicing in LGMDD2 that could be contributing to muscle degeneration. On the other hand, the models have been used to test drugs on a large scale and to be able to select 6 compounds for their repositioning against LGMDD2. Furthermore, proof-of-concept of the potential of CRISPR-Cas9-mediated editing of TNPO3 as a therapeutic approach against LGMDD2 is provided. In turn, gene editing of the TNPO3 mutation has served to identify key alterations at the transcriptome level in LGMDD2 that also could be contributing to the pathology. All in all, this thesis provides information on the molecular mechanisms involved in LGMDD2 that will serve to better understand how muscle degeneration is triggered in patients and allows progress in the search for valid therapies against this dystrophy.

La estratificación pronóstica de los pacientes con Leucemia Linfática Crónica (LLC) se basa en el índice pronóstico LLC-IPI, que integra marcadores clínicos, citogenéticos y biológicos, como el estudio de la región variable del gen de la cadena pesada de las inmunoglobulinas (IGVH) y del gen TP53. La secuenciación de nueva generación (NGS), ha permitido identificar las alteraciones genéticas asociadas con el desarrollo, progresión y resistencia a los tratamientos convencionales, y desarrollar nuevas herramientas pronósticas, y novedosas terapias dirigidas. Con la inmunoquimioterapia (IQT), la evolución clonal después de la terapia es la regla, mientras que con Ibrutinib, es la adaptación del tumor a la resistencia a la terapia. A día de hoy, se desconocen los parámetros clínicos y las alteraciones clonales que impactan sobre la evolución de la enfermedad, y si su estudio puede guiar las decisiones terapéuticas. El objetivo principal ha sido analizar el impacto en la evolución clonal de las variables clínicas, biológicas y moleculares con valor pronóstico y/o predictivo potencial en la LLC. Se realizó un estudio observacional retrospectivo de 96 pacientes con LLC/LLCP (1999 y 2020) no tratados, de los que se describieron las características clínicas y biológicas, de progresión, administración de tratamiento, y respuesta. Se caracterizó en la muestra basal y en 302 de seguimiento, el estado mutacional de TP53, SF3B1, BIRC3, NOTCH1, MYD88, XPO1, EGR2, POT1, NFKBIE, ATM y FBXW7 por NGS. Se determinó el clonotipo y estado mutacional IGVH por Secuenciación Sanger (Sseq), y por NGS a partir de una estrategia in house y la herramienta de análisis B-MyRepCLL. Se diseñó y validó el panel IBR-R para la detección de mutaciones en BTK y PLC&2 asociados a resistencias a Ibrutinib. La evaluación de la enfermedad medible residual (EMR) se realizó por citometría de flujo. Conocer el patrón genético ha permitido evaluar la fracción alélica secuencial de cada mutación como indicador de la capacidad evolutiva de la enfermedad a corto y largo plazo, fundamentando la asociación entre una dinámica clonal temprana y una respuesta adversa a según qué tipo de tratamiento y en función del tiempo. Las mutaciones adquiridas en TP53 y SF3B1, y la del(17p13), han revelado el patrón de evolución más relacionado con la resistencia molecular a la IQT, y con Ibrutinib, se ha asociado a otros genes driver, con una relación indirecta entre TP53mut y la competencia clonal. El panel IBR-R, ha permitido detectar la mutación en el gen BTK p.Cys481Ser meses antes de la recaída clínica, reforzando el papel de estas mutaciones en la resistencia a Ibrutinib. El método in house y la herramienta específica B-MyRepCLL, es robusto en la anotación de los reordenamientos VDJ y en la detección del repertorio inmunogenético con respecto a Sseq. Ha servido para detectar la EMR con mayor sensibilidad y rastrear las poblaciones de células B clonales, su dinámica y características moleculares.

La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la presencia de placas amiloideas, hiperfosforilación de la proteína TAU e incremento de la inflamación cerebral. El uso de modelos animales de experimentación, como APP/PS1 (proteína precursora de amiloide/presenilina 1), permite observar los cambios producidos tanto a nivel de bioquímico como de biología molecular. Las células encargadas de intervenir en el proceso inflamatorio cerebral son los astrocitos y la microglía. Los resultados de esta tesis nos indican que los cambios en las quimiocinas y los receptores de quimiocinas son importantes debido a la implicación que podrían tener en la inflamación relacionada con la enfermedad de Alzheimer. Además, podrían ser una de las posibles causas para el desarrollo de este trastorno. Se produce daño en la barrera hematoencefálica, con un aumento de la quimiotaxis. Por otra parte, el movimiento de las moléculas a través de las membranas celulares podría ser posiblemente mayor en ratones transgénicos en comparación con los ratones de tipo salvaje, lo que sugeriría que podría existir una pérdida de energía en los ratones transgénicos si los comparamos con los ratones de tipo salvaje. Esto viene evidenciado por los resultados obtenidos respecto a los cambios detectados en la proteína ABCF1 que presentan mayor expresión en el ratón transgénico que en el ratón de tipo salvaje. Los niveles de quimiocinas y citoquinas, junto con sus receptores cambian en el ratón APP/PS1 con respecto al ratón de tipo salvaje. Este hecho podría llevar a nuevos tratamientos en la EA, con la posibilidad de actuar de manera más específica controlando todos los procesos fisiológicos ligados a la acción de estos mediadores en nuestro organismo. Alzheimer's disease is characterized by the presence of amyloid plaques, hyperphosphorylation of the TAU protein, and increased brain inflammation. The use of experimental animal models, such as APP/PS1 (amyloid precursor protein/presenilin 1), makes it possible to observe the changes produced both at the biochemical and molecular biology level. The cells responsible for intervening in the cerebral inflammatory process are astrocytes and microglia. The results of this thesis indicate that changes in chemokines and chemokine receptors are important due to the implication they could have in inflammation related to Alzheimer's disease. In addition, they could be one of the possible causes for the development of this disorder. Damage to the blood-brain barrier occurs, with increased chemotaxis. On the other hand, the movement of molecules across cell membranes could possibly be higher in transgenic mice compared to wild-type mice, which would suggest that there could be a loss of energy in transgenic mice compared to wild-type mice. wild type mice. This is evidenced by the results obtained regarding the changes detected in the ABCF1 protein that present greater expression in the transgenic mouse than in the wild-type mouse. The levels of chemokines and cytokines, along with their receptors, change in the APP/PS1 mouse relative to the wild-type mouse. This fact could lead to new treatments in AD, with the possibility of acting more specifically by controlling all the physiological processes linked to the action of these mediators in our body.

Dementia; Retinal microperimetry; Type 2 diabetes Demencia; Microperimetría retiniana; Diabetes tipo 2 Demència; Microperimetria retiniana; Diabetis tipus 2 The presence of type 2 diabetes acts as an accelerator of cognitive impairment (mild cognitive impairment and later dementia), with a significant impact on the management of the disease and its complications. Therefore, it is recommended to perform an annual evaluation of cognitive function in patients with diabetes older than 65 years. Current guidelines still recommend the use of the Minimental State Evaluation Test (MMSE) as screening test, but it has a modest sensitivity and specificity for identifying mild cognitive impairment. This represents an important gap because patients with mild cognitive impairment are at risk of progressing to dementia. The neurocognitive diagnosis is based on complex neuropsychological tests, which require specifically trained personnel and are time consuming, making its routine incorporation into daily clinical practice unfeasible. Therefore, at present there are no reliable biomarkers to identify patients with type 2 diabetes at increased risk of developing cognitive impairment. Since the brain and the retina have a common embryological origin, our Research Group, has worked over the last 10 years evaluating the usefulness of the retina as a “window” to the brain. We provided evidence that retinal microperimetry is a simple, feasible and useful tool for screening and monitoring cognitive function in patients with type 2 diabetes. We propose a review of actual tests recommended for screening of cognitive impairment as well as an update of new emerging methods, such as retinal microperimetry.

La teoría del envejecimiento más aceptada y testada es la teoría de los radicales libres en el envejecimiento, la cual afirma que el envejecimiento y la muerte se producen por un aumento acumulativo de los efectos de los radicales libres a lo largo de la vida. Por otro lado, los radicales libres están implicados en el ejercicio físico, aumentando éstos cuando se produce un ejercicio físico agotador, provocando estrés oxidativo. Con el objetivo de estudiar el papel de la xantina óxidoreductasa como fuente de radicales libres en el proceso de envejecimiento y su contribución al estrés oxidativo en el ejercicio físico agotador, se ha estudiado el efecto del ejercicio físico agotador en ratas wistar macho jóvenes y viejas, obteniendo parámetros de daño muscular en plasma, de estrés oxidativo en sangre, hígado y músculo esquelético, de actividad y expresión de xantina óxidoreductasa en plasma, hígado, músculo esquelético y aorta, y de producción de radical superóxido en anillos aórticos. Los resultados indican que el envejecimiento se asocia a estrés oxidativo en sangre, hígado y músculo esquelético, así como a un aumento de la actividad y expresión de xantina oxidasa en plasma, músculo esquelético y aorta y también a un aumento de la producción de radical superóxido en aorta. Por otro lado, el ejercicio físico agotador provoca un aumento de los indicadores plasmáticos de daño muscular y del estrés oxidativo en sangre, hígado y músculo esquelético tanto en animales jóvenes como en viejos, así como un aumento de la actividad xantina oxidasa en plasma de animales jóvenes., Free radical theory of aging is the most accepted and tested theory to explain the aging process. According to this theory, the progressive and cumulative harmful effects of free radicals along life causes aging and death. Free radicals are also involved in exercise. They increase when performing an exhausting exercise, leading to oxidative stress. With the aim of assessing the role of xanthine oxidoreductase as a free radical source in the aging process and his contribution to oxidative stress that occurs in exhausting exercise, we have studied the effect of exhausting exercise in young and old male wistar rats. We measured skeletal muscle damage parameters in plasma, oxidative stress in blood, liver and skeletal muscle, xanthine oxidoreductase activity and expression in plasma, liver, skeletal muscle and aorta, and superoxide production in aortic rings. Our results show that aging is associated to blood, liver and skeletal muscle oxidative stress, as well as an increase in xanthine oxidase activity and expression in plasma, skeletal muscle, and aorta, and also an increase in superoxide production in aorta. Exhausting exercise leads to an increase of skeletal muscle damage parameters in plasma and to an increase of oxidative stress in blood, liver and skeletal muscle either in young or old animals, as well as to an increased xanthine oxidase activity in plasma of young animals.

Calcium (Ca2+) is involved in different cellular functions and signaling pathways, mediating between extracellular and intracellular signals. MAMs (Endoplasmic reticulum-mitochondria associated membranes) are specific close appositions formed by the physical interaction of the ER and the mitochondria, thus regulating the main intracellular Ca2+ flux by means of the communication between the two compartments. This is fundamental to maintain cell function and so it has been proposed as a common mechanism in neurodegeneration. Friedreich's Ataxia (FRDA) is an autosomal recessive neurodegenerative disorder in which patients show reduced levels of frataxin (FXN), a protein fundamentally associated with the mitochondrial matrix. This implies several alterations in signaling pathways related to mitochondrial function. Among these, evidence for dysfunction of intracellular Ca2+ homeostasis has been observed, but the mechanisms involved are unknown. On the other hand, the existence of extra-mitochondrial FXN isoforms highlights the importance of the functional characterization of FXN linked to its subcellular localization and tissue distribution in FRDA. Therefore, the aim of the present work is to determine the involvement of MAMs in the pathophysiology of FRDA, as well as their relevance as potential therapeutic targets of the disease. The study of FXN subcellular localization revealed that FXN is located in MAMs domain, interacting with two of the main proteins responsible for ER-mitochondria Ca2+ exchange. Moreover, FXN deficiency decreases MAMs communication in our cell model both structurally and functionally, decreasing Ca2+ transfer from the ER to the mitochondria. Treatment with Trolox, NAC and compounds targeting MAMs such as Omaveloxolone, Fluvoxamine and Kaempferol, succeeded in rescuing some of the deficiencies observed in the model, highlighting the importance of this domain as a therapeutic target for FRDA. We optimized the Split-TurboID technique to study the interactome of FXN I and II in both the ER/cytosol and the mitochondrial matrix with the aim of elucidating which isoform of FXN might be involved in the regulation of MAMs domain. Results showed that both FXN I and FXN II localize extramitochondrially, interacting with the ER from the cytosol, while FXN I localizes to the mitochondria, exhibiting a dual subcellular localization. Dataset analysis of both interactomes in the ER revealed proteins belonging to MAMs, with some involved in Ca2+ homeostasis suggesting that both are present in this domain and would be implicated in intracellular Ca2+ homeostasis. In short, our results point to a clear involvement of FXN in the regulation of the MAMs domain, which may contribute to the pathophysiology of FRDA. However, the contribution of each isoform in these processes needs to be clarified. Taken together, our findings open a field of possibilities focused on the communication of MAMs as a possible therapeutic strategy for FRDA.

Antecedentes: El síndrome metabólico (SM) se define como el conjunto de al menos tres de las siguientes condiciones: obesidad central, elevación de triglicéridos, disminución de lipoproteínas de alta densidad, hipertensión sistémica e intolerancia a la glucosa. El SM está relacionado con una alta prevalencia de enfermedades cardiovasculares, muerte súbita cardíaca y arritmias auriculares, eventos que pueden ser consecuencia de cambios relacionados con la estructura, función y control del corazón. Uno de los mecanismos subyacentes podría ser la alteración de la automaticidad del nodo sinusal por alteraciones del sistema nervioso autónomo qué pueden evaluarse analizando los componentes de la variabilidad de la frecuencia cardíaca (VFC). Objetivo: Examinar las modificaciones de la VFC, su evolución y su posible relación con los diferentes componentes del síndrome metabólico en un modelo experimental en conejo, inducido por la administración de una dieta alta en grasa y azúcar. Métodos: Se asignaron al azar conejos machos NZW al grupo control (n = 10) o al grupo SM (n = 10), alimentados con una dieta rica en grasas (10% de aceite de coco y 5% de manteca de cerdo) y alta en sacarosa (15% disuelta en agua). durante 28 semanas. Se registró un ECG durante 15 minutos antes de la administración de la dieta, en las semanas 14 y 28. En la semana 28, se realizó un registro de ECG de 24 horas (eMotion Faros 180, Mega Electronics®, 1 kHz). Luego se aislaron estos corazones, se estabilizaron durante 15 minutos y se registraron electrogramas de 15 minutos de duración en un sistema de tipo Languendorff. Analizamos las oscilaciones RR in vivo de corta y larga duración, y en corazón aislado, en los dominios del tiempo, la frecuencia y el análisis no lineal. Para el análisis estadístico se utilizó el análisis multivariado de varianza (MANOVA, modelo factorial) (p 0,05) en MSE mínimo y máximo, así como en el CI1-20 con predominio en la semana 14. Los demás parámetros del análisis no lineal no mostraron cambios estadísticamente significativos. Resultados análisis de larga duración: El análisis en el dominio del tiempo mostró una disminución en el intervalo RR y el Ti geométrico (p>0,005) en animales con SM, indicativo de un aumento de la FC. El resto de parámetros en el dominio del tiempo analizados no se modificaron. En el dominio de la frecuencia en el espectro FFT, encontramos una disminución significativa en la banda LF (p = 0.032) en animales SM. El resto de los parámetros del dominio de la frecuencia (índice VLF, HF y LF / HF) se mantuvo sin cambios. El análisis de Poincaré mostró un aumento del índice SD1 / SD2 en animales con SM durante el día y la noche en comparación con los controles (p = 0.043). Además, encontramos una disminución de DFAα1 (p = 0.021) y DFAα2 (p = 0.002) en animales SM. Se encontró la misma tendencia en MSEmax (p = 0.014) para el grupo SM. No se observaron cambios significativos en el resto de componentes de los análisis no lineales. Resultados análisis en corazón aislado: En el dominio de la frecuencia, encontramos un aumento en el componente LF de VFC en animales con SM y la relación LF / HF (p

La pérdida de masa muscular producida durante la inmovilización, es un fenómeno que produce un deterioro muy significativo en la calidad de vida de las personas. La xantina oxidasa es una enzima mediadora de la degradación de las purinas que se ha postulado como una de las causantes de esta pérdida de masa muscular durante la inmovilización. El papel protector del alopurinol en la pérdida de masa muscular en distintos modelos de atrofia, a través de la inhibición de la xantina oxidasa, ha sido estudiado en animales de experimentación. En la presente tesis doctoral nos planteamos, a través de un ensayo clínico en humanos (EUDRACT 2011-003541-17), estudiar el efecto de la administración de alopurinol en paciente inmovilizados tras un diagnóstico de esguince grado II, sobre la pérdida de masa muscular esquelética. Los pacientes fueron aleatorizados en dos grupos, aquellos que tomaron alopurinol (300 mg/día) durante un periodo de dos semanas y el grupo placebo. Transcurridas las dos semanas de inmovilización se valoró, a través de pruebas de imagen por Resonancia Magnética, el área de sección transversal, así como el volumen del músculo sóleo. Tras catorce días de inmovilización con una férula se comprobó una pérdida de masa muscular en ambos grupos experimentales. El valor de pérdida del área de sección transversal fue del 8,6% en el grupo control frente a un 4,1% en el grupo tratado con alopurinol. Sin embargo, no encontramos prevención en la pérdida de volumen del sóleo asociada al periodo de inmovilización. Por otra parte, no encontramos diferencias significativas entre el grupo control y el de alopurinol en ningún marcador de daño inflamatorio, hepático o muscular. Nuestros resultados muestran que el alopurinol protege parcialmente contra la atrofia muscular en humanos, tal y como se había demostrado previamente en un modelo murino. El efecto protector del alopurinol es similar al del ejercicio de resistencia, que es la forma más conocida de prevenir la pérdida de masa muscular en modelos humanos en desuso. Para poder realizar estudios de los mecanismos implicados en el proceso de atrofia de la musculatura esquelética es imprescindible poder obtener muestras de biopsias musculares. Sin embargo, la técnica de la biopsia muscular percutánea utilizando una aguja tipo Bergtröm, de no ejecutarse con una metodología apropiada, puede interferir en las vías de señalización celular, especialmente las cascadas inflamatorias y oxidativas que se sabe están implicadas en el proceso de atrofia. En el segundo estudio de la presente tesis doctoral pretendimos valorar si la reiteración de biopsias en la misma incisión podía favorecer procesos inflamatorios que pudieses invalidarnos los resultados que obtenemos a la hora de analizar este tipo de muestras. Este estudio se realizó con 5 sujetos a los que se les realizaron 6 biopsias reiteradas utilizando tanto los mismos puntos de incisión como puntos diferentes. Las proteínas analizadas en las distintas muestras fueron: MAPKs: ERK1/2, p38 y JNK y la cascada de señalización celular inflamatoria de NF-B: IB, IKK e IL-6). Se obtuvieron cuatro biopsias a través de la misma incisión (5-6 mm) de la pierna derecha (tomadas a los 0, 30, 123 y 126 minutos) y otras dos de nuevas incisiones realizadas en la pierna izquierda (a los 31 y 120 minutos). Las primeras tres biopsias de la pierna derecha se tomaron a una distancia de ~3 cm de las áreas pre-biopsiadas. La última biopsia se obtuvo del mismo punto del que se tomó la segunda biopsia. Las tres biopsias realizadas a través de la misma incisión en la piel de áreas musculares no lesionadas mostraron niveles similares de fosforilación de ERK1/2-MAPK, p38-MAPK, JNK-MAPK, IKKα, IκBα y contenido similar de ARNm de IL-6. No hubo diferencias significativas en los niveles de fosforilación de ERK1/2-MAPK, p38-MAPK, JNK-MAPK, IKKα e IκBα entre la media de las tres biopsias obtenidas de la misma incisión y la sexta biopsia obtenida de un área lesionada. El contenido de ARNm de IL-6 aumentó 1,8 veces en la sexta biopsia en comparación con la media de las tres biopsias obtenidas de la misma incisión (P

La obesidad es una enfermedad multifactorial e incapacitante que se caracteriza por una sobrecarga metabólica del tejido adiposo (AT), la inflamación crónica de bajo grado, el estrés oxidativo y la disfunción endotelial. En la actualidad, la prevalencia mundial de la obesidad está aumentando, donde el estilo de vida influye de manera significativa en la resolución de esta enfermedad. En este contexto, ha aumentado la demanda de estrategias para revertir las comorbilidades y frenar su aumento. El procedimiento de bypass gástrico en Y de Roux (RYGB) es una herramienta eficaz para la pérdida de peso y la remisión de las comorbilidades metabólicas de la obesidad, aunque se desconocen los mecanismos moleculares que implican estas mejoras. Por lo tanto, el objetivo principal de la presente tesis doctoral fue determinar cómo la cirugía RYGB modula la inflamación crónica de bajo grado, el estrés oxidativo y la disfunción endotelial, explorando su efecto sobre el complejo del inflamasoma, la autofagia, la dinámica mitocondrial y el estrés del retículo endoplásmico (ER). También se abordó el papel de la metformina, un enfoque terapéutico alternativo para la obesidad y la diabetes de tipo 2 (T2D). Por lo tanto, otro objetivo de este estudio fue analizar los mecanismos moleculares relacionados con la inflamación y la autofagia en la AT y el efecto protector de la metformina contra las alteraciones metabólicas. Nuestra hipótesis fue que la pérdida de peso inducida por la RYGB modula la respuesta de los leucocitos, componentes primordiales del sistema inmunitario. Para comprobar esta hipótesis, analizamos las distintas vías metabólicas que se ven alteradas por la obesidad y exploramos si el AT responde de forma diferencial a la metformina. Observamos que la pérdida de peso producida tras 1 año de RYGB se acompañaba de una mejora del perfil lipídico proaterogénico y de la sensibilidad a la insulina. Esto se acompañó de una disminución de las citocinas proinflamatorias y de la producción de especies reactivas de oxígeno de los leucocitos y de una mayor respuesta antioxidante, lo que dio lugar a una menor interacción entre los leucocitos y el endotelio y a marcadores de disfunción endotelial. Además, un análisis más detallado de los mecanismos moleculares en los leucocitos tras la pérdida de peso reveló una mejora de la respuesta homeostática como resultado de un aumento de la AMPK, de los marcadores de autofagia, de la biogénesis y de la dinámica mitocondrial, junto con una disminución de las citoquinas proinflamatorias, de los marcadores de inflamación y del estrés del ER. En conjunto, estos resultados ayudan a arrojar luz sobre los mecanismos que subyacen al efecto protector de la pérdida de peso en el control metabólico y la homeostasis celular en la obesidad. Además, mediante un estudio transversal, observamos que los pacientes con obesidad y T2D tratados con metformina presentan una mejora del perfil inflamatorio y oxidativo con respecto a los sujetos con obesidad metabólicamente sana (MHO). Esta mejora parece estar modulada por cambios en la activación del complejo del inflamasoma y la autofagia en el AT visceral, lo que sugiere -a pesar de la creencia común- que los sujetos MHO no están tan protegidos cardiometabólicamente como se espera. Por lo tanto, se sugiere que estudios futuros presenten como objetivo determinar las dianas directas de la metformina responsables de mediar en estas respuestas. Obesity is a multifactorial and disabling disease characterized by metabolic overload in adipose tissue (AT), chronic low-grade inflammation, oxidative stress and endothelial dysfunction. Currently, the worldwide prevalence of obesity is increasing, with lifestyle having a significant influence on the resolution of this disease. In this context, there has been an increase in the demand for strategies to reverse comorbidities and to stop its increase. The Roux-en-Y gastric bypass (RYGB) procedure is an effective tool for weight loss and remission of the metabolic comorbidities of obesity, although the molecular mechanisms involving these improvements are unknown. Therefore, the main objective of the present PhD thesis was to determine how RYGB surgery modulates chronic low-grade inflammation, oxidative stress and endothelial dysfunction, by exploring its effect on the inflammasome complex, autophagy, mitochondrial dynamics and endoplasmic reticulum (ER) stress. The role of metformin, an alternative therapeutic approach to obesity and type 2 diabetes (T2D), was also addressed. Therefore, another aim of this study was to analyse the molecular mechanisms related to inflammation and autophagy in AT and the protective effect of metformin against metabolic alterations. Our hypothesis was that RYGB-induced weight loss modulates the response of leukocytes, primordial components of the immune system. To test this hypothesis, we analysed the various metabolic pathways that are altered by obesity and explored whether AT responds differentially to metformin. We observed that the weight loss produced after 1 year of RYGB was accompanied by an improvement in proatherogenic lipid profile and insulin sensitivity. This was accompanied by a decrease in proinflammatory cytokines and leukocyte reactive oxygen species production and an enhanced antioxidant response, resulting in less interaction between leukocytes and both the endothelium and markers of endothelial dysfunction. In addition, further analysis of molecular mechanisms in leukocytes after weight loss revealed an improvement in the homeostatic response as a result of an increase in AMPK, markers of autophagy, biogenesis and mitochondrial dynamics, along with a decrease in proinflammatory cytokines, markers of inflammation and ER stress. Considered together, these results help to shed light on the mechanisms underlying the protective effect of weight loss on metabolic control and cellular homeostasis in obesity. Moreover, through a cross-sectional study, we reported that obese T2D patients treated with metformin exhibit improved inflammatory and oxidative profile with respect to metabolically healthy obesity (MHO) subjects. This improvement seems to be modulated by changes in the activation of the inflammasome complex and autophagy in VAT, suggesting – despite common belief – that MHO subjects are not as cardiometabolically protected as expected. Future mechanistic studies should aim to determine the direct targets of metformin responsible for mediating these responses.

El diagnóstico del tumor vesical requiere en muchos de los casos de un procedimiento invasivo. Los miARNs son un tipo de ARN no codificante que poseen la capacidad de regular la expresión génica por diversos mecanismos. Investigaciones recientes han permitido conocer los perfiles de expresión global de los miARNs en líneas celulares, en tejidos de cáncer de vejiga, sangre y orina, permitiendo demostrar su utilidad en el diagnóstico no invasivo, pronóstico y respuesta al tratamiento de esta enfermedad. Objetivos: Nuestro objetivo es demostrar la utilidad diagnóstica y pronóstica de los miARNs en suero y orina para el diagnóstico de neoplasia vesical. Material y método: Estudio de casos y controles prospectivo. En el grupo control se seleccionaron pacientes en seguimiento en las consultas de urología sin enfermedad oncológica, infecciosa ni inflamatoria. El grupo de casos eran pacientes diagnosticados de tumor vesical pendiente de confirmación mediante RTU, sin otra patología oncológica. Se tomó una muestra de orina por micción espontánea y una muestra de sangre en el momento de la canalización de la vía periférica previamente al procedimiento quirúrgico. Las muestras fueron remitidas al laboratorio donde se llevó a cabo la extracción de miARN de las mismas, el almacenamiento y posteriormente la ampliación de los miARN mediente RT-PCR. Las variables estudiadas fueron la edad, diabetes mellitus, hipertensión, dislipemia, hábito tabáquico y los miRNA 200b (103), 200b (191), 33(103), 33(191), 92(103), 92(191) en suero y 187, 142 y 140 en orina. Resultados: Se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas en el análisis univariante con el miARN 200b en suero para distinguir entre casos y controles. Se obtuvieron diferencias significativas entre los grupos con tumor vesical músculo-invasivo y no músculo-invasivo para los miARNs en orina 187, 142 y 140. Conclusiones: No hemos obtenido un grupo de miARNs que nos de un valor diagnóstico y pronóstico para el tumor vesical, pero si hemos encontrado algunos hallazgos que podrían ser de utilidad en investigaciones futuras.

El cáncer pulmonar es la segunda neoplasia con mayor incidencia y la que presenta mayor mortalidad a nivel mundial. El cáncer pulmonar no microcítico (CPNM) representa el 85% de todos los tumores pulmonares, siendo el adenocarcinoma el subtipo más común. Se han diseñado inhibidores de tirosina quinasa (ITQs) contra las formas EGFR mutantes, uno de los oncogenes más frecuentemente mutados en el CPNM. Desafortunadamente, la mayoría de tumores adquieren resistencia a los ITQs a partir de los 9-15 meses. Se han identificado múltiples mecanismos de resistencia, como mutaciones secundarias o la transición epitelio-mesenquimal (EMT), entre otros. Sin embargo, aún existen entre un 40-50% de tumores que adquieren resistencia a los ITQs de tercera generación por mecanismos desconocidos. El microambiente tumoral contribuye a la adquisición de resistencia a ITQs a través de procesos como la hipoxia tumoral, un rasgo común de los tumores sólidos que favorece la EMT. Debido a la hipoxia y a su creciente necesidad de sustento, los tumores poseen un entorno proangiogénico. La endotelina 1 (EDN1) es un factor proangiogénico y vasoconstrictor que se ha relacionado con la mayoría de los procesos fisiopatológicos tumorales. En este trabajo se han empleado líneas celulares y modelos animales para reproducir el CPNM EGFR mutante resistente a ITQs y estudiar mediante distintas técnicas de biología molecular la relación de la oxigenación tumoral con la secreción de EDN1 y la eficacia de la hiperoxia normobárica como tratamiento frente al adenocarcinoma de pulmón resistente a ITQs. Los resultados indican que los modelos celulares de CPNM EGFR mutantes desarrollan resistencia a los ITQs a través de la EMT. La proliferación de las células resistentes se ralentiza in vivo, pero no in vitro. Además, la sobrexpresión de EDN1 aumenta la resistencia a gefitinib in vivo, pero no in vitro. El TGFβ1, los ITQs y la hipoxia aumentan la secreción de EDN1 in vitro y durante la EMT. Al reoxigenar los cultivos celulares disminuye la secreción de EDN1 y al someterlos a hiperoxia se observa un efecto citotóxico directo. En los modelos animales, hemos observado que los tumores tratados con ITQs incrementan los niveles de EDN1 que disminuye la perfusión sanguínea, la concentración intratumoral de gefitinib e induce un microambiente hipóxico. Al revertir la hipoxia con oxigenoterapia, la secreción de EDN1 disminuye y la concentración intratumoral de gefitinib aumenta. En resumen, identificamos y describimos la sobrexpresión de EDN1 como un nuevo mecanismo de resistencia a los ITQs de EGFR. Concluimos que la hiperoxia tiene un efecto antitumoral, disminuye la hipoxia del microambiente tumoral, reduce la expresión y secreción de EDN1, aumenta la perfusión tumoral y la disponibilidad intratumoral del fármaco gefitinib in vivo. En base a ello, proponemos la combinación de hiperoxia e ITQs de EGFR como un tratamiento eficaz frente al CPNM EGFR mutante en la práctica clínica.

En las sociedades donde las personas mayores son un grupo demográfico mayoritario, mejorar su calidad de vida es una prioridad. Por tanto, la búsqueda de estrategias para retrasar los cambios degenerativos asociados al envejecimiento y la fragilidad son especialmente interesantes. Varias investigaciones muestran que los factores liberados por las células madre son responsables de su potencial regenerativo. Las vesículas extracelulares (VEs) son pequeñas vesículas recubiertas de una capa lipídica liberadas por múltiples tipos celulares que contienen proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y metabolitos. Comparadas con las células madre, las VEs son más estables, sin riesgo de aneuploidía y presentan menor posibilidad de rechazo. El principal objetivo de esta tesis fue estudiar el papel de las VEs derivadas de células madre de tejido adiposo (CMTAs) jóvenes en varios parámetros afectados por el envejecimiento en ratones. Para ello se aislaron CMTAs del tejido adiposo inguinal de ratones jóvenes (C57BL/6J, 4-6 meses) y posteriormente VEs del medio de cultivo de estas células mediante ultracentrifugación diferencial, para caracterizar las células y sus VEs se utilizó la citometría de flujo y el marcaje con oro en microscopía electrónica. Las VEs fueron inyectadas en la vena de la cola de ratones envejecidos (C57BL/6J, 20-24 meses) y se evaluó la función física, renal y la regeneración del pelaje antes y después del tratamiento. Como control se utilizaron ratones de la misma edad tratados con PBS (vehículo). 30 días después del tratamiento se obtuvo el tejido renal y muscular de los animales y se estudió la estructura histológica y los marcadores moleculares asociados al envejecimiento; estrés oxidativo, longitud y daño a los telómeros, senescencia celular, inflamación y el reloj epigenético. Por último, se comparó el contenido en microARNs de las VEs mediante un array. Se evidenció una mejoría en la función física de los animales tratados con VEs, de hecho, un 40% de los animales control eran frágiles, mientras que ninguno de los tratados con VEs lo era. Se observó una mejor función renal y mayor capacidad de regeneración del pelaje. Se observaron cambios histológicos en ambos tejidos compatibles con una mayor regeneración tisular en el grupo tratado con VEs. En cuanto a los marcadores moleculares, en el grupo tratado con VEs se encontró un menor estrés oxidativo e inflamación en el músculo, una menor senescencia celular en ambos tejidos y no se observaron cambios en los telómeros. La edad epigenética del tejido renal y hepático disminuyó con el tratamiento. Por último, los microARNs sobreexpresados en las VEs derivadas de CMTAs jóvenes regulan importantes procesos biológicos relacionados con la regeneración tisular y el envejecimiento. La principal conclusión de esta tesis es que las VEs derivadas de CMTAs jóvenes mejoran funciones fisiológicas y marcadores estructurales y moleculares asociados al envejecimiento en ratones envejecidos.

Introducción. El déficit de alfa-1 antitripsina (DAAT) es una condición genética rara que se caracteriza por unos niveles séricos bajos de la proteína (AAT), lo que puede provocar enfermedad pulmonar y/o hepática. Esta provocado por mutaciones en el gen SERPINA1 siendo M la variante alélica que da lugar a la proteína funcional, mientras que S y Z son las mutaciones más comunes asociadas a esta condición. Es considerado un trastorno proinflamatorio en el que los neutrófilos, aumentados en los pulmones de estos pacientes, juegan un papel crucial. La habilidad de los neutrófilos de dañar los tejidos adyacentes depende de su estado de activación. Una excesiva activación conduce a su degranulación, y por consiguiente liberación de proteasas, liberación de citoquinas proinflamatorias y producción de especies reactivas, lo que contribuye al daño tisular. Los neutrófilos, así como otras células del sistema inmunitario, ejercen su función en focos de infección y/o inflamación donde trabajan a concentraciones de oxígeno bajas. Objetivo. Evaluar el efecto de la hipoxia sobre la activación de los neutrófilos en pacientes con DAAT, así como determinar si la terapia de reposición reduce su activación. Metodología. Se aislaron neutrófilos a partir de sangre periférica de los sujetos de estudio mediante selección inmunomagnética negativa y se cultivaron, bajo condiciones de hipoxia (1% O2) o bajo normoxia (21% O2) durante 4 horas a 37°C. Tras ello, se estimularon y activaron con TNF-α (20 ng/ml, 30 min) y fMLP (100 nM, 10 min). Posteriormente, se determinó la viabilidad celular y parámetros de degranulación, producción y liberación de citoquinas y perfil oxidativo. Resultados. Los neutrófilos procedentes de niños ZZ asintomáticos, bajo condiciones de hipoxia, presentan una mayor degranulación (gránulos primarios, secundarios y terciarios), un incremento en la producción de ONOO-, H2O2, NO e IL-8, respecto a los neutrófilos MM. La expresión de catalasa se encuentra reducida en los niños ZZ asintomáticos lo que explicaría la acumulación de H2O2. Además, existe un daño oxidativo incrementado en los lípidos (ZZ) y en las proteínas (MZ, SZ y ZZ). Los neutrófilos de pacientes ZZ con EPOC, incubados en hipoxia, presentan un incremento en la liberación de los gránulos primarios (MPO) y mayor daño oxidativo en las proteínas. La hipoxia aumenta la liberación de los gránulos primarios (MPO), IL-8 y H2O2 en los neutrófilos de niños ZZ asintomáticos respecto a normoxia. Además, la hipoxia produce mayor efecto en la liberación de AAT en los pacientes con DAAT, tanto niños como adultos, que en los individuos sanos, lo cual sugiere un mecanismo de defensa frente al DAAT. Conclusiones. La hipoxia induce un fenotipo más agresivo en los neutrófilos de pacientes DAAT con un incremento en su habilidad para liberar los gránulos de proteínas, producción y liberación de citoquinas proinflamatorias y de especies reactivas, agravando el daño tisular en los pacientes con DAAT. Introduction. Alpha-1 antitrypsin deficiency (AATD) is a rare genetic condition characterized by low serum levels of the protein (AAT), which can lead to lung and/or liver disease. It is caused by mutations in the SERPINA1 gene, with M being the allelic variant that codifies the functional protein, while S and Z are the most common mutations associated with this condition. It is considered a proinflammatory disorder in which neutrophils, increased in the lungs of these patients, play a crucial role. The ability of neutrophils to damage adjacent tissues depends on their activation state. Excessive activation leads to its degranulation, and consequently release of proteases, proinflammatory cytokines, and the production of reactive species, which contributes to tissue damage. Neutrophils, as well as other cells of the immune system, exert their function in infection and/or inflammation foci where they work at low oxygen concentrations. Objective. To evaluate the effect of hypoxia on the activation of neutrophils in patients with AATD, as well as to determine if replacement therapy reduces their activation. Methodology. Neutrophils were isolated from the peripheral blood of the study subjects by negative immunomagnetic selection and cultured under hypoxic (1% O2) or normoxic (21% O2) conditions for 4 hours at 37°C. After that, they were stimulated and activated with TNF-α (20 ng/ml, 30 min) and fMLP (100 nM, 10 min). Subsequently, cell viability, degranulation, production and release of cytokines, and oxidative profile parameters were determined. Results. Neutrophils from asymptomatic ZZ children, under hypoxic conditions, show greater degranulation (primary, secondary and tertiary granules), and an increase in the production of ONOO-, H2O2, NO, and IL-8, compared to MM neutrophils. Catalase expression is reduced in asymptomatic ZZ children, which would explain the accumulation of H2O2 in these patients. In addition, there is an increase in oxidative damage in the lipids (ZZ) and proteins (MZ, SZ, and ZZ). Neutrophils from ZZ patients with COPD, incubated in hypoxia, show an increase in the release of primary granules (MPO) and greater oxidative damage in the proteins. Hypoxia increases the release of primary granules (MPO), IL-8, and H2O2 in neutrophils of asymptomatic ZZ children relative to normoxia. In addition, hypoxia has a greater effect on AAT release in AATD patients, both children, and adults, than in healthy individuals, suggesting a defense mechanism against AATD. Conclusions. Hypoxia induces a more aggressive phenotype in neutrophils from AATD patients with an increase in their ability to release protein granules, production, and release of proinflammatory cytokines and reactive species, aggravating tissue damage in AATD patients.

Las nanopartículas de óxido de cerio (CeO2NPs) podrían tener un futuro prometedor como nanomaterial de uso médico debido a su poder antioxidante y su alta biocompatibilidad, entre otras características. Sin embargo, sus efectos en el sistema cardiovascular están poco estudiados y es por ello que, en la presente tesis nos centramos en el estudio de las CeO2NPs a nivel vascular, utilizando segmentos de vena safena interna humana. Nuestra hipótesis es que las CeO2NPs podrían tener propiedades antioxidantes a nivel vascular, especialmente por actuar como miméticas de la superóxido dismutasa (SOD) y disminuir los niveles del anión superóxido (.O2 ). Esto aumentaría la biodisponibilidad de óxido nítrico (NO) y revertiría la disfunción endotelial ocasionada por el aumento de estrés oxidativo asociado con las enfermedades cardiovasculares. El objetivo general de la presente tesis fue estudiar el efecto de las CeO2NPs sobre la reactividad vascular (en respuesta a diferentes agonistas relajantes y contráctiles) y sobre la expresión de diferentes proteínas relacionadas con la homeostasis vascular. Para ello se montaron los segmentos venosos en un sistema de baño de órganos para el registro de tensión isométrica, o se procesaron para cuantificar la expresión proteica mediante la técnica de Western-Blot. Nuestros resultados mostraron que las CeO2NPs aumentan la respuesta relajante al nitroprusiato sódico, probablemente por mimetizar la SOD, disminuyendo así los niveles de .O2- y aumentando la biodisponibilidad de NO. En consonancia, las CeO2NPs mostraron capacidad antioxidante a nivel vascular por aumentar la expresión proteica de ambas isoformas de la SOD y disminuir la NADPH oxidasa 4 (NOX4). Sin embargo, las CeO2NPs disminuyeron la respuesta vasodilatadora a la bradiquinina, sin afectar a la relajación inducida por acetilcolina ni la vía eNOS-NO-GCs. Por último, nuestros resultados mostraron que las CeO2NPs no modifican la contracción inducida por la noradrenalina, el análogo del tromboxano A2 (U46619) ni la endotelina 1. No obstante, sí que disminuyen la respuesta contráctil a la angiotensina II (Ang II), efecto que no se atribuye a la capacidad para modificar la expresión de los receptores ATR1 y ATR2, pero que sí podría estar relacionado con un aumento de la expresión proteica la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) inducido por las CeO2NPs.

Introducción: La nutrición es especialmente importante en pacientes quemados por su catabolismo acelerado, con necesidad de grandes aportes calórico-proteicos. De estos aportes dependen tanto la curación de las heridas como el prendimiento de injertos. El objetivo principal de este estudio fue determinar la asociación entre los niveles séricos de prealbúmina, marcador subrogado de estado nutricional, y la probabilidad de prendimiento de autoinjertos de piel parcial en pacientes quemados. También se evaluaron diversos parámetros nutricionales antes y después de la implantación de un protocolo de nutrición para pacientes ingresados dentro del marco ERAS (Enhanced Recovery After Surgery). Metodología: Estudio observacional prospectivo en el que se midió diversos parámetros nutricionales (prealbúmina, albúmina, transferrina, ferritina, proteínas totales, colesteroles, triglicéridos, filtrado glomerular, creatinina y urea) peri-quirúrgicamente y durante dos meses en pacientes quemados tratados quirúrgicamente. Para cada quemadura analizada, se registró el porcentaje de autoinjerto de piel prendido en las primeras cinco curas, y el tiempo hasta la curación completa. Resultados: La prealbúmina fue un predictor independiente de la probabilidad de prendimiento del 100% en la quinta cura, tras ajustar por factores de confusión. Por cada 1 mg/dL de prealbúmina adicional en la analítica peri-quirúrgica, esta probabilidad aumentó un 8% en dicho análisis multivariante (p=0,028). Adicionalmente, por cada 1 mg/dL de prealbúmina adicional en la analítica peri-quirúrgica, el porcentaje de prendimiento aumentó entre un 0,64% y un 0,82% (p

Introducción. El déficit de alfa-1 antitripsina (DAAT) es una enfermedad rara caracterizada por niveles bajos en sangre de una proteína denominada alfa-1 antitripsina (AAT), principal enzima antiproteasa del suero. El DAAT está provocado por mutaciones en el gen SERPINA1, que codifica para la AAT. Las dos mutaciones más frecuentes se denominan Pi*Z y Pi*S, provocando la primera una sintomatología más grave. A la variante normal se le denomina Pi*M. CRISPR/Cas9 es una herramienta de edición génica adaptada del sistema de inmunidad adquirida presente en bacterias y arqueas que consiste en una endonucleasa, Cas9, guiada por una molécula de RNA simple (sgRNA), complementaria al gen diana. Objetivos. Generar una línea celular estable mediante inmortalización de células procedentes de pacientes con DAAT. Editar la mutación Pi*Z del gen SERPINA1 primero en líneas celulares establecidas y finalmente, en la línea celular de DAAT generada. Metodología. Para la inmortalización de líneas celulares se realizaron tanto infecciones virales como transfecciones no virales para inducir la expresión del antígeno T grande de SV40, la subunidad catalítica de la telomerasa humana o la quinasa 4 dependiente de ciclina en monocitos primarios. Finalmente, se procedió a la inmortalización de linfocitos B de pacientes mediante infección con el virus de Epstein-Barr. Las líneas celulares obtenidas se caracterizaron mediante el ensayo de expresión génica del gen SERPINA1 y la determinación del número de copias del gen por qPCR, el genotipado mediante secuenciación Sanger y la detección de la proteína AAT en los lisados celulares mediante Western Blot. Para la edición de la mutación Pi*Z se diseñaron tres sgRNA que fueron testadas inicialmente en la línea celular HEK293. Posteriormente, se transfectaron monocitos primarios y macrófagos derivados de monocitos y, por último, los linfocitos B inmortalizados. Para las transfecciones se utilizaron ribonucleoproteínas formadas por la Cas9 y las sgRNA que se introdujeron en las células mediante la formación de lipoplejos y electroporación. Para validar las sgRNA se utilizó el ensayo de la endonucleasa T7. Resultados. La inmortalización de monocitos primarios no fue posible con ninguno de los métodos probados, aunque se producían alteraciones del cultivo, no se mantuvo la proliferación del mismo durante largos períodos de tiempo. Sin embargo, la inmortalización de linfocitos B dio lugar a cuatro líneas de genotipo: Pi*MM, Pi*MS, Pi*SS y Pi*MZ. La expresión de AAT en estas líneas se pudo detectar tanto a nivel de transcripción mediante qPCR como de síntesis proteica mediante Western Blot. Se comprobó que el porceso de transformación no había alterano ni el número de copias del gen ni el genotipo de los donantes. El ensayo de la endonucleasa T7 permitió detectar que las sgRNA diseñadas fueron capaces de editar de forma no homóloga la mutación Pi*Z tanto en la línea HEK293 como en monocitos primarios y macrófagos derivados de monocitos y en los linfocitos B inmortalizados. Conclusiones. Se han generado cuatro líneas de linfocitos B con diferentes fenotipos del DAAT y se ha descrito por primera vez que estas células son productoras de AAT. El sistema CRISPR/Cas9 con las sgRNA diseñadas ha sido capaz de editar de forma no homóloga la mutación Pi*Z del gen SERPINA1 tanto en la línea celular HEK293, como en monocitos primarios, macrófagos derivados de monocitos y linfocitos B inmortalizados. Introduction. Alpha-1 antitrypsin deficiency (AATD) is a rare disease characterized by diminished plasmatic levels of the protein called alpha-1 antitrypsin (AAT), the main circulating antiprotease enzyme. It is related to respiratory and hepatic symptoms. AATD is caused by mutations in the SERPINA1 gene, located on the 14th chromosome, which codifies for AAT protein. The most frequent mutations are single nucleotide polymorphisms, they are named Pi*Z and Pi*S. Pi*Z mutation is related to more severe symptomatology than the Pi*S mutation. The functional variant of the gene is called Pi*M. CRISPR/Cas9 is a genome editing tool developed from an immune system of archaea and bacteria. It is based on an endonuclease enzyme, Cas9, and a single guide RNA molecule (sgRNA), complementary to the target gene. Objectives. Two main objectives have been established. To generate a cellular stable line through immortalization of AATD patients’ cells (1). To edit Pi*Z SERPINA1 gene mutation by CRISPR/Cas9 gene editing tool, first in cell lines and then, in the generated AATD cell line (2). Methods. In order to immortalize a primary AATD cell line, both viral and non-viral transfection methods were used trying to induce in human primary monocytes the expression of SV40 large T antigen, human telomerase reverse transcriptase (hTERT), and cyclin-dependent kinase 4 (CDK4). Finally, B-cells transformation with Epstein-Barr virus was performed with peripheral blood samples from AATD patients. Obtained cell lines were characterized regarding SERPINA1 gene expression and copy number assay by quantitative PCR, genotyping by Sanger sequencing, and AAT production by denaturing western blotting. Aiming to edit Pi*Z mutation, three sgRNA were designed and synthesized in vitro. Lipofectamine and nucleofection were used as non-viral vectors to introduce CRISPR/Cas9 system. Different cell lines were transfected with ribonucleoprotein complexes, formed by the Cas9 endonuclease and the sgRNA. First of all, the sgRNAs were tested in the Hek293 cell line, afterward, in primary monocytes, monocyte-derived macrophages, and finally in the generated immortalized B-cell lines. To validate the designed sgRNA, the T7 endonuclease assay was performed after 72-hour incubation. Results. None of the different methods used to immortalize human primary monocytes were successful. Despite the fact that culture alterations were detected, proliferation was not maintained for long periods of time. However, B-cell immortalization results in four different stable cell lines with the following genotypes: Pi*MM, Pi*MS, Pi*SS y Pi*MZ. AAT expression in these cell lines was detected both at mRNA and protein levels. It was confirmed that the transformation process did not affect the gene copy number and donor genotype. T7 endonuclease assay allowed to detect SERPINA1 gene non-homologous edition using the designed sgRNA in the different tested cell lines: Hek293, primary monocytes, monocyte-derived macrophages and immortalized B-cells. Conclusion. Four B-cell lines were generated representing four different AATD phenotypes. It was described, for the first time, that these cells are also capable of expressing AAT. CRISPR/Cas9 system and designed sgRNA were able to edit following the non-homologous end-joining pathway the Pi*Z mutation of SERPINA1 gene in all tested cell lines: Hek293, primary monocytes, monocyte-derived macrophages and immortalized B-cells.

Leonard Hayflick definió el envejecimiento como un proceso que ocurre en todos los miembros de una misma especie, en todas las especies y, en el ser humano, se caracteriza principalmente por una pérdida de la capacidad intrínseca, así como por el deterioro de la capacidad funcional y los sistemas fisiológicos. Este deterioro nos lleva a reducir nuestra capacidad de respuesta y adaptación a distintos tipos de estreses, ya sean a nivel celular o sobre la suficiencia para realizar actividades como levantarse de una silla. En las últimas décadas se ha podido observar como la mejora en la atención sociosanitaria, entre otros factores, nos ha llevado a aumentar drásticamente nuestra esperanza de vida. De hecho, ésta ha aumentado más durante la última mitad del s. XX que durante el resto de la historia de nuestra especie. Este escenario nos presenta un nuevo desafío puesto que los años que hemos ganado de vida, en muchos casos, no son de calidad. En este contexto, el síndrome geriátrico de la fragilidad aparece como uno de los mayores retos a tratar y una de las intervenciones que ha demostrado ser más efectiva es el ejercicio físico multicomponente. Son diversas las intervenciones que se han realizado. Sin embargo, existe una carencia de investigaciones fuera del contexto clínico para tratar de prevenir revertir la fragilidad en el adulto mayor. A raíz de un ensayo clínico previamente realizado por nuestro grupo de investigación (NCT02331459), en la presente tesis doctoral nos propusimos trasladar e implantar esta metodología fuera del entorno hospitalario (Real-Life). Utilizando los mismos criterios de inclusión, se recluta y realizan las evaluaciones geriátricas integrales a través de los servicios sociales de distintos municipios de la zona de Valencia, para luego desarrollar una intervención con ejercicio físico multicomponente durante seis meses. Este programa cuenta con una serie de modificaciones y adaptaciones, que se detallarán más adelante, respecto al protocolo desarrollado en el ensayo clínico. El objetivo de estos cambios se fundamenta en la intención de aumentar la adherencia para garantizar los estímulos suficientes de cada una de las capacidades físicas intervenidas. La intervención Real-Life demuestra ser efectiva reduciendo los criterios de fragilidad de Linda Fried, el riesgo y número de caídas y aumentando la capacidad para realizar las actividades básicas y complementarias de la vida diaria en los adultos mayores tras los seis meses de intervención. Así mismo, hemos conseguido mejorar la composición corporal, aumentar la fuerza de prensión palmar y fomentar una mejor autopercepción de la calidad de vida y del apoyo social. También hemos visto reducidos los criterios de depresión. En comparación con el ensayo clínico previo, hemos conseguido aumentar en gran medida la adherencia, hecho que ha permitido obtener resultados más favorables en los parámetros anteriormente mencionados. Por último, se ha observado que, para estos mismos parámetros y con los mismos criterios de inclusión, existen diferencias en función del sexo. La fragilidad es un síndrome geriátrico de mayor prevalencia entre las mujeres que entre los hombres, lo cual influye en la calidad de vida y la independencia de las adultas mayores. La adherencia a la intervención Real-Life también ha derivado en mejores resultados para los parámetros estudiados en las mujeres de este grupo, en comparación con las que participaron en el ensayo clínico previo.

Introducción La práctica de ejercicio físico y actividades deportivas es cada vez más habitual en la población general. El ejercicio físico y, de manera más específica el entrenamiento de la fuerza, presenta numerosos beneficios para la salud y el rendimiento de las personas. En pro de maximizar estos beneficios, se hace necesario evaluar las diferentes adaptaciones fisiológicas y de rendimiento que se pueden dar en base a las características metodológicas de la actividad o ejercicio realizados. Tal como se muestra en el Capítulo 1, existen diferentes variables de programación del entrenamiento (por ejemplo, selección de ejercicio, intensidad, volumen, carácter del esfuerzo y material empleado) que conllevarán diferentes respuestas fisiológicas y de rendimiento. Por tanto, es necesario analizar una variedad de metodologías. En este sentido, la sentadilla es uno de los ejercicios más seleccionados para rutinas de entrenamiento de la fuerza debido a su similitud con un amplio rango de actividades atléticas y del día a día. Las diferentes variantes de la sentadilla presentan diferentes características biomecánicas y diferentes efectos neuromusculares agudos. En consecuencia, el estudio de la sentadilla y sus diferentes variantes es necesario para comprender en profundidad el movimiento e individualizar los programas de entrenamiento de la fuerza. En cuanto al material, las bandas elásticas están incrementando en popularidad para el entrenamiento de la fuerza, tanto con objetivos de salud, como de rendimiento. Las bandas elásticas aportan una mayor resistencia (más kilogramos) cuando su longitud es mayor y menos kilogramos cuando su longitud es menor. Por tanto, desde una perspectiva de rendimiento en el ejercicio de la sentadilla, las bandas elásticas podrían proporcionar una resistencia óptima a lo largo del rango de movimiento. En este sentido, para realizar sentadillas, las bandas elásticas se suelen cargar a la barra con el peso correspondiente en la posición de bipedestación del participante, como se suele hacer cuando se utilizan discos para cargar la barra. Por tanto, los kilogramos que el participante está utilizando en bipedestación serían los mismos independientemente de que se usen bandas elásticas o discos. Sin embargo, durante todo el rango de movimiento por debajo de este punto, las bandas elásticas estarían aportando menos peso que los discos y, por tanto, la comparación en cuanto a resistencia movilizada quedaría descompensada. Dentro del rango de movimiento de algunos ejercicios de fuerza, como la sentadilla, existe la llamada zona de estancamiento (sticking region). La zona de estancamiento se define como la parte del rango de movimiento en la que tiene lugar un aumento desproporcionado de la dificultad para realizar el movimiento, debido a factores biomecánicos. Con esto en mente, surge la cuestión de si las bandas elásticas pudieran ser cargadas a la barra con los kilogramos correspondientes justo por encima del punto de estancamiento (sticking point, punto en el que se termina la zona de estancamiento) para obtener menos peso en las partes del rango de movimiento que son biomecánicamente desventajosas y más peso en las partes que son biomecánicamente eficientes. Esta aplicación de las bandas elásticas podría resultar en más peso durante más grados de movimiento y menos peso durante menos grados de movimiento en comparación con el uso de discos. Por tanto, esta manera de aplicar las bandas elásticas podría ser una estrategia útil para superar el punto de estancamiento (sticking point) en el ejercicio de sentadilla y maximizar el rendimiento. Esta nueva metodología de aplicar las bandas elásticas podría permitir a los participantes realizar más repeticiones y obtener más peso del que serían capaces de movilizar utilizando discos para cargar la barra. Ningún estudio previo ha evaluado los efectos de cargar las bandas elásticas a la barra con el peso pertinentes por encima del punto de estancamiento en la sentadilla. Enfocándonos en salud, el entrenamiento de la fuerza ha mostrado tener influencia en parámetros oculares y cardiovasculares, tanto de manera aguda como crónica. Esta influencia en parámetros cardiovasculares (por ejemplo, presión arterial sistólica y diastólica, presión arterial media, presión del pulso, etcétera) y oculares (por ejemplo, presión intraocular y presión de perfusión ocular) difiere dependiendo de las variables de programación del entrenamiento, como, por ejemplo, el peso utilizado, el carácter del esfuerzo y el material empleado. En este sentido, algunas de estas adaptaciones agudas cardiovasculares y oculares, en lugar de beneficiosas, podrían ser peligrosas para el desarrollo y progresión de enfermedades. Entre ellas, aparecen enfermedades cardiovasculares asociadas con la presión arterial elevada, como puede ser la hipertensión, factor principal modificable para enfermedad cardiovascular y muerte prematura. También, aumentos drásticos o fluctuaciones de presión intraocular y/o disminuciones de presión de perfusión ocular podrían suponer un riesgo para el desarrollo de enfermedades oculares, como lo es el glaucoma primario de ángulo abierto, segunda causa de ceguera irreversible en todo el mundo. El comportamiento de parámetros cardiovasculares con ejercicio ha sido estudiado en mayor medida con resultados homogéneos. Por lo contrario, existe cierta controversia en cuanto al comportamiento de la presión intraocular con ciertas metodologías de ejercicio físico, tales como el entrenamiento de la fuerza, incluyendo el ejercicio de sentadilla. Mientras que algunos estudios aseguran aumentos de presión intraocular y reducciones de presión de perfusión ocular con el entrenamiento de fuerza, otras investigaciones detectaron disminuciones en estos parámetros. Cabe destacar, que en las fases más profundas de la sentadilla se dan aumentos de presión intraabdominal y que esto, podría dar lugar a aumentos de la presión intracraneal y presión intraocular. Por tanto, teniendo en mente que las bandas elásticas modifican los kilogramos utilizados a lo largo del rango de movimiento, surge la pregunta de si utilizar bandas elásticas para cargar la barra en sentadillas podría producir diferentes respuestas agudas oculares y/o cardiovasculares en comparación con los dispositivos de entrenamiento tradicionales (en particular, discos). Además, numerosos estudios han mostrado que el sexo, la edad, el espesor corneal central y los niveles basales de presión intraocular, entre otros parámetros, pueden estar correlacionados con los niveles de presión intraocular y sus fluctuaciones. Por consiguiente, es crucial conocer el rol moderador que variables sociodemográficas y fisiológicas pueden tener en las variaciones individuales de presión intraocular debido al ejercicio. No se han encontrado estudios previos analizando el potencial predictor del sexo, la edad, los niveles de reposo de presión intraocular y de espesor corneal central en las variaciones de presión intraocular tras la práctica de ejercicio físico. Objetivos Tomando en consideración lo mencionado en la introducción, el compendio de artículos que constituye la presente tesis doctoral tiene el objetivo de evaluar el uso potencial de las bandas elásticas para cargar la barra en sentadillas y su relación con parámetros de salud ocular y cardiovascular, esfuerzo subjetivo y rendimiento. Además, se diseñaron dos estudios preliminares para identificar predictores potenciales de las variaciones de presión intraocular tras el ejercicio y para seleccionar la variación de sentadilla más apropiada para el presente proyecto, respectivamente. A continuación, se muestra el diseño, los principales resultados y las conclusiones de cada uno de los cuatro artículos dentro del compendio, justificativos de la aportación original de esta tesis. Primer estudio: El potencial del sexo, la edad y los niveles basales de presión intraocular para predecir las variaciones de presión intraocular con ejercicio El primer artículo del compendio está incluido en el Capítulo 2. Este tenía el objetivo de identificar y profundizar en parámetros mediadores en los cambios de presión intraocular después del ejercicio. Para este propósito, una regresión lineal múltiple se llevó a cabo con la edad, sexo, niveles basales de presión intraocular y niveles basales de espesor corneal central como potenciales predictores de las variaciones de presión intraocular tras una sesión de noventa minutos de gimnasia acrobática. Cuarenta y nueve gimnastas, con experiencia de al menos seis meses y con buena salud ocular (63.27% mujeres, edad: 27.67 ± 7.10 años, rango: 18 - 40 años) accedieron a participar en el estudio de manera voluntaria. Se llevaron a cabo dos sesiones, una de familiarización para confirmar la validez de los participantes para el estudio según los criterios de inclusión, y una sesión experimental para llevar a cabo los procedimientos de investigación. En la sesión experimental se tomaron medidas de las variables seleccionadas para el estudio, antes de la sesión de entrenamiento y entre 5 y 10 minutos al terminar el ejercicio. La sesión tenía una duración de 90 minutos. Para los análisis estadísticos, los participantes fueron divididos según sexo y edad, en adultos jóvenes (≤ 25 años) y adultos (> 25 años). De la misma manera, se dividió a los sujetos en tres grupos en función de los niveles de presión intraocular de reposo (bajos, medios y altos). Para ello, los niveles de presión intraocular obtenidos antes del ejercicio se dividieron en terciles (con límites en 14 y 17 mmHg). Un análisis de la varianza (ANOVA) mixto factorial evaluó diferencias entre grupos y entre valores antes y después del ejercicio. Se determinaron el sexo, la edad y los niveles basales de presión intraocular como factores inter- sujeto y el ejercicio como factor intra-sujeto. Además, se llevó a cabo una regresión lineal múltiple para potencialmente predecir las variaciones de presión intraocular por efecto del ejercicio físico. El nivel de significancia fue uniformemente establecido en p < 0.05. Los resultados mostraron que los niveles de presión intraocular obtenidos tras la sesión de entrenamiento eran significativamente menores que los niveles medidos antes del ejercicio (p < 0.001, tamaño del efecto: 0.73) y que el espesor corneal central no se modificó de manera significativa (p = 0.229). Cabe destacar que los niveles de reposo de presión intraocular (p = 0.007) y el sexo (p = 0.001) aparecieron como predictores significativos de las variaciones de presión intraocular debidas al ejercicio. De manera más específica, los hombres, los sujetos mayores de 25 años y los sujetos con niveles de presión intraocular de reposo por encima de 14 mmHg obtuvieron disminuciones significativas de presión intraocular tras el ejercicio (p ≤ 0.001 en todos los casos, tamaños del efecto entre 0.57 y 1.02). En cambio, las mujeres, los sujetos menores de 25 años y los sujetos con niveles de presión intraocular de reposo iguales o por debajo de 14 mmHg no mostraron variaciones significativas de presión intraocular tras el ejercicio (valores de significancia [p] entre 0.114 y 0.312). Se observaron diferencias significativas en las variaciones de presión intraocular entre los sujetos con presión intraocular de reposo por debajo o iguales a 14 mmHg y los sujetos con presión intraocular igual o mayor de 17 mmHg (p = 0.008, tamaño del efecto: 0.96). Estos resultados confirman que el comportamiento de la presión intraocular tras el ejercicio es multifactorial. Los profesionales que trabajen con personas con riesgo de padecer presión intraocular elevada deberían tener en cuenta diferencias individuales como el sexo, la edad y los niveles basales de presión intraocular para programar entrenamientos acordes a la situación de cada sujeto. Segundo estudio: Caracterización de las variantes de sentadilla más comunes El segundo artículo del compendio, incluido en el Capítulo 3, recoge una caracterización de la información biomecánica, kinesiológica, y mioeléctrica de las variaciones de sentadilla más comunes (es decir, sentadilla trasera barra alta, sentadilla trasera barra baja, sentadilla frontal, sentadilla con barra por encima de la cabeza y sentadilla guiada). El objetivo de este estudio fue obtener información de la literatura científica para seleccionar la variante de sentadilla más adecuada y ser esta incluida como referencia en las siguientes investigaciones de la presente tesis doctoral. Para lograrlo, se llevó a cabo una revisión sistemática en cuatro bases de datos y diferentes búsquedas manuales. Tras pasar los filtros basados en los criterios de selección de artículos se recopilaron 30 artículos. La calidad de los estudios incluidos se evaluó mediante la escala PEDro, obteniendo todos ellos una puntuación de entre 5 y 6 sobre un máximo de 6 puntos. Las variantes de sentadillas escogidas fueron la sentadilla trasera con barra alta (26 artículos la analizaban), sentadilla trasera con barra baja (un artículo la analizaba), sentadilla frontal (cinco artículos la analizaban), sentadilla con barra por encima de la cabeza (dos artículos la analizaban) y sentadilla trasera con barra alta realizada en máquina Smith (dos artículos la analizaban). Se incluyeron el glúteo mayor, glúteo medio, aductores, vasto lateral, vasto medial, recto femoral, bíceps femoral, semitendinoso, tibial anterior, gastrocnemio y sóleo, como musculatura que actúa sobre las caderas, rodillas y tobillos. La ejecución de la sentadilla, común a todas las variantes, inicia con el participante en posición de bipedestación. Se realiza una flexión sinergista de cadera, rodilla y tobillo en el descenso, seguida de una extensión en el ascenso, para terminar con el participante en la posición inicial. Los resultados de la presente revisión, a nivel general, mostraron que la sentadilla es un ejercicio en el que se activa predominantemente la musculatura extensora de la rodilla, es decir principalmente los músculos del cuádriceps (vasto lateral, vasto medial, recto femoral y vasto intermedio). A pesar de esto anterior, modificaciones en la posición de la barra pueden aumentar la actividad de la musculatura extensora de la cadera, como por ejemplo en la sentadilla trasera con barra baja. La mayoría de las investigaciones examinadas (26 artículos) analizaron la sentadilla trasera con barra alta, con resultados relativamente homogéneos en cuanto a los patrones de activación. La carga fue identificada como el mayor determinante de los niveles de activación muscular. Además, se observó que diferentes modificaciones técnicas (profundidad del movimiento, separación de los pies, rotación de las caderas, orientación de las puntas de los pies) conllevaban diferentes patrones de activación muscular. Tras todos los análisis realizados, la sentadilla trasera con barra alta y realizada en máquina Smith fue seleccionada para ser incluida en la metodología de los otros dos estudios sobre sentadillas de esta tesis. Respecto a la ejecución técnica, se escogió una profundidad de sentadilla hasta la paralela del fémur con el suelo y posiciones neutras en cuanto a separación de pies, rotación de caderas y orientación de las puntas de los pies. Tercer estudio: El potencial de las bandas elásticas para maximizar el rendimiento en sentadillas El tercer artículo del compendio, presentado en el Capítulo 3, pone a prueba un nuevo método de cargar la barra con bandas elásticas en sentadillas. El peso pertinente que cada participante debía movilizar en función del porcentaje de la repetición máxima fue añadido a la barra utilizando exclusivamente bandas elásticas en la posición de bipedestación o justo por encima del punto de estancamiento (sticking point) de la rodilla de cada participante. Veinte hombres sanos y físicamente activos, con al menos un año de experiencia en el entrenamiento de la fuerza (edad: 25.50 ± 5.26 años; índice de masa corporal: 24.09 ± 2.06 kg/m2; grasa corporal: 10.16 ± 2.23%; kilogramos para una repetición máxima en sentadilla: 127.10 ± 24.10 kg; ratio kilogramos para una repetición máxima por peso corporal [fuerza relativa]: 1.70 ± 0.36), participaron en tres sesiones: dos para evaluación y familiarización y una experimental. En la sesión experimental, se realizaron seis series (tres utilizando exclusivamente discos para cargar la barra y tres utilizando sólo bandas elásticas) de sentadillas en orden aleatorio. Cuatro series (dos con discos y dos bandas elásticas) fueron realizadas hasta el fallo muscular y dos series (una con discos y una con bandas elásticas) consistieron en esfuerzos submáximos. La altura a la que se encontraba la barra en el punto de estancamiento de cada participante se marcó tras medir el punto mediante goniometría en la articulación de la rodilla. En la condición correspondiente, las bandas elásticas se aplicaron con el peso pertinente justo por encima de este punto. Inmediatamente al terminar cada serie, se midieron los kilogramos utilizados en bipedestación, el número de repeticiones realizadas, frecuencia cardíaca, presión arterial y ratio de esfuerzo percibido. Se llevaron a cabo un análisis de la varianza de medidas repetidas de una vía con ajustes de Bonferroni y pruebas no paramétricas de Friedman y Wilcoxon para evaluar diferencias en las variables de estudio entre las distintas condiciones de sentadilla. El nivel de significancia fue uniformemente establecido en p < 0.05. Cuando el peso era equiparado entre discos y bandas elásticas en posición de bipedestación, las bandas elásticas permitieron realizar alrededor de ocho repeticiones más (p < 0.001; tamaño del efecto: 2.44) con los mismos kilogramos en posición de bipedestación (menos en fases más profundas), con respuestas de carga interna similares (presión arterial, ratio de esfuerzo percibido) en comparación con los discos. En cambio, cuando las bandas elásticas se aplicaron justo por encima del punto de estancamiento, estas permitieron realizar alrededor de tres repeticiones más (p = 0.001, tamaño del efecto: 1.27) con aproximadamente 25% más kilogramos (p = 0.001, tamaño del efecto: 1.15) en la posición de bipedestación (mismo peso en el punto de estancamiento y menos peso por debajo del mismo) y con respuestas similares de presión arterial y frecuencia cardíaca (p > 0.05). Estos resultados confirman que las bandas elásticas pueden ser un material óptimo para cargar la barra en entrenamientos de la fuerza en el ejercicio de sentadilla en hombres jóvenes entrenados. Además, sugieren que la aplicación justo por encima del punto de estancamiento podría ser una metodología útil para aumentar el rendimiento mediante la superación de la fase del movimiento más biomecánicamente desventajosa de la sentadilla, en la que se suele perder la técnica y tener lugar el fallo. Los hallazgos de este estudio permiten establecer la base para futuras investigaciones utilizando bandas elásticas para mejorar el rendimiento en el ejercicio físico. Entre otras futuras líneas de investigación, estudios de intervención a medio o largo plazo deberían evaluar el potencial del estímulo de entrenamiento proporcionado por aplicar las bandas elásticas justo por encima del punto de estancamiento en sentadilla y/o otros ejercicios para producir adaptaciones crónicas. También, sería interesante evaluar si se obtiene el mismo incremento en el peso y número de repeticiones cuando se añade un 25% más de la carga directamente en la posición de bipedestación en comparación con la metodología de cargar la barra justo por encima del punto de estancamiento. Cuarto estudio: Las bandas elásticas como material para provocar respuestas oculares y cardiovasculares conservadoras Basándose en los resultados de los Capítulos 2, 3 y 4, el cuarto y último artículo publicado en el compendio, descrito y desarrollado en el Capítulo 5, analizó las posibles respuestas oculares y cardiovasculares tras realizar sentadillas utilizando bandas elásticas para cargar la barra. Además, se evaluó si estas respuestas fisiológicas eran similares en comparación a las respuestas obtenidas al realizar sentadillas con discos. El objetivo principal de esta investigación fue examinar las respuestas oculares (presión intraocular, presión de perfusión ocular y espesor corneal central) y cardiovasculares (presión arterial media, presión del pulso y frecuencia cardíaca) producidas por realizar sentadillas con discos o bandas elásticas y comparar las respuestas tras un carácter del esfuerzo máximo y submáximo. Veinte hombres sanos y físicamente activos, con al menos un año de experiencia en el entrenamiento de la fuerza, participaron de forma voluntaria en el estudio (edad: 25.55 ± 4.75 años; masa corporal: 75.67 ± 9.02 kg; índice de masa corporal: 24.04 ± 2.11 kg/m2; grasa corporal: 10.19 ± 2.29 %; kilogramos para una repetición máxima en sentadilla: 126.53 ± 24.62 kg; ratio kilogramos para una repetición máxima por peso corporal [fuerza relativa]: 1.68 ± 0.35). Se llevaron a cabo dos sesiones, una de evaluación y familiarización y una experimental. En la sesión experimental se realizaron repeticiones hasta el fallo y repeticiones submáximas con un 75% de una repetición máxima con bandas elásticas (cargadas en la posición de bipedestación) o con discos. Es decir, se realizaron un total de cuatro series diferentes (dos con discos y dos con bandas elásticas). Se tomaron medidas pre-ejercicio de cada uno de los parámetros cardiovasculares y oculares. Posteriormente, tras un calentamiento estandarizado, se realizó cada una de las series en orden aleatorio. Las mediciones cardiovasculares se realizaron inmediatamente al terminar cada serie. Las mediciones oculares se iniciaron uniformemente un minuto después de terminar cada serie. Un análisis de la varianza de medidas repetidas de dos vías con el material y el carácter del esfuerzo como factores intra- sujeto evaluó diferencias entre las diferentes condiciones de sentadilla realizadas. Además, un análisis de la varianza de medidas repetidas de una vía evaluó diferencias entre los valores pre- ejercicio y los valores obtenidos tras cada una de las condiciones experimentales. Se estableció un nivel de significancia en p < 0.05. Las bandas elásticas permitieron realizar más repeticiones con los mismos kilogramos en bipedestación (menos en las partes más profundas de la sentadilla). A nivel de los parámetros fisiológicos analizados relacionados con esta tesis, la presión intraocular fue significativamente más baja que antes del ejercicio (tamaños del efecto entre 0.73 y 1.00). De la misma manera, la presión de perfusión ocular media (tamaños del efecto entre 1.14 y 1.36), la frecuencia cardíaca (tamaños del efecto entre 2.42 y 2.77), la presión del pulso (tamaños del efecto entre 0.80 y 1.32) y la presión arterial media (tamaños del efecto entre 0.85 y 1.16) fueron significativamente más altas en comparación con los valores pre-ejercicio. En cambio, el espesor corneal central no varió significativamente (p = 0.828). Se encontraron respuestas cardiovasculares y oculares similares (p > 0.05) entre el uso de los discos (menos repeticiones, más kilogramos de media) y las bandas elásticas (más repeticiones, menos kilogramos de media). Aunque no se observó un efecto significativo del material sobre los parámetros oculares (p > 0.05), el mayor descenso de presión intraocular (2.70 mmHg) se encontró tras realizar el máximo número de repeticiones con bandas elásticas; se observó una tendencia a diferencias estadísticamente significativas comparando con el máximo número de repeticiones con discos (diferencia media: 0.55 mmHg, intervalo de confianza al 95% [-0.12–1.22]; p = 0.10; tamaño del efecto: 0.21). Por tanto, las bandas elásticas parecen un dispositivo apropiado para cargar la barra en sentadillas para sujetos que deberían evitar incrementos de presión intraocular. Para complementar estos resultados, futuros estudios deberían comparar las variaciones de presión intraocular obtenidas a lo largo de todo el rango de movimiento con el uso de discos o de bandas elásticas para cargar la barra, diferenciando entre las fases del movimiento, por ejemplo, concéntrica y excéntrica. Además, se deberían evaluar las adaptaciones crónicas de presión intraocular y presión de perfusión ocular obtenidas con entrenamiento de la fuerza con bandas elásticas en sujetos sanos, sujetos mayores, sujetos en riesgo de sufrir glaucoma y sujetos con glaucoma diagnosticado. Los hallazgos de la presente investigación sugieren que la cantidad de trabajo total (repeticiones x peso) podría condicionar las respuestas oculares y cardiovasculares. Con el objetivo de mantener respuestas de presión intraocular conservadoras, a nivel general, se podría recomendar el control de la técnica, tempo de movimiento y evitar la maniobra de Valsalva. Siguiendo estos términos, los discos y las bandas elásticas podrían ser utilizados de manera indistinta en lo que a respuestas oculares y cardiovasculares se refiere. Los optometristas, oftalmólogos y/o profesionales del ejercicio físico trabajando con personas en riesgo de padecer presión intraocular elevada, u otros factores asociados al desarrollo del glaucoma, podrían encontrar de utilidad los hallazgos del presente estudio. Conclusiones Los hallazgos de la presente tesis doctoral, mostrados a través de los resultados de los cuatro artículos desarrollados, establecen una base para investigaciones futuras con bandas elásticas desde una perspectiva de rendimiento. De la misma manera, los resultados obtenidos en cuanto a parámetros de salud ocular y cardiovascular abren nuevas vías para comprender factores externos (variables de programación de entrenamiento) e internos (sociodemográficos y fisiológicos) que potencialmente condicionan las adaptaciones fisiológicas agudas al ejercicio. Las principales conclusiones a destacar y que responden a las tres hipótesis de la presente tesis doctoral se presentan a continuación. En primer lugar, la presión intraocular medida tras realizar una sesión de gimnasia acrobática es menor que antes del ejercicio, obteniéndose diferencias significativas entre sexos, grupos de edad y grupos formados según niveles de presión intraocular de reposo. Los niveles de presión intraocular en reposo y el sexo aparecieron como predictores significativos de las variaciones de presión intraocular debidas al ejercicio. Segundo, las bandas elásticas, cuando se cargan a la barra justo por encima del punto de estancamiento con el peso correspondiente, permiten utilizar un 25% más de peso en posición de bipedestación y hacer aproximadamente tres repeticiones más que el mismo porcentaje de una repetición máxima con discos, sin diferencias significativas en la presión arterial y frecuencia cardíaca. Tercero, la presión intraocular medida tras realizar sentadillas es significativamente menor que antes del ejercicio y la presión de perfusión ocular media, presión del pulso y presión arterial media más elevada, sin diferencias significativas entre el uso de bandas elásticas o discos para cargar la barra. Además de arrojar cierta luz sobre el uso potencial de las bandas elásticas y sus diferentes aplicaciones para maximizar el rendimiento, el compendio de artículos que compone la presente tesis doctoral contribuye a la colaboración multidisciplinar entre profesionales del entrenamiento de la fuerza y el acondicionamiento físico, optometristas y oftalmólogos para concienciar en la importancia de la prevención, manejo y control de factores de riesgo asociados al glaucoma como fluctuaciones de presión intraocular, presión de perfusión ocular y presión arterial. Introduction Physical exercise and sports practice are common habits in most population groups. Physical exercise and more specifically resistance training have innumerable benefits for health and performance. To maximize these benefits, it is necessary to evaluate performance and physiological adaptations that can be achieved depending on the methodological features of the activity or exercise performed. As presented in Chapter 1, different training program variables (e.g., exercise selection, intensity, volume, effort level, and materials used) produce different responses. Therefore, the study of varied training methodologies is required. The squat is one of the most commonly selected exercises for resistance training routines due to its similarity to a wide range of athletic and everyday activities. Each different squat variation presents different biomechanical characteristics and entails different neuromuscular acute effects. Consequently, it is necessary to study the squat exercise and its different variations to deeply understand the movement and to individualize resistance training programs. Concerning materials, elastic bands are increasing in popularity for resistance training with both health and performance purposes. Elastic bands provide greater resistance (more kilograms) when they are longer and fewer kilograms when they are shortened. Accordingly, from a performance perspective, elastic bands can provide optimum resistance throughout the range of motion in squats. For squats, elastic bands are usually attached to the bar to provide the pertinent resistance measured at the participant’s standing position, as is done when using weight plates to load the bar. Therefore, the weight at the participant’s standing position is the same whether one uses elastic bands or weight plates. However, elastic bands provide less weight throughout the range of movement below this point. This makes the comparison between elastic bands and weight plates in terms of used resistance uneven. Within the range of motion of certain resistance training exercises such as the squat, there exists the so-called sticking region. The sticking region is defined as the part of the range of motion in which a disproportionally large increase in difficulty occurs, and this is considered a mechanical constraint. Bearing this in mind, the question arises whether elastic bands could be attached to the bar right above the sticking point (the point at which the sticking region ends) to provide the pertinent weight. This would make it possible to obtain less weight in the parts of the range of motion that are biomechanically disadvantageous and more weight in the biomechanically efficient parts of the exercise. Attaching the elastic bands to the bar immediately above the sticking point would therefore result in more weight during more degrees of movement and less weight during fewer degrees of movement compared to weight plates. Therefore, this way of applying the elastic bands could be a useful strategy to overcome the squat sticking point and enhance performance. This new methodology could allow participants to perform more repetitions with more weight compared with what they would be able to move with weight plates. To the best of our knowledge, no previous research has evaluated the effects of attaching the elastic bands to the bar immediately above the squat sticking point. The elastic bands would therefore be providing the pertinent weight at the sticking point instead of at the standing position of the participant. Focusing on health, resistance training has been shown to influence cardiovascular and ocular parameters both acutely and chronically. This influence on cardiovascular (e.g., systolic and diastolic blood pressure, mean arterial blood pressure, pulse pressure) and ocular parameters (e.g., intraocular pressure, ocular perfusion pressure) could vary depending on training program variables such as the weight used, the level of effort, or the materials used. These cardiovascular and ocular acute adaptations could be detrimental rather than beneficial for the development and progression of cardiovascular conditions associated with blood pressure such as hypertension, which is the leading modifiable risk factor for cardiovascular disease and premature death. Furthermore, dramatic increases or fluctuations of intraocular pressure and/or ocular perfusion pressure decreases could entail a risk for the development of ocular conditions such as primary open-angle glaucoma, which is the second most common cause of irreversible blindness worldwide. Responses of the cardiovascular system to physical exercise have been widely studied with relatively homogeneous results. On the other hand, there is controversy regarding the intraocular pressure behavior with certain physical exercise methodologies such as resistance training, including the squat. While several studies indicate that intraocular pressure increases and ocular perfusion pressure decreases with resistance training, other research has found the opposite. It is worth highlighting that in the deepest phases of the squat, the intraabdominal pressure rises, and this could lead to intracranial pressure and intraocular pressure elevation. Therefore, considering that elastic bands modify the kilograms provided throughout the range of motion, the question arises whether the use of elastic bands to load the bar in squats may provoke different cardiovascular and/or ocular acute adaptations compared to traditional resistance training devices (in particular, weight plates). Furthermore, numerous studies have shown that sex, age, central corneal thickness, and baseline levels of intraocular pressure, inter alia, could be correlated with intraocular pressure levels and fluctuations. In consequence, it is crucial to understand the moderating role that sociodemographic and physiological variables can play in individual variations of intraocular pressure with exercise. We did not find previous studies analyzing the prediction potential of sex, age, baseline levels of intraocular pressure, and baseline levels of central corneal thickness in the variations of intraocular pressure caused by exercise. Aims Bearing in mind what has been mentioned in the introduction, the compendium composing the present doctoral thesis was aimed at assessing the potential use of elastic bands to load the bar in squats and its relationship with ocular and cardiovascular health parameters, subjective effort, and performance. Additionally, two preliminary studies were designed to identify potential predictors of the intraocular pressure variations after exercise and to select the most appropriate squat variation for the present project, respectively. The study design, main results, and conclusions of each of the four articles included in the compendium, which justify the original contribution of the present doctoral thesis, are presented below. First study: The potential of sex, age, and baseline intraocular pressure to predict intraocular pressure variations with exercise The first article of the compendium is included in Chapter 2. It was aimed at identifying mediator parameters in the intraocular pressure changes after exercise. For this purpose, a multiple linear regression was conducted with age, sex, baseline intraocular pressure levels, and baseline central corneal thickness levels as potential predictors of intraocular pressure variations after a 90-minute acrobatic gymnastics session. Forty-nine healthy gymnasts with at least six months of experience (63.27% females, age: 27.67 ± 7.10 years, range: 18–40 years) voluntarily agreed to participate in the study. Two sessions were conducted. One session was used for familiarization and to confirm the suitability of the participants for the study according to the inclusion criteria. The second session was conducted to complete the research procedures. In this experimental session, measurements of the selected variables (intraocular pressure, central corneal thickness) were performed before the training session and between 5 and 10 minutes after finishing the exercise. The session lasted 90 minutes. For the statistical analyses, participants were divided according to their sex and age with groups of young adults (≤ 25 years) and adults (> 25 years). Furthermore, participants were stratified into three groups according to their resting intraocular pressure levels (low, medium, or high). For this purpose, preexercise intraocular pressure levels of the sample were divided into terciles (with limits at 14 and 17 mmHg). A mixed-factorial analysis of variance (ANOVA) evaluated differences between groups and between the preexercise and postexercise values. Sex, age, and intraocular pressure levels were included as the between-subject factors. On the other hand, exercise was used as the within-subject factor. In addition, a multiple linear regression was conducted to potentially predict the intraocular pressure variations due to the exercise. The level of significance was uniformly established at p < 0.05. The results of this study show that intraocular pressure levels obtained after the training session were significantly lower than preexercise values (p < 0.001, effect size: 0.73). Central corneal thickness was not significantly modified due to the exercise effect (p = 0.229). It is worth highlighting that baseline intraocular pressure (p = 0.007) and sex (p = 0.001) appeared as significant predictors of the intraocular pressure variations with exercise. More specifically, males, participants older than 25 years, and participants with baseline intraocular pressure levels above 14 mmHg experienced significant decreases in the postexercise values compared with preexercise values (p ≤ 0.001 in all cases, effect sizes between 0.57 and 1.02). In contrast, females, participants younger than 25 years, and participants with resting intraocular pressure levels equal or below 14 mmHg did not show significant intraocular pressure variations after the exercise (significance levels [p] between 0.114 y 0.312). Significant differences in the intraocular pressure variations were observed between the participants with resting intraocular pressure equal to or below 14 mmHg and subjects with resting intraocular pressure equal to or above 17 mmHg (p = 0.008, effect sizes: 0.96). These results confirm that intraocular pressure behavior after exercise is multifactorial. Professionals working with people at risk of suffering high intraocular pressure should account for individual difference such as age, sex, and baseline intraocular pressure levels when programming training adapted to each subject situation. Second study: Characterization of the main squat variations The second article of the compendium, which is presented in Chapter 3, gathers biomechanical, kinetic, and myoelectric information about the most common squat variations (i.e., high-bar back squat, low-bar back squat, front squat, overhead squat, and guided squat). This study aimed to obtain scientific information to select the most appropriate squat variation to be included as a reference in the subsequent studies of the present doctoral thesis. A systematic review of the literature was conducted using four databases and different manual searches. Thirty articles were retrieved after filtering according to the eligibility criteria. The quality of the included studies was assessed with the Physiotherapy Evidence Database (PEDro) scale. All studies obtained scores of between 5 and 6 points out of 6 possible points. Selected squat variations were the high-bar back squat (analyzed by 26 articles), low- bar back squat (analyzed by one article), front squat (analyzed by five articles), overhead squat (analyzed by two articles), and guided squat performed using a Smith machine (analyzed by two articles). Gluteus maximus, gluteus medialis, adductors, vastus lateralis, vastus medialis, rectus femoris, biceps femoris, semitendinosus, tibialis anterior, gastrocnemius, and soleus were included as muscles acting on the hips, knees, and ankles. All variations of the squat exercise begin with the participant in the standing position. Synergistic hip, knee, and ankle flexion is performed followed by extension in the ascent, which ends with the participant in the starting position. The results of the present study indicate that the squat is a knee extensors-predominant exercise, meaning that it mainly exercises the muscles of the quadriceps (vastus lateralis, vastus medialis, rectus femoris, and vastus intermedius). Although the muscles of the quadriceps are the main target of the squat exercise, modifications in the bar placement such as in the low-bar back squat can increase the activity of the hip extensors muscles. Most of the consulted investigations (26 articles) analyzed the high-bar back squat with relatively homogeneous results in terms of activation patterns. The load was identified as the major determinant of muscle activation levels. Furthermore, different technical modifications (movement depth, width of stance, hip rotation, and feet orientation) entailed different activation patterns. After the analysis was performed, the guided high-bar back squat performed using a Smith machine was selected for inclusion in the methodology of the other two studies of the present doctoral thesis analyzing the squat. Concerning the technical execution, parallel depth (as per the lines drawn by the femur and the ground) and neutral positions of stance width, hip rotation, and feet orientation were selected. Third study: The potential of elastic bands to maximize performance in squats The third article of the compendium, which comprises Chapter 4, tests a new method of loading the bar with elastic bands in squats. The pertinent weight that each participant had to use according to their one-repetition maximum percentage was added to the bar at the standing position or just above each participant’s knee sticking point using exclusively elastic bands. Twenty healthy, physically active males, with at least one year of experience in resistance training (age: 25.50 ± 5.26 years; body mass index: 24.09 ± 2.06 kg/m2; body fat: 10.16 ± 2.23%; squat one-repetition maximum: 127.10 ± 24.10 kg; ratio one-repetition maximum to body weight [relative strength]: 1.70 ± 0.36) participated in three sessions: two for assessment and familiarization and one experimental. In the experimental session, six series of squats were performed in random order (three sets using only weight plates to load the bar and three using only elastic bands to load the bar). Four sets (two using weight plates to load the bar and two using elastic bands) were performed until muscular failure, and two sets (one using weight plates to load the bar and one using elastic bands) consisted of submaximal efforts. A goniometer was used to measure the angle of the knee sticking point, and the height of the barbell at this point was marked. Elastic bands were attached to the bar just above this point of the range of motion in the pertinent condition. The weight at the standing position, number of repetitions performed, heart rate, blood pressure, and rate of perceived effort were measured immediately after the completion of each set. An analysis of variance of one-way repeated measurements with Bonferroni adjustments and nonparametric Friedman and Wilcoxon tests were conducted to evaluate differences between the study variables in the different squat conditions. The level of significance was uniformly established at p < 0.05. When weights were equated at the standing position between weight plates and elastic bands, elastic bands permitted participants to perform approximately eight more repetitions (p < 0.001; effect size: 2.44) with the same weight at the standing position (less at the deepest positions), with similar internal load responses (i.e., blood pressure, rate of perceived exertion) compared to weight plates. On the other hand, when weights were equated just above the sticking point between weight plates and elastic bands, elastic bands allowed participants to perform approximately three more repetitions (p = 0.001, effect size: 1.27) with approximately 25% more kilograms (p = 0.001, effect size: 1.15) at the standing position (same kilograms at the sticking point and less kilograms below the sticking point) with similar blood pressure and heart rate responses (p > 0.05). These results confirm that elastic bands could be an optimal material to load the bar for squats for young, trained males. Furthermore, the results suggest that the methodology of adding the pertinent weight just above the sticking point using elastic bands could be useful to increase squat performance. This would be obtained through the overcoming of the biomechanically disadvantageous phase of the squat in which technique is compromised and failure occurs. The findings of this study establish the foundation for future research regarding using elastic bands to improve physical performance. Among other future research lines, medium- or long-term intervention studies should evaluate the potential of the training stimulus provided by the elastic bands attached to the bar immediately above the sticking point in the squat and/or other resistance training exercises to produce chronic adaptations. Additionally, it would be interesting to evaluate whether the same increase in weight and number of repetitions is obtained when directly adding 25% more weight at the participant’s standing position compared to the methodology of loading the bar just above the sticking point. Fourth study: Elastic bands as a device to provoke conservative ocular and cardiovascular responses With the results of Chapters 2, 3, and 4 in mind, the fourth and last published article of the compendium, which comprises Chapter 5, assessed the potential ocular and cardiovascular responses after squatting using elastic bands to load the bar. Additionally, the study evaluated whether these physiological responses were similar compared to those squatting using weight plates. The main aim of the study was to examine ocular (intraocular pressure, ocular perfusion pressure, and central corneal thickness) and cardiovascular (mean blood pressure, pulse pressure, and heart rate) responses produced by squatting using weight plates or elastic bands to load the bar. Furthermore, the responses after a maximal or submaximal effort level were compared. Twenty healthy, physically active males with at least one year of experience in resistance training voluntarily participated in the study (age: 25.55 ± 4.75 years; body mass: 75.67 ± 9.02 kg; body mass index: 24.04 ± 2.11 kg/m2; body fat: 10.19 ± 2.29%; kilograms for one-repetition maximum: 126.53 ± 24.62 kg; ratio one-repetition maximum to body weight [relative strength]: 1.68 ± 0.35). Two sessions were conducted: one for assessment and familiarization and one experimental trial. In the experimental session, the participants performed repetitions to failure and submaximal repetitions at 75% of their one-repetition maximum using weight plates or elastic bands (added at the participants’ standing position) to load the bar. A total of four different sets were performed (two using elastic bands to load the bar and two using weight plates). Preexercise measurements of each cardiovascular and ocular parameter were taken. Each of the four sets was then performed in random order after a standardized warm-up. Cardiovascular measurements were taken immediately after the completion of each set. Ocular measurements were uniformly started one minute after the exercise. An analysis of variance of two-way repeated measurements evaluated differences between the squat conditions performed. The material used (elastic bands or weight plates) and effort level (maximal or submaximal) were used as the within-subject factors. A significance level of p < 0.05 was established. Elastic bands permitted performing more repetitions with the same weight at the standing position (fewer at the deepest phases of the squat) compared to weight plates. Regarding the physiological parameters analyzed related to the present doctoral thesis, intraocular pressure was significantly lower than before the exercise (effect sizes between 0.73 and 1.00). Similarly, mean ocular perfusion pressure (effect sizes between 1.14 and 1.36), heart rate (effect sizes between 2.42 and 2.77), pulse pressure (effect sizes between 0.80 and 1.32), and mean arterial blood pressure (effect sizes between 0.85 and 1.16) were significantly higher compared with preexercise values. On the other hand, central corneal thickness did not significantly vary (p = 0.828). Cardiovascular and ocular responses were similar (p > 0.05) for the use of weight plates (fewer repetitions, more average weight) and elastic bands (more repetitions, less average weight). Although no effect of the material was observed in the ocular variables (p > 0.05), the major intraocular pressure descent (2.70 mmHg) was obtained after performing the maximum number of repetitions with elastic bands; a tendency of statistical significance was observed in the comparison with the condition consisting of a maximal number of repetitions with weight plates (mean difference: 0.55 mmHg, 95% confidence interval [-0.12–1.22], p = 0.10, effect size: 0.21). Therefore, elastic bands seem an appropriate device to load the bar in squats for subjects who should avoid intraocular pressure increments. To supplement these results, future studies should compare intraocular pressure variations throughout the range of motion when using weight plates or elastic bands to load the bar using a continuous monitoring device to differentiate between the movement phases (e.g., concentric and eccentric). Additionally, chronic intraocular pressure and ocular perfusion pressure adaptations to resistance training with elastic bands in healthy subjects, older subjects, subjects at risk of suffering glaucoma, and subjects with diagnosed glaucoma should be evaluated. The findings of the present research suggest that the total amount of work (repetitions x weight) could condition ocular and cardiovascular responses. It is recommended to control technique and movement tempo and avoid the Valsalva maneuver with the aim of maintaining conservative intraocular pressure responses. With this in mind, elastic bands and weight plates could be interchangeably used to load the bar in squats in terms of ocular and cardiovascular responses. Optometrists, ophthalmologists, and strength and conditioning professionals working with people at risk of suffering elevated intraocular pressure or other factors associated with glaucoma development could find the findings of this study useful. Conclusions The findings of the present doctoral thesis shown through the results of the four articles developed establish a foundation for future research with elastic bands from a performance approach. Similarly, results obtained regarding ocular and cardiovascular health parameters open new paths to understanding external (training programming variables) and internal (sociodemographic and physiological) factors potentially conditioning physiological acute adaptations to exercise. Responding to the hypotheses of the present thesis, the main conclusions to highlight are presented hereafter. First, the intraocular pressure after performing an acrobatic gymnastics training session is lower than preexercise values, obtaining significant differences between sexes, age groups, and groups based on baseline intraocular pressure. Baseline intraocular pressure levels and sex were encountered as significant predictors of the intraocular pressure variations provoked by exercise. Second, elastic bands, when attached to the bar with the pertinent weight just above the sticking point, make it possible to use 25% more weight at the standing position and perform approximately three more repetitions compared to weight plates with nonsignificant differences in blood pressure and heart rate. Third, the intraocular pressure after squatting is lower compared with preexercise values, and mean ocular perfusion pressure, pulse pressure, and mean arterial blood pressure are higher with nonsignificant differences between using elastic bands or weight plates to load the bar. The compendium of articles composing the present doctoral thesis illuminates the potential use of elastic bands to maximize performance and maintain conservative ocular and cardiovascular responses. It also contributes to the multidisciplinary collaboration between strength and conditioning professionals, optometrists, and ophthalmologists to raise awareness of the importance of the prevention, management, and control of risk factors associated with glaucoma such as elevated intraocular pressure or fluctuations, decreased ocular perfusion pressure, and increased or decreased blood pressure.

El carcinoma broncogénico (CB) es el más frecuente a nivel mundial y el más letal en ambos sexos. La incidencia del CB varía no sólo entre países sino también entre distintas zonas de un mismo país. Dado que la OMS recomienda disponer de estrategias de lucha contra el cáncer, creemos que analizar su situación en una zona geográfica dada puede contribuir a establecer una correcta planificación sanitaria. En consecuencia, hemos planteado el presente trabajo con los principales objetivos de: 1.- Conocer las principales características anatomopatológicas, clínicas, y epidemiológicas del CB en la provincia de Castellón entre 2004 y 2017. 2.- Analizar la evolución en este tiempo de las tasas de incidencia y supervivencia del CB. 3.- Valorar la influencia sobre la incidencia del CB de determinadas variables intervinientes (sexo, año de diagnóstico, y departamento sanitario). 4.- Valorar la influencia sobre la supervivencia del CB de determinadas variables independientes y/o intervinientes (edad, sexo, tipo histológico, estadio clínico y patológico, localización del tumor, año de diagnóstico, técnica diagnóstica, y departamento sanitario). 5.- Valorar la efectividad de los nuevos métodos diagnósticos y terapéuticos del CB. El presente estudio ha sido realizado sobre una muestra de 4.346 sujetos (3.703 varones y 643 mujeres) diagnosticados de CB y residentes en la provincia de Castellón entre 2004 y 2017, cuyos datos están recogidos en el Sistema de Información sobre Cáncer (SIC). Los datos han sido procesados y sometidos a tratamiento estadístico, a partir del cual se han obtenido unos resultados que han permitido concluir: 1.- Las características anatomopatológicas, clínicas, y epidemiológicas del CB en la provincia de Castellón durante el periodo de estudio han coincidido básicamente con las del resto de series nacionales e internacionales. 2.- Las tasas de incidencia estandarizada del CB han sido más bajas que las del resto del país. En relación con Europa, han sido más altas en hombres y más bajas en mujeres. Las tasas de incidencia brutas, global y en hombres, no han variado en este tiempo; sin embargo, la de las mujeres han aumentado. 3.- Las tasas de supervivencia han aumentado en términos de probabilidad en ambos sexos; sin embargo, el tiempo promedio vivido en 2017 no ha sido superior al de 2004 en ninguno de los dos sexos. 4.- La pertenencia a un determinado departamento sanitario no ha influido en las tasas de incidencia ni en las de supervivencia. 5.- La supervivencia se ha correlacionado positivamente con: el sexo femenino, la cirugía, y el año de diagnóstico; y negativamente con: el sexo masculino, edad, tipo histológico, y estadio clínico. 6.- Dada la limitada información obtenida al respecto, creemos que no procede valorar la eficacia de los nuevos fármacos incluidos dentro del grupo de terapias dirigidas e inmunoterapia. 7.- Finalmente, creemos que, aunque mejorable, el SIC cumple los objetivos para los que fue creado y diseñado.

En la presente Tesis Doctoral, se ha evaluado diferentes situaciones fisiológicas y patológicas relevantes en el campo neonatal. Por un lado, se ha mejorado la predicción de los resultados de la encefalopatía hipóxico-isquémica, lo que es de vital importancia para desarrollar estrategias de trapiento personalizadas y reducir la mortalidad y morbilidad neonatas. Por lo lado, la lactancia materna es el estándar de oro para la nutrición de recién nacidos a término y pretérmino. Para los bebés prematuros cuyas madres no pueden proporcionar su propia leche materna (OMM), la leche humana de donante pasteurizada (DHM) es la alternativa preferida. En esta Tesis, se ha estudiado la huella metabólica de los recién nacidos prematuros para descifrar el efecto de la nutrición sobre su metabolismo. Asimismo, la transposición de las grandes arterias (TGA) es una cardiopatía congénita caracterizada por hipoxemia y circulación anormal, responsable de alteración cerebral y retraso del neurodesarrollo a largo plazo. La septostomía auricular provoca un aumento repentino de la oxigenación de la sangre arterial que conduce a cambios metabólicos complejos. En esta Tesis, se ha evaluado el cambio metabólico en lactantes con TGA después de la septostomía auricular para arrojar luz sobre el efecto de los cambios en la oxigenación cerebral. In this PhD Thesis different physiological and pathological situations that are relevant to the neonatal field have been assessed. Hypoxic-Ischemic encephalopathy (HIE) is a neurologic sequela of perinatal asphyxia. In this Thesis, the aim was to improve prediction of outcomes of HIE, which would be of key importance for developing personalized treatment strategies and reduce neonatal mortality and morbidity. Furthermore, breastfeeding is the gold standard for nutrition of the term and preterm infants. For preterm infants whose mothers are unable to provide of own mothers’ milk (OMM), pasteurized donor human milk (DHM) is the preferred alternative. In this Thesis, metabolic signature of preterm infants has been studied to unscramble the effect of nutrition on their metabolism. Likewise, transposition of the great arteries (TGA) is a congenital heart disease characterized by hypoxemia and abnormal circulation is responsible for brain alteration and long-term neurodevelopmental delay. Atrial septostomy causes a sudden increase in arterial blood oxygenation leading to complex metabolic changes. In this Thesis, the metabolic switch in infants with TGA after atrial septostomy were assessed to shed light on the effect of the changes in the cerebral oxygenation.

To assess severity markers and outcomes of patients with systemic sclerosis (SSc) with or without pulmonary arterial hypertension (PAH-SSc/non-PAH-SSc), and the impact of interstitial lung disease (ILD) on PAH-SSc. Non-PAH-SSc patients from the Spanish SSc registry and PAH-SSc patients from the Spanish PAH registry were included. A total of 364 PAH-SSc and 1589 non-PAH-SSc patients were included. PAH-SSc patients had worse NYHA-functional class (NYHA-FC), worse forced vital capacity (FVC) (81.2 ± 20.6% vs 93.6 ± 20.6%, P

La sepsis es una afección potencialmente mortal causada por una respuesta anormal del huésped a una infección, produciendo respuestas fisiológicas alteradas que dañan los propios tejidos del paciente y pueden provocar disfunción orgánica e incluso la muerte. Asimismo, algunos pacientes sépticos progresan a shock séptico, caracterizado por alteraciones circulatorias, celulares y metabólicas sustanciales que aumentan el riesgo de mortalidad. A pesar de que la sepsis se caracteriza por un mal funcionamiento del sistema inmunológico, lo que a su vez conduce a una respuesta inmune alterada e inmunosupresión, la alta complejidad de la fisiopatología de la sepsis requiere una mayor investigación para comprender las respuestas inmunes que ocurren durante la sepsis. Asimismo, las histonas extracelulares circulantes han ganado relevancia como mediadores citotóxicos en la sepsis, ya que actúan como patrones moleculares asociados a daño, que inducen estrés oxidativo y activan el inflamasoma NLRP3. Estos mecanismos median la activación de la piroptosis, un mecanismo de muerte celular programada que produce inflamación mediante la expresión de IL-18, IL-1β and IL-1α. Sin embargo, a pesar de la evidencia de activación del inflamasoma en las células inmunes durante la sepsis, se desconoce si las histonas extracelulares son capaces de activar los inflamasomas endoteliales y sus consecuencias. En este trabajo destacamos el papel previamente desconocido de las histonas extracelulares, mediando la activación del inflamasoma NLRP3 y la piroptosis en las células endoteliales, contribuyendo a la disfunción endotelial y la desregulación de la respuesta inmune mediada por el endotelio. Asimismo, también demostramos cómo la acetilación de histonas disminuye la activación de la piroptosis. Además, demostramos que la piroptosis se produce en pacientes con shock séptico y los niveles de histonas circulantes se correlacionan con la expresión de citoquinas proinflamatorias y citoquinas piroptóticas, la liberación de factores de adhesión endotelial y la gravedad de la enfermedad. Proponemos la piroptosis mediada por histonas como un nuevo objetivo para desarrollar intervenciones clínicas. De manera similar, hemos analizado las respuestas inmunorelacionadas que ocurren durante las primeras etapas de la sepsis con el objetivo de proporcionar nuevos datos comparando las cantidades de citoquinas, inmunomoduladores y otros mediadores endoteliales en pacientes críticamente enfermos no sépticos, sépticos y de shock séptico. Nuestro enfoque ayudará a caracterizar rápidamente las respuestas inmunes alteradas en pacientes sépticos y de shock séptico ingresados en la Unidad de Cuidados Intensivos. Finalmente analizamos el papel de la metilación del ADN en el control del sistema inmune séptico. Nuestros resultados demostraron el papel central de la metilación del ADN modulando la respuesta molecular en los pacientes de shock séptico y contribuyendo a la inmunosupresión, a través de la alteración de los patrones de metilación de los promotores de IL-10 y TREM-2. Sepsis is a life-threatening condition caused by an abnormal host response to an infection that produce altered physiological responses which damages own tissues of the patient and can result in organ dysfunction and in some cases death. Likewise, a subset of septic patients progresses to septic shock, characterized by substantial circulatory, cellular and metabolic abnormalities, which substantially increase the risk of mortality. Sepsis is characterized by a malfunction of the immune system and it can lead to an altered immune response and immunosuppression. Moreover, the high complexity of the pathophysiology of sepsis requires of further investigation to characterize the immune responses in sepsis and septic shock. Likewise, circulating extracellular histones have gained relevance as cytotoxic mediators in sepsis pathophysiology, since they act as damage-associated molecular patterns, which induce oxidative stress and activate NLRP3 inflammasome. Subsequently, inflammasome mediates pyroptosis activation, a programmed cell death mechanism that produces inflammation through the release of IL-18, IL-1β and IL-1α. However, despite inflammasome activation may occur in immune cells during sepsis, it is unknown if this process also takes place in endothelial cells and particularly whether extracellular histones are capable of activating endothelial inflammasomes and their consequences. In this work we highlight a previously unknown role for extracellular histones, that mediates the activation of NLRP3 inflammasome and pyroptosis in endothelial cells by contributing to endothelial dysfunction and the dysregulation of the immune response mediated by endothelium. Likewise, we demonstrated how histone acetylation decreases pyroptosis activation. Furthermore, we show how pyroptosis occurs in septic shock patients and how circulating histone levels correlate with the expression of pro-inflammatory and pyroptotic cytokines, the release of endothelial adhesion factors and septic shock severity. We propose histone-mediated pyroptosis as a new target to develop clinical interventions. Similarly, we have analyzed the immune-related responses occurring during the early stages of sepsis with the aim of providing new data by comparing the amounts of cytokines, immune modulators and other endothelial mediators in critically-ill non-septic patients, septic and septic shock patients. Our approach will help to rapidly characterize the altered immune responses in septic and septic shock patients admitted in the Intensive Care Unit. Finally, we also analyzed the role of DNA methylation in the control of septic immune system. Our results demonstrated the central role of DNA methylation modulating the molecular response in septic shock patients and contributing to immunosuppression, through the alteration of DNA methylation patterns of IL-10 and TREM2 promoters.

Aging is defined as an intrinsic, progressive, deleterious and inevitable multifactorial phenomenon that occurs as a result of the gradual accumulation of damage at cellular and molecular levels. Due to the recent discovery of BCL-XL being overexpressed in peripheral blood mononuclear cells from centenarians, a new approach has emerged to investigate the BCL-XL function in healthy aging. The major goal of this thesis is to study the role of BCL-XL in frailty and healthy aging in transgenic mice overexpressing a human form of BCL-XL in T cells. For this, we used the heterozygous transgenic mice from Cg-Tg(LCKprBCL2L1)12Sjk/J strain, which express the human BCL-XL cDNA sequence in all thymocyte subsets. We measured physical performance parameters such as spontaneous activity, body weight, grip strength, motor coordination, physical endurance, and frailty. We also measured metabolic parameters such as respiratory metabolism, intake, body composition and glucose tolerance. We also measured T cell purity, cellular senescence, apoptosis, autophagy, cell death and mitochondrial function. Our results showed that transgenic mice exhibit better physical performance reduced frailty at advanced ages. Mice total body mass and body fat percentage were positively correlated with age in wild type mice but not in transgenic mice although no differences of intake were observed between strains. Additionally, a reduction of glucose intolerance in 15-23-month-old transgenic mice was observed. In T cells, increased autophagic response to starvation was observed in old transgenic mice-derived T cells compared to wild type-derived T cells. Additionally, apoptosis was increased in transgenic mice-derived T cells at 17-20 months of age under physiological conditions (freshly isolated cells). On the contrary, apoptosis was reduced in transgenic mice-derived T cells at 2-5 and 8-11 months of age under more hostile conditions (cultured cells), both in absence and in presence of the apoptotic inducer dexamethasone. When studying mitochondrial function of T cells, we also observed a significantly reduction of oxygen consumption rate and proton leak under basal conditions in 2-5 and 8-11-month-old transgenic mice-derived T cells compared to wild type mice-derived T cells. In conclusion, BCL-XL overexpression in T cells attenuates physical performance and prevents frailty during aging, helps to maintain a youthful body composition and enhanced glucose tolerance in transgenic mice. In addition, T cells overexpressing BCL-XL exhibit an enhanced cellular function by being more resistant to apoptosis under stressful conditions, showing an improved autophagic response to starvation and having a lower oxygen consumption and proton leak.

La distrofia miotónica tipo 1 (DM1) es una enfermedad neuromuscular crónica y debilitante causada por una expansión del triplete CTG en el 3´UTR del gen DMPK. La disfunción muscular es uno de los principales contribuyentes a la mortalidad y morbilidad en DM1. Sin embargo, los mecanismos moleculares desencadenantes de la degeneración y atrofia muscular no se conocen en profundidad. Por consiguiente, no existe una terapia específica para el tratamiento de este aspecto de la enfermedad. Las expansiones CTG al transcribirse forman estructuras insolubles capaces de secuestrar factores reguladores del splicing alternativo, principalmente Muscleblind-like 1 (MBNL1; y su parálogo MBNL2). Ahora bien, la espliceopatía característica en DM1 no explica de forma satisfactoria la pérdida de masa muscular, por lo que se han sugerido otros factores contribuyentes al fenotipo. Entre ellos, los principales mecanismos de degradación proteica, la autofagia y el sistema ubiquitin proteasoma (UPS) se han descrito sobreactivados en DM1. En el caso de la autofagia se ha demostrado que contribuye al fenotipo atrófico, ya que la inhibición genética de la autofagia, o la sobreexpresión de Muscleblind son suficientes para rescatar dicho fenotipo. No obstante, se desconocen de forma clara las causas del aumento patológico de este proceso. Algunos estudios sugieren que la falta de biodisponibilidad de MBNL1 contribuye, al menos en parte, a la autofagia excesiva. Por otra parte, miR-7 es un regulador negativo directo de ATG4A y ATG7, implicados en autofagia, y se ha demostrado que los niveles de este miRNA están reducidos en DM1. En el presente trabajo, se ratificó la implicación de la alteración de la autofagia en la disfunción muscular en DM1 mediante su bloqueo con el anti-autofágico Cloroquina (CQ). El tratamiento con CQ mejoró diferentes fenotipos relacionados con la DM1 a nivel molecular, celular y fisiológico in vitro en miotubos DM1 e in vivo en un modelo de DM1 en Drosophila y en ratones HSALR. Concomitante, se descubrió que el bloqueo de la autofagia aumenta la biodisponibilidad de MBNL1/2, y ese aumento es funcional puesto que se rescatan diferentes eventos splicing alterados en DM1. También se descubrió que los bajos niveles de miR-7 contribuyen a la hiperactivación de la autofagia en DM1. Además, miR-7 regula otras vías relacionadas con la atrofia, como el UPS, en DM1, de forma independiente de MBNL1. Por último, se describió por primera vez que la proteína de unión a RNA Musashi-2 (MSI2) está regulada al alza en DM1. MSI2 controla la biogénesis de miR-7, por lo que mediante diferentes estrategias se demostró que la reducción de los niveles o actividad de MSI2 aumenta la expresión de miR-7, reprime la autofagia excesiva y regula negativamente genes relacionados con la atrofia del sistema UPS. En conjunto, estos resultados abren la puerta al estudio del eje MSI2-miR-7-autofagia como enfoque terapéutico válido para tratar la disfunción muscular en la DM1.

Tesis doctoral, 328 p. Figuras y tablas., [EN] Stl is a master repressor encoded by Staphylococcus aureus pathogenicity islands (SaPIs) that participates in the dissemination of these mobile genetic elements on the bacterial chromosome. After infection or induction of a resident helper phage, the SaPIs are de-repressed by specific interactions of the phage proteins with the Stl repressor, allowing the island to replicate and introduce its genetic material into the phage capsids, taking advantage of its machinery to achieve a horizontal gene transfer when virus particles with genetic material from the island infect other cells. SaPIs have developed a fascinating mechanism to ensure their promiscuous transfer by targeting structurally unrelated proteins that perform identical and conserved functions for the phage, the dimeric and trimeric dUTPases. These proteins would act in a similar way to the proto-oncogenic G proteins, where their moonligthing and signaling function would be regulated by dUTP, which would act as a second messenger, allowing or preventing the binding of the repressor and, therefore, the replication and transfer of the genes of the island. In this thesis we decipher the molecular mechanism of this elegant strategy through mutational assays that, firstly, delimit the areas involved in the interaction and, finally, determining and validating the structure of the Stl repressor of SaPIbov1 alone and in complex with dUTPases from different S. aureus phages. Surprisingly, SaPIbov1 Stl is a modular protein capable of interacting with dimeric and trimeric dUTPases through different domains and mechanisms. In case of the SaPIbov1 Stl complex with trimeric dUTPases, the intermediate domain of the repressor plays a key role through the active center of the enzyme emulating its substrate, dUTP, and interacting with conserved motifs of the same. On the other hand, the formation of the repressor complex with dimeric dUTPases is generated through the Cterminal motif, which not only interacts with the active center of the enzyme but also emulates the dimerization surface of the dUTPase, forming a heterodimer. The adquisition of multispecificity through the recruitment of domains proposes Stl from SaPIbov1 as a new type of repressor, which preserves its mechanism of interaction with DNA but allows an evolution of other parts of the protein with the aim of a wide diffusion of the SaPI proteins., [ES] Stl es un represor maestro codificado por islas de patogenicidad de Staphylococcus aureus (SaPIs) que participa en la diseminación de estos elementos genéticos móviles en el cromosoma bacteriano. Después de la infección o inducción de un fago colaborador residente, las SaPIs son de-reprimidas por interacciones específicas de las proteínas del fago con el represor Stl, permitiendo a la isla replicarse e introducir su material genético en las cápsides del fago, aprovechando su maquinaria para conseguir una transferencia horizontal de genes cuando las partículas víricas con el material genético de la isla infectan otras células. Las SaPIs han desarrollado un mecanismo fascinante para asegurar su transferencia promiscua al dirigirse a proteínas estructuralmente no relacionadas que realizan funciones idénticas y conservadas para el fago, las dUTPasas diméricas y triméricas. Estas proteínas actuarían de manera análoga a las proteínas G protooncogénicas, donde su función moonligthing y señalizadora estaría regulada por dUTP, el cual actuaría de segundo mensajero permitiendo o impidiendo la unión del represor y, por tanto, la replicación y transferencia de los genes de la isla. En esta tesis desciframos el mecanismo molecular de esta elegante estrategia mediante ensayos mutacionales que, primeramente, delimitan las áreas implicadas en la interacción y, finalmente, determinando y validando la estructura del represor Stl de SaPIbov1 solo y en complejo con dUTPasas de diferentes fagos de S. aureus.Sorprendentemente, Stl de SaPIbov1 se trata de una proteína modular capaz de interaccionar con dUTPasas diméricas y triméricas mediante dominios y mecanismos diferentes, En el caso del complejo de Stl de SaPIbov1 con dUTPasas triméricas, el dominio intermedio del represor interviene de manera clave a través del centro activo de la enzima emulando al sustrato de ésta, el dUTP, e interaccionando con motivos conservados de la misma. Por otra parte, la formación del complejo del represor con dUTPasas diméricas se genera a través del motivo Cterminal, el cual no sólo interacciona con el centro activo de la enzima sino que, además, emula la superficie de dimerización de la dUTPasa, formando un heterodímero con ésta. La adquisición de multiespecificidad a través del reclutamiento de dominios propone a Stl de SaPIbov1 como un nuevo tipo de represor, el cual conserva su mecanismo de interacción con ADN pero permite una evolución de otras partes de la proteína con el fin de una difusión amplia de las SaPIs por la naturaleza

Asthma; Medical research Asma; Investigación médica Asma; Recerca mèdica Though asthma and bronchiectasis are two different diseases, their coexistence has been demonstrated in many patients. The aim of the present study is to compare the characteristics of asthmatic patients with and without bronchiectasis and to assess risk factors for the development of this condition. Two hundred and twenty-four moderate-severe asthmatic patients were included. The severity of bronchiectasis was assessed by Reiff and FACED parameters. Logistic regression was used to identify independent factors associated with bronchiectasis. Bronchiectasis was identified in 78 asthma patients. In severe asthma patients, its prevalence was 56.9%. Bronchiectasis was defined as mild in81% of patients using modified Reiff criteria and in 74% using FACED criteria. Asthmatic patients with bronchiectasis had decreasing FEV1, FVC and FEV1/FVC (p = 0.002, 0.005 and 0.014 respectively), presented more frequent asthma exacerbations (p

Los centenarios son un modelo de envejecimiento satisfactorio. No solo disfrutan de una larga longevidad, sino que además muestran una envidiable compresión de la morbilidad. El objetivo del estudio fue esclarecer si las personas centenarias tienen un perfil genético de expresión característico en comparación con personas septuagenarias y jóvenes, así como evaluar sus diferencias a nivel de estrés oxidativo. Para ello se obtuvo muestras de células polimorfonucleares de todos los grupos de edad y se realizó un análisis de su miRNoma y transcriptoma. El análisis de componentes principales reveló un solapamiento entre el perfil de miRNoma de centenarios y el de jóvenes, ambos distintos de los septuagenarios. Su estudio detallado mostró que la regulación de los miRNAs en centenarios se encuentra aumentada, pues sobreexpresan 7 miRNAs frente a jóvenes y 102 miRNAs frente a septuagenarios. Esto sugiere que los centenarios presentan un mejor control de la expresión génica del RNA mensajero a través de la regulación de los miRNAs. Posteriormente, se analizó el transcriptoma de los tres grupos de estudio, mostrando el análisis de componentes principales diferente direccionalidad entre el grupo de centenarios y el de septuagenarios. Se encontraron 1721 genes característicos de centenarios. Agrupamos estos 1721 genes según su implicación en procesos biológicos. La respuesta inmune y la señalización celular encabezaron la lista de los que involucraban mayor número de ellos. A continuación, se realizó un análisis de las conexiones funcionales o estructurales entre los 1721 genes que dio lugar a 6 genes: IFNG; TCR; TNF; SP1; TGFβ1; IL-32. Al comparar centenarios con jóvenes, y septuagenarios con jóvenes se obtuvieron imágenes casi especulares que mostraban que, genes sobreexpresados en centenarios estaban infraexpresados en septuagenarios cuando se comparaba su expresión con los jóvenes. Por tanto, la expresión de mRNA en el envejecimiento exitoso difiere de la del envejecimiento ordinario. Un nuevo análisis de conexiones funcionales o estructurales entre los 6 genes anteriores identificó 4 genes comunes: Bcl-xL, Fas, FasL y CCL5, tres de los cuales están implicados en la regulación de la vía extrínseca e intrínseca de la apoptosis. Se destaca así el papel clave de la apoptosis en la centenariedad. Nos centramos en el papel de Bcl-xL, especialmente por su implicación con la función mitocondrial, y confirmamos su sobreexpresión en centenarios por RT-PCR. Asimismo, determinamos los niveles de MDA, como índice de peroxidación lipídica, y la carbonilación proteica y observamos que dichos niveles eran menores en centenarios comparado con septuagenarios. Así pues, los centenarios están protegidos frente al estrés oxidativo. Por tanto, los centenarios tienen un perfil característico de expresión de miRNAs y de mRNAs relacionados con procesos asociados a la longevidad y están protegidos frente al estrés oxidativo, lo cual podría explicar en parte su envejecimiento satisfactorio.

La escoliosis idiopática del adolescente (EIA) es una enfermedad que afecta de forma tri-dimensional a la estructura de la columna vertebral. Aunque su prevalencia en la población adolescente es baja, entre el 1-3%, la repercusión económica que acarrea su cribado, diagnóstico y tratamiento son elevados. Los programas de cribado actuales carecen de suficiente evidencia científica de calidad que los respalde. Su manejo va a depender de la magnitud de la curva en cada valoración que se le haga al paciente y del potencial de crecimiento remanente, es decir, de su evolución. Es por ello que muchos especialistas involucrados en el manejo de la EIA sienten que las terapias viajan un paso por detrás de la enfermedad y no son capaces de anticiparse a su evolución. El diagnóstico y seguimiento de la deformidad requieren exponer al paciente a una elevada dosis de radiación ionizante durante su adolescencia y adultez precoz, lo cual se ha demostrado aumenta el riesgo de padecer determinados tipos de cáncer. Su etiología ha sido ligada a muchos factores: metabólicos, biomecánicos, neurológicos, hormonales, entre otros. Recientemente, los factores epigenéticos han sido propuestos como contribuyentes en la fisiopatología de la EIA, sin embargo, la información acerca de los mecanismos y rutas moleculares continúa siendo poco conocido. Por lo que respecta a los factores epigenéticos, los microRNAs (miRNAs) son moléculas que participan modulando la expresión de genes a través de la regulación de importantes rutas celulares. Se ha utilizado la secuenciación de nueva generación (next-generation sequencing) para descubrir una serie de miRNAs circulantes detectables en muestras de sangre periférica de pacientes afectos de EIA, lo cual ha dado lugar a establecer una firma única de biomarcadores miRNAs capaces de diferenciar a un paciente con EIA de un individuo sano con una alta sensibilidad y especificidad. Este estudio propone que dichos miRNAs identificados participan en el control epigenético de rutas de señalización específicas regulando la diferenciación de osteoblastos y osteoclastos y con ello, modulando la base genética de los pacientes con EIA. El presente estudio de investigación ha dado como fruto dos resultados relevantes: 1) evidencia acerca de la participación de miRNAs desregulados en los mecanismos de diferenciación de osteoblastos/osteoclastos en la EIA; 2) Se ha identificado una firma de miRNAs que puede ser potencialmente utilizada como herramienta en el proceso diagnóstico molecular de la EIA. La utilización de miRNAs como biomarcadores para el diagnóstico de la EIA es especialmente relevante ya que pueden ofrecer un diagnóstico en una fase muy precoz de la enfermedad con los consiguientes beneficios positivos para el paciente como la aplicación más temprana de métodos de tratamiento ortopédico, todo ello con el fin de reducir la progresión de la deformidad y con ello la necesidad de precisar una cirugía correctiva.

Se ha investigado en corazones de conejo aislados, perfundidos y en fibrilación ventricular (sin interrumpir la perfusión global) en situación de perfusión normalmente oxigenada y durante isquemia regional, el efecto de la aplicación de un protocolo de ejercicio físico sobre la refractariedad ventricular, la heterogeneidad electrofisiológica y la reversibilidad de la fibrilación tras la aplicación de choques eléctricos de ondas bifásicas (durante la isquemia regional). Han sido investigados, en otro grupo de conejos y con la misma metodología para el aislamiento del corazón, en normoxia y durante isquemia regional, el efecto de la infusión del bloqueante del canal KATP, glibenclamida, sobre los parámetros mencionados, para evidenciar las similitudes o las discrepancias, con las respuestas electrofisiológicas de los corazones de animales entrenados; todo ello con el fin de contribuir a dilucidar, al menos en parte, el papel del mencionado canal en los efectos protectores cardiovasculares del entrenamiento. Las propiedades y/o los parámetros analizados han sido: la refractariedad ventricular, determinando el periodo refractario funcional durante la arritmia (percentil 5 de los intervalos fibrilatorios) y a través del análisis espectral de la arritmia; la energía normalizada de la señal fibrilatoria (indicador de heterogeneidad electrofisiológica) y la respuesta del corazón en fibrilación a los choques eléctricos de ondas bifásicas y así determinar el “umbral desfibrilatorio”. Concluimos que 1. El efecto beneficioso del ejercicio físico crónico sobre la instauración de arritmias que amenazan la vida podría ser debido, al menos en parte, al incremento de la refractariedad miocárdica ventricular intrínseca observada en el presente trabajo, en situación de normoxia. 2. El mantenimiento de los valores de refractariedad, tras la oclusión coronaria, en la fase temprana de la isquemia, en los corazones de animales entrenados, contribuye a asentar que el ejercicio físico crónico parece mantener mejor el estatus metabólico de los cardiomiocitos. 3. Las modificaciones de los parámetros de refractariedad en la isquemia, en los corazones tratados con glibenclamida, parecen descartar la idea de que el entrenamiento protege bloqueando el canal. 4. El ejercicio físico crónico ejerce un efecto protector antiarrítmico dado el menor requerimiento de energía para revertir la fibrilación con choques. 5. La similitud de repuesta de los corazones tratados con glibenclamida y los de conejos entrenados, en el umbral desfibrilatorio, sugiere que el ejercicio opera a través del bloqueo del canal KATP. 6. Si la protección exhibida por el ejercicio físico crónico, opera a través del incremento de la corriente vehiculada por el canal KATP, que en opinión de la mayor parte de autores es arritmogénica, ¿cómo explicar que el ejercicio que exhibe protección antiarrítmica, lo hace a través de incrementar la corriente vehiculada por el mencionado canal, como se sostiene actualmente? The effect of applying a physical exercise protocol on the ventricular refractoriness, the heterogeneity electrophysiological and the reversibility of fibrillation after the application of electric shock of biphasic waves (during regional ischemia), has been investigated rabbit hearts which were isolated, perfused and in ventricular fibrillation (without interrupting global perfusion) in a situation of normally oxygenated perfusion and during regional ischemia. The effect of the infusion of the KATP channel blocker, glibenclamide, on the mentioned parameters, has been investigated in another group of rabbits and with the same methodology for the isolation of the heart, in normoxia and during regional ischemia, to show the similarities or the discrepancies with the electrophysiological responses of the hearts of trained animals. This shall help elucidate, at least in part, the role of the aforementioned channel in the cardiovascular protective effects of training. The analyzed properties and/or parameters were the following: the ventricular refractoriness, determining the functional refractory period during arrhythmia (5th percentile of fibrillatory intervals) and through spectral analysis of arrhythmia; the normalized energy of the fibrillatory signal (indicator of electrophysiological heterogeneity) and the response of the heart in fibrillation to the electric shocks of biphasic waves and thus determine the “defibrillation threshold”. We conclude that 1. The beneficial effect of chronic physical exercise on the establishment of life-threatening arrhythmias could be due, at least in part, to the increase in intrinsic ventricular myocardial refractoriness observed in the present study, in a situation of normoxia. 2. The maintenance of the refractoriness values, after coronary occlusion, in the early phase of ischemia, in the hearts of trained animals, contributes to establishing that chronic physical exercise seems to better maintain the metabolic status of cardiomyocytes. 3. The modifications of the refractory parameters in ischemia, in hearts treated with glibenclamide, seem to reject the idea that training protects by blocking the channel. 4. Chronic physical exercise exerts an antiarrhythmic protective effect given the lower energy requirement to reverse shock fibrillation. 5. The similarity of response of the hearts treated with glibenclamide and those of trained rabbits, in the defibrillation threshold, suggests that the exercise operates through the blockade of the KATP channel. 6. If the protection exhibited by chronic physical exercise operates through the increase in the current carried by the KATP channel, which in the opinion of most authors is arrhythmogenic, how can could we explain that the exercise that exhibits antiarrhythmic protection, does it by increasing the current carried by the aforementioned channel, as it is currently supported?

La diabetes es un trastorno metabólico complejo que se asocia con resistencia a la insulina, señalización de insulina alterada, disfunción de las células β, niveles anormales de glucosa, metabolismo lipídico alterado, inflamación subclínica y aumento del estrés oxidativo. La Organización Mundial de la Salud estima que el número de pacientes diabéticos se ha multiplicado por cuatro en los últimos cuarenta años. Las complicaciones que se derivan de ella son la principal causa de discapacidad y muerte en los pacientes diabéticos. El estrés oxidativo generado por la diabetes y el mal control metabólico, juegan un papel clave en el desarrollo de la retinopatía diabética (RD), una complicación diabética común que genera pérdida de visión y en el peor de los casos, ceguera. La pérdida del control homeostático glucémico puede afectar a todas las estructuras anatómicas oculares, sin embargo, la retina es especialmente sensible, por lo que es la estructura ocular más afectada en el desarrollo de la RD. Las alteraciones afectan tanto a las células nerviosas como a las vasculares, por lo que se la considera una complicación neurovascular. La gran problemática de esta patología reside en que permanece asintomática hasta que alcanza estadios avanzados, siendo la única estrategia terapéutica en las primeras etapas de la enfermedad un control estricto de los factores de riesgo para prevenir el desarrollo de la patología o detener su progresión. Los tratamientos actualmente disponibles son aplicables sólo en etapas muy avanzadas donde la vista se encuentra amenazada, e incluyen las inyecciones intravítreas de corticosteroides y agentes anti-VEGF o la fotocoagulación con láser. Estos tratamientos presentan una administración incómoda para los pacientes, además de numerosos efectos secundarios a largo plazo. Por ello es importante enfocar la investigación en la prevención de esta enfermedad con la búsqueda de terapias alternativas. En este aspecto cobran importancia el uso de los polifenoles como potencial tratamiento de la RD. El presente estudio muestra al pterostilbeno (Pter), un estilbeno natural con gran actividad antioxidante y con efectos beneficiosos en diferentes patologías, incluida la diabetes, como un tratamiento preventivo del desarrollo de RD. Para este trabajo se marcaron como objetivos analizar la capacidad protectora y/o terapéutica del Pter frente a las alteraciones retinianas inducidas por la hiperglucemia, y su posible mecanismo de acción en un modelo experimental animal de diabetes tipo I. Para ello se realizaron ensayos in vitro en diferentes líneas celulares de origen retiniano, e in vivo en conejos New Zealand con diabetes tipo I inducida. El Pter protegió las retinas de los conejos diabéticos contra el daño inducido por altos niveles de glucosa en sangre. El polifenol redujo el daño oxidativo de lípidos y proteínas, disminuyó la neurotoxicidad retiniana, y recuperó la actividad de las principales enzimas antioxidantes, mejorando de esta manera el estado redox. Además, la regulación redox por Pter se asoció con la activación de la vía PI3K/AKT/GSK3β/NRF2 y la inhibición de ERK1/2. También se presenta al Pter como un agonista de la proteína de membrana GLP1R, que es capaz de inducir la activación de esta vía protectora. Nuestros resultados muestran, por tanto, que el Pter es un poderoso agente protector que puede retrasar el desarrollo temprano de la RD. Diabetes is a complex metabolic disorder associated with insulin resistance, impaired insulin signalling, β-cell dysfunction, abnormal glucose levels, altered lipid metabolism, subclinical inflammation and increased oxidative stress. The World Health Organisation estimates that the number of diabetic patients has quadrupled in the last forty years. The resulting complications are the leading cause of disability and death in diabetic patients. The oxidative stress generated by diabetes and poor metabolic control play a key role in the development of diabetic retinopathy (DR), a common diabetic complication that leads to vision loss and in the worst cases, blindness. Loss of glycaemic homeostatic control can affect all ocular anatomical structures, but the retina is particularly sensitive, making it the ocular structure most affected in the development of DR. The alterations affect both nerve and vascular cells, which is why it is considered a neurovascular complication. The major problem with this pathology is that it remains asymptomatic until it reaches advanced stages, the only therapeutic strategy in the early stages of the disease being strict control of risk factors to prevent the development of the pathology or halt its progression. Currently available treatments are applicable only in very advanced stages where sight is threatened, and include intravitreal injections of corticosteroids and anti-VEGF agents or laser photocoagulation. These treatments are uncomfortable for patients to administer and have numerous long-term side effects. It is therefore important to focus research on the prevention of this disease with the search for alternative therapies. In this respect, the use of polyphenols as a potential treatment for DR is important. The present study shows pterostilbene (Pter), a natural stilbene with high antioxidant activity and beneficial effects in different pathologies, including diabetes, as a preventive treatment for the development of DR. The objectives of this study were to analyse the protective and/or therapeutic capacity of Pter against retinal alterations induced by hyperglycaemia, and its possible mechanism of action in an experimental animal model of type I diabetes. For this purpose, in vitro assays were performed in different cell lines of retinal origin, and in vivo in New Zealand rabbits with induced type I diabetes. Pter protected the retinas of diabetic rabbits against damage induced by high blood glucose levels. The polyphenol reduced oxidative damage to lipids and proteins, decreased retinal neurotoxicity, and restored the activity of key antioxidant enzymes, thereby improving redox status. Furthermore, redox regulation by Pter was associated with activation of the PI3K/AKT/GSK3β/NRF2 pathway and inhibition of ERK1/2. Pter is also shown to be an agonist of the membrane protein GLP1R, which is able to induce activation of this protective pathway. Our results therefore show that Pter is a potent protective agent that can delay the early development of DR.

En el cerebro adulto de la mayoría de los mamíferos el nicho neurogénico con mayor capacidad neurogénica es la zona ventricular-subventricular (V-SVZ). Esta región se encuentra distribuida a lo largo de las paredes de los ventrículos laterales. La capacidad neurogénica que presenta esta región se debe a la presencia de las denominadas células B. Además nos encontramos con otros tipos celulares como son las células tipo C o progenitores intermedios, las tipo A o migradoras y las tipo E o células ependimarias. Las células tipo B son capaces de dar lugar a las células tipo C que finalmente generan las células tipo A. En condiciones fisiológicas, las células tipo A migran principalmente hasta los bulbos olfatorios y una vez allí dan lugar a distintos tipos de interneuronas. Este proceso de migración se produce de manera tangencial a través de la vía migratoria rostral (RMS). Sin embargo, estas células también son capaces de migrar a otras zonas como el cuerpo calloso y generar otros tipos neurales como oligodendrocitos y astrocitos. Este proceso de neurogenesis se ha observado que se encuentra disminuido en pacientes de enfermedad de Alzheimer (EA) y en distintos modelos, pero se desconoce el motivo. Esta enfermedad se ha convertido en una gran preocupación en los últimos años debido al gran aumento de su incidencia como consecuencia del envejecimiento de la población. Los principales rasgos fisiopatológicos de la enfermedad de Alzheimer son la formación de placas amiloides, generadas por la agregación del péptido Ab, y la de los ovillos neurofibrilares como consecuencia de la hiperfosforilación de la proteína Tau. En ambos casos provocan una serie de procesos patológicos que van a desembocar en neurodegeneración. Además, existe una íntima relación entre el ciclo celular tanto con la neurogénesis, como con la EA. En este trabajo se pretende abordar la relación entre la EA y el proceso de neurogénesis que se produce en la V-SVZ. Para ello se utilizó un modelo murino de EA, el doble transgénico APP/PS1. Los resultados obtenidos demostraron que las células tipo A se encuentran acumuladas en la V-SVZ. De tal manera que esta acumulación se relaciona con una disminución de este tipo de células a lo largo de la RMS y de neuronas maduras en los bulbos olfatorios. Además, se traduce en una pérdida de capacidad olfativa. Para profundizar analizamos el ciclo celular de las células de la V-SVZ y vimos que una parte significativa se encuentran paradas en la fase G1. Esto podría deberse a un aumento de los niveles de Cdh1. Cdh1 se sobreexpresa como consecuencia de la respuesta al daño del ADN. Esta parada provoca que las células tipo A entren en senescencia. En conclusión, en ratones APP/PS1 las células tipo A entran en senescencia y pierden su capacidad de migrar a lo largo de la RMS. Esto contribuye a cambios morfológicos en la V-SVZ y a un fallo en la regeneración de los bulbos olfatorio y por tanto, de la capacidad de olfacción. In the adult mammalian brain, the ventricular-subventricular zone (V-SVZ) is the area with the greatest neurogenic capacity. This region is distributed along the walls of the lateral ventricles. The neurogenic capacity of this region is due to the presence of so-called neural stem cells (NSCs) or type B cells. In addition, there are other cell types such as C cells or intermediate progenitors, A cells or migrating cells, and E cells or ependymal cells. Type B cells are capable of giving rise to type C cells, which ultimately generate type A cells. Under physiological conditions, type A cells migrate mainly to the olfactory bulbs, where they give rise to different types of interneurons. This migration process occurs tangentially via the rostral migratory pathway (RMS). However, these cells are also able to migrate to other areas such as the corpus callosum and give rise to other neural types such as oligodendrocytes and astrocytes. This process of neurogenesis is decreased in Alzheimer's disease (AD) patients and in different models, but the cause is unknown. AD has become a major concern in recent years due to the large increase in its incidence as a consequence of the aging of the population. The main pathophysiological features of AD are the formation of amyloid plaques, generated by the aggregation of A peptide, and the formation of neurofibrillary tangles as a consequence of the hyperphosphorylation of Tau protein. In both cases, they cause a series of pathological processes that lead to neurodegeneration. Moreover, there is also a close link between the cell cycle and both neurogenesis and AD. The principal aim of this doctoral thesis is to provide some insight into the link between AD and the process of neurogenesis that occurs in the V-SVZ. We show, in a murine model of AD (the APP/PS1), that type A cells accumulate in the V-SVZ. Moreover, the accumulation is related to a decrease of type A cells in the RMS and to the amount of mature neurons in the olfactory bulbs. These changes translate into an increase in the index of odor discrimination. The cell cycle analysis revealed that a significant amount of V-SVZ cells are arrested in the G1 phase which could be due to an increase in Cdh1 levels. Cdh1 overexpression may be a consequence of the DNA damage response induced by the presence of Ab and/or oxidative stress. We also observe an increase of type A cells in a senescence state. Finally, we find an increase in apoptotic astrocytes which also could contribute to the failure in the neural migration. In conclusion, in the murine model of AD, APP/PS1, type A cells enter in a senescence state and lose their ability to migrate along the RMS. This contributes to morphological and functional changes in the V-SVZ and to a failure of olfactory bulb regeneration and thus olfactory capacity.

BackgroundPulmonary arterial (PA) stiffness has an essential contribution to the right ventricular (RV) failure pathogenesis. A comprehensive and multiparameter risk assessment allows predicting mortality and guiding treatment decisions in PA hypertension (PAH). We characterize PA remodeling with intravascular ultrasound (IVUS) in prevalent and stable patients with PAH according to the ESC/ERS risk table and analyze the RV-PA coupling consequences.MethodsTen control subjects and 20 prevalent PAH adult patients underwent right heart catheterization (RHC) with simultaneous IVUS study. We estimated cardiac index (CI), pulmonary vascular resistance, and compliance (PVR, PAC) by standard formulas. From IVUS and RHC data, PA diameter, wall thickness/luminal diameter ratio, and indexes of stiffness (pulsatility, compliance, distensibility, incremental elastic modulus - Einc-, and the stiffness index β) were measured. We evaluated RV-PA coupling by the ratio of tricuspid annular plane systolic excursion to systolic pulmonary arterial pressure (TAPSE/sPAP). The individual average risk was calculated by assigning a score of 1 (low-risk -LR-), 2 (intermediate-risk -IR-), and 3 (high-risk -HR-) for each of seven variables (functional class, six-minute walking test, brain natriuretic peptide, right atrial area and pressure, CI, and PA oxygen saturation) and rounding the average value to the nearest integer.ResultsAll PA segments interrogated showed increased vessel diameter, wall cross-sectional area (WCSA), and stiffness in patients with PAH compared to control subjects. 45% corresponded to LR, and 55% corresponded to IR PAH patients. The different measurements of PA stiffness showed significant correlations with TAPSE/sPAP (r = 0.6 to 0.76) in PAH patients. The IR group had higher PA stiffness and lower relative WCSA than LR patients (P < 0.05), and it is associated with a lower PAC and TAPSE/sPAP (P < 0.05).ConclusionIn prevalent PAH patients, the severity of proximal PA remodeling is related to the risk stratification and associated with PAC and RV-PA coupling impairment beyond the indirect effect of the mean PA pressure. The concomitant assessment of IVUS and hemodynamic parameters at diagnosis and follow-up of PAH patients could be a feasible and safe tool for risk stratification and treatment response of the PA vasculopathy during serial hemodynamic measurements.

Se ha investigado, en un modelo de infarto crónico (seis semanas) en conejo, el efecto de un inhibidor de las desacetilasas de histonas, el ácido valproico, sobre la magnitud del miocardio infartado y sobre determinadas propiedades electrofisiológicas y mecánicas del miocardio ventricular. El modelo experimental de infarto ha sido desarrollado en conejos macho Nueva Zelanda, toracotomizados y anestesiados a los que se les ocluyó la arteria coronaria circunfleja (una hora) a mitad de su trayecto epicárdico, seguida de reperfusión. Tras seis semanas de evolución del proceso necrótico, se sacrificó a los conejos, se les extrajo el corazón y se ubicó en un sistema de perfusión tipo Langendorff, para proceder al estudio electrofisiológico mediante la ubicación, en el epicardio ventricular izquierdo, de una placa multielectrodo (256 electrodos) de registro, de un electrodo de registro auricular y otro de estimulación ventricular. Las determinaciones fueron: 1.- Periodos refractarios ventriculares efectivo y funcional, mediante la aplicación del test del extra-estímulo; 2- Inducibilidad de fibrilación ventricular, aplicando el test del extra-estímulo en cuatro diferentes zonas del ventrículo; 3.- Parámetros determinados durante la fibrilación ventricular (sin interrumpir la perfusión): Periodo refractario funcional (percentil 5 de los intervalos fibrilatorios), coeficiente de variación del periodo refractario; 4.- La extensión del infarto mediante tinción macroscópica, finalizado el estudio electrofisiológico. Durante el periodo de evolución del infarto y antes del estudio electrofisiológico se determinaron indicadores bioquímicos de lesión miocárdica, en suero, y se efectuaron controles ecocardiográficos. Los resultados y las conclusiones fueron: 1) El modelo de infarto desarrollado, validado con indicadores bioquímicos en suero e identificación por tinción macroscópica, ha posibilitado la realización del presente estudio y se considera que puede ser de interés para investigaciones de características similares; 2) el ácido valproico ha exhibido un efecto protector manifestado por su capacidad para reducir la magnitud del daño miocárdico; 3) el ácido valproico ha mostrado capacidad para prevenir el desencadenamiento de la fibrilación ventricular; 4) la protección anti arrítmica exhibida por el ácido valproico puede relacionarse con su capacidad para reducir la heterogeneidad electrofisiológica, evidenciada en el presente trabajo; 5) el efecto beneficioso del ácido valproico se ha manifestado asimismo sobre el remodelado ventricular. Por tanto, se concluye de modo general que el ácido valproico ha exhibido un efecto protector sobre el miocardio isquémico. Dicho efecto protector podría estar ligado a la prevención de la fibrosis derivada de su capacidad para inhibir las desacetilasas de histonas. The effect of an inhibitor of histone deacetylases, valproic acid, on the magnitude of the infarcted myocardium and on certain electrophysiological and mechanical properties of the ventricular myocardium has been investigated in a rabbit model of chronic infarction (six weeks). The experimental model of infarction has been developed in New Zealand male rabbits, thoracotomized and anesthetized, in which the circumflex coronary artery was occluded (one hour) in the middle of its epicardial course, followed by reperfusion. After six weeks of evolution of the necrotic process, the rabbits were sacrificed, the heart was extracted and placed in a Langendorff-type perfusion system, to proceed to the electrophysiological study by the location, in the left ventricular epicardium, of a multi-electrode plate (256 electrodes) recording, an atrial recording electrode and a ventricular pacing electrode. The determinations were: 1.- Effective and functional ventricular refractory periods, through the application of the extra-stimulus test; 2- Inducibility of ventricular fibrillation, applying the extra-stimulus test in four different areas of the ventricle; 3.- Parameters determined during ventricular fibrillation (without interrupting perfusion): functional refractory period (5th percentile of fibrillatory intervals), coefficient of variation of the refractory period; 4.- The extension of the infarct by macroscopic staining, after the electrophysiological study. During the infarct evolution period and before the electrophysiological study, biochemical indicators of myocardial injury were determined, in serum, and echocardiographic controls were carried out. The results and conclusions were: 1) The infarct model developed, validated with biochemical indicators in serum and identification by macroscopic staining, has made possible the realization of this study and it is considered that it may be of interest for investigations with similar characteristics; 2) valproic acid has exhibited a protective effect manifested by its ability to reduce the magnitude of myocardial damage; 3) valproic acid has shown the ability to prevent the onset of ventricular fibrillation; 4) the anti-arrhythmic protection exhibited by valproic acid may be related to its ability to reduce electrophysiological heterogeneity, evidenced in the present work; 5) the beneficial effect of valproic acid has also been manifested on ventricular remodeling. Therefore, it is generally concluded that valproic acid has exhibited a protective effect on the ischemic myocardium. This protective effect could be linked to the prevention of fibrosis derived from its ability to inhibit histone deacetylases.

La sepsis, disfunción orgánica potencialmente mortal causada por una respuesta descontrolada del huésped a la infección, va en aumento en los últimos años a nivel mundial y puede llegar a suponer el 50% de los ingresos en unidades de cuidados intensivos, siendo una las principales causas de morbimortalidad en pacientes críticos. Para lograr un diagnóstico precoz y definir una estratificación pronóstica, el clínico dispone de biomarcadores diagnósticos, y que monitorizan el tratamiento, como la procalcitonina (PCT), la proteína C reactiva (PCR) la interleukina 6 (IL-6). El estudio de nucleoproteinas y HMGB1 en sangre, resultantes del daño tisular inicial, han sido relacionadas con la patogénesis de la sepsis y se han postulado como biomarcadores de diagnóstico y pronóstico. El fracaso renal agudo séptico puede llegar a requerir técnicas continuas de remplazo renal (TCRR), que van a permitir extraer del torrente sanguíneo moléculas inflamatorias como interleukinas entre otras. Nuestra hipótesis de trabajo fue si las TCRR podían nucleoproteínas y HMGB1 en pacientes en shock séptico con fracaso renal agudo sometidos a TCRR durante las primeras 24 horas. El objetivo primario fue conocer la evolución de PCT, PCR, IL-6, nucleoproteínas y HMGB1. Los secundarios analizar dichos biomarcadores en función del tiempo de evolución de la sepsis y del control del foco séptico; evaluar su relación con las disfunciones orgánicas; y por último evaluar la mortalidad en función de los mismos. Diseñamos un estudio observacional prospectivo longitudinal en el Servicio de Medicina Intensiva del Hospital Dr Peset de Valencia, en el que incluimos a pacientes mayores de 18 años que cumplían criterios diagnósticos de shock séptico con terapias de remplazo renal, excluyendo pacientes inmunodeprimidos politraumatizados con neoplasias y con insuficiencia renal crónica previa. Definimos distintos tiempos para medir los biomarcadores: antes de iniciar la diálisis (T0), a la hora del inicio : pre-filtro (T1pre) post-filtro (T1post) y en efluente, y a las 24 horas. Para el análisis de nucleoproteínas se utilizó un ELISA “home-made” usando anticuerpos de captura y detección, para el de HMGB1 se utilizó el kit ELISA IBL. Se reclutaron 30 pacientes. La edad media fue de 67 años, las escalas APACHE II y SOFA al ingreso fueron de 28 10 y de 11  3. Se logró control del foco séptico previo en el 72% de los pacientes. Entre las disfunciones orgánicas, mejoraron significativamente la escala SOFA, el fracaso cardiovascular y renal, y el equilibrio ácido base. Las concentraciones iniciales de nucleoproteínas y HMGB1 fueron elevadas y no se modificaron por las TCRR. PCT e IL-6 descendieron de manera global. Las nucleoproteínas y HMGB1 tuvieron valores más elevados en sepsis más precoces. Hubo correlación positiva entre PCT, IL-6, nucleoproteínas y HMGB1 con las disfunciones orgánicas, además nucleoproteínas y los biomarcadores clásicos se correlacionaron también. Los fallecidos en UCI presentaron concentraciones más elevadas de HMGB1 a las 24 horas de iniciar TCRR. El desarrollo de un algoritmo diagnóstico basado en el conjunto de resultados presentados, asociado con las escalas de evaluación clínica y la información microbiológica podrían dar lugar a un nuevo paradigma a la hora de diagnosticar al paciente séptico. Así como mejorar el criterio de administración de la TCRR Sepsis, a life-threatening organ dysfunction caused by an uncontrolled host response to infection, has been on the rise in recent years worldwide and can account for 50% of admissions to intensive care units, being one of the main causes of morbidity and mortality in critically ill patients. To achieve an early diagnosis and define a prognostic stratification, the clinician has diagnostic biomarkers that monitor treatment, such as procalcitonin (PCT), C-reactive protein (CRP) and interleukin 6 (IL-6). The study of nucleoproteins and HMGB1 in blood, resulting from the initial tissue damage, have been related to the pathogenesis of sepsis and have been postulated as diagnostic and prognostic biomarkers. Acute septic kidney failure may require continuous renal replacement techniques (RCRT), which will allow inflammatory molecules such as interleukins, among others, to be removed from the bloodstream. Our working hypothesis was whether TCRR could nucleoproteins and HMGB1 in patients in septic shock with acute renal failure who underwent TCRR during the first 24 hours. The primary objective was to know the evolution of PCT, CRP, IL-6, nucleoproteins and HMGB1. The secondary ones analyze said biomarkers according to the time of evolution of sepsis and the control of the septic focus; evaluate its relationship with organic dysfunctions; and finally to evaluate mortality based on them. We designed a longitudinal prospective observational study in the Intensive Medicine Service of the Dr Peset Hospital in Valencia, in which we included patients over 18 years of age who met diagnostic criteria for septic shock with renal replacement therapies, excluding polytraumatized immunosuppressed patients with neoplasms and previous chronic kidney failure. We define different times to measure biomarkers: before starting dialysis (T0), at the start time: pre-filter (T1pre) post-filter (T1post) and in effluent, and at 24 hours. For nucleoprotein analysis, a “home-made” ELISA was used using capture and detection antibodies, for HMGB1 the IBL ELISA kit was used. 30 patients were recruited. The mean age was 67 years, the APACHE II and SOFA scales at admission were 2810 and 113. Control of the previous septic focus was achieved in 72% of the patients. Among organic dysfunctions, the SOFA score, cardiovascular and renal failure, and acid-base balance improved significantly. The initial concentrations of nucleoproteins and HMGB1 were high and were not modified by the TCRRs. PCT and IL-6 decreased globally. Nucleoproteins and HMGB1 had higher values ​​in earlier sepsis. There was a positive correlation between PCT, IL-6, nucleoproteins and HMGB1 with organic dysfunctions, in addition nucleoproteins and classical biomarkers were also correlated. Those who died in the ICU had higher concentrations of HMGB1 24 hours after initiating CRRT. The development of a diagnostic algorithm based on the set of results presented, associated with the clinical assessment scales and microbiological information could lead to a new paradigm when diagnosing the septic patient. As well as improving the criteria for administering the TCRR

La diabetes mellitus (DM) presenta un problema de salud pública a nivel mundial. La DM es un grupo de enfermedades metabólicas heterogéneas asociadas a alteraciones en el metabolismo glucídico, lipídico y proteico y inflamación sistémica crónica de bajo grado. Además, está caracterizada por un estado de hiperglucemia secundaria a un defecto absoluto o relativo en la secreción de insulina por parte de las células-β del páncreas. Tanto en la DM tipo 1 como en la DM de tipo 2 (DM1 y DM2) la hiperglucemia, la inflamación sistémica y el estrés oxidativo, son unos de los mayores factores predisponentes a la disfunción endotelial y a las enfermedades cardiovasculares. En los últimos años se han desarrollado como tratamiento farmacológico de la DM otro grupo de fármacos entre los que se incluyen los inhibidores del cotransportador SGLT-2 (iSGLT2). Gracias a su mecanismo de acción, los i-SGLT2 favorecen un mejor control glucémico modulando la disfunción mitocondrial, la cual es asociada a la activación del inflamasoma NLRP3 en la DM2. A tal fin, en la presente tesis doctoral nos planteamos investigar sobre diversos aspectos donde existen vacíos en el conocimiento. Por lo tanto, hemos establecido los siguientes objetivos específicos: 1. Evaluar las interacciones leucocitos-endotelio y explorar tal relación y su correlación con la producción ROS y la disfunción mitocondrial en leucocitos de pacientes con DM1 y sus respectivos controles. 2. Evaluar el papel del control glicémico en la activación del inflamasoma NLRP3 en pacientes con DM2. 3. Evaluar el efecto del iSGLT2 empagliflozina sobre el perfil inflamatorio y la respuesta antioxidante en leucocitos procedentes de pacientes con DM2 y sus respectivos controles. En la presente tesis doctoral, hemos observado que la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo y el control glucémico pueden modular las dinámicas y la función de los leucocitos en los pacientes con DM1 y DM2, favoreciendo las interacciones entre los leucocitos y las células endoteliales vasculares provocando junto a la inflamación de bajo grado danos vasculares. Además, los resultados apoyan la hipótesis que los pacientes DM2 tratados con Empagliflozina mejoran el perfil inflamatorio. En conclusión, los datos obtenidos sugieren que un buen manejo del control glucémico y de la inflamación junto al utilizo de los iSGLT2 podría prevenir también otras comorbilidades asociadas a la DM2. Diabetes mellitus (DM) has been recognized as one of the four major non-communicable diseases widespread worldwide. Its multifactorial aetiology leads to impaired carbohydrate and fat metabolism, prolonged and inappropriate hyperglycaemia, chronic low-grade inflammation, as well as defects in insulin action and/or secretion. Accumulating evidence suggests that hyperglycaemia, systemic inflammation and oxidative stress are some of the main common features of both type 1 and 2 diabetes (T1D and T2D), thus acting as key factors in the development of DM associated macro- and microvascular complications. Over the last few years, inhibitors of sodium-glucose co-transporter type 2 (iSGLT2) have received growing attention as new oral antidiabetic drugs. Their unique mechanism of action results in improved glucose control by modulating mitochondrial dysfunction, which is associated with NLRP3 inflammosome activation in T2D. With this aim in mind, we established the following objectives: 1. To assess the relationship between the inflammatory/adhesive process in the vascular wall and intracellular mechanisms in T1D patients, and explore its relevance in ROS production and mitochondrial impairment. 2. To explore the role played by glycaemic control in NLRP3 inflammasome activation in T2D patients. 3. To evaluate beneficial effects of iSGLT2 Empagliflozin treatment on glycaemic state, systemic inflammation and antioxidant properties in leukocytes in the peripheral blood (PMNs) in T2D patients. The findings of the current doctoral thesis reveal that mitochondrial dysfunction, oxidative stress and glycaemic control affect leukocyte dynamics and function in both T1D and T2D patients by promoting the interaction between these cells and the vascular endothelium and therefore vessels damage due to low grade inflammation. Moreover, our data support the hypothesis that treatment of T2D patients with Empagliflozin ameliorates the disease’s inflammatory profile. Together, these findings suggest that adequate management of the glycaemic state and inflammation and the use of iSGLT2 can prevent the onset of the atherosclerotic process and, consequently, delay the development of DM-associated vascular complications.

La tendinopatía es uno de los problemas de tendón más frecuente de lesión en la actualidad. En el caso de miembros superiores, la alteración en los tendones es bastante significativa tanto en deportistas como en personas que no practican deporte. Sin embargo, hay pocos estudios que reflejen cómo repercute esto en las personas que lo padecen. Objetivos: el objetivo de este estudio es examinar y comparar la actividad electromiografia, la fuerza y la calidad de vida en personas con alteración tendinosa epicondílea del músculo extensor corto de carpo entre personas sanas, además de comprobar el efecto de la punción seca como rama de tratamiento en la actividad muscular, fuerza y dolor. Material y métodos: un total de 32 participantes se ofrecieron voluntarios al estudio. Fueron divididos en dos grupos, según si eran sujetos sanos o con alteración tendinosa. Se realizaron mediciones electromiográficas y recogida de valores de fuerza y se midió el efecto de la punción seca tanto en electromiografías, fuerza y dolor y cumplimentación de los cuestionarios PRTEE y DASH. Resultados: no se encontraron diferencias significativas en las electromiografías ni en fuerza entre los grupos. En cambio, los resultados de los cuestionarios PRTEE si fueron diferentes entre ambos grupos. Se muestran diferencias estadísticamente significativas en niveles de fuerza y dolor con pacientes tratados por punción seca. Por el contrario, no hubo diferencias estadísticamente significativas en la electromiografía de superficie para el músculo extensor radial del carpo después de tratamiento con punción seca. Conclusiones: el tratamiento por punción seca a pacientes con epicondilitis genera una mejoría con respecto al nivel de dolor y fuerza. La alteración tendinosa epicondílea del músculo extensor radial del carpo no modifica la actividad electromiográfica del paciente sano. Tendinopathy is one of the most frequent problems of tendon injury today. In the case of upper limbs, the alteration in the tendons is quite significant both in athletes and in people who do not practice sports. However, there are few studies that reflect how this affects people who suffer from it. Objectives: The objective of this study is to examine and compare the electromyography activity, strength and quality of life in people with epicondyle tendon alteration of the extensor carpi brevis muscle and healthy people, and to verify the effect of dry needling as a treatment branch in muscle activity, strength and pain. Material and Methods: a total of 32 participants volunteered for the study. They were divided into two groups, according to whether they were healthy subjects or those with tendon disorders. Electromyographic measurements and collection of force values were performed and the effect of dry needling was measured both in electromyography, force and pain and completion of the PRTEE and DASH questionnaires. Results: no significant differences were found in electromyography and strength. In contrast, the results of the PRTEE questionnaires were different between the two groups. Statistically significant differences are shown in levels of force and pain with patients treated by dry needling. In contrast, there were no statistically significant differences in surface electromyography for the extensor carpi radialis muscle after dry needling treatment. Conclusions: dry needling treatment in patients with epicondylitis generates an improvement with respect to the level of pain and strength. The epicondíleal tendon alteration of the extensor carpi radialis muscle does not modify the electromyographic activity of the healthy patient.

Las alteraciones torsionales de fémur son una de las causas de inestabilidad patelofemoral y de dolor anterior de rodilla. Debido a la dificultad para la predicción de los efectos de la osteotomía sobre la deformidad inicial, actualmente las osteotomías desrotadoras femorales son una técnica muy exigente tanto a nivel de su indicación como su ejecución. No obstante, junto con las osteotomías desrotadoras tibiales, son las que mayor capacidad de corrección del eje axial albergan. En la presente tesis, proponemos un protocolo de trabajo, desde su diagnóstico a su aplicación, para facilitar su implementación y poder disponer en cualquier centro de las ventajas que esta técnica aporta. Para ello, y debido a la enorme variabilidad existente en la anatomía femoral, presentamos un método de medición de la torsión femoral que permita su cuantificación en un entorno de diseño 3D doméstico, de modo que se pueda medir con certeza la deformidad antes y tras el diseño virtual de la osteotomía, pudiendo así predecir el efecto de ésta sea cual sea su diseño y sobre cualquier deformidad inicial en los tres planos del espacio. Posteriormente, utilizamos la distancia de Hausdorff-Bescovitch para el análisis del origen de la torsión y por lo tanto para el establecimiento del eje sobre el que realizar la corrección. Por último, empleamos la metodología 3D por FDM para la generación de biomodelos 3D que puedan ser esterilizados con autoclave convencional, para que puedan ser utilizados durante la cirugía para mejorar la reproducibilidad de la técnica previamente planificada en un entorno tridimensional.

En los últimos años se ha incrementado el uso de técnicas de biología molecular para mejorar el diagnóstico y conocer mejor la etiología del CP (cáncer pulmonar), debido a que la posibilidad de padecerlo ha sido definida como la interrelación entre la exposición a carcinógenos ambientales y la susceptibilidad individual determinada genéticamente (D’Amico et al., 1999). Dicha susceptibilidad genética es la que resulta determinante para entender por qué, siendo el tabaco responsable de más del 90% de los CP en el hombre y del 80% en la mujer, sólo un 11-12% de los fumadores desarrollan un cáncer (Kratz et al., 2012). Sin embargo, comprender qué factores genéticos determinan una mayor propensión a desarrollar un CP es una tarea compleja. Estudios previos han mostrado que el riesgo genético está determinado por numerosos polimorfismos, cada uno de ellos de baja penetrancia (estimada en un 1% de la población general). Cuando varios de estos polimorfismos coinciden en un individuo concreto definen el riesgo cuantitativo, aunque siempre en relación con la dosis de exposición a los carcinógenos (Wheatley-Price et al., 2008). Además, por el momento tampoco se conoce bien el agrupamiento genético que pueda definir el riesgo de cada tipo de CP (Mok et al., 2009). Existen diversos factores pronósticos, sobre todo de tipo morfológico y molecular, que pueden condicionar la supervivencia de las distintas formas de cáncer y que no se tienen en cuenta en la clasificación TNM. En el CP la utilidad del sistema TNM también ha sido cuestionada, ya que no logra configurar grupos de pacientes con un pronóstico homogéneo, sobre todo en estadios precoces. La afectación metastásica a nivel ganglionar es el principal factor pronóstico en el carcinoma pulmonar localizado, habiéndose relacionado recientemente la activación aberrante de la transición epitelio - mesenquimal (EMT) con la conversión de un carcinoma no invasivo en un tumor de características metastásicas y de mal pronóstico. De hecho la EMT ha sido establecido como uno de los principales factores en la progresión del cáncer, la diseminación linfática y la aparición de metástais. Durante este proceso, las células pierden la expresión de marcadores epiteliales (como E-Cadherina) e incrementa la expresión de marcadores mesenquimales (como Vimentina o N-Cadherina). Dado que la micrometástasis por sí solas no se relacionan con el pronóstico pero si que muestran un 20% de recidivas, el análisis de las vias de EMT y sobretodo del papel del sistema inmune nos podría ayudar a diferenciar esas micrometástasis que van a progresar de las que no lo van a hacer. Una evaluación de la expresión de los marcadores de EMT en las micrometástasis moleculares localizadas en el ganglio centinela de pacientes con carcinoma pulmonar permitiría avanzar en el conocimiento de los procesos moleculares implicados en la metástasis durante la enfermedad. Por otro lado, un estudio paralelo de los niveles de expresión de los marcadores de las diferentes vías de control inmunológico y de las células inmunitarias infiltradas en el tejido tumoral pulmonar y en ganglio centinela de estos pacientes contribuiría a obtener información sobre nuevas dianas moleculares susceptibles de ser bloqueadas mediante inmunoterapia. MATERIAL Y MÉTODOS​En el estudio se incluyeron pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) para los cuales se programó cirugía para su tratamiento. Como paso preoperatorio, se realizó una estadificación rutinaria. Durante la cirugía se realizó un muestreo sistemático de los ganglios linfáticos en todos los pacientes. Tras la resección pulmonar, las muestras quirúrgicas (tumor primario y ganglios linfáticos) fueron evaluadas inmediatamente por un patólogo y se llevó a cabo la clasificación histopatológica de rutina y la estadificación patológica del tumor de acuerdo con las Revisiones en el Sistema Internacional para la Estadificación del Cáncer de Pulmón (Hsu et al., 2009). Se diseñó un estudio observacional longitudinal prospectivo no probabilístico de tipo consecutivo de entre aquellos sujetos que cumplían los criterios de inclusión.​Para analizar las variables como categóricas, los valores de expresión génica en tumor se clasificaron, en comparación con los tejidos normales adyacentes, como altos (>1) o bajos (0,05).​Por otra parte, también determinamos la presencia de micrometástasis en GC mediante IHQ, detectando la expresión de CK7 a nivel proteico en secciones de muestras incluidas en parafina. Es importante destacar que el 54% de las muestras con resultado negativo mediante IHQ resultaron ser positivas mediante qPCR, lo que podría explicarse por la mayor sensibilidad de la PCR respecto a la IHQ. Por el contrario, el 40% de muestras positivas por IHQ obtuvo un resultado negativo mediante qPCR, probablemente atribuible a la falta de células que expresan dicho marcador en la muestra de GC a analizar.​Tampoco podemos obviar que, a pesar de las diferencias entre las dos técnicas, observamos que la presencia micrometástasis detectada por qPCR no influye en la supervivencia de los pacientes. En nuestro trabajo no encontramos diferencias en la expresión de marcadores de EMT entre los tumores de los pacientes con micrometástasis en GC detectada mediante qPCR y los que no la presentaban. Del mismo modo, no encontramos diferencias en la expresión de CDH1 y CDH2 en tumores primarios con micrometástasis detectada por IHQ, aunque sí observamos una mayor expresión de SNAI1, VIM, ZEB1 y ZEB2. Por otra parte, en el análisis del estado molecular de la EMT del GC, observamos que la micrometástasis por qPCR e IHQ se relacionó con una alta expresión de CDH2 y un mayor número de pacientes con alta expresión de VIM. En cuanto al valor pronóstico, el análisis de supervivencia mostró un peor pronóstico en los pacientes con una baja ratio CDH1/CDH2 en GC (tanto SLE como SG). DISCUSIÓN Con todo, nuestros datos sugieren que la expresión de marcadores de EMT en GC se podría utilizar para mejorar la clasificación de los pacientes y predecir un pronóstico para los pacientes en estadio temprano de CP. Este análisis complementaría la evaluación histopatológica para estudiar la micrometástasis mediante métodos moleculares con mayor profundidad y así detectar aquellos pacientes de CP en estadio temprano que recaen pero que no son detectados mediante los análisis histopatológicos rutinarios. Por esto, pensamos que el estudio de la expresión de los marcadores de las diferentes vías de control inmunológico en el tumor y GC de los pacientes podría contribuir a identificar nuevas dianas susceptibles de ser bloqueadas mediante inmunoterapia. Además, la relación de la expresión de estos marcadores con las características clínico-patológicas de los pacientes podría ofrecer una mejor clasificación de la enfermedad y una mejora en la elección del tratamiento. En un primer análisis de los marcadores del sistema inmunitario en tejido tumoral, encontramos que alrededor del 60% de los pacientes mostraron una alta expresión de CD137 y GITR, mientras que menos del 20% mostraron una alta expresión de PD-1 y PD-L1. De todos los marcadores estudiados, únicamente CD27 y CD137 aparecieron en mayor frecuencia en los pacientes con micrometástasis positiva por qPCR. Por otra parte, el estudio mostró valores más altos de expresión de los marcadores CD27, CD28 y CD40 en los tumores de pacientes con un resultado positivo de micrometástasis por qPCR. La señalización mediante CD27 tiene un papel inmunitario importante y se podría usar como terapia antitumoral ya que se ha visto que linfocitos infiltrados en el tumor sólido expresan CD27 (Starzer y Berghoff, 2020).​El análisis de supervivencia mostró una menor SG de los pacientes con baja expresión de CD27 en tejido tumoral. Además, aquellos con una alta expresión de KIR, PD-1 y PD-L1 también mostraron menor supervivencia, en este caso SLE.​En cuanto al GC, observamos que un mayor número de pacientes con micrometástasis positiva por qPCR presentaba una alta expresión de los marcadores CD137 y LAG-3 y en el análisis de expresión de los marcadores del sistema inmunitario observamos que los pacientes con un resultado positivo de micrometástasis por qPCR mostraron mayores niveles de expresión de CD40, KIR, OX-40 y PD-L2. Como conclusión diremos que el estudio del perfil de expresión de los marcadores del sistema inmunitario nos permite establecer un mejor pronóstico y clasificación del paciente con el objetivo de mejorar el tratamiento con imnunoterapia.

La Fibrosis Pulmonar idiopática (FPI) está definida como una neumonía intersticial fibrosante crónica de causa desconocida, progresiva y fatal que afecta fundamentalmente a adultos mayores de 60 años, limitada a los pulmones y asociada con el patrón histopatológico de neumonía intersticial usual (NIU). La ausencia de manifestaciones específicas de la FPI supone un obstáculo para su detección temprana. Es una enfermedad de diagnóstico difícil y tardío, con un abordaje terapéutico de eficacia reducida. Estas características suscitan la necesidad de encontrar nuevos biomarcadores asociados a la fibrosis y nuevas dianas terapéuticas para un diagnóstico temprano e incrementar la calidad y esperanza de vida de los pacientes. La patogenia de la enfermedad conlleva una pérdida de células epiteliales alveolares, una proliferación de fibroblastos y su transformación a miofibroblastos, en un ambiente de remodelación de la matriz extracelular producida por un desequilibro de factores de secreción y solubles. Este microambiente fibrótico favorece la senescencia celular, la adquisición de fenotipo mesenquimal y/o asociado al miofibroblasto, así como cambios en el metabolismo celular. El fenotipo miofibroblasto, considerado efector del proceso fibrótico, juega un papel de enorme importancia debido a su capacidad de proliferación, migración, contracción y síntesis de colágeno y otras proteínas de la matriz extracelular. Resultados previos de nuestro grupo identifican la enzima metabólica NNMT como directora de la transformación epitelio-mesenquimal (EMT) en modelos de células epiteliales tumorales de cáncer de pulmón no microcítico resistentes a la terapia. Otros estudios describen su importancia en procesos similares asociados al cáncer gástrico, cáncer de próstata, cáncer de ovario y glioblastomas. La NNMT cataliza la metilación de la nicotinamida (NAM) y compuestos similares usando la S-adenosilmetionina (SAM) como dador de metilos para producir S-adenosilhomocisteína (SAH) y metilnicotinamida (1-MNA), modificando el metabolismo y la capacidad de metilación celular. Con estos antecedentes, nuestra hipótesis fue que la NNMT podría jugar un papel de relevancia en los procesos fibróticos asociados a la transformación fibroblasto-miofibroblasto (FMT) que se pudiese reflejar en el desarrollo clínico de los pacientes con FPI. Por tanto, nuestro objetivo ha sido estudiar la implicación de la NNMT en la FMT, la senescencia y el metabolismo de poblaciones de fibroblastos aislados de pacientes con FPI respecto a los fibroblastos control. Utilizando muestras clínicas de histología, también nos planteamos determinar si NNMT podría ser un biomarcador de la enfermedad. Se aislaron y cultivaron poblaciones de fibroblastos primarios procedentes de biopsias pulmonares de pacientes con FPI (N=15) y se compararon con poblaciones de fibroblastos obtenidos de pacientes con neumotórax como grupo control (N=30). Utilizando TGF-β1 como factor profibrótico e IL1β como factor antifibrótico y proinflamatorio, se caracterizaron estas poblaciones analizando parámetros asociados al proceso FMT, EMT y de senescencia. A continuación, mediante técnicas de transducción génica con lentivirus, se inhibió y se sobreexpresó la NNMT con objeto de evaluar su rol en estos procesos y su repercusión en el metabolismo celular. Finalmente, se analizó la presencia de NNMT en cortes histológicos procedentes de pacientes comparándola con otros marcadores fibróticos. Los resultados nos muestran que los fibroblastos de FPI presentan una sobreexpresión de marcadores fibróticos como el α-SMA, COL1A1 y COL1A2, así como de marcadores de senescencia (p16, p21 y actividad β-galactosidasa) respecto a los fibroblastos control. La inducción con TGF-β1 produjo un aumento en la expresión de marcadores fibróticos como el α-SMA, FN1, COL1A1 y COL1A2 y marcadores mesenquimales como la n-cadherina y SNAI1, tanto en fibroblastos fibróticos como control. En cambio, la IL1β provocó una disminución de estos marcadores en los fibroblastos fibróticos, pero no en los fibroblastos control. La actividad enzimática de la NNMT se mostró incrementada en fibroblastos de FPI respecto a los controles. Este resultado se corroboró al observar un aumento significativo de la expresión proteica y génica de dicha proteína en los fibroblastos fibróticos. La inhibición de NNMT en fibroblastos de FPI provocó una disminución en la expresión de marcadores fibróticos (α-SMA), mesenquimales (SNAI1 y vimentina) y de senescencia (p16, p21 y actividad β-galactosidasa) en estas poblaciones shNNMT respecto a las poblaciones control (shNT). En contraste, la sobreexpresión de NNMT en fibroblastos de FPI (NNMT) produjo un aumento significativo de los marcadores fibróticos, mesenquimales y de senescencia respecto a las poblaciones control (Flag). Respecto a la capacidad de cierre de la herida de los cultivos de fibroblastos, la represión y la sobreexpresión de NNMT produjo un incremento y una disminución del área cerrada por migración y/o proliferación respectivamente, comparado con fibroblastos control. Estudios de inmunofluorescencia en estas poblaciones con anticuerpos fluorescentes específicos para NNMT y α-SMA mostraron que ambos marcadores co-expresan, lo que podría indicar que tendrían una relación directa en la adquisición del fenotipo miofibroblastos y el desarrollo de la fibrosis. La modulación de los niveles de NNMT representaron un cambio metabólico en los fibroblastos fibróticos. Las poblaciones de fibroblastos con niveles elevados de NNMT mostraron una disminución de 1-MNA y NAM y un aumento de los metabolitos de la ruta de las poliaminas (espermina y espermidina). Sin embargo, los niveles de NAD+ no mostraron cambios entre los distintos grupos. Finalmente, los resultados de inmunohistoquímica obtenidos de cortes de tejido parafinado procedentes de pacientes con FPI nos mostraron que NNMT, al igual que α-SMA, se expresa en las zonas de fibrosis reactiva y no en tejido sano. En conclusión, nuestros resultados indican que la NNMT se expresa en muestras clínicas de pacientes con FPI y en fibroblastos obtenidos de los mismos. Además, los fibroblastos control y fibróticos sobreexpresan NNMT en ambientes profibróticos (TGF-β1) y esta expresión disminuye en ambientes antifibróticos (IL-1β). La sobreexpresión génica de NNMT aumenta el fenotipo fibrótico y senescente asociado a los fibroblastos y su represión lo disminuye. Todo ello apunta a que la NNMT juega un papel de relevancia en los procesos fibróticos, de senescencia y metabólicos asociados a los fibroblastos fibróticos y a la FPI y nos presenta a esta enzima como un marcador prometedor de fibrosis que podría constituir una diana terapéutica para el tratamiento de esta patología. Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) is defined as a chronic fibrosing interstitial pneumonia of unknown, progressive and fatal cause that mainly affects adults over 60 years of age, limited to the lungs and associated with the histopathological pattern of usual interstitial pneumonia (UIP). The absence of specific manifestations of IPF is an obstacle to its early detection. It is a disease of late and challenging diagnosis, with a therapeutic approach of reduced efficacy. These characteristics raise the need to find new biomarkers associated with fibrosis and new therapeutic targets for an early diagnosis and increase patients' quality and life expectancy. The pathogenesis of the disease involves a loss of alveolar epithelial cells, a proliferation of fibroblasts and their transformation to myofibroblasts in an environment of remodeling of the extracellular matrix produced by an imbalance of secretory and soluble factors. This fibrotic microenvironment favors cellular senescence, the acquisition of the mesenchymal phenotype and/or associated with the myofibroblast, as well as changes in cellular metabolism. The myofibroblast phenotype, considered an effector of the fibrotic process, plays a role of enormous importance due to its capacity for proliferation, migration, contraction and synthesis of collagen and other proteins of the extracellular matrix. Previous results from our group identify the metabolic enzyme NNMT as a director of epithelial-mesenchymal transformation (EMT) in models of non-small cell lung cancer tumor epithelial cells resistant to therapy. Other studies describe its importance in similar processes associated with gastric cancer, prostate cancer, ovarian cancer and glioblastomas. NNMT catalyzes the methylation of nicotinamide (NAM) and similar compounds using S-adenosylmethionine (SAM) as a methyl donor to produce S-adenosylhomocysteine (SAH) and methyl nicotinamide (1-MNA), modifying metabolism and cellular methylation capacity. With this background, we hypothesized that NNMT could play a relevant role in the fibrotic processes associated with fibroblast-myofibroblast transformation (FMT) that could be reflected in the clinical development of patients with IPF. Therefore, our objective has been to study the involvement of NNMT in FMT, senescence and metabolism of primary fibroblasts isolated from patients with IPF compared to control fibroblasts. Using clinical histology samples, we also considered whether NNMT could be a biomarker for the disease. Primary fibroblast cultures were isolated and cultured from lung biopsies of IPF patients (N = 15) and compared with fibroblast populations obtained from pneumothorax patients as a control group (N = 30). Using TGF-β1 as a profibrotic factor and IL-1β as an antifibrotic and pro-inflammatory factor, these populations were characterized by analyzing parameters associated with the FMT, EMT and senescence process. Next, using lentivirus gene transduction techniques, NNMT was inhibited and overexpressed to evaluate its role in these processes and its impact on cell metabolism. Finally, the presence of NNMT was analyzed in histological sections from patients, comparing it with other fibrotic markers. The results show us that IPF fibroblasts exhibit overexpression of fibrotic markers such as α-SMA, COL1A1 and COL1A2, and senescence markers (p16, p21 and β-galactosidase activity) compared to control fibroblasts. Induction with TGF-β1 produced an increase in the expression of fibrotic markers such as α-SMA, FN1, COL1A1 and COL1A2 and mesenchymal markers such as n-cadherin and SNAI1, both in fibrotic fibroblasts and controls. In contrast, IL-1β caused a decrease in these markers in fibrotic fibroblasts but not in control fibroblasts. The enzymatic activity of NNMT was shown to be increased in IPF fibroblasts compared to controls. This result was corroborated by observing a significant increase in the protein and gene expression of this protein in fibrotic fibroblasts. The inhibition of NNMT in IPF fibroblasts caused a decrease in the expression of fibrotic markers (α-SMA), mesenchymal (SNAI1 and vimentin) and senescence (p16, p21 and β-galactosidase activity) in shNNMT fibroblasts compared to the control ones (shNT). In contrast, the overexpression of NNMT in IPF fibroblasts (NNMT) produced a significant increase in fibrotic, mesenchymal and senescence markers compared to control fibroblasts (Flag). Regarding the wound closure capacity of fibroblast cultures, the repression and overexpression of NNMT produced an increase and a decrease in the area closed by migration and/or proliferation, respectively, compared to control fibroblasts. Immunofluorescence studies in these fibroblasts with fluorescent specific antibodies for NNMT and α-SMA showed that both markers co-express, which could indicate that they would have a direct relationship in the acquisition of the myofibroblast phenotype and the development of fibrosis. Modulation of NNMT levels represented a metabolic change in fibrotic fibroblasts. Fibroblast populations with high levels of NNMT showed a decrease in 1-MNA and NAM and an increase in metabolites of the polyamine pathway (spermine and spermidine). However, the levels of NAD + did not show changes between the different groups. Finally, the immunohistochemical results obtained from paraffin tissue sections from patients with IPF showed us that NNMT, like α-SMA, is expressed in reactive fibrosis areas and not in healthy tissue. In conclusion, our results indicate that NNMT is expressed in clinical samples from patients with IPF and in fibroblasts obtained from them. Furthermore, control and fibrotic fibroblasts overexpress NNMT in profibrotic environments (TGF-β1), and this expression is decreased in antifibrotic environments (IL-1β). NNMT gene overexpression increases the fibrotic and senescent phenotype associated with fibroblasts, and its repression decreases it. All of this points to the fact that NNMT plays an essential role in the fibrotic, senescence and metabolic processes associated with fibrotic fibroblasts and IPF and presents us with this enzyme as a promising fibrosis marker that could constitute a therapeutic target for the treatment of this pathology.

Desde los inicios de la medicina, se conoce la relación entre enfermedad y las variaciones de temperatura corporal, lo que ha llevado al estudio y desarrollo de técnicas de termometría, que permitiesen cuantificar dichos cambios de temperatura. Entre ellas, destaca la Termografía Infrarroja, que es una técnica de imagen inocua, ya que se basa en captar la emisión de radiación del infrarrojo que emite el cuerpo, es rápida de realizar y accesible, pues se puede realizar cerca del paciente, sin necesidad de desplazamientos ni sedación. Todas estas características hacen que sea una técnica recomendable para utilizar en la población pediátrica que, por su corta edad, es más vulnerable a las radiaciones ionizantes, a la separación de sus padres y a la necesidad de sedación. Este trabajo revisa en primer lugar las bases fisiológicas de la microcirculación cutánea, las limitaciones de la imagen médica convencional empleada en Pediatría, los aspectos básicos de la Termografía Infrarroja y sus aplicaciones en el campo de la Pediatría. La hipótesis de este trabajo es que la Termografía Infrarroja podría ser una herramienta útil para la práctica clínica pediátrica en patologías que alteran la microcirculación cutánea, como las anomalías vasculares (hemangiomas y malformaciones vasculares) y las complicaciones asociadas a los CVC (infección y trombosis). Su utilidad radica en 2 aspectos fundamentales, permitir el diagnóstico precoz de estas patologías y valorar la evolución de un paciente tras la administración de un tratamiento, detectando de manera temprana si el tratamiento es efectivo, o si existe alguna complicación asociada. Se realiza un estudio prospectivo en población pediátrica en el Hospital Clínico Universitario de Valencia, que se centra en analizar la correlación que existe entre la información que ofrece la Termografía Infrarroja con la clínica del paciente y con las técnicas de imagen estandarizadas utilizadas, en las 2 patologías antes mencionadas, la infección de catéteres venosos centrales y las anomalías vasculares. Se valoran las asimetrías térmicas entre la zona patológica y la sana, de manera cualitativa, y también cuantitativa, mediante 3 parámetros: TAM (diferencia entre temperaturas medias de la zona afecta y la sana); TAMáx (diferencia entre temperaturas máximas de la zona afecta y la sana), ambos en grados centígrados; e Índice Térmico (diferencia entre temperaturas medias entre la zona afecta y la sana, dividido entre la temperatura media de la frente), en porcentaje. También se comparan las imágenes termográficas con las fotografías y las pruebas convencionales (Ecografía, Resonancia Magnética, Radiografía…). Los resultados muestran asimetría térmica entre la zona patológica y la sana cuando existe patología que altera la microcirculación cutánea (infección de catéter venoso central y anomalías vasculares), que desaparece tras la instauración de un tratamiento cuando la evolución es favorable. Los parámetros TAM, TAMáx e Índice Térmico permiten facilitar el uso de la Termografía Infrarroja en la práctica médica diaria y reducir la variabilidad inter e intraobservador. La comparación de las imágenes termográficas con las imágenes fotográficas y pruebas convencionales, muestra en general adecuada correlación y aporta en muchas ocasiones información complementaria a la exploración clínica y a las pruebas de imagen habituales.

Introducción y Objetivos El ictus isquémico es un problema sanitario de primer orden que tiene una elevada prevalencia en la población y que es causa frecuente de muerte y discapacidad. El principal objetivo del tratamiento del ictus isquémico por oclusión de gran vaso en la fase aguda es recanalizar el vaso ocluido procurando una reperfusión precoz del tejido isquémico, siendo el tratamiento endovascular mediante trombectomía mecánica la técnica más efectiva de las actualmente implantadas en práctica clínica. Los objetivos principales de este estudio son analizar la efectividad y seguridad de esta técnica en nuestro medio e identificar marcadores pronósticos de evolución de los pacientes sometidos a dicho tratamiento. Material y Métodos Se diseña un estudio observacional con registro prospectivo de casos consecutivos de pacientes atendidos en nuestro centro con ictus isquémico agudo secundario a oclusión de gran vaso sometidos a trombectomía mecánica. Se realiza una caracterización etiológica de los pacientes. Se evalúa la influencia de factores demográficos, clínicos y radiológicos en el estado clínico precoz medido por la escala NIHSS, en el pronóstico funcional a 90 días medido con la escala mRS, en la frecuencia de transformación hemorrágica sintomática y no sintomática y en la mortalidad al alta y a 90 días. Resultados Se presenta el análisis descriptivo y de caracterización etiológica de la muestra, que incluye un total de 356 pacientes. Se presentan resultados de los análisis de efectividad, de seguridad y de pronóstico funcional del subgrupo de pacientes con ictus isquémico por oclusión de gran vaso intracraneal de circulación anterior (N:312). Se obtiene una buena recanalización (TICI 2b-3) en el 78,8% de pacientes, un porcentaje de independencia funcional a 90 días del 43,1% y de transformaciones hemorrágicas sintomáticas del 5,4%. La mortalidad a 90 días fue del 20,8%. Una buena recanalización se asoció a una mejor evolución clínica precoz, a un mayor porcentaje de independencia funcional a 90 días y a una reducción de la mortalidad a 90 días sin incremento de las complicaciones hemorrágicas globales, hemorrágicas radiológicamente graves o hemorrágicas con deterioro clínico. La buena colateralidad leptomeníngea tuvo un efecto favorable significativo sobre la evolución de la gravedad clínica y sobre el estado funcional a 90 días, de potencia similar a la que aporta una buena recanalización del vaso ocluido. Conclusiones El tratamiento endovascular del ictus isquémico agudo por oclusión de gran vaso intracraneal es eficaz y seguro en nuestro medio. La recanalización eficaz se asocia a una mejor evolución clínica precoz, a un mejor estado funcional a 90 días y a una menor mortalidad. La buena colateralidad leptomeníngea tiene en nuestra serie un efecto favorable sobre la gravedad clínica precoz y sobre el estado funcional a 90 días similar al que aporta una recanalización eficaz.

Revisión sistemática y metaanálisis de precisión diagnóstica. Contexto: La pancreatitis aguda grave supone hasta el 20% de los casos de pancreatitis aguda, con una mortalidad cercana al 25%, debida a la aparición de complicaciones locales y sistémicas. Se han propuesto múltiples sistemas y marcadores para predecir esta gravedad. Objetivo: Este trabajo buscó evaluar la capacidad de la proteína C reactiva, la procalcitonina y el dímero D para predecir la pancreatitis aguda grave, medida mediante escalas de gravedad. Métodos: Se realizó una revisión sistemática en Medline, CENTRAL, Embase, Web of Science, clinical trials, literatura gris y revisión de las referencias de artículos elegibles, diseñando previamente una estrategia de búsqueda. La búsqueda se actualizó con fecha 20/8/20. Los artículos elegibles incluyeron todo tipo de estudios, excepto series de casos, que compararon alguno de los marcadores (proteína C reactiva, procalcitonina y dímero D) con una escala de gravedad (Atlanta, APACHE II, Ranson…). Se excluyeron los estudios centrados en pancreatitis aguda postquirúrgicas y que solo incluían postCPRE. Posteriormente, se analizó el riesgo de sesgo mediante QUADAS-2, AMSTAR y R-AMSTAR según el diseño, y la calidad de los artículos mediante STARD y PRISMA. Se elaboraron recomendaciones GRADE con los resultados. Para el análisis cuantitativo se calcularon forest plot y curvas SROC, según modelo bivariante. Se usó para ello Revman 5 y STATA 15® . El estudio no fue financiado. Todas las fases se realizaron de forma independiente por dos autores, resolviendo las discrepancias entre ambos por un tercero. Resultados: Se incluyeron 19 estudios: 1 utilizó dímero D, 16 la proteína C reactiva y 9 la procalcitonina. La sensibilidad global para predecir la gravedad para la proteína C reactiva fue de 74.6% IC 95% (65.9- 81.7%), la especificidad del 77.4% IC 95% (66.5%-85.5%) y la DOR de 10.12 IC 95% (5.02-20.38). Para la procalcitonina la sensibilidad fue: 85.4% IC 95% (81-88%), la especificidad del: 75% IC 95% (50-89%) y la DOR: 17.5 IC 95% (5.27-58.47). En las curvas SROC se observó una amplia dispersión de los resultados. Respecto al análisis de la calidad, la misma fue muy baja en la mayoría de los estudios, llevando a unas recomendaciones GRADE de baja o muy baja calidad. Estos resultados fueron en consonancia con los publicados previamente, siendo la principal limitación la ausencia de ensayos clínicos aleatorizados que aumentarían la precisión de los resultados. Conclusiones: No existe evidencia para recomendar el uso de proteína C reactiva, procalcitonina y dímero D como predictores de la gravedad, con una baja calidad de la literatura y alto riesgo de sesgo

Although under physiological conditions ROS are essential for normal cell signaling, ROS overproduction under oxidative stress conditions may cause damage to biomolecules. Cysteine residues within proteins are often easily oxidized. Reversible cysteine oxidation is used as a mechanism of redox signaling and control of protein function. However, oxidative stress promotes oxidation of protein thiols, leading to the formation of mixed disulfides between proteins and low-molecular-weight thiols. Disulfide reductases such as thioredoxins can reduce disulfide bonds back to free thiols. Acute pancreatitis is currently one of the leading causes of hospital admission for gastrointestinal disorders, and its incidence has increased considerably over the last decade. Acute pancreatitis is an acute inflammatory process of the pancreas, which can affect other organs and systems. Our laboratory described disulfide stress associated with acute inflammatory processes, which is characterized by a decrease in GSH levels as well as protein cysteinylation and gamma-glutamylcysteinylation, without changes in protein glutathionylation. We found an increase in protein cysteinylation levels in TRP14 knockdown cells, and identified 42 proteins whose cysteinylation levels increased in TRP14 deficient cells, such as elongation factor 2 and peroxiredoxin 2. Besides, we demonstrated that cysteinylated Prx2 is inactive, and both TRP14 and Trx1 systems can reduce it and restore its activity. Unexpectedly TRP14 knockout mice showed lower levels of cysteinylated proteins than wild type sham mice in pancreas under basal conditions. However, upon acute pancreatitis a marked increase in protein cysteinylation levels together with cystine levels was observed in TRP14 knockout mice, while there was a decrease in protein cysteinylation levels in wild type mice. Protein gamma-glutamylcysteinylation also increased in TRP14 knockout mice with pancreatitis as well, but without changes in protein glutathionylation. Furthermore, the transsulfuration pathway and GSH synthesis were both induced in TRP14 knockout mice with pancreatitis avoiding GSH depletion. The mRNA expression of Trx1, TrxR1, Gr, as well as other NRF2 targets such as Nqo-1, Gclc, and Ho1 increased in pancreas from wild type mice upon acute pancreatitis, with further increases in pancreas from TRP14 knockout mice with pancreatitis correlated with nuclear translocation of NRF2. At the histological level, TRP14-deficient mice showed less tissue edema and inflammatory infiltrate in pancreas upon pancreatitis induction. Decreased pancreatic MPO activity was also observed in this group. Therefore, TRP14 and thioredoxin 1 exhibit de-cysteinylation activity, and TRP14 deficiency induces protein cysteinylation and gamma-glutamylcysteinylation, NRF2 activation as well as up-regulation of the transsulfuration pathway and GSH synthesis upon acute pancreatitis.

Tesis llevada a cabo para conseguir el grado de Doctor por la Universidad de Valencia.--2020-06-05, El ejercicio físico es un agente modulador de cambios relacionados con la salud en el ser humano, que participa en el mantenimiento de ésta y en la prevención de distintas enfermedades. A causa de esto, cada vez más se utiliza como herramienta para prevenir y tratar diferentes patologías. En la actualidad hay amplia evidencia que indica que la práctica de ejercicio físico, de manera regular, mejora la salud y reduce el riesgo de enfermedades relacionadas con la edad. Así mismo, ha sido establecida la relación inversa entre una vida físicamente activa y el riesgo de sufrir decline cognitivo, siendo la inactividad física uno de los principales factores de riesgo para padecer Alzheimer, lo que a su vez indica que podría ser prevenido. Aunque los mecanismos exactos por los cuales el ejercicio físico tiene efectos positivos a nivel cognitivo no se conocen completamente, se sabe que la síntesis y la liberación de factores neurotróficos y citocinas, a nivel cerebral y periférico, juegan un papel importante en la activación de las vías de señalización encargadas de regular la cognición. Entre los factores tróficos y biomarcadores relacionados con la función cognitiva, el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la Catepsina B (CTSB) y las sirtuínas (SIRT1, SIRT2, SIRT3 y SIRT6) han sido medidos en la presente tesis. Estos factores juegan un papel importante en distintos procesos relacionados con la neurogénesis hipocampal, sinaptogénesis, mantenimiento y diferenciación neuronal, axogénesis, dendrogénesis y angiogénesis, lo que a su vez permite que sean potenciadoras de eventos complejos como el aprendizaje, la memoria y la plasticidad cerebral. Objetivos: Nuestro objetivo principal fue determinar si la práctica, a largo plazo (35 ± 15 años), de un deporte de equipo como el rugby promueve el mantenimiento de la memoria en hombres de mediana edad. De igual forma, quisimos caracterizar los cambios en los factores tróficos y marcadores de inflamación, defensa antioxidante y daño oxidativo a nivel periférico, en sujetos sedentarios y activos, tanto jóvenes como de mediana edad. Metodología: Inicialmente reclutamos 60 voluntarios sanos entre 17 y 68 años de edad. Los sujetos fueron asignados a tres grupos diferentes: MSG [Middle-Aged Sedentary Group (Grupo sedentario de mediana edad), entre 47 y 67 años de edad; n = 25]; MTG [ Middle-Aged Trained Group (Grupo Entrenado de Mediana edad), entre 46 y 68 años de edad; n = 24] y YSG [Young Sedentary Group (Grupo Sedentario Joven), entre 17 y 21 años de edad; n = 21]. Sin embargo, tras los análisis de expresión génica decidimos reclutar un cuarto grupo que penamos nos podría aportar información relevante, para compararla con los demás grupos experimentales: YTG [Young Trained Group (Grupo Entrenado Joven), entre 18 y 25 años de edad; n = 16]. Los años de educación, el hábito tabáquico y la hiperglicemia fueron considerados al momento del reclutamiento para controlar el sesgo entre los grupos entrenados y sedentarios. Todos los participantes en el MTG eran jugadores de rugby aficionados que lo habían estado practicando durante 35 ± 15 años, mientras que los sujetos de YTG se ejercitaron regularmente durante los últimos siete años, aunque la frecuencia, duración e intensidad de su ejercicio fueron variadas. Los deportes practicados por el YTG incluyeron tenis, atletismo, fútbol y/o taekwondo.