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Spinareoviridae is a large family of icosahedral viruses that are usually regarded as non-enveloped with segmented (9–12 linear segments) dsRNA genomes of 23–29 kbp. Spinareovirids have a broad host range, infecting animals, fungi and plants. Some have important pathogenic potential for humans (e.g. Colorado tick fever virus), livestock (e.g. avian orthoreoviruses), fish (e.g. aquareoviruses) and plants (e.g. rice ragged stunt virus and rice black streaked dwarf virus). This is a summary of the ICTV Report on the family Spinareoviridae, which is available at ictv.global/report/spinareoviridae.

Additional file 6 Figure S1: Length distribution of the sRNAs produced by the 38 MITE-derived miRNAs. Figure S2: Description of the MITE-derived miRNA 5 production site and an alignment of the target transcript TraesCS2A02G281000.2 region considering the wheat relatives for the A genome. Figure S3: Description of the MITE-derived miRNA 36 production site and an alignment of the target transcript TraesCS6A02G276700.1 region considering the wheat relatives for the A genome. Figure S4: Description of the MITE-derived miRNA 36 production site and an alignment of the target transcript TraesCS3A02G274100.1 region considering the wheat relatives for the A genome. Figure S5: Hairpin plots of the secondary structures of 4 examples of highly conserved miRNAs and 4 examples of MITE-derived miRNAs.

Additional file 3 pre-miRNAs secondary structures predictions.

In Argentina, wheat fields have exhibited virus-like symptoms, such as chlorotic streaking, dwarfing, yellowing and empty ears since 2007. Symptomatic plants and leaves samples were collected in 2007 from Marcos Juarez and in 2008 and 2013 from Río Cuarto. The virus was experimentally transmitted from symptomatic wheat plants to wheat cv. Baguette 10 and cv. BioINTA 3005 using the vector Delphacodes kuscheli Fennah (Delphacidae), producing chlorotic streaking, dwarfing and yellowing in the inoculated cereals at 10?15 days post-inoculation. Virus presence was confirmed by electron microscopy and RT-PCR using degenerated primers, which amplified a conserved region of the plant rhabdovirus polymerase (L) gene. Sequence comparison showed 98% nucleotide identity with Maize yellow striate virus C. Caroya (JQ715419) isolated from corn in Argentina. To our knowledge, this is the first report of the occurrence of Maize yellow striate virus in wheat in Argentina. Fil: Dumón, Analía Delina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Mattio, Maria Fernanda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigaciones Agropecuarias. Instituto de Patología Vegetal; Argentina Fil: Argüello Caro, Evangelina Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Alemandri, Vanina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigaciones Agropecuarias. Instituto de Patología Vegetal; Argentina Fil: Puyané, Valeria Aida. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigaciones Agropecuarias. Instituto de Patología Vegetal; Argentina Fil: del Vas, Mariana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: López Lambertini, Paola María. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigaciones Agropecuarias. Instituto de Patología Vegetal; Argentina Fil: Truol, Graciela Ana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigaciones Agropecuarias. Instituto de Patología Vegetal; Argentina

The detection and exact quantification of the presence of GMOs (genetically modified organisms, also named as living modified organisms, LMOs) grains has become very important in international commercial transactions, especially from countries producing both types of commodities, GMOs and GMO-free. This makes necessary to check every batch previous delivery to the recipient country. Several PCR protocols have been proposed to detect the presence of GMO DNA in a sample due to its sensitivity and independence of environmental and physiological influences. However, most of them are qualitative assays and don’t give a good quantitative estimation of the detected signal. We developed a semi-quantitative method based on the comparison of the mass of the amplification product of the sample with the mass obtained from standard samples of known GMO concentration delivering an accurate estimation of the amount of GMO in a sample. At the same time the reaction is countersigned by an internal reaction control. A strict set up of the conditions is essential to control error-prone steps (like the quantification of the DNA template and of the DNA products and pipetting errors) that may bias the result. Using this protocol, we were able to routinely assess the quantity of transgenic grains present in shipments that sum more than 600,000 tons of corn and 250,000 tons of soybean exported between 1997 and 1999.

La papa es el cuarto cultivo en orden de importancia mundial luego del trigo, el maíz y elarroz. El cultivo resulta seriamente afectado por virus, insectos y malezas que aumentanlos costos de producción, reducen el rendimiento y la calidad y obligan al uso deagroquímicos. La técnica de transformación mediada por Agrobacterium tumefacienspermite la transferencia de genes de interés agronómico al fondo genético de loscultivares apreciados por el productor sin modificación del mismo. Se utilizó esta técnicapara la obtención de plantas resistentes al virus del enrollamiento de la hoja (PLRV), alataque por larvas de la polilla del tomate y al herbicida total fosfmotricina. l) Resistencia a PLRV por expresión del gen de la cápside. Para realizar el clonado del gen de cápside viral, asi como también parte de los extremos 5' y 3' no codificantes aledaños a este gen, se amplificó el fragmento de interés por latécnica de PCR usando RNA total de planta infectada como templado. Esto evita lapurificación viral, que es particularmente dificil en el caso de PLRV que replicasolamente en células de floema y acompañantes. Se secuenció el fragmento en estudio,encontrándose entre 89 y 53 % de homologías (a nivel de nucleótidos) con las secuenciasde cápsides de aislamientos recientemente publicados. Se construyó un vector binariorecombinante, de manera que el gen de cápside de PLRV quedara bajo la regulación deun promotor y un terminador adecuados para la expresión de este gen en plantas. Utilizando la técnica de transformación de hoja mediada por Agrobacterium previamentepuesta a punto para un cultivar de uso local (Huinkul-MAG), se obtuvieron 84 plantastransgénicas. Se confirmó que algunas expresaban el mRNA de el gen de cápside por Northern blot. Asimismo, se hizo un ensayo de multiplicación viral (cuantificada por ELISA) en plantas transgénicas y control (sin transformar) infectadas mediante áfidosque previamente se habían alimentado en plantas de papa con infección secundaria de PLRV. 2) Resistencia a insectos por expresión de la toxina de Bacillus thuringiensis (BT). La plantas transgénicas Alfa l y Alfa 2 fueron el resultado de la transformación delcultivar Alfa de papa con un vector que lleva el gen que codifica para la toxina de BTbajo el control de un promotor inducible por daño. Se confirmó que el gen de interésestaba integrado en el genoma por Southern blot, y que se expresaba por Northern blot. Para determinar si las plantas Alfa l y Alfa 2 presentaban actividad insecticida frente aun lepidóptero minador, se hicieron ensayos de actividad biológica estudiando lasensibilidad de larvas de polillas de tomate (Scrobipalpuloides absoluta Meyrik) frente ala toxina que estas plantas, teóricamente expresan. A las dos semanas de la eclosión delas larvas, se observaron galerías y larvas vivas tanto en las hojas de las plantastransgénicas como en los controles sin transformar. Si embargo el daño observado (tamaño y número de galerías) en las plantas transgénicas fue considerablemente menorque el registrado en las plantas control. Asimismo el desarrollo de las larvas criadassobre plantas transgénicas fue menor que el observado en las plantas control ya que noalcanzaron el estadío de pupa, y por lo tanto tampoco el de adulto, lo que sí ocurriónormalente en las plantas control. 3) Resistenicia a fosfinotricina (PPT, principio activo del herbicida total Basta® ) porexpresión de una enzima detoxificante. Se obtuvo una planta transgénica (llamada AE2) que expresa el gen bar que codificapara una enzima capaz de inactivar a la fosfinotricina por acetilación. AE2 presentóresistencia a fosfinotricina tanto in vitro como in vivo. Fil: Del Vas, Mariana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Tesis para obtener el grado de Doctor en el área de Ciencias Biológicas, de la Universidad de Buenos Aires, en 2011 El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Reoviridae, Fijivirus) causa la principal enfermedad que afecta al maíz en la Argentina. Su genoma consiste en diez segmentos de ARN de doble cadena (S1 a S10) que codifican para un total de trece proteínas. El virus es transmitido de manera persistente y propagativa por insectos de la familia Delphacidae. Luego de adquirir el virus, sólo una pequeña proporción de los insectos vectores pueden transmitir la enfermedad al alimentarse de plantas sanas. Se desconocen aún las bases moleculares de la transmisión de MRCV y en general de las funciones que las proteínas virales cumplen durante la infección. Para establecer si existe una correlación entre la acumulación viral y la transmisión, se desarrolló un protocolo útil para la cuantificación de MRCV u otros ARN endógenos en insectos individuales mediante RT‐qPCR. Se optimizaron los pasos a seguir desde el almacenamiento de muestras hasta la cuantificación viral. Debido a que la técnica de RT‐qPCR requiere la previa validación de controles internos invariables en los tratamientos a estudiar, se seleccionaron, clonaron y secuenciaron 7 genes de mantenimiento del delfácido transmisor Delphacodes kuscheli y se evaluó la estabilidad de su expresión durante la infección con MRCV. Se determinó que, de los 7 genes estudiados, el gen de la ubiquitina es el más establemente expresado y por lo tanto adecuado para ser utilizado como control interno de referencia. La plataforma desarrollada no sólo permitirá la cuantificación precisa del título de MRCV en individuos D. kuscheli, sino que además abre el camino a futuros estudios del cambio en la expresión de genes endógenos de los insectos infectados con MRCV. Esto permitirá aportar datos moleculares para lograr una compresión más integral de la interacción MRCV‐delfácido vector. En paralelo, se decidió estudiar la función que cumplen las proteínas de MRCV durante la replicación viral en el insecto expresándolas en células Sf9 (de insecto no hospedante) y se analizó su localización subcelular por inmunofluorescencia y en células vivas. Se determinó que tanto las proteínas estructurales P3, P4 y P8 como la proteína no estructural P7‐1, se distribuyen en el núcleo y el citoplasma celular. Dado que el tamaño de estas proteínas excede el límite permitido por el complejo del poro nuclear, los resultados sugieren que las mismas serían transportadas activamente al núcleo celular. Asimismo, se observó que la proteína P5‐2 se localiza exclusivamente en el núcleo. Es posible que estas proteínas de MRCV capaces de ingresar al núcleo celular jueguen un rol en la regulación transcripcional de las células del hospedante. Se observó que la proteína P5‐1 posee una distribución citoplasmática heterogénea de aspecto granuloso y que dicha distribución se torna homogénea en ausencia del tripéptido carboxilo terminal TKF, el cual es un presunto motivo de unión a proteínas PDZ o de importación a peroxisomas. Por otro lado, se determinó que P6 forma grandes cúmulos perinucleares amorfos y es capaz de relocalizar parte de la tubulina celular a éstas formaciones. Esto sugiere un posible rol para P6 en la formación del material fibrilar que se observa en células de insecto y planta infectadas con MRCV. La proteína P9‐2 fue capaz de localizar en la membrana plasmática e indujo la formación de filopodios membranosos en la superficie de las células, por lo que esta proteína podría estar involucrada en el transporte del virus a través de la membrana durante la infección del insecto vector. Por su lado, la proteína de cápside externa P10 fue capaz de localizar en el retículo endoplasmático y de colocalizar completamente con tubulina, sugiriendo que el MRCV explota el sistema de secreción y el citoesqueleto de tubulina para el ensamblado y/o transporte viral. Finalmente, P9‐1 fue capaz de formar inclusiones citoplasmáticas conspicuas similares a cuerpos de inclusión virales (VIBs) o viroplasmas. A continuación, se utilizaron algunas combinaciones de fusiones fluorescentes de proteínas del MRCV para analizar su colocalización subcelular. No se logró observar colocalización entre la proteína P9‐2 y P5‐1, P7‐1, P7‐2, P9‐1 o P10. Tampoco se observó colocalización entre P9‐1 y P10 o P5‐2. Por otro lado, se determinó que P6 colocaliza con P10, P9‐1 y P7‐2, indicando que P6 podría cumplir algún rol en la formación del viroplasma y/o reclutamiento de otras proteínas a estas estructuras, así como en el movimiento intracelular de los viriones. Dado que la localización subcelular de P9‐1 es similar a la distribución característica de las proteínas mayoritarias de viroplasma de reovirus, decidimos estudiar más en profundidad sus propiedades funcionales y bioquímicas. Observamos que, al igual que otras proteínas mayoritarias de viroplasmas de reovirus, P9‐1 se auto asocia en complejos de alto peso molecular al ser expresada en bacterias, auto interacciona in vivo localizadamente en los cuerpos de inclusión que forma en células de insecto, tiene la capacidad de unir ácidos nucleicos de simple cadena, posee actividad ATPasa y alberga un dominio importante para la formación de cuerpos de inclusión en su mitad carboxilo terminal. Estos resultados indican que P9‐1 es el componente mayoritario de los viroplasmas y por lo tanto juega un rol fundamental en la replicación y ensamblado del MRCV en las células hospedantes. Mal de Río Cuarto virus (MRCV, Reoviridae, Fijivirus) causes the most important maize disease in Argentina. Its genome consists of ten double‐stranded RNA segments (S1 to S10) that encode a total of thirteen proteins. The virus is persistently and propagatively transmitted by planthoppers of the family Delphacidae. Planthoppers acquire the virus by feeding on infected plants and after a 10 days latency period (during which the virus replicates and moves) a small proportion of them become infective and can transmit the virus to healthy plants. The molecular basis of the transmission and the general function of MRCV proteins during infection are still unknown. To establish whether the differences in transmission between individuals are due to differences in viral accumulation, a protocol useful for quantification of MRCV or endogenous RNAs in individual insects by RT‐qPCR was developed. The protocol steps, from the sample storage to the viral quantification were optimized. Since the RT‐qPCR technique requires the previous validation of invariable internal controls in the studied conditions, 7 housekeeping genes from the planthopper vector Delphacodes kuscheli were selected, cloned, sequenced and evaluated for their expression stability during MRCV infection. Out of the 7 studied genes, the polyubiquitin gene was the most stably expressed and consequently the most reliable as a reference internal control. The platform developed along this work will be useful for the precise quantification of MRCV titers in individual D. kuscheli insects as well as for future gene expression studies in MRCV infected delphacids. In parallel, we studied the role of MRCV proteins during the insect viral infection by expressing them in Sf9 non‐host insect cells and analyzing their subcellular localization by immunofluorescence and live imaging. We determined that the structural proteins P3, P4, and P8, and the non‐structural protein P7‐1, are distributed in the nucleus and cytoplasm. Because the size of these proteins exceeds the limits allowed by the nuclear pore complex, the results suggests that they are actively transported to the cell nucleus. Likewise, we observed that P5‐2 is located exclusively in the nucleus. Those MRCV proteins able to enter the cellular nucleus may perhaps be involved in transcriptional regulation of the host genes. We also observed that P5‐1 displays a heterogeneous granular cytoplasmic distribution that turns into a homogeneous localization when the C‐terminal tripeptide TKF, which in turn is a putative PDZ protein interaction motif and/or a peroxisomal import motif, is absent. On the other hand, it was shown that P6 accumulates in big amorphous perinuclear inclusions, being able to relocalize some of the cellular tubulin to these structures. This suggests that P6 might be involved in the formation of the fibrillar material observed in MRCV‐infected insect and plant cells. The P9‐2 protein was able to localize to the plasma membrane of cells and induced the formation of superficial filopodia‐like formations, suggesting that this protein might be involved in the viral transport across the plasma membrane during the insect vector cells infection. The putative outer capsid protein P10 was located in the endoplasmic reticulum and completely co‐localized with tubulin, suggesting that MRCV might also exploit the secretion pathway and the microtubules cytoskeleton for assembly and/or viral transport. Finally, P9‐1 was able to form conspicuous cytoplasmic VIB‐like structures. Next, some of the fluorescent fusions of MRCV proteins were used to analyze its subcellular co‐localization. We could not observe co‐localization between P9‐2 and P5‐1, P7‐1, P7‐2, P9‐1 or P10. Similarly, co‐localization of P9‐1 with P10 or P5‐2 was not detected. On the other hand, we showed that P6 co‐localize with P10, P9‐1 and P7‐2, which suggests that P6 might play a role in viroplasm formation and/or recruitment of other proteins to this structure as well as in the viral intracellular movement. Given that P9‐1 subcellular localization is similar to the distribution characteristically displayed by reovirus major viroplasm proteins, we carried out a more comprehensive study of its functional and biochemical properties. We observed that, like other reoviral major viroplasm proteins, P9‐1 self‐associates to form high molecular weight complexes when expressed in bacteria, displays a localized in vivo self‐interaction in the inclusion bodies formed in insect cells, has the ability to bind single stranded nucleic acids, has ATPase activity and contains an important domain for the formation of inclusion bodies at its C‐terminal half. These results suggest that P9‐1 is the major component of viroplasms, and thus plays a fundamental role in MRCV replication and assembly during the infection of host cells. Instituto de Biotecnología Fil: Maroniche, Guillermo Andrés. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV) causa la principal enfermedad del maíz en nuestro país y es transmitido de manera persistente y propagativa por delfácidos. Diversas evidencias indican que los virus de este género se originaron de un virus de insectos ancestral y más recientemente adquirieron la capacidad de infectar plantas. La replicación viral está limitada al floema de gramíneas donde provoca síntomas severos, mientras que ocurre en diversos tejidos y es asintomática en los delfácidos vectores. El genoma del MRCV está formado por diez segmentos de RNA de doble cadena (dsRNA) que codifican para trece proteínas. El actual manejo de la enfermedad se realiza a través del monitoreo y control del principal insecto vector, D. kuscheli. Sin embargo, no se han desarrollado prácticas adecuadas ni existen cultivares resistentes en el caso de un eventual brote. El desarrollo de nuevas tecnologías de bajo impacto ambiental que permitan controlar efectivamente la virosis depende de la generación de conocimiento básico sobre la interacción hospedante-virus, particularmente sobre el ciclo viral y de los mecanismos de defensa de ambos hospedantes. El silenciamiento génico mediado por RNA es un mecanismo de regulación génica específico de secuencia que a su vez funciona como sistema de defensa antiviral. Con el objetivo de caracterizar la respuesta diferencial en plantas e insectos infectados con MRCV, se realizó un ensayo de infección controlada utilizando el insecto vector D. kuscheli y plántulas de trigo como modelo hospedante. Se secuenciaron los RNAs pequeños de ambos hospedantes y se caracterizó el perfil de aquellos derivados del genoma viral (vsiRNAs). Se determinó que, mientras que la respuesta en plantas se caracteriza por la generación de “puntos calientes” muy marcados de vsiRNAs en prácticamente todos los segmentos, en insectos la acumulación resultó más homogéneamente distribuida. Por otro lado, la proporción de vsiRNAs derivados de ambas hebras fue prácticamente la misma en ambos hospedantes, por lo que se presume que la maquinaria de silenciamiento tiene acceso a todo el largo de los segmentos en algún momento del ciclo infectivo. Adicionalmente, en plantas se observó una acumulación preferencial de vsiRNAs en el primer tercio de gran parte de los segmentos genómicos, y una correlación inversa entre la acumulación de vsiRNAs y el largo de los segmentos. En D. kuscheli, se identificaron piRNAs por primera vez en esta especie y se descartó la participación directa de los mismos en el silenciamiento antiviral. Finalmente, el análisis del perfil mutacional del virus dentro de cada hospedante evidenció la presencia de sitios altamente variables que son únicos para cada hospedante y que dan lugar mayoritariamente a mutaciones no sinónimas que probablemente se deban a un proceso adaptativo. Dentro de los mecanismos desencadenados por los virus durante el establecimiento de la infección se encuentra la modulación de la expresión de genes del hospedante. Esto puede conducir a cambios en la expresión de genes potencialmente involucrados en la producción de síntomas y/o que intervienen en mecanismos de defensa como el silenciamiento génico que restringen la replicación viral. Con el objetivo de identificar alteraciones en la acumulación de RNAs mensajeros ante la infección con MRCV, se realizó un RNAseq en plantas de trigo infectadas a dos etapas tempranas: 12 y 21 días post infección. Se realizó la anotación manual del genoma de trigo recientemente liberado (TGACv1) y se determinaron los genes diferencialmente expresados a cada tiempo utilizando dos métodos estadísticos. Estudios de enriquecimiento funcional revelaron que la infección con MRCV induce la sobreexpresión de genes que intervienen en la traducción, la biosíntesis de celulosa y la modificación de ácidos nucleicos. Dentro de las categorías de genes subexpresados se encuentran algunos relacionados con vías hormonales implicadas en el desarrollo y crecimiento de la planta: auxinas, citoquininas y brasinoesteorides. El MRCV y la mayor parte de los fijivirus poseen tres segmentos bicistrónicos S5, S7 y S9, y se desconoce el mecanismo implicado en la traducción de los ORFs ubicados hacia el extremo 3’. El segmento S5 presenta un marco abierto de lectura (ORF5-2) parcialmente superpuesto al primero (P5-1). Estudios de genómica comparativa de secuencias del S5 de varias especies de fijivirus permitieron la identificación de una secuencia “UCU_UUU_CG” altamente conservada que podría funcionar como un sitio de deslizamiento ribosomal en la región superpuesta hacia el extremo 5' del ORF 5-2. En este trabajo de Tesis, se llevaron adelante experimentos de traducción in vitro del segmento S5 utilizando diferentes construcciones mutantes que comprobaron experimentalmente la existencia del frameshift que da lugar a una proteína de fusión P5-1/2. Si bien aún resta ahondar en los mecanismos moleculares que ulteriormente determinan la sintomatología, los resultados contenidos en esta Tesis constituyen un insumo sumamente valioso para continuar avanzando en la comprensión del patosistema y poder eventualmente dar lugar a productos biotecnológicos que formen parte de un diseño racional, integrado y sustentable de estrategias de control de la enfermedad. Mal de Río Cuarto Virus (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causes the most important maize disease in Argentina and it is transmitted in a persistent and propagative manner by delphacids. Evidence indicates that viruses of this genus evolved from an ancestral insect virus that more recently acquired the ability to infect plants. Viral replication is limited to phloem tissue of grasses causing severe symptoms, whereas in insect vectors occurs in multiple tissues and is asymptomatic. MRCV genome consists of ten double-stranded RNA segments (dsRNA) coding for thirteen proteins. At present, there are no effective management strategies for controlling the disease. Development of new technologies with low environmental impact for virus control depends on basic knowledge about host-virus interaction, particularly on the replication cycle and the defense mechanisms of both hosts. Post-transcriptional gene silencing is an antiviral defense mechanism widely spread among eukaryotes. In order to describe the silencing responses of plant and insects infected with MRCV and to characterize possible distinct features of both responses, a controlled infection experiment was performed using the insect D. kuscheli as a vector and wheat seedlings as a plant host model. Small RNAs from both hosts were sequenced and virus-derived siRNAs (vsiRNAs) profiles were characterized. We found that, while the response in plants showed conspicuous "hot spots" of vsiRNAs in nearly all genome segments, in insects vsiRNAs accumulation was homogeneously distributed. Furthermore, the proportion of vsiRNAs derived from + and - strands was practically the same in both hosts, indicating that the silencing machinery has access to full length segments at some point of the infective cycle. In addition, in plants, preferential accumulation of vsiRNAs within the upstream 30% region of most of the virus segments and an inverse correlation between the accumulation of vsiRNAs and the length of the segments were observed. In D. kuscheli, the piRNA pathway was shown to be active for the first time but not involved in the production of virus-derived piRNAs. Finally, the analysis of the virus mutational landscape evidenced the presence of a large number of distinct variable positions within each host, most of them causing non-synonymous mutations and possibly reflecting an adaptive process. Virus infection induces changes in the modulation of host gene expression that could be potentially responsible of symptom development. In order to identify alterations in the mRNA profile upon early stages of MRCV infection, controlled wheat infections followed by RNAseq were performed at 12 and 21 dpi. Annotation of the new release of wheat genome (TGACv1) was done and differentially expressed genes were identified using two statistical methods. Functional enrichment analysis revealed that MRCV infection induces overexpression of genes involved in translation, cellulose biosynthesis and nucleic acid modifications. In turn, subexpressed genes were enriched in categories related to perception and biosynthesis of diverse phytohormones (cytokinins, brasinoesteroids and auxins), all of them involved in plant development. S5, S7 and S9 MRCV segments are bicistronic and the mechanisms involved in the translation of 3’ ORFs have not yet been determined. Segment S5 has two partially overlapping open reading frames (ORF5-1 and ORF5-2). The use of comparative genomics analysis has allowed the identification of a highly conserved sequence "UCU_UUU_CG" that could function as a slippery site for +1 ribosomal frameshifting rendering a P5-1/2 trans frame fusion protein. In this PhD work, in vitro translation experiments of different mutant constructs of S5 segment allowed to experimentally verify the existence of a +1 frameshift that gives rise to a fusion P5-1/2 protein. Although further research on the molecular mechanisms involved in plants symptom-development upon MRCV infection is needed, the results obtained during this Thesis constitute an extremely valuable input for the understanding of the patosystem, and eventually may give rise to knowledge-based biotechnological products that contribute to rational, integrated and sustainable strategies for disease control. Fil: de Haro, Luis. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causa la principal enfermedad delmaíz en nuestro país provocando grandes pérdidas económicas. El virus es transmitido porchicharritas de la familia Delphacidae e infecta además diversas gramíneas como trigo, cebada,avena y sorgo, dando lugar a síntomas severos. El genoma del MRCV está formado por diezsegmentos de ARN doble cadena (ARNdc) que codifican para trece proteínas. Durante el ciclode infección, el MRCV replica en cuerpos de inclusión citoplasmáticos virales denominadosviroplasmas, y nuestro grupo demostró que están compuestos principalmente por la proteínano estructural P9-1 (Maroniche, 2011). Para otros reovirus se ha demostrado que losviroplasmas contienen además ARN viral y proteínas virales minoritarias junto concomponentes celulares del hospedante. Con el fin de avanzar en la comprensión de las bases moleculares de la enfermedad en primerlugar se analizaron las interacciones de las proteínas del MRCV entre sí utilizando la técnica dedoble híbrido de levaduras (Y2H). Se identificaron cuatro interacciones positivas: P6 con P6 ycon P9-1, P9-1 con P9-1, y P9-2 con P9-2. Se definieron además las regiones de P6 y de P9-1involucradas en las interacciones utilizando mutantes de deleción y se encontró que la regióncentral de P6 con un posible dominio “coiled-coil” es necesaria para la interacción consigomisma y con P9-1, mientras que los últimos 24 residuos de P9-1 intervienen en la formación dedímeros de P9-1. Estos resultados, junto con resultados previos del grupo (Maroniche, 2011),permitieron postular a P6 como componente minoritario del viroplasma e indicaron que laregión C-terminal de P9-1 sería necesaria para la formación del viroplasmas. Adicionalmente se evaluó la interacción de las proteínas virales P6, P7-2, P9-1, P9-2 y P10 conproteínas celulares que son candidatas a cumplir roles relevantes en la interacción MRCVhospedante. Ente otros resultados, se encontró que P7-2 interactúa con la proteína SKP1 (SPhase Kinase Associated Protein 1) componente del complejo E3 ligasa del sistema ubiquitinaproteasoma (UPS). Estos resultados son de gran relevancia ya que sugieren que P7-2 tiene lacapacidad de interferir con el UPS. Para continuar con la caracterización de las proteínas virales P9-1 y P6 e identificar posiblescomponentes celulares asociados con los viroplasmas, se realizaron relevamientos de una biblioteca de ADN copia (ADNc) de hoja de trigo por Y2H. Se encontró que P9-1 es capaz deinteractuar con una proteína con posible función de aldosa 1-epimerasa y otra con posiblefunción de aciltransferasa. Por su parte, P6 mostró interacción con una posible tiorredoxina. Dado que las proteínas identificadas intervienen en el metabolismo de la planta, se postulaque su interacción con proteínas virales podría estar asociada con la generación de síntomas. Finalmente se determinó que tanto P6 como P9-1 contienen potenciales motivos PEST dedegradación vía proteasoma. Se construyeron mutantes sin estos motivos y se observó unincremento en los niveles de acumulación de P6 y P9-1 mutadas en plantas, sugiriendo que los PEST serían funcionales. Si bien aún resta comprender los mecanismos precisos que subyacen a las interaccionesproteína-proteína encontradas en este trabajo de Tesis y sus consecuencias biológicas, estosresultados significan un importante avance en el conocimiento de la función y rol de lasproteínas codificadas por el MRCV, en especial de P6 y P9-1. Mal de Río Cuarto virus (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causes the most important maize diseasein Argentina leading to great economic losses. The virus is transmitted by planthoppers fromthe Delphacidae family and also infects other grasses like wheat, rye, oat and sorghum, causingsevere symptoms. The MRCV genome is composed of ten double stranded RNA (dsRNA)segments that code for thirteen proteins. During its infection cycle, MRCV replicates incytoplasmic inclusion bodies called viroplasms, and our group has found that are mainlycomposed by the viral non-structural protein P9-1 (Maroniche, 2011). In other reovirus, theviroplasms also contain viral RNA and minor viral proteins as well as cellular components of thehost. To gain insight into the molecular basis of the disease, MRCV protein-protein interactions wereanalyzed using the yeast two-hybrid (Y2H) technique. Four positive interactions were found: P6with itself and with P9-1, P9-1 with P9-1, and P9-2 with P9-2. The regions of P6 and P9-1involved in such interactions were also identified by using deletion mutants. Through theseanalyses, it was established that the central region of P6 containing a possible coiled-coildomain is necessary for P6/P6 and P6/P9-1 interactions, whereas the last 24 residues of P9-1are involved in P9-1 dimmer formation. These results, together with previous results of ourgroup (Maroniche, 2011), allowed us to postulate P6 as a minor viroplasm component andthey also suggest that P9-1 C-terminal region is necessary for viroplasm assembly. Additionally, the interactions of viral proteins P6, P7-2, P9-1, P9-2 and P10 with cellularproteins that are proposed to have important roles in MRCV-host interaction were analyzed. Among other results, it was found that P7-2 interacts with SKP1 (S-Phase Kinase Associated Protein 1), component of E3 ligase complex of the ubiquitin-proteasome system (UPS). Theseresults are relevant because they suggest that P7-2 is able to interfere with the UPS. To further characterize P6 and P9-1 and to identify possible cellular components of theviroplasms, Y2H screenings of a wheat copy DNA (cDNA) library where carried out. Theseassays showed that P9-1 interacts with a putative aldose 1-epimerase and with a putativeacyltransferase. In addition, P6 interacts with a protein with a predicted thiorredoxin activity. Given that the identified proteins are involved in the plant metabolism, their interaction withviral proteins might be associated with symptom development. Finally, it was identified that P6 and P9-1 contain potential PEST motives for degradationthrough the UPS. P6 and P9-1 mutants without these motives showed increased proteinaccumulation in plants, suggesting that their PEST motives are functional. Although the mechanisms underlying the protein-protein interactions found in this Thesis, aswell as their biological consequences remain unknown, this study broadens the currentknowledge of the function and role of MRCV encoded proteins, in particular those of P6 and P9-1. Fil: Llauger, Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El desarrollo de plantas transgénicas que explotan el mecanismo desilenciamiento génico contra los virus causales del mosaico (SCMV y SrMV) representauna interesante estrategia alternativa a los métodos de mejoramiento genético clásico. Sin embargo hasta el momento dichas estrategias han sido implementadas en base alconocimiento de unas pocas secuencias virales, lo que incrementa la posibilidad de quela resistencia sea quebrada por variantes poco frecuentes del virus. Se desarrolló unprotocolo simple, rápido y económico diseñado para obtener secuencias virales a partirde un gran número de hojas de caña sintomáticas. Utilizando dicho protocolo se analizóla estructura poblacional de los virus causales del mosaico de la caña de azúcar en la Argentina y las áreas cañeras limítrofes de Bolivia, Uruguay y Paraguay, incluyendo 103 sitios de muestreo. Se analizaron 567 muestras sintomáticas por RT-PCR (pertenecientes a 104 genotipos de caña de azúcar) amplificando un fragmento del gende la proteína de cápside del SCMV y del SrMV con iniciadores reportados en laliteratura. Los productos de amplificación fueron secuenciados directamente. El análisisde las secuencias virales determinó que el principal agente causal de mosaico en laregión es el SCMV, presente en 94% de las muestras. El SrMV estaba presente en solo 2,8% de las muestras, con bajos porcentajes de coinfección de los dos virus (0,5%). Lassecuencias fueron analizadas filogenéticamente y clasificadas en cuatro grupos viralesutilizando un valor de corte de 0,91 de identidad de secuencia, con un nuevo grupo viral (W) propuesto dentro de la clasificación del SCMV reportada en la literatura. Se diseñóun transgén de resistencia para desencadenar el silenciamiento génico contra todas lasvariantes virales encontradas en el muestreo realizado. Se seleccionaron tres fragmentosdel genoma viral evolutivamente conservados: parte del gen P3 (función probables deanclaje a membrana del complejo de replicación) y dos fragmentos no homólogos delgen de la proteína de cápside, para ser clonados en direcciones opuestas a ambos ladosde un intrón (construcción tipo horquilla), bajo la dirección del promotor del gen de laubiquitina de maíz. Se obtuvieron plantas transgénicas de cinco variedades de caña deazúcar de interés comercial y fueron desafiadas con el SCMV en un ensayo de inoculación artificial en invernáculo y en un ensayo a campo bajo condiciones naturalesde infección en la Chacra Experimental (provincia de Salta). Resultados preliminaresindican la ocurrencia de eventos resistentes a la infección con mosaico de cuatrovariedades de caña. El análisis molecular de un grupo de eventos es consistente con unaresistencia mediada por silenciamiento génico. Se planea la realización de ensayos acampo para confirmar el fenotipo de resistencia a mosaico e identificar eventos queconserven las características agronómicas del genotipo transformado. Attractive alternatives to traditional resistance breeding in sugarcane against sugarcaneand sorghum mosaic virus (SCMV and SrMV, respectively), both causal agents ofmosaic disease, have derived from transgenic approaches exploiting gene silencing. Such approaches, however, have been implemented based upon relatively few availablevirus sequences, therefore it is possible that infrequent variants escape gene silencingand break resistance. We developed a simple, fast and economic protocol designed toobtain viral sequences from a large set of symptomatic sugarcane leaf samples. Usingthis protocol, we estimated the population structure of potyviruses causing sugarcanemosaic disease throughout the sugarcane growing area of Argentina and neighboringregions in Bolivia, Uruguay and Paraguay by analyzing sugarcane leaf samples showingmosaic symptoms from 103 locations, including commercial and experimental fields. Aset of 567 samples from 104 sugarcane genotypes were extracted and analyzed for thepresence of a genomic fragment including most of the SCMV and SrMV coat proteincoding regions by RT-PCR using reported sets of primers. PCR products were directlysequenced using the same amplification primers. Sequence analysis demonstrated that SCMV is the predominant mosaic virus infecting sugarcane in the region, and is presentin 94% of the samples. SrMV was present only in 2.8% of samples, with low (0.5%)coinfection rates. Sequences were subject to phylogenetic analysis and classified intofour viral groups using a 0.91 nucleotide identity cutoff, and a new group (W) wasproposed to be included in the SCMV classification previously reported. A resistancetransgene was designed to trigger silencing mediated resistance against all virus variantsfound in the large scale survey. Three viral fragments: a P3 gene fragment and two nonoverlappingfragments from the coat protein gene, were cloned in opposite directionsseparated by an intron in a hairpin construct, and placed under the maize UBI promoter. Transgenic sugarcane plants belonging to 5 varieties were obtained and putative eventswere tested in the greenhouse with artificial inoculation and in a field trial at Chacra Experimental (Salta province) under natural infection conditions. Preliminary resultsindicate the occurrence of events from four sugarcane varieties that are resistant tomosaic infection. Preliminary molecular analysis are consistent with a resistancemechanism mediated by gene silencing. Further analysis are needed to identify resistantevents that have a good agronomic performance as well. Fil: Gómez, Maximiliano. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causa la principal enfermedad del maíz en la Argentina. Este virus es capaz de replicar de manera persistente y no citopática en delfácidos (chicharritas) y en el floema de varias especies de gramíneas donde provoca síntomas severos y económicamente importantes. Nuestro trabajo anterior demostró que el MRCV es una especie viral independiente de las conocidas hasta el momento cuyo genoma está formado por 10 segmentos de RNA de doble cadena que codifican para 13 proteínas (PMRCVs) e identificó aquellas proteínas estructurales. Sin embargo, aún se desconoce la función de la mayoría de las proteínas virales (en particular de aquellas no estructurales) y los mecanismos moleculares que determinan el establecimiento y desarrollo de la infección. El objetivo general de esta Tesis fue estudiar, definir y caracterizar la función de distintas proteínas codificadas por el MRCV a nivel molecular en hospedantes vegetales. En particular se propuso identificar las proteínas virales implicadas en el movimiento intercelular del virus dentro de la planta, en la producción de los síntomas del MRCV en plantas (determinantes de patogenicidad) y la(s) posible(s) proteina(s) con actividad supresora del silenciamiento de RNA. Este trabajo de Tesis representa el primer avance en la caracterización a nivel molecular de la función de 10 las 13 PMRCVs (P4, P5-1, P5-2, P6, P7-1, P7-2, P8, P9-1, P9-2 y P10) en sistemas vegetales. Para identificar proteínas del MRCV responsables del movimiento viral en plantas, se ensayó la capacidad de las distintas proteínas en estudio de complementar el movimiento de un Potato virus X (PVX) mutante, defectivo en esta función en Nicotiana benthamiana (Nb). Mediante este sistema, no fue posible identificar proteínas de movimiento entre las codificadas por el MRCV. A continuación se analizaron las características de la infección de plantas de Nb con recombinantes de PVX portando distintas secuencias codificantes para las PMRCVs. Se encontró que la expresión temprana de la proteína no estructural P7-2 produce un drástico aumento en la severidad sintomática que no es acompañado por un aumento en la acumulación viral, mientras que la expresión de P7-1 a partir del mismo vector retrasa la infección viral y reduce la severidad sintomática. Por otra parte, la presencia de los secuencias codificantes para las proteínas P9-1 (mayoritaria del viroplasma) y P10 (mayoritaria de cápside externa) en el mismo vector viral impidió el establecimiento de la infección, sugieriendo que estas proteínas podrían desencadenar una respuesta de resistencia a la infección viral en Nb. Con el objetivo de identificar proteínas del MRCV con actividad supresora del silenciamiento del RNA se utilizó un sistema modelo que se basa en la inducción del silenciamiento en plantas transgénicas que expresan GFP mediante la agroinfiltración con una cepa capaz de expresar un inductor de silenciamiento (GFP o dsGFP). Ninguna de las proteínas del MRCV evaluadas logró interferir con el silenciamiento tanto local como sistémico en este sistema. Sin embargo, mediante el uso de este sistema modelo se logró demostrar que la expresión de las proteínas no estructurales P7-1 y P7-2 codificadas por el segmento 7 del MRCV da lugar a reducciones en la acumulación del mRNA de transgenes expresados de manera transitoria o estable en un proceso que probablemente sea de origen postranscripcional. Esta actividad no había sido descripta hasta el momento para otras proteínas virales y es muy novedosa e interesante, en particular cuando se considera que la proteína P7-2 no está presente en el virus Nilaparvata lugens reovirus (NLRV) que pertenece al mismo género que el MRCV pero que es incapaz de infectar plantas. En conjunto los resultados sugieren que las proteínas P7-1 y P7-2 podrían estar implicadas en la regulación de la expresión tanto de genes virales como del hospedante durante el desarrollo de la infección del MRCV. Finalmente, al estudiar la expresión transitoria de las PMRCVs en Nb se encontró que sus niveles de expresión son bajos y que la utilización de dicotiledóneas como sistemas modelo para el estudio funcional de estas proteínas podría no ser conveniente en ciertos casos. Al analizar comparativamente el uso de codones de las PMRCVs en Nb, maíz y Nilaparvata lugens (delfácido en el que replica el NLRV), no se encontraron diferecias en el uso de codones que pudieran explicar los bajos niveles de expresión en Nb. La información y herramientas biológicas aquí generadas constituyen un gran progreso en el estudio de la actividad de las proteínas coficadas por el MRCV lo cual contribuirá al diseño de futuras estrategias efectivas de control de esta enfermedad en plantas. Mal de Río Cuarto virus (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causes the most important maize disease in Argentina. This virus is able to replicate both in delphacid vectors (planthoppers) where it replicates in a persistent and non-cytopathic manner and in the phloem tissue of several grass species where it produces severe and economically important symptoms. Our previous work showed that MRCV is a new viral species and that its genome consists of 10 segments of double-stranded RNA that encode for 13 proteins (PMRCVs). The identity of the viral structural proteins was also defined. However, the biological function of the different PMRCVs (particularly in the case of non-structural proteins) and the mechanisms that determine the establishment and development of MRCV infection in both hosts are still unknown. The aim of this Thesis was to study, define and characterize the role of different MRCV-encoded proteins in plant hosts at a molecular level. Our particular goals were to identify those viral proteins involved in the virus spread within the plant, those involved in the development of MRCV symptoms in plants (pathogenicity determinants) and the possible viral RNA silencing suppressors. This Thesis represents the first general survey of the biological function at a molecular level of 10 of the 13 PMRCVs (P4, P5-1, P5-2, P6, P7-1, P7-2, P8, P9-1, P9-2 y P10) using plant model system. In order to identify those PMRCVs involved in plant intercellular movement, the capacity of different viral-encoded proteins to complement movement of a mutant Potato Virus X (PVX) in Nicotiana benthamiana (Nb) was assessed. Using this model system no movement protein was found amongst PMRCVs. Next, general features of infections caused by recombinant PVX viruses carrying PMRCVs-coding sequences in Nb were analyzed. It was found that the early expression of P7-2 causes a drastic increase in symptom severity without producing a concomitant increase in recombinant PVX accumulation. Expression of P7-1 from the same PVX vector, on the other hand, lead to a delay in the progress of viral infection and reduced symptom severity. Inoculation of Nb with PVX recombinant vectors harboring P9-1 (major viroplasm protein) or P10 (major outher capsid protein) coding sequences produced no infection, suggesting that these proteins might trigger a resistance response. With the aim of identifying viral suppressors of RNA silencing among PMRCVs, a model system based on the induction of RNA silencing in transgenic plants expressing GFP by agroinfiltration with a strain capable of expressing an inducer of silencing (GFP or dsGFP) was used. None of the analyzed PMRCVs interfered with local or systemic RNA silencing. However using this same model system it was found that the expression of non-structural proteins P7-1 and P7-1, both encoded by MRCV genomic segment 7, caused reductions in the accumulation of mRNA from trangenes either transiently or stably expressed in a process that most probably is of postrancriptional origin. This activity has not been described so far for other viral protein and is very novel and interesting, especially considering that P7-2 is not present in Nilaparvata lugens reovirus (NLRV), a Fijivirus that is unable to infect plants. Overall, the results suggest that P7-1 and P7-2 may be involved in regulating the expression of both viral and host genes during MRCV infection. Finally, upon studying the transient expression of PMRCVs in Nb it was shown that their expression levels are low and that the use of dicots species as model systems for the functional study of these proteins may not be appropriate in certain cases. Comparative analysis of the codon usage of PMRCVs in Nb, maize and Nilaparvata lugens (delphacid in which NLRV replicates), showed that the low levels of expression of PMRCVs in Nb cannot be explained by differences in codon usage between these species. The information and tools generated here represent an important advancement in the study of MRCV-coded activities that will in turn contribute to the development of effective long-term strategies for disease control in plants. Fil: Mongelli, Vanesa Claudia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El Mal de Rio Cuarto es la principal enfermedad del maíz en la Argentina. Es causado porel Mal de Río Cuarto virus (MRCV) y transmitido por una chicharrita de la especie Delphacodes kuscheli. El MRCV pertenece a la familia Reoviridae, género Fijivirus, ytiene la propiedad de multiplicar tanto en plantas de maíz como en el insecto vector. Lasparticulas virales consisten en una cápside icosahédrica formada por una doble capa deproteínas y contiene en su interior lO segmentos genómicos de RNA de doble cadena (dsRNA) llamados Sl a SlO, siendo el tamaño del genoma de aproximadamente 29 kbp. En los últimos años, y en muchos casos en paralelo con el desarrollo de éste trabajo, sehan reportado las secuencias de algunos segmentos de virus relacionados: el MRDV (Maize rough dwarf virus), el FDV (Fiji disease virus), el ODSV (Oat sterile dwarf virus),el genoma completo del RBSDV (Rice black streaked dwarf virus) y del NLRV (Nilaparvata lugens reovirus). En este trabajo se clonaron, secuenciaron y analizaron los segmentos genómicos Sl, S2, S3, S4, S5, S6, S8 y SlO completos del MRCV. Se determinó que todos los segmentosgenómicos analizados poseen secuencias 5’ y 3’ terminales conservadas y característicasdel serogrupo al cual pertenece el MRCV: 5’AAGUUUUU3’ (extremo 5’) y 5’CAGCUnnnGUC3’ (extremo 3’). Adyacente a los extremos conservados se encuentranrepeticiones de 7 a 12 nucleótidos invertidas e imperfectas que son segmento específicas. La predicción de la estructura secundaria de las cadenas codificantes de todos lossegmentos estudiados, muestra que las regiones terminales son capaces de formarestructuras secundarias determinadas y estables que fueron propuestas como señales dereplicación y empaquetamiento en virus del género Rotavirus. Se compararon las secuencias de nucleótidos obtenidas y las secuencias de aminoácidosdeducidas con las secuencias de otros reovirus depositadas en las bases de datos, y seidentificó la presencia de motivos característicos, a menudo indicativos de función. Sedeterminó que el MRCV Sl codifica para una proteína básica de 168,4 kDa que contienemotivos conservados en las RNA polimerasas dependientes de RNA y es homóloga a las RNA polimerasas codificadas por los virus RBSDV, FDV y NLRV, asi como a lascodificadas por miembros de otros géneros de la familia Reoviridae. El MRCV S2codifica para una proteína de 134,4 kDa y posee homología con las proteínas codificadaspor el RBSDV S4, el FDV S2 y NLRV S2. En este trabajo presentamos evidencias de quela proteína codificada en éste segmento es no estructural. El MRCV S3 codifica para unaproteína de 141,7 kDa, y hemos demostrado que es la proteína mayoritaria de la cápsideinterna o “core” viral y posee una alta homología con las proteínas correspondientescodificadas por el RBSDV S2 y FDV S3. El MRCV S4 codifica para una proteina de 131,7 kDa y su función se desconoce. Presenta una relativamente alta homología conmiembros del género Fijivirus como así también con otros miembros de la familia Reoviridae. El MRCV S5 codifica para una proteína de 106,9 kDa cuya función sedesconoce. Esta proteína presenta homología con las proteínas codificadas por lossegmentos S5 del RBSDV y del FDV. El MRCV S6 codifica para una proteína de 90 kDacuya función se desconoce. Esta proteína presenta una llamativa baja homología con lasproteínas codificadas por los segmentos S6 del RBSDV y del FDV. El MRCV S8 codificapara una proteína de 68,3 kDa que contiene un motivo de unión de ATP/GTP que escaracterístico de helicasa. Además la proteína es homóloga con las proteínas codificadaspor el RBSDV S8, el MRDV S7, el OSDV S9 y el NLRV S7, todas con probable funciónde helicasa. El MRCV SlO codifica para una proteína de 63,5 kDa y su probable funciónsería la de proteína de cápside externa. Esta proteína presenta una alta homología con lasproteínas correspondientes codificadas por los segmentos SlO de los virus RBSDV, MRDV y FDV. El análisis de los valores de homología encontrados entre los distintossegmentos del MRCV y los segmentos de virus relacionados, apoyaría la idea de evoluciónindependiente de cada segmento viral. El análisis filogenético realizado con las secuencias obtenidas del MRCV permitióproponer que a pesar de que el MRCV está relacionado con el MRDV y el RBSDV, debeser considerado una especie diferente del género Fijivirus (Distéfano y col., 2002) y no unaraza geográfica del MRDV, como había sido inicialmente propuesto. El análisisfilogenético realizado con las secuencias de aminoácidos de polimerasas representativas detodos los géneros de la familia Reoviridae mostró la existencia de dos grupos evolutivosseparados: uno agrupa a los Orthoreovirus, Aquareovirus, Orbivirus y Rotavirus, y otroagrupa a los Fijivirus, Cypovirus, Olyzavirus y Coltivirus. Se expresaron algunos de los segmentos virales en estudio en bacterias obteniéndoseproteínas de fusión con un péptido rico en histidinas que facilita su posterior purificación. Se obtuvieron antisueros policlonales contra las proteínas codificadas por los segmentos S2, S3, S4 y S6. El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 fuecapaz de reconocer específicamente una de las proteína estructurales presentes enpartículas virales purificadas del MRCV en un ensayo de “Western blot”. Esta proteinacorrespondería a la proteína mayoritaria de la cápside interna o “core” viral. En unexperimento complementario, un antisuero obtenido contra las proteínas de la partículaviral fue capaz de reconocer a la proteína del MRCV S3 expresada en bacterias. Asimismoel antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 reconoce una proteínade tamaño similar al esperado en extractos de plantas enfermas. Mediante experimentos deinmunomicroscopía electrónica sobre cortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV seconfirmó que la proteína codificada por el S3 del MRCV es una proteína estructural delvirus y se demostró que forma parte del “core” viral El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV 82, reconocióespecíficamente a una proteína de menor tamaño al esperado en extractos proteicos totalesde plantas enfermas. Mediante experimentos de inmunomicroscopía electrónica sobrecortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV se confirmó que la proteína codificadapor el S2 del MRCV seria una proteína no estructural presente en los viroplasmas. En experimentos de “Far-Western blot” se observó que la proteína codificada por el MRCV S3 era capaz de interactuar consigo misma, con una proteína de 130 kDa quecorrespondería a la espícula viral de tipo B y con la RNA polimerasa dependiente de RNAcodificada por el MRCV Sl. En Rotavirus se demostró que las proteínas equivalentesinteraccionan entre sí. Los resultados presentados en este trabajo contribuyeron al avance en el estudio del virusque causa la enfermedad del Mal de Río Cuarto, a la clasificación taxonómica del mismo yal estudio de su origen evolutivo. Además los datos obtenidos permitieron el diseño de unaestrategia de resistencia al MRCV en plantas transgénicas de maíz basada en eldesencadenamiento del silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS). Mal de Río Cuarto is the most important maize disease in Argentina. lt is caused by the Mal de Río Cuarto virus (MRCV) and transmitted by the planthopper Delphacodeskuschell. MRCV belongs to the Reoviridae family, Fijivirus genus, and has the interestingfeature of being able to multiply both phloem cells of maize plants and in vector insects. The viral icosahedral double-shelled particles contain lO double-stranded RNA segments (dsRNA) called Sl -SlO, with a total genome size of nearly 29 kbp. In the last years, and inmany cases simultaneously with this work, the nucleotide sequences of some Fijivirusgenome segments have been reported: MRDV (Maize rough dwarf virus), FDV (Fijidisease virus) and ODSV (0at sterile dwarf virus). In addition the entire RBSDV (Riceblack streaked dwarf virus) and NLRV (Nilaparvata lugens reovirus) has been published. This work reports the cloning, sequence and analysis of the genomic nucleotide sequencesof MRCV Sl, S2, S3, S4, S5, S6, S8 and SlO. All the analyzed segments have theconserved 5’ and 3’ ends that were reported for viruses of the same serogroup to which MRCV belongs: 5’AAGUUUUU3’ and 5’CAGCUnnnGUC3’, respectively. In additionsegment-specific imperfect inverted repeats of 7-12 nucleotides were identifiedimmediately adjacent to the conserved sequences. Prediction of the secondary structure ofall segments coding strands showed that terminal regions were able to form defined andstable secondary structures that are proposed to be replication and packaging signals in Rotavirus. We compared their nucleotide and amino acidic sequences with the ones deposited in Genebank for other reoviruses. MRCV Sl potentially encodes a 168.4 kDa basic proteinthat contains RdRp distinctive motifs and has identity with the RdRps encoded by RBSDV, FDV and NLRV as well as with RNA polimerases coded by virus belonging to othergenera of the Reovirdae family. MRCV S2 encodes a single 134.4 kDa protein which hasand intermediate identity to RBSDV S4, FDV S2 and NLRV S2-encoded proteins. In thiswork we showed that the protein coded by this segment is a non-structural protein. MRCV S3 codes for a l4l .7 kDa protein and we demonstrated that is the major core protein andhas an extremely high homology with the proteins coded by RBSDV S2 and FDV S3. MRCV S4 codes for a 131.7 kDa protein and its function is unknown. It shows identity tomembers of Fijivirus as well as to two other genera of the Reoviridae family. MRCV S5codes for a 106.9 kDa protein and its function is unknown. It shows identity with RBSDV SS and FDV S5-encoded protein. MRCV S6 codes for a 90 kDa protein and its function isunknown. It has a very low homology with the proteins coded by RBSDV S6 and FDV S6. MRCV SBcodes for a 68.3 kDa protein Significantly, MRCV S8 encoded protein containsan ATP/GTP-binding site motif that is a common feature of dsRNA helicases. In addition, MRCV S8 revealed identity with the proteins coded by RBSDV S8, MRDV S7, OSDV S9and NLRV S7, all of them with proposed helicase function. MRCV SlO codes for a 63.5kDa protein that probably corresponds to the outer capsid protein. This protein shows ahigh identity with the proteins coded by RBSDV SlO, MRDV SlO and FDV SlO. Thecomparative level of homology between different MRCV encoded proteins variednoticeably, supporting an independent evolution of the different genome segments. We discussed the evolutionary relationships of MRCV to other Reoviridae, and based onphylogenetic analysis we proposed that although MRCV is related to MRDV and RBSDV,it could be regarded as a new species of the Fijivirus genus and not a geographic race of MRDV as it was previously proposed. Phylogenetic analysis based on RdRps amimo acidicsequences of viruses belonging to all the genus of the Reoviridae family, showed theexistence of two major evolutionary divisions of polymerase proteins among them: onegrouped Orthoreovirus, Aquareovirus, Orbivirus and Rotavirus, and the second onegrouped Fijivirus, Cypovirus , Oryzavirus and Coltivirus. Some of the studied segments were expressed in bacteria as fusion proteins with anhistidine-rich peptide. Polyclonal antibodies were raised against S2, S3, S4 and S6 coded proteins. The antiserum obtained against the protein coded by MRCV S3 was able tospecifically recognize a single structural protein present in the purified virus particles in a Western blot assay and a 140 kDa protein present in infected plants. This proteincorresponds to the major core protein. On the other side, a polyclonal antiserum against thepurified virus particle was able to recognize a MRCV S3 fusion protein expressed inbacteria. Inmuno-electron microscopy revealed that antiserum against the protein coded by MRCV S3 reacted with viral cores. The antiserum obtained against the protein coded by MRCV S2 was able to specificallydetect a single protein of a smaller size as predicted in total proteins extracts from infectedmaize plants. Inmuno-electron microscopy revealed that antiserum against the proteincoded by MRCV S2 reacted with viroplasms present in the phloem cells of infected maizeplants. “Far-Westem blot” experiments showed that MRCV S3 coded protein interacts with itselfwith a protein of l30 kDa that probably correspond to the B-spike and with the RNAdependent RNA polimerase encoded by MRCV Sl. In Rotavirus the correspondentproteins also interact. The results showed in this work contribute to the understanding of the virus that cause Mal de Rio Cuarto disease, helped redefine the virus taxonomic classification within thegenera, and collaborated with the determination of the evolutionary origin of the fijivirusgenus. Also these results allowed to the design of a MRCV resistance strategy in trasgenic maizeplants based on the triggering of post-transcriptional gene silencing (PTGS). Fil: Distéfano, Ana Julia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.