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Beim Tissue Engineering mit prim��ren humanen Chondrozyten ist die Dedifferenzierung w��hrend Zellproliferationsphase in vitro ein limitierender Prozess um eine ausreichende Zellzahl zu generieren f��r die Besiedelung eines klinisch relevanten Produkts. Obwohl Chondrozyten partiell redifferenzieren sobald sie in eine dreidimensionale (3D) Kultur ��berf��hrt werden, entspricht eine neu gebildete Knorpelmatrix nicht der Qualit��t eines Nativknorpels. Es wurde der Einfluss von Hypothermie Bedingungen auf die Dedifferenzierung von humanen Septumchondrozyten untersucht in einer Monolayer Zellkultur zur Proliferation, sowie in einer 3D Pelletkultur. Jede Zellkultur wurde w��hrend Zellproliferation entweder bei 32,2 ��C oder bei 37 ��C kultiviert. Weiter wurden Zellen, die bei diesen Temperaturen proliferiert wurden, in einer Pelletkultur bei 32,2 ��C und bei 37�� C untersucht. Hinwei��gebend auf den zellul��ren Differenzierungsgrad war die Bestimmung der mRNA knorpelspezifischer Zielgene mittels Polymerase Kettenreacktion (PCR) und hieraus gebildete Quotienten (Kollagen II/Kollagen I; Aggrecan/Versican). Ein jeweils h��herer Quotient zeigte einen h��heren Differenzierungsgrad an. Histologische und Immunhistochemische F��rbungen dienten zur Objektivierung vorhandener Proteine in Pelletkultur. In Monolayer wurde die Zellproliferation mittels 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) kolorimetrisch bestimmt. In Monolayer zeigte sich unter dem Einfluss von 32,2 ��C eine signifikant langsamere Zellproliferation verglichen zur Kultur bei 37 ��C, ein Dedifferenzierungsprozess verlief bei 32,2 ��C ebenso langsamer. In Pelletkultur konnte ein Redifferenzierungsprozess bei beiden Temperaturen nachgewiesen werden, dieser zeigte sich in den Kulturen bei 37 ��C ausgepr��gter. M��gliche Vorteile durch langsamere Dedifferenzierung in Monolayer unter 32, 2 ��C werden durch effektivere Redifferenzierungsprozesse bei 37 ��C aufgehoben. Es konnte gezeigt werden dass eine gezielte Verlangsamung der Zellproliferation und Dedifferenzierung bei 32,2 ��C in Monolayer zur Zellproliferation keinen Nachteil hat wenn diese Zellen anschlie��end in eine Pelletkultur bei 37 ��C ��berf��hrt werden.

Tumorstammzellen scheinen das Triebwerk für die Initiierung und Progression des Mammakarzinoms zu sein. Durch ihr Potential zur Proliferation von Tumorgewebe, zur Metastasierung und zur Bildung von Rezidiven bestimmen sie maßgeblich die Prognose und Mortalität von Brustkrebspatientinnen. Diese Arbeit demonstriert, welche Mechanismen sich Brustkrebsstammzellen zu Nutze machen, um einer Immunantwort durch NK Zellen zu entkommen. Mittels durchflusszytometrischer Analysen konnte innerhalb der Gesamtpopulation an MCF 7-Brustkrebszellen eine CD44highCD24low-Subpopulation, die dem Tumorstammzellanteil entspricht, abgegrenzt werden. Im Vergleich zur Ausgangspopulation war nach einer Kokultur mit aktivierten NK Zellen gesunder menschlicher Spender eine Anreicherung von Tumorstammzellen in vitro zu verzeichnen. Die Inkubation von Brustkrebszellen mit NK Zell-Überstand führte zu keiner wesentlichen Veränderung der Tumorstammzellpopulation, was die Notwendigkeit eines direkten Zell-Zell-Kontakts impliziert. Diese Tumorstammzellen könnten nach einem Angriff durch NK Zellen einerseits durch Selektion übrig geblieben sein oder andererseits durch epithelial-mesenchymale Transition (EMT) neu entstanden sein. Hinweise auf einen Selektionsprozess ließen sich anhand der verminderten Oberflächenexpression von NK Zell-Liganden auf Tumorstammzellen im Vergleich zu Nichtstammzellen finden. Die untersuchten Brustkrebszelllinien (MCF 7, SKBR 3, BT 474 und MDA MB 231) besaßen ein jeweils individuell reguliertes Muster der aktivierenden NKG2D Liganden (MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3), DNAM 1-Liganden (CD112, CD155) und von MHC1-Molekülen auf Tumorstammzellen und Nichtstammzellen. Die niedrigere Expression von NK Zell-Liganden auf Tumorstammzellen lässt auf eine verminderte Angreifbarkeit durch NK Zellen schließen. Eine Induktion von Tumorstammzellen aus differenzierten epithelialen Tumorzellen via EMT nach einer Kokultur mit NK Zellen konnten wir beweisen. Aus einer stammzelldepletierten MCF 7-Population gingen nach dem Kontakt zu NK Zellen Tumorzellen mit dem Phänotyp CD44highCD24low de novo hervor. Die Herunterregulation des epithelialen Adhäsionsmoleküls E-Cadherin sowie die Hochregulation mesenchymaler Marker wie des Strukturproteins Vimentin, der EMT-auslösenden Transkriptionsfaktoren Slug, Snail und Twist, und der stammzelltypischen Transkriptionsfaktoren Oct4, KLF4 und cMyc auf mRNA-Ebene sprachen für eine EMT-getriggerte Induktion von Tumorstammzellen nach einer Kokultur von MCF 7-Zellen mit NK Zellen. Desweiteren stellten wir fest, dass der direkte Kontakt zwischen Tumorzellen und NK Zellen für die Induktion von Tumorstammzellen von großer Bedeutung ist, und zwar auch nach Inhibition des zytotoxischen Effektorpotentials der NK Zellen. Diese Zell-Zell-Interaktionen scheinen von NKG2D und DNAM 1 abhängig zu sein und eine konsekutive Stammzellinduktion via EMT zu beinhalten. Da aus einer nativen Population nach dem Kontakt zu NK-Zellen ein doppelt so hoher Anteil an Tumorstammzellen hervorging wie aus einer ebenso mit NK-Zellen behandelten stammzelldepletierten Fraktion, ist davon auszugehen, dass ein überdurchschnittlich gutes Überleben von Tumorstammzellen unter NK-Zell-vermitteltem Selektionsdruck auch zum „Immune Escape“ beitragen kann. Hinsichtlich ihrer Klonogenität gab es zwischen bestehenden und induzierten Tumorstammzellen keinen Unterschied. Beide Fraktionen waren in gleichem Ausmaß in der Lage neue Kolonien zu bilden. Es konnte also gezeigt werden, dass eine EMT-getriggerte Induktion im Sinne eines „Immune Escapes“ von Brustkrebszellen nach dem Kontakt zu NK Zellen maßgeblich zur Tumorstammzellanreicherung beiträgt. Ein zusätzlicher Selektionsprozess bestehender Tumorstammzellen kann als wahrscheinlich angenommen werden. Interaktionen über die NK Zell-Rezeptoren NKG2D und DNAM 1 bzw. deren Liganden auf Tumorzellen scheinen eine Schlüsselrolle zu spielen. Sie könnten als Ansatzpunkt für medizinische Interventionen dienen, die zur Verhinderung einer Tumorstammzellanreicherung im Mammakarzinom beitragen und somit die Prognose von Brustkrebspatientinnen verbessern., Tumor stem cells seem to be the engine for initiation and progression of breast cancer. By their potential for unlimited proliferation, dissemination and relapse they largely determine the prognosis and mortality of breast cancer patients. This thesis shows mechanisms breast cancer (stem) cells use to escape from an immune response by NK cells. Using flow cytometry analysis, we defined a subpopulation of CD44highCD24low cells corresponding to the tumor stem cell fraction of MCF-7 breast cancer cells. Compared to the native MCF-7 cell population we observed an enrichment of tumor stem cells in vitro after co-culture with activated NK cells from healthy human donors. Incubation of breast cancer cells with NK cell supernatant resulted in no significant change, which implies that the observed NK cell-mediated enrichment of the cancer stem cell population depends on direct cell-cell contact. One possibility is that these tumor stem cells could be enriched by selection, i.e. by preferential killing of their more differentiated counterparts. Alternatively, they could arise de novo via epithelial to mesenchymal transition (EMT). A selection process was supported by data showing reduced surface expression of NK cell ligands on tumor stem cells compared to non-stem cells. The investigated breast cancer cell lines (MCF-7, SKBR 3, BT 474 and MDA MB 231) showed a distinctly regulated pattern of activating NKG2D-ligands (MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3) and DNAM 1-ligands (CD112, CD155) and of MHC1-molecules on tumor stem cells and non-stem cells. The comparatively lower expression of NK cell ligands suggests a reduced vulnerability of tumor stem cells towards NK cells. However, we also showed the induction of tumor stem cells from differentiated epithelial tumor cells via EMT. Tumor cells with the phenotype CD44highCD24low arose de novo from a stem cell depleted MCF-7 tumor cell population which was then co-incubated with NK cells. Downregulation of the epithelial cell adhesion molecule E-cadherin as well as upregulation of mesenchymal markers such as the structural protein vimentin, the EMT-inducing transcription factors Slug, Snail and Twist and the stem cell-typical transcription factors Oct4, KLF4 and cMyc on mRNA level indicate an EMT-triggered induction of tumor stem cells after co-culture of MCF-7 with NK cells. We also found that the direct contact between tumor cells and non-lytic NK cells is of vital importance for the induction of tumor stem cells. These cell-cell interactions appeared to depend on NKG2D and DNAM-1 and to include a consecutive stem cell induction via EMT. As the proportion of tumor stem cells after co-culture of native MCF-7 cells and NK cells was almost twice the number of stem cells arisen from an equally treated stem cell depleted fraction we can assume that an above-average survival of tumor stem cells due to selection stress can also contribute to immune escape. Regarding their clonogenicity we noticed no difference between pre-existent and induced tumor stem cells. Both fractions possessed the ability to generate new colonies of similar quantity. Thus, we showed that upon exposure to NK cells EMT-triggered induction considerably contributes to the enrichment of breast cancer stem cells. An additional process of stem cell selection seems to be realistic. Interactions of the NK cell receptors NKG2D and DNAM 1 and its ligands on tumor cells respectively seem to play a key role. The recognition that de-differentiation may represent a previously unrecognized immune escape mechanism of breast cancer cells could serve as a starting point for medical interventions, with the aim of preventing stem cell accumulation in breast cancer and thus improving the prognosis of breast cancer patients.

Experimentelle und neurophysiologische Studien weisen auf eine Spezifität der Gesichterkognition hin. In der differentiellen Psychologie wird ein Schwerpunkt auf die Differenzierbarkeit sozio-kognitiver Leistungen von akademischen Fähigkeiten gelegt. Dabei werden bislang kaum Versuche unternommen, Messmodelle zu etablieren, die in neurokognitiven Modellen verankert sind. Basierend auf neuartigen Versuchen zur Etablierung solcher Modelle ist es das Ziel dieser Dissertation, die Robustheit dieser Modelle aus einer entwicklungspsychologischen Perspektive zu betrachten und diese zu erweitern. Zudem werden altersbedingte Leistungsunterschiede in der Gesichterkognition auf der Ebene latenter Faktoren ermittelt und die Hypothese altersbedingter kognitiver Dedifferenzierung mit modernen Methoden kritisch untersucht. Das Hauptziel ist die Erbringung entwicklungspsychologischer Evidenz für die Spezifität der Gesichterkognition. In einem ersten - primär methodologischen - Manuskript wird erstmalig in der Literatur die Implementierung von Funktionen der Beobachtungsgewichtung aus der nicht-parametrischen Regression für Strukturgleichungsanalysen vorgeschlagen. Diese Methode ergänzt Multigruppenanalysen bei der Untersuchung kognitiver Dedifferenzierung. Weitere vier Manuskripte adressieren Fragestellungen zur Gesichterkognition und zeigen: 1) Gesichterwahrnehmung, Gesichtergedächtnis und die Schnelligkeit der Gesichtererkennung sind separierbare Prozesse über die gesamte erwachsene Lebensspanne; 2) die Schnelligkeit der Gesichtererkennung kann nicht von der Schnelligkeit der Emotions- und Objekterkennung faktoriell getrennt werden; 3) Gesichterwahrnehmung und Gesichtergedächtnis können bis zum späten Alter von allgemeinen kognitiven Fähigkeiten getrennt werden, und 4) eine leichte Dedifferenzierung zwischen Objekt- und Gesichterkognition tritt auf der Ebene von Akkuratheitsmessungen auf. Implikationen sind in den Manuskripten ausführlich diskutiert und im Epilog zusammengefasst., Cognitive-experimental and neuropsychological studies provided strong evidence for the specificity of face cognition. In individual differences research, face tasks are used within a broader variety of tasks, usually with the intention to measure some social skills. Contemporary individual differences research still focuses on the distinction between social-emotional vs. academic intelligence, rather than establishing measurement models with a solid basis in experimental and neuropsychological work. Building upon recent efforts to establish such measurement models this dissertation aimed to extend available models and assess their robustness across age. Furthermore, it investigates mean age differences for latent factors, critically looks at phenomena of dedifferentiation with novel and innovative analytic methods, and attempts to provide more evidence on the uniqueness and communalities of face cognition throughout adulthood. In a first primarily methodological manuscript, we propose for the first time in the literature an implementation of functions to weight observations used in nonparametric regression approaches into structural equation modeling context, which can fruitfully complement traditionally used multiple-group approaches to investigate factorial dedifferentiation. In the following four manuscripts, we investigated individual and age-differences in face cognition. Results show that: 1). Face perception, face memory and the speed of face cognition remain differentiable throughout adulthood; 2). The speed of face cognition is not differentiable from the speed of perceiving emotional expressions in the face and complex objects, like houses; 3). Face perception and memory are clearly differentiable from abstract cognition throughout adulthood; and 4). A slight dedifferentiation occurs between face and object cognition. Implications are discussed in the manuscripts and the epilogue.

Die Hodgkin/Reed-Sternberg Zellen des klassischen Hodgkin Lymphoms stammen von Keimzentrums-B-Zellen ab. Dennoch prägen sie fast keine B-Zell-spezifischen Gene aus, stattdessen ko-exprimieren sie Marker anderer hämatopoetischer Linien. Die Ursache für den Verlust des B-Zell-Phänotyps ist weitestgehend unbekannt, da die Transkriptionsfaktoren E2A und PAX5, die in reifen B-Zellen zur Aufrechterhaltung der Expression B-Zell-spezifischer Gene essentiell sind, von primären HRS Zellen ausgeprägt werden. Allerdings wird PAX5 im Vergleich zu normalen B-Zellen deutlich schwächer exprimiert. E2A wird durch direkte Interaktion mit dem inhibitor of DNA binding, ID2, negativ reguliert. ID2 besitzt eine bHLH-Struktur und dimerisiert mit Transkriptionsfaktoren. Da ihm jedoch die DNA-bindende Domäne fehlt, wird die Bindung der Heterodimere an die DNA verhindert und die Transkriptionsfaktoren somit inaktiviert. In hämatopoetischen Zellen scheint die ID2-Expression die B-Zell-Entwicklung und auch die Expression B-Zell-spezifischer Gene zu unterdrücken und stattdessen die Ausprägung von Genen anderer Linien zu unterstützen. In reifen B-Zellen wird ID2 während der Plasmazellentwicklung bei gleichzeitigem Verlust der Expression B-Zell-spezifischer Gene stark exprimiert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ID2, das in normalen B-Zellen nicht detektiert werden konnte, dagegen in allen HL-Fällen nicht nur auf RNA-Ebene, sondern auch auf Proteinebene stark exprimiert wird. Ko-Immunopräzipitation des E2A mit ID2 aus HL-Zelllinien zeigte die Interaktion und somit vermutlich auch die transkriptionelle Inaktivierung des E2A durch ID2, wodurch es zum Verlust der Expression B-Zell-spezifischer Gene kommt. Darüber hinaus wird PAX5 zusammen mit EBF durch E2A induziert. So führt die ID2-vermittelte E2A-Inaktivierung im HL vermutlich dazu, dass ID2 via EBF auch die Regulation von PAX5 beeinflusst. PAX5 spielt bei der Differenzierung eine duale Rolle, denn es aktiviert nicht nur B-Zell-spezifische Gene, sondern es unterdrückt auch die Gene anderer Linien. Demnach könnte ID2 auch an der Expression der nicht-B-Zell-spezifischen Gene im HL beteiligt sein. Darüber hinaus ist ID2 im HL durch die E2A-Inaktivierung via EBF auch möglicherweise an der schwächeren Expression des PAX5 im Vergleich zu normalen B-Zellen beteiligt. Obwohl das ID2-Protein in den HL-Zelllinien durch RNA-Interferenz erfolgreich reduziert werden konnte, zeigte sich allerdings weder eine Änderung der Proteinexpression der B-Zell-spezifischen Gene CD19 und CD79A noch der Gene anderer hämatopoetischer Linien GATA-3 und M-CSF-R. Unabhängig von seiner möglichen Beteiligung an der Dedifferenzierung der HRS Zellen im HL, spielt ID2 vermutlich auch eine weitere Rolle in der Pathogenese des HL. Verschiedene Interaktionen weisen darauf hin, dass ID2 auch an der Regulation des Zellzyklus beteiligt ist. Zum einen konnte in dieser Arbeit die Interaktion des ID2 mit dem HLH-Protein HEF1 zumindest in einer der HL-Zelllinien gezeigt werden. HEF1 ist ein Aktivator der Aurora Kinase 1, welche nach Aktivierung Gene phosphoryliert, die den Ablauf der Mitose begünstigen. Zum anderen konnte der negative Zellzyklusregulator p21Cip1 in HL-Zelllinien durch RNAi-vermittelte Reduktion des ID2-Proteins als ID2-Target-Gen identifiziert werden. Auch wenn die Interaktion mit RB, dem zur Familie der Pocket-Proteine gehörenden Schlüsselregulator des Zellzyklusverlaufs, in HL-Zelllinien nicht nachgewiesen werden konnte, zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die aberrante ID2-Expression offenbar an der Veränderung des Zellzyklus im HL beteiligt ist. Sie lassen jedoch noch keinen endgültigen Schluss zu. Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, wird ID2 ebenfalls im analplastisch großzelligen T-Zell-Lymphom aberrant exprimiert. Auch eine Interaktion mit E2A, das auch in der T-Zell-Entwicklung eine Rolle spielt, konnte gezeigt werden. Nicht zuletzt scheint demnach ID2 auch in der Dedifferenzierung des ALCL ein wichtiger Faktor zu sein. ID2 wird im HL aberrant exprimiert und es konnte die Interaktion mit E2A in den HL-Zelllinien nachgewiesen werden, wodurch die transkriptionelle Aktivität des E2A vermutlich inhibiert wird. Auch wenn in Folge der RNAi-vermittelten Herunterregulation von ID2 in den HL-Linien weder eine Re-Expression B-Zell-spezifischer Gene noch eine Beeinflussung der Expression Marker andere hämatopoetischer Linien gefunden werden konnte, spielt ID2 vermutlich dennoch eine wichtige Rolle in der Dedifferenzierung der HRS Zellen im HL. Unabhängig davon konnte der negative Zellzyklusregulator p21Cip1 als ID2-Target-Gen identifiziert und eine Interaktion mit HEF1 gezeigt werden. Demnach ist ID2 möglicherweise nicht nur an der Dedifferenzierung, sondern auch an der Dysregulation des Zellzyklus im HL beteiligt und somit ein wichtiger Faktor in der Pathogenese des HL. The Hodgkin/Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma (HL) are derived from germinal center B cells. Nevertheless, they express almost no B-cell specific genes, instead, they co-express markers of other hematopoietic lines. The reason for the loss of B-cell phenotype is largely unknown, because the transcription factors E2A and PAX5, which are essential in mature B cells to maintain the expression of B-cell-specific genes cells, are expressed by primary HRS. However, PAX5 is expressed significantly lower compared to normal B-cells. E2A is through direct interaction with the inhibitor of DNA binding, ID2, negatively regulated. ID2 has a bHLH structure, and dimerises with transcription factors. Due to its lack of a DNA binding domain, DNA binding of the heterodimers is prevented, thus inactivating transcription factors. In hematopoietic cells ID2 expression seems to repress B-cell development and the expression of B-cell-specific and instead to promote the expression of genes of other lines. In mature B cells ID2 is highly expressed during plasma cell development with concomitant loss of expression of B-cell-specific genes. The results of this study indicate that ID2, which could not be detected in normal B cells, is, however, strongly expressed in all HL cases, not only at the RNA level but also at the protein level. Co-immunoprecipitation of E2A with ID2 from HL cell lines showed the interaction and thus presumably the transcriptional inactivation of E2A with ID2, resulting in the loss of expression of B-cell-specific genes. Moreover, PAX5 is induced by E2A together with EBF. Thus the ID2-mediated E2A-inactivation indicates that ID2 via EBF also influences the regulation of PAX5 in HL. PAX5 plays a dual role in the differentiation, because it activates not only B-cell-specific genes, but also represses the genes of other lines. Thus ID2 could also be involved in the expression of non-B-cell-specific genes in HL. In addition, ID2 may also be attended in the lower expression of PAX5 in the HL compared to normal B-cells by E2A inactivation via EBF. Although the ID2 protein could be reduced successfully by RNA interference in HL-cell lines, neither a change in the protein expression of the B-cell-specific genes CD19 and CD79A, nor of genes of other hematopoietic lines GATA-3 and M-CSF-R could be shown. Regardless of its possible involvement in the dedifferentiation of the HRS cells in HL, ID2 seems to play a further role in the pathogenesis of HL. Different interactions suggest that ID2 is also involved in the regulation of the cell cycle. First, this work showed the interaction of ID2 with the HLH protein HEF1 in at least one of the HL cell lines. HEF1 is an activator of Aurora kinase 1, which phosphorylates after activation genes that promote the process of mitosis. Second, the negative cell cycle regulator p21Cip1 could be identified as ID2 target gene in HL cell lines by RNAi-mediated reduction of the ID2 protein. Even if the interaction with RB, a key regulator of cell cycle progression belonging to the family of pocket proteins, could not be detected in HL-cell lines, the results of this study show that aberrant ID2 expression is apparently involved in the change of the cell cycle in HL. Nevertheless, the results still admit no final conclusion. This study found, that ID2 is also aberrantly expressed in anaplastic large cell T-cell lymphoma. Also here an interaction with E2A, which also plays a role in T-cell development, could be demonstrated. Therefore, ID2 could be also an important factor in the dedifferentiation of ALCL. ID2 is aberrantly expressed in HL and it interacted with E2A in the HL cell lines, thus the transcriptional activity of E2A is probably inhibited. Even if as a result of RNAi-mediated down-regulation of ID2 in the HL-lines, neither a re-expression nor an influence of the expression of markers of other hematopoietic lines could be found, ID2 is thought to play nevertheless an important role in the dedifferentiation of the HRS cells in HL. Regardless, the negative cell cycle regulator p21Cip1 could be identified as ID2-target gene and the interaction with HEF1 was found. Accordingly, ID2 may be involved not only in the dedifferentiation, but also in the deregulation of the cell cycle in HL and thus is an important factor in the pathogenesis of HL.

Mittels 2D-DIGE\(^{TM}\) und MALDI-MS-Analyse unter Verwendung des Gel-\(\it warping\)-Algorithmus RAIN wurde untersucht, wie die Dedifferenzierung humaner Primärhepatozyten sowie die Behandlung der Zellen mit Rifampicin auf das Proteom der Zellen wirkt. Die insgesamt 20 differenziellen Proteine wurden z.T. durch mRNA-Transkriptdaten und Western-Blotting validiert. Zusätzlich wurde das Phosphoproteommuster mittels spezifischer Pro-Q® Diamond-Gelfärbung untersucht. Im Weiteren konnte gezeigt werden, wie sich nanoLC-ESI-MS/MS dazu verwenden lässt, hoch homologe Cytochrom-P450-Isoformen (CYPs) zu differenzieren und semiquantitativ zu erfassen. Zusätzlich konnten 7 neue CYP-Phosphorylierungsstellen identifiziert werden. Es wurde daraufhin eine Methode zur Quantifizierung von CYPs und CYP-Phosphorylierungen auf Basis von nanoLC-MRM entwickelt. In einem Pilotversuch konnte erstmalig die Enzymdeaktivierung von CYP2B6 durch Phosphorylierung gezeigt werden.

Mastzellen (MZ) reifen zu terminal differenzierten Zellen erst in peripheren Geweben. ATRA ist ein wesentlicher Regulator der Hämatopoese und kann auf positive wie auf negative Weise deren Differenzierung beeinflussen – die Qualität ist dabei häufig abhängig vom Reifegrad. Die Arbeit beschäftigte sich daher mit der Frage, ob die Effekte von ATRA auf MZ ebenfalls abhängig von deren Reifegrad sind. Unreife HMC-1 5C6 Zellen, differenziertere LAD 2 Zellen und reife kutane MZ (KMZ) wurden mit ATRA behandelt und die Effekte auf spezifische Mastzellmarker auf Protein- und mRNA-Ebene untersucht. Die Proteinexpression von c-kit, FceRI, Tryptase und Chymase wurde bei allen drei Zellsystemen herunterreguliert. Änderungen der Proteinexpression wurden qualitativ, wenngleich nicht immer quantitativ auf mRNA-Ebene reflektiert, d.h. es gab Marker, bei denen die Herunterregulation auf der einen oder anderen Ebene überwog. Eine genaue Quantifizierung der ATRA-Effekte auf die Tryptase und Chymase zeigte eine prozentual erheblich stärkere Herunterregulation der mRNA als des Proteins. Invers dazu war der Effekt bei c-kit, ein Effekt, der besonders deutlich bei HMC-1 5C6 auszumachen war. Zur Klärung, welcher Mechanismus der von der mRNA-Ebene unabhängigen Herunterregulation des c-kit-Proteins zugrunde liegt, wurden HMC-1 5C6 zusätzlich zu ATRA mit Inhibitoren fundamentaler Zellfunktionen inkubiert. Cycloheximid allein war dabei in der Lage, die Wirkung von ATRA zu imitieren. Es kann also vermutet werden, dass die starke Herunterregulation des Proteins im Vergleich zur mRNA einem translationellen Mechanismus folgt. Betrachtet man alle Effekte gemeinsam, so zeigte ATRA den stärksten Einfluss auf das am weitesten differenzierte Mastzellsystem, nämlich KMZ. Geringer waren die Effekte bei LAD 2, wohingegen bei HMC-1 5C6 das schwächste Ansprechpotential gegenüber ATRA gefunden wurde. Dies ist von besonderem Interesse, weil ATRA normalerweise wesentlich potenter auf unreif-proliferierende Systeme wirkt. ATRA hat auf humane MZ einen deutlich dedifferenzierenden Effekt, der weitgehend unabhängig vom Reifegrad der Zellen operiert. Die Effekte scheinen dabei in Abhängigkeit vom betrachteten Marker nicht auf die transkriptionelle Ebene beschränkt zu sein, sondern könnten auch einem translationellen Mechanismus unterliegen., Mast cells (MC) are of hematopoietic origin but complete their differentiation exclusively within tissues. A large number of mediators positively or negatively affect the maturation process of MC. ATRA is a potential master regulator of haematopoiesis, where it primarily affects immature and proliferative leukocytes. Here, the effects of ATRA (3-7d) on MC that span different stages of maturation, i. e. immature-leukemic HMC-1 5C6 cells, intermediately matured LAD 2 cells, and terminally differentiated skin MC were analyzed. The expression of the lineage markers c-kit, FceRI, tryptase, chymase und histidindecarboxylase (HDC) was studied in parallel at protein level by flow-cytometric analysis and at mRNA level by RT-PCR. ATRA exposure led to a down-regulation at protein and at mRNA level of c-kit, FceRI, tryptase and chymase by all MC subtypes. Comparing protein and transcript levels, however, substantial differences between c-kit and the proteases were noted. c-kit down-regulation was more pronounced at protein level, whereas the opposite was found with proteases. Further analysis revealed the existence of a second mechanism of c-kit down modulation that proceeded rapidly and independently of mRNA changes. This pathway was restricted to immature MC and could be mimicked by cycloheximide, suggesting that altered translation may account for the phenomenon. Taken together, the study indicates that MC are significant target cells of ATRA throughout their lifespan, but that the molecular events underlying down-regulation of lineage markers may be shifted in the course of MC differentiation. The strongest effects of ATRA were observed in mature MC, while this accounts to a lesser degree for LAD 2 cells. In contrast, the immature and highly proliferating HMC-1 5C6 cells presented even less sensitive to ATRA. Therefore, ATRA has dedifferentiating potential towards human MC that is most pronounced in mature MC. Depending on the specific marker, protein down regulation can underlie various mechanisms. In this regard, c-kit seems to follow a translational rather than transcriptional inhibitory process.

The present thesis is a contribution to unravel the molecular mechanisms that underlie urodele regeneration. Urodele amphibians (newts and salamanders) are among the few vertebrates with the remarkable ability to regenerate lost body appendages, like the limbs and the tail. Urodele tail and limb regeneration occurs via blastemal epimorphic regeneration. A blastema is a mound of progenitor cells that accumulates at the amputation plane and eventually gives rise to the missing structures. It is known today that dedifferentiating muscle fibers at the amputation plane contribute to the blastema cell pool, but how this process occurs on the cellular and molecular level is hardly understood, which is in part due to the lack of molecular methods to test gene function in urodeles. Furthermore, little is known about how coordinated growth and patterning occurs during urodele regeneration, and if the patterning mechanisms in regeneration are related to the ones in development. The goal of this study was to better understand these processes on the molecular level. To address these questions, I first established several methods in our model systems, which are the mexican salamander Ambystoma mexicanum (axolotl) and a cell line derived from the newt Notophthalmus viridescens. In order to monitor gene expression on a cellular level during regeneration, I worked out a good in situ hybridization protocol on axolotl tissue cryosections. To be able to test gene function, I established electroporation conditions to both overexpress genes in the cultured newt cells and to deliver morpholinos into axolotl cells in vivo and newt cells in culture. I demonstrate here that morpholinos are an effective tool to downregulate protein expression in urodele cells in vivo and in culture. Testing the role of two candidate genes in muscle fiber dedifferentiation, the homeobox containing transcription factor Msx1 and Rad, a GTP-binding protein of a new Ras-related protein family, revealed that neither seems to play a major role in muscle dedifferentiation, both in culture and in vivo. In addition to testing gene function I have examined the muscle dedifferentiation process in more detail. I show here that dedifferentiating muscle fiber nuclei undergo morphological changes that are likely due to chromatin remodeling events. I also demonstrate that the axolotl spinal cord expresses embryonic dorsoventral (d/v) patterning markers of the neural tube. The transcription factors Msx1, Pax7 and Pax6 are expressed in their respective d/v domains in both the differentiated and the regenerating axolotl spinal cord. Furthermore, the secreted signaling molecule sonic hedgehog (Shh) is expressed in the floor plate in both the differentiated and the regenerating cord. Using a chemical inhibitor (cyclopamine) and an activator of the hedgehog pathway, I discovered that hedgehog signaling is required for overall tail regeneration. Blocking hedgehog signaling does not only result in d/v patterning defects of the regenerating spinal cord, but it also strongly reduces blastema cell proliferation. In addition, I identified cartilage and putative muscle progenitor cells in the blastema, marked by the expression of the transcription factors Sox9 and Pax7, respectively. Both progenitor populations are reduced in the blastema in the absence of hedgehog signaling. The continuous expression of marker genes for embryonic progenitor cell domains in the mature axolotl may be related to their ability to regenerate.