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The human pathogen Bacillus cereus is responsible of many food poisoning due to the ingestion of contaminated vegetables or processed foods. For the survival and colonization, the bacteria form a biofilm on biotic and abiotic surfaces in which a specific subpopulation differentiates to produce a multifunctional extracellular matrix (ECM), mainly composed by exopolysaccharides, proteins and extracellular DNA. One of the most attractive components of the ECM are the amyloid proteins due to its high tendency to fibrillate and the multifunctional role in the bacterial physiology. In the B. cereus genome there is a specific genomic region that contains two orthologues genes to the tasA gene in Bacillus subtilis, initially described as essential in the assembly of amyloid fibers, named tasA and calY respectively. The deletion of these genes gives a different phenotype related with a deficient biofilm formation in both cases. In the tasA mutant, the biofilm finally detaches at 72 hours, and the calY mutant shows a thinner ring phenotype in comparison with the wild type strain. The gene expression dynamic during the biofilm development reveals that there are three different subpopulations: both genes are expressed, only calY or none of them. Furthermore, transcriptomic analysis by RNA-Seq show that the mutants have different changes in the gene regulation and the calY mutant is the most affected, with 227 genes deregulated that affect to several important pathways such as the synthesis of extracellular DNA, an important component of the ECM. The results mentioned above indicate that TasA and CalY might have complementary roles in the biopellicle development but also evidence that this physiological process is more complex in B. cereus in comparison with the model described in B. subtilis. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Comunicación oral a congreso Las comunidades microbianas presentes en la rizosfera de árboles de aguacate sanos presentan una elevada presencia de bacterias del filo Proteobacteria. Destacan aquellas especies pertenecientes al complejo Pseudomonas fluorescens que presentan actividades relacionadas con la promoción del crecimiento de plantas (Plant Growth Promotion: PGP), así como con el control biológico de diferentes fitopatógenos como hongos, bacterias e insectos. Para estudiar el comportamiento y las interacciones que tienen lugar entre distintas cepas de P. chlororaphis aisladas de la rizosfera de aguacate, se ha construido una comunidad sintética de tres cepas y se han analizado sus fenotipos. Los genomas de estas cepas están secuenciados y se realizó un estudio comparativo de sus genomas. Por un lado, se han realizado estudios de compatibilidad y competitividad in vitro e in vivo entre las distintas cepas, y se determinó el fenotipo dominante en las diferentes combinaciones de cepas para la morfología de colonias y formación de biofilm. Por otro lado, se observó mediante microscopía confocal la formación de biofilm in vitro, así como la distribución de las cepas en solitario y combinadas sobre la raíz de aguacate. Por último, se ha estudiado, el control biológico y la estabilidad del consorcio en la rizosfera de aguacate, determinando su capacidad de colonización y persistencia. Financiación: FPU18/05672, AGL2017-83368-C2-1-R, UMA18-FEDERJA-046, y Universidad de Málaga. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Las proteínas amiloides tienen la tendencia natural de formar fibras insolubles a partir de monómeros solubles, un proceso que implica la formación de agregados de distintos tamaños, y con distintas conformaciones. Una de características definitorias de las fibras amiloides es el enriquecimiento en láminas beta que confieren propiedades tintoriales, bioquímicas y biológicas. A pesar de preservar la denominación patológica, los amiloides median funciones que son esenciales para la homeostasis celular o la adaptación al entorno. En Bacillus subtilis, la proteína amiloide TasA desempeña varias de estas funciones: i) estructural, contribuyendo al ensamblaje de la matriz extracelular, ii) celular, preservando la fluidez y funcionalidad de la membrana, iii) señalización, manteniendo ciertas subpoblaciones celulares. Por lo tanto, resulta esencial conocer los residuos o dominios de la proteína que hacen posible a TasA transitar entre las distintas conformaciones, como paso previo a entender esta diversidad de funciones. En trabajos previos (1), estudiamos las propiedades estructurales de TasA en su forma fibrilar, y mediante la digestión con proteínasa K demostramos la existencia de una región resistente en la mitad amino terminal y que denominamos el núcleo amiloide. En este trabajo se ha estudiado esta región mediante el uso de diversas aproximaciones, genética, bioinformáticas, bioquímicas o biofísicas. Como resultado hemos detectado la existencia de residuos aminoácidos y regiones conservadas que parecen ser esenciales al menos en el proceso de amiloidogenesis, y por tanto en el papel estructural involucrado en la formación de biofilm. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

The extracellular matrix and sporulation are defensive mechanisms used by Bacillus cells when they interact with Pseudomonas strains expressing a type VI secretion system (T6SS). Here, we define Tse1 as the main toxin mobilized by the Pseudomonas T6SS that triggers sporulation in Bacillus. We characterize Tse1 as a peptidoglycan hydrolase and electron microscopy analysis and the use of diverse chemical probes, let us visualize malfunction of the Bacillus cell membrane. By performing RNA-seq and immunocytochemistry analyses, we also delineate the response of Bacillus cells to Tse1, which through the coordinated actions of the extracellular sigma factor σW and the cytoplasmic histidine kinases KinA and KinB, culminates in activation of the sporulation cascade. We propose that this cellular developmental response is conserved in Bacilli to defend against the toxicity of T6SS-mobilized Tse1 effector. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Bacterial communities are continuously adapting and evolving for survival. They produce and secrete a broad range of molecules that kill, defend, or mediate communication between cells of different lineages, thus shaping the final structure of the microbial community. In this work, with the combination of -omics approaches, molecular biology and microscopic techniques, we expand our knowledge on the chemical interplay and specific mutations that modulate the transition from antagonism to co-existence between two plant-beneficial bacteria, Pseudomonas chlororaphis and Bacillus amyloliquefaciens. We demonstrate that bacillaene, a secondary metabolite with bacteriostatic activity produced by Bacillus, interacts with the protein elongation factor FusA of P. chlororaphis to arrest its growth and population advancement. Point mutations in this protein lead to tolerance to bacillaene and other inhibitors of protein translation. Additionally, we describe the key role of the glycerol kinase GlpK from B. amyloliquefaciens in its unspecific tolerance against P. chlororaphis. Mutations in GlpK provoked by a decrease of Bacillus cell membrane permeability among other pleiotropic responses. We conclude that nutrient specialization and mutations in basic biological functions are bacterial adaptive dynamics that lead to the coexistence of two primary competitive bacterial species rather than their mutual eradication. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Comunicación a congreso en formato póster La cepa modelo Pseudomonas chlororaphis PCL1606 (PcPCL1606) es una bacteria asociada a la rizosfera de las plantas de aguacate. Esta rizobacteria muestra una marcada capacidad de antagonismo y control biológico frente a diferentes hongos fitopatógenos de suelo, incluido Rosellinia necatrix, agente causal de la podredumbre blanca radicular en cultivos de aguacate en el área Mediterránea. La actividad de control biológico viene mediada, principalmente, por la producción de la molécula antifúngica 2-hexil, 5-propil resorcinol (HPR). Además, HPR también interviene en procesos como la colonización de las raíces, la formación de biopelículas y las interacciones multitróficas en la rizosfera, lo que indica una actividad reguladora adicional. Datos previos obtenidos en un estudio transcriptómico para identificar los genes regulados por HPR, revelaron la inducción de un clúster de genes durante la interacción con la rizosfera de aguacate. Este clúster presenta homología con genes que codifican un posible pili tipo IV Flp/ Tad (por sus siglas en inglés Tight Adherence), descrito previamente por su implicación en la adhesión temprana. Para estudiar el papel de esta región génica en la biología de PcPCL1606, se construyó un mutante dirigido por deleción en los genes que codifican para la principal proteína estructural de este pili y se validó su fenotipo con respecto a la cepa silvestre. Los resultados obtenidos evidencian la importancia de este clúster de genes en la adhesión y la formación de la biopelícula, ambos procesos relacionados con el control biológico y la colonización de PcPCL1606 en las raíces de la planta de aguacate. Este trabajo ha sido financiado por las ayudas I+D+i del Programa Operativo FEDER Andalucía (UMA18-FEDERJA-046); y la Universidad de Málaga. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Comunicación a congreso en formato póster Las biopelículas bacterianas están formadas por agregados celulares embebidos en una matriz extracelular de producción propia, formada principalmente por exopolisacáridos (EPS), proteínas y ADN extracelular. Existen datos recientes que sugieren que entre el 40-80% de las bacterias se encuentran formando biopelículas en la naturaleza, y que la formación de las biopelículas se ve afectada por factores ambientales. Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) es una bacteria fitopatógena causante de la necrosis apical del mango (NAM), enfermedad limitante de la producción de este cultivo en la región mediterránea. En Pss se ha descrito una conexión entre factores ambientales y la incidencia y severidad de la NAM, jugando los EPS celulosa y uno tipo-Psl, un papel relevante en la transición entre un estilo de vida epífito o patogénico. En este trabajo, se ha analizado el papel de algunos factores ambientales relevantes como son la luz y la temperatura en la formación de la biopelícula in vitro en una colección de cepas de Pss aisladas de mango. Los resultados obtenidos sugieren que la temperatura y particularmente la luz pueden influir en la formación de las biopelículas a través de la biosíntesis de los EPS, principalmente celulosa. Además, también se ha observado como niveles más bajos de producción de celulosa podrían estar asociados con una mayor virulencia. Estos resultados indican que los EPS, y principalmente celulosa juegan un papel clave en la ecología de Pss sobre la planta de mango a través de la formación de la biopelícula. Este trabajo ha sido financiado por Proyectos de Excelencia de la Junta de Andalucía (P12- AGR-1473), cofinanciado con ayudas a proyectos I+D+i en el marco del Programa Operativo FEDER Andalucía (UMA20-FEDERJA-060), y la Universidad de Málaga. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Beneficial microbes are known to stimulate the germination of the seeds; however, the exact mechanisms mediating these interactions are only beginning. Bacillus subtilis is a commonly detected member of the plant holobiont and provides multifaceted traits to the plant health. In this work, we demonstrated that B. subtilis triggered genetic and physiological responses in seeds that resulted in changes in the metabolic and developmental status of adult plants. A multidisciplinary approach based on microscopy, transcriptomics and metabolomics demonstrated that the chemically diverse extracellular matrix of Bacillus structurally cooperate in bacterial colonization of the seed storage tissues. The amyloid protein TasA and fengycin, two components of the extracellular matrix, differentially stimulated levels of ROS inside seeds after imbibition and targeted the oil bodies of the seed endosperm, provoking specific changes in lipid metabolism or accumulation of glutathione-related molecules that resulted in two different plant growth programs: the development of seed radicles or major growth and immunization of adult plants. Our findings prove the versatility of the bacterial ECM in establishing a mutualistic interaction with plants. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

The need to implement sustainable agricultural models has led to the search for alternatives to deal with different plant diseases, with the use of biocontrol agents being one of the most versatile options. A clear example of these agents are the strains belonging to the Bacillus velezensis group, Grampositive bacteria capable of colonizing the different structures of plants and synthesizing a variety of compounds with various activities, ranging from growth promotion to antagonism against to different phytopathogens due to the synthesis of molecules such as lipopeptides (surfactins, fengycins and iturins) among others. Previous studies carried out in our research group have shown how the B. velezensis UMAF6639 strain has a great biocontrol capacity in plants belonging to the Cucurbitaceae family, derived mainly from the production of lipopeptides. The objective of this work focuses on the genetic improvement by random mutagenesis of said strain to obtain mutants with greater antimicrobial activity. Once the derivatives with the greatest antimicrobial activity have been identified, their characterization is being carried out to determine the genetic changes that justify the increase in their biocontrol capacity, as well as the changes in the production profile of secondary metabolites, implementing genomic and metabolomic tools to decipher the different mechanisms responsible for the antagonistic activity of these strains. This work has been supported by contract 8.06/60.4086 financed by the biotechnology company KOPPERT B.V. (The Netherlands) and Universidad de Málaga, Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Beneficial microbes are known to stimulate the germination of the seeds; however, the exact mechanisms mediating these interactions are only beginning. Bacillus subtilis is a commonly detected member of the plant holobiont and provides multifaceted traits to the plant health. In this work, we demonstrated that B. subtilis triggered genetic and physiological responses in seeds that resulted in changes in the metabolic and developmental status of adult plants. A multidisciplinary approach based on microscopy, transcriptomics and metabolomics demonstrated that the chemically diverse extracellular matrix of Bacillus structurally cooperate in bacterial colonization of the seed storage tissues. The amyloid protein TasA and fengycin, two components of the extracellular matrix differentially stimulated levels of ROS inside seeds after imbibition and targeted the oil bodies of the seed endosperm, provoking specific changes in lipid metabolism or accumulation of glutathione-related molecules that resulted in two different plant growth programs: the development of seed radicles or major growth and immunization of adult plants. Our findings prove the versatility of the bacterial ECM in establishing a mutualistic interaction with plants. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Bacillus cereus es un patógeno humano responsable de numerosas intoxicaciones alimentarias debido al consumo de verdura y comida procesada contaminada. El desarrollo de comunidades bacterianas, también conocidas como biofilms, y la formación de esporas, son etapas esenciales para la supervivencia y transmisión de esta bacteria. Durante el proceso de formación de la biopelícula, una subpoblación celular se diferencia en células productoras de matriz extracelular, compuesta principalmente por exopolisacáridos, proteínas y ADN extracelular. Las proteínas amiloides forman parte de dicha matriz, se caracterizan por presentar una alta tendencia a fibrilar y participan de forma multivalente en la fisiología bacteriana. En B. cereus se han identificado dos genes ortólogos al gen tasA de Bacillus subtilis, denominados tasA y calY, respectivamente, y se ha demostrado que ambos participan en la formación de fibras amiloides. La deleción de cada uno de los genes da lugar a un fenotipo diferente relacionado con alteraciones en la formación de la biopelícula. En el caso del ΔtasA, el biofilm se desprende de la superficie del pocillo a las 72 horas, y en ausencia de calY el grosor es menor. Mediante citometría de flujo se ha determinado que los niveles de expresión de ambos genes varían en función de subpoblaciones celulares dentro del propio biofilm: se expresan ambos, sólo se expresa calY, o ninguno de ellos. Adicionalmente se ha llevado a cabo un análisis mediante RNA-Seq y se han identificado cambios diferenciales para cada uno de los mutantes con respecto a la cepa silvestre. Los resultados preliminares que se mencionan en este resumen indican que ambas proteínas podrían estar implicados diferentes funciones en la formación del biofilm. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Bacillus cereus is a human pathogen responsible of many food poisoning due to the ingestion of contaminated vegetables or processed foods. The biofilm development and spore formation, are essential stages in the survival and transmission of the bacteria and hence the production of harmful toxins for the consumer. During the biofilm formation, a subpopulation is differentiated to extracellular matrix producers, mainly composed by exopolysaccharides, proteins and extracellular DNA. One of the most fascinating compounds of this matrix are the amyloid proteins, that shows a high tendency to fibrillate and have a multifunctional role in the bacterial physiology. In earlier studies it was identified that B. cereus possess two orthologues genes to the tasA gene in B. subtilis, initially described as essential in the assembly of amyloid fibers, and they were named as tasA and calY respectively. Both genes are located in the same genomic region and the deletion of each one leads to a different phenotype related with a deficient biofilm. In the case of the tasA mutant the biofilm finally detaches from the well at 72 hours, and the calY mutant shows a thinner ring phenotype in comparison with the wild type strain. Those preliminary results could indicate that TasA and CalY have different roles in the biofilm formation. The level of tasA and calY expression in the biofilm was higher than in planktonic cells, and it could be differentiated three different subpopulations: both genes are expressed, only calY or none of them. Amyloid proteins have been described as being involved in adhesion and host-colonization. A study of the dynamic of tasA gene expression show that is influenced by the type of vegetable surface. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

El aumento de bacterias multi-resistentes a antibióticos es un problema a nivel mundial que provocará más de 10 millones de muertes al año en 2050 según la OMS. Por tanto, es prioritario comprender cómo las bacterias resisten a este tipo de moléculas. Además de los mecanismos de resistencia a antibióticos conocidos hasta el momento, recientemente se ha propuesto un papel clave de genes del metabolismo en la resistencia bacteriana. Mediante la utilización de Bacillus como modelo, estudiamos el papel de GlpK, la enzima con actividad glicerol kinasa implicada en la transformación de glicerol en glicerol 3-fosfato, en la resistencia a antibióticos en Gram-positivos. Los resultados obtenidos muestran que mutaciones puntuales en GlpK provocan un amplio cambio en la expresión genes. La activación de distintas rutas involucradas en la adquisición de fuentes de carbono, metabolismo de lípidos, movilidad, esporulación, señalización y genes implicados directamente en la resistencia a antibióticos, sugieren un papel complementario de GlpK al catabolismo de glicerol. Estos resultados en conjunto con los obtenidos mediante ensayos metabolómicos no dirigidos y el uso de microscopía confocal han permitido determinar cambios en la composición lipídica de la membrana celular, así como en sus propiedades físico-químicas caracterizado por un incremento en la rigidez de la membrana, lo que dificultaría la entrada de ciertos compuestos antimicrobianos al interior celular. El análisis a nivel proteico nos permitirá dilucidar el posible papel complementario de GlpK como regulador transcripcional y por tanto conectar la resistencia a antibióticos con la activación o represión de ciertas rutas metabólicas. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

En la naturaleza, las bacterias se encuentran frecuentemente formando comunidades bacterianas conocidas como biofilms. Las interacciones inter o intra-específicas pueden alterar notablemente la estructura de la comunidad y la forma en que se relaciona con el entorno. Hasta ahora, la mayor parte de la información sobre interacciones bacterianas se ha obtenido mediante técnicas microbiológicas clásicas, limitando nuestra capacidad para el estudio de estas interacciones a nivel celular y su visualización in vivo.En este trabajo presentamos el desarrollo de una metodología no invasiva para el estudio de la progresión de la formación de biofilms o la dinámica de las interacciones bacterianas que tienen lugar en estas comunidades. Igualmente, mostramos el uso de un innovador script de procesamiento de imágenes (BacLive, https://github.com/BacLive) para poder analizar los datos obtenidos a partir de estudios de microscopia de fluorescencia de alta resolución de una forma rápida y sencilla empleando Fiji/ImageJ. BacLive ofrece al usuario una estimación del movimiento de la población durante su crecimiento para calcular las variaciones de posición en el eje Z a lo largo del tiempo. De esta forma, sólo se adquieren las secciones en el plano Z correspondientes a las zonas donde hay crecimiento microbiano y no aquellas secciones sin información útil. El estudio de diversos ejemplos ha confirmado la utilidad de BacLive en la generación de imágenes en 2D y 3D de forma simple y eficiente y su empleabilidad en estudios de ecología microbiana. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

El uso de microorganismos para hacer frente a las distintas enfermedades de las plantas causadas por fitopatógenos ha surgido en las últimas décadas como una de las mejores alternativas en el desarrollo de una agricultura sostenible. Las cepas englobadas dentro del grupo de Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum son bacterias Gram positivas asociadas a plantas, reconocidas como agentes de biocontrol que destacan por su actividad antagonista frente a distintos patógenos (tanto fúngicos como bacterianos), así como por la liberación de sustancias capaces de estimular el crecimiento y la respuesta inmune de las plantas. Estudios previos en el grupo de investigación han demostrado como estas bacterias, en concreto la cepa B. amyloliquefaciens UMAF6639, presentan una gran capacidad de biocontrol derivada principalmente de la producción de lipopéptidos (fengicinas, surfactinas e iturinas), actuando como antagonistas de distintos microorganismos sobre todo en plantas de la familia de las cucurbitáceas. Por ello, el principal objetivo de este trabajo se centra en la mejora genética de dicha cepa para obtener mutantes con mayor actividad antimicrobiana. La obtención de estos mutantes se ha realizado utilizando técnicas de mutagénesis aleatoria, que nos permitan poder comercializar dichos microorganismos en el marco legal actual. Una vez identificados los derivados con mayor actividad antimicrobiana, se está realizando su caracterización para determinar los cambios genéticos que justifican el aumento de su capacidad de biocontrol, profundizando así en los distintos mecanismos responsables de la actividad antagonista de dichas cepas. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

La formación de biofilms representa una respuesta bacteriana adaptativa al medio ambiente. En Bacillus subtilis se ha demostrado que la capacidad de formación de biofilm sobre la superficie de la planta contribuye positivamente a la persistencia y antagonismo frente a hongos. Trabajos previos de nuestro grupo han demostrado las propiedades amiloides de TasA, principal componente proteíco de la matrix extracelular, y su papel adicional en la fisiología bacteriana así como adaptación a la vida de Bacillus en la filosfera. El objetivo de este trabajo ha sido determinar las regiones implicadas en las propiedades amiloides y funcionales de TasA.La digestión de TasA con proteínasa K, demostró la existencia de una región resistente a la proteólisis y correspondiente a la mitad amino terminal de la proteína, que denominamos núcleo amiloide. El análisis bioinformático de este núcleo, probó la existencia de repeticiones imperfectas de aminoácidos y segmentos amiloidogénicos que podrían ser importantes para el montaje de la fibra amiloide y la formación del biofilm. El análisis mediante unión a colorantes específicos, microscopía electrónica de transmisión, y estudios de agregación, han demostrado las propiedades amiloides del núcleo. Además, se han estudiado variantes de TasA con mutaciones puntuales en ciertos aminoácidos específicos dentro de este núcleo amiloide y potencialmente amiloidogénicos.En conclusión, TasA, al igual que otras proteínas amiloides, posee un núcleo altamente “empaquetado” y resistente a degradación proteolítica, proporcionando la robustez necesaria para ensamblar un polímero. Además, hemos encontrado aminoácidos específicos que podrían contribuir o bien al papel estructural o fisiológico de TasA. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

La cepa PCL1606 de Pseudomonas chlororaphis es una bacteria aislada de la rizosfera de aguacates sanos localizados en fincas afectadas por la podredumbre blanca radicular, enfermedad causada por el hongo de suelo Rosellinia necatrix. Se realizaron ensayos de antagonismo en placa mostrando una fuerte inhibición del crecimiento no solo de R. necatrix, sino de otros hongos fitopatógenos. Su capacidad antagonista se debe principalmente a la producción del compuesto 2-hexil, 5-propil resorcinol (HPR). En experimentos realizados en plantas de aguacate, se observó como PCL1606 mostraba una fuerte actividad de biocontrol frente a R. necatrix, además era capaz de colonizar eficientemente la raíz y persistir por largos periodos de tiempo en el lugar de inoculación. Igualmente se ha comprobado que la aplicación de PCL1606 provoca la disminución de la población de R. necatrix en suelos infectados, sin alterar las poblaciones de otros grupos de microorganismos autóctonos del suelo. Por todo ello, la cepa PCL1606 se propone como una firme candidata a formar parte de los productos de control biológico denominados como biofungicidas. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. UMA18-FEDERJA-046

AGL2017-83368-C2-1-R (MICINN) y UMA18-FEDERJA-046 (Junta de Andalucía), ambos fondos FEDER. FPU18/05672 (Ministerio de Ciencias, Innovación y Universidades). Desde la rizosfera de aguacates sanos localizados en áreas afectadas por el hongo fitopatógeno Rosellinia necatrix, se han aislado de forma consistente bacterias de la especie Pseudomonas chlororaphis que muestran actividades de biocontrol y PGPR. Con la intención de profundizar en las interacciones multitróficas que pueden tener lugar entre este grupo de microorganismos en la rizosfera, se ha procedido al diseño y caracterización de una comunidad microbiana sintética formado por tres aislados procedentes de rizosfera de aguacate: P. chlororaphis PCL1606, P. chlororaphis PCL1601 y P. chlororaphis subsp. piscium PCL1607. Los estudios de compatibilidad y competitividad han determinado que estas tres cepas son compatibles. La caracterización incluye, además, los estudios de crecimiento en medios con sobrenadantes de otras bacterias, así como con exudados de raíz de aguacate o procedentes de cultivos de R. necatrix. Además, se evaluará la capacidad de formación de biofilm, la capacidad de movimiento swarming y swimming, tanto individual como en conjunto. Por último, se determinará la capacidad de colonización y persistencia en raíces de plántulas de aguacate, observándose el comportamiento individual frente al mostrado en la comunidad sintética. Financing: AGL2017-83368-C2-1-R (MICINN) y UMA18-FEDERJA-046 (Junta de Andalucía), ambos fondos FEDER. FPU18/05672 (Ministerio de Ciencias, Innovación y Universidades). Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

La rizobacteria Pseudomonas alcaligenes AVO110 muestra antagonismo frente al hongo fitopatógeno Rosellinia necatrix. Esta cepa coloniza eficazmente las hifas de R. necatrix y es capaz de alimentarse de sus exudados. Recientemente, hemos publicado la secuencia completa del genoma de P. alcaligenes AVO110. La filogenia de todos los genomas de P. alcaligenes disponibles separa los aislados ambientales, procedentes de agua, junto a la cepa AVO110, de los obtenidos de infecciones de sangre humana y de tejidos de ostras, que agrupan con Pseudomonas otitidis. Análisis del core y del pangenoma de P. alcaligenes han revelado que las cepas de esta especie codifican conjuntos de genes altamente heterogéneos, y que el genoma de AVO110 codifica la región variable más grande y exclusiva de todos ellos (aproximadamente 1,6 Mb y 1795 genes). Los genes exclusivos de AVO110 incluyen un amplio repertorio de genes relacionados con la formación de biopelículas (biofilms), de entre los cuales destacan aquellos modulados transcripcionalmente por exudados de R. necatrix. Uno de estos genes (cmpA) codifica una proteína con dominios GGDEF/EAL específica de cepas de Pseudomonas spp. aisladas de la rizosfera de diversas plantas, de suelo y de agua. También hemos demostrado que CmpA tiene un papel en la formación de biopelículas y que la integridad de su dominio EAL está involucrada en esta función. Este trabajo contribuye a una mejor comprensión del estilo de vida y de la adaptación a nichos específicos de P. alcaligenes, incluido el comportamiento micofágico de la cepa AVO110. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Los nematodos fitoparásitos son uno de los grupos de patógenos de cultivos más destructivos causando graves pérdidas anuales a nivel mundial. La mayoría de los nematodos fitoparásitos se localizan en el suelo siendo patógenos de la raíz, lo que implica una gran dificultad en cuanto a su control y erradicación. Hoy en día, la aplicación de agentes químicos sigue siendo el método más común para la gestión y control de estos patógenos. Sin embargo, debido a la crecientes preocupaciones sobre los problemas de seguridad del medio ambiente y salud pública, muchos nematicidas químicos con alto grado de toxicidad se han retirado o se ha restringido su uso. Por tanto, urge desarrollar alternativas ecológicas para el control de estos patógenos. El empleo de bacterias beneficiosas para combatir plagas o enfermedades de plantas ha cobrado gran importancia en las últimas décadas. En un estudio previo, se demostró que la cepa de Bacillus amyloliquefaciens UMAF6639, es una excelente candidata como agente de biocontrol contra enfermedades fúngicas y bacterianas de las cucurbitácea. Resultados preliminares indicaron que también podría ser efectiva contra nematodos parásitos de plantas. En este trabajo persigue esclarecer cuáles son los factores que median dicha actividad nematicida y el modo de acción de dichos factores, para ello se integran técnicas de química analítica y aproximaciones genómicas para identificar los compuestos responsables de dicha actividad. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Comunicación congreso The Psl polysaccharide has only been studied in Pseudomonas aeruginosa, and its role in bacteria that interact with plants is still unknown. On the one hand, P. syringae is a model of study of plant-pathogen interactions. On the other hand, P. chlororaphis is a biocontrol agent of plant-fungal diseases, as the white root rot caused by Rosellinia necatrix. In silico analysis have let us identify in both species a genomic region which is ortholog to the Psl-encoding region of P. aeruginosa PAO1. We constructed mutants of this region in both strains and analysed its phenotype in biofilm formation, both in static microwell plates and dynamic flow-cell chamber experiments. The results revealed a different and an important role of this polysaccharide in the biofilm architecture of both strains. Furthermore, in P. syringae this Psl-like polysaccharide has a very important role in swarming motility. All these striking phenotypes led us further study the implication of this polysaccharide in the lifestyles of both models of plant-bacteria interaction. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. AGL2017-83368-C2-1-R

En este trabajo, se analizará a nivel transcriptómico, la expresión/represión de los genes cuando se compara un mutante defectivo en la producción de HPR (mutante en el gen darB) frente a la cepa silvestre, identificando los fenotipos dependientes de la producción de HPR durante el proceso de interacción multitrófica, que se produce durante el control biológico de la podredumbre blanca radicular. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech . Este trabajo se ha financiado gracias a el Plan Nacional de l+D+I del Ministerio de Economía (AGL2014-52518-C2-l-R y AGL2017-83368-C2-l-R; MINECO, España) y cofinanciado con fondos PEDER (EU). S. Tienda está siendo financiada con una ayuda del programa FPI del MINECO

Las plantas viven en asociación con microorganismos, y han desarrollado estrategias para discriminar entre beneficiosos y patogénicos. Bacillus subtilis, agente de biocontrol en cucurbitáceas frente a patógenos como el oídio, es capaz de colonizar distintas superficies de las plantas, como las raíces o las hojas, mediante el establecimiento de comunidades bacterianas denominadas biopelículas o biofilms. Para establecerse en la parte aérea de las plantas, B. subtilis debe enfrentarse a condiciones ambientales adversas, como son los cambios de temperatura, el viento, la radiación solar y la reducida disponibilidad de nutrientes impuesta por la cutícula vegetal, lo que limita su colonización y crecimiento en dicha superficie. Por otro lado, Bacillus es capaz de influenciar el estado fisiológico de las plantas, promover su crecimiento o inducir una resistencia sistémica frente a patógenos. Para formar biofilms, Bacillus secreta una serie de compuestos, entre los que destaca la surfactina, que promueve el ensamblaje de una matriz extracelular en la que se embeben las células, cuyos componentes mayoritarios son proteínas (por ejemplo, las proteínas TasA y TapA, que forman fibras amiloides) y exopolisacáridos. Nuestro principal objetivo es determinar cómo el establecimiento de las comunidades de Bacillus afecta al estado fisiológico de las plantas, principalmente melón y pepino, y qué papel juegan los componentes de la matriz extracelular en la interacción con las plantas, así como los mecanismos por los cuales las plantas modulan la formación de dichas comunidades en la superficie de las hojas. El análisis de la respuesta de Arabidopsis y melón a distintos componentes de la matriz extracelular de B. subtilis sugiere que tanto la surfactina como los elementos mayoritarios de la matriz (las proteínas TasA y TapA, exopolisacáridos) activan mecanismos de señalización en ambas especies, que pueden promover el crecimiento de la planta o anticipar la defensa frente a patógenos. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Los nematodos fitoparásitos son uno de los grupos de patógenos de cultivos más destructivos causando graves pérdidas anuales a nivel mundial. La mayoría de los nematodos fitoparásitos se localizan en el suelo siendo patógenos de la raíz, lo que implica una gran dificultad en cuanto a su control y erradicación. Hoy en día, la aplicación de agentes químicos sigue siendo el método más común para la gestión y control de estos patógenos. Sin embargo, debido a la crecientes preocupaciones sobre los problemas de seguridad del medio ambiente y salud pública, muchos nematicidas químicos con alto grado de toxicidad se han retirado o se ha restringido su uso. Por tanto, urge desarrollar alternativas ecológicas para el control de estos patógenos. El empleo de bacterias beneficiosas para combatir plagas o enfermedades de plantas ha cobrado gran importancia en las últimas décadas. Entre las diferentes especies microbianas estudiadas, los miembros del género Bacillus se han demostrado eficaces para su uso como agentes de control biológico. En un estudios previos, se demostró que las cepas de Bacillus amyloliquefaciens, UMAF6614 y UMAF6639, son excelentes candidatas como agentes de biocontrol contra enfermedades fúngicas y bacterianas de las cucurbitáceas. Tras realizar los ensayos de mortalidad se ha visto que estas cepas tienen actividad nematicida pero se desconoce cuáles son los factores que median esta actividad y el modo de acción de dichos factores. Por tanto, en este trabajo se integran técnicas de química analítica y aproximaciones genómicas para identificar los compuestos responsables de dicha actividad y regiones en el genoma que codifiquen compuestos con actividad nematicida.

Bacillus cereus es un patógeno humano implicado en una serie de intoxicaciones alimentarias debido al consumo de verdura o comida procesada contaminada. La producción de esporas y la formación de comunidades denominadas biopelículas, son dos factores claves en la contaminación de los alimentos, la transmisión y la producción de toxinas perjudiciales para el consumidor. Durante su ciclo de vida, B. cereus es capaz de sobrevivir como saprófito, así como en asociación con una gran variedad de hospedadores: humanos, plantas e insectos. Se piensa que la formación de comunidades bacterias posee un importante papel en la supervivencia bacteriana y adhesión a superficies. En estudios previos se han identificado dos componentes proteicos de la matriz extracelular, TasA y CalY, implicados en la formación de biopelículas en B. cereus. La región cromosómica localizada entre estas dos proteínas contiene el locus bc_1280, que se encuentra ampliamente distribuido en el grupo de B. cereus y especies relacionadas. Estudios transcriptómicos y proteómicos han demostrado que bc_1280 se encuentra sobreexpresado en células de biofilm en comparación con células plantónicas. La deleción del gen bc_1280 en las cepas B. cereus ATCC14579 y AH187 presenta un fenotipo deficiente en la formación de comunidades bacterianas. El posible papel de esta proteína en la formación de biopelículas, y su amplia distribución a lo largo del grupo B. cereus, nos ha llevado a realizar un estudio en mayor detalle para determinar la funcionalidad de este locus en la multicelularidad y la interacción con hospedadores. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss), is the most polyphagous bacterium of the P. syringae complex, based on its wide host range, that severely affects woody and herbaceous plants. Pss has been described as the causal agent of bacterial apical necrosis (BAN) on mango crops, an important threat that drastically reduces the mango fruit yield in the Mediterranean region. Copper compounds have traditionally been used as standard bactericides to manage woody plant diseases, being the spraying of copper compound known as Bordeaux mixture (BM), the conventional treatment for controlling BAN disease. The extensive use of copper compounds can lead to many problems, and among them, the emergence of copper-resistant strains is one of the most serious. Pss strains isolated from mango trees harbour at least, two different genetic structures (copABCD and copABCD modified) encoded by plasmids that are involved in copper detoxification. Determination of the minimum inhibitory concentration of copper, together with a phylogenetic distribution analysis performed in a collection of Pss strains isolated from mango trees revealed a phylogenetic group of Pss strongly associated with high levels of copper resistance. Genome mining and functional characterization of one Pss strain present in this group have uncovered a novel gene cluster of chromosomal location that could be playing a major role in high levels of copper resistance during the epiphytic survival of Pss on mango tree surfaces. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Las bacterias pertenecientes al género Pseudomonas constituyen un modelo de estudio de la interacción microorganismo-planta. Pseudomonas syringae es una especie que produce enfermedades en la parte aérea de algunas plantas. Por otro lado, Pseudomonas chlororaphis interacciona con la raíz y ha demostrado ser un agente de control biológico. Ambas especies forman biopelículas y, a pesar de su diferente estilo de vida, análisis in silico han puesto de manifiesto la existencia de regiones genómicas tanto comunes como diferenciales que parecen estar implicadas en la biosíntesis de matriz extracelular. En este trabajo se han construido mutantes de estas regiones y analizado su implicación en la formación de biopelícula y aspectos relacionados. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Este trabajo ha sido financiado por el Proyecto de Excelencia de la CICE, Junta de Andalucía (P12-AGR-1473) y el Proyecto del Plan Nacional I+D+I MINECO (AGL2017-83368-C2-l-R), cofinanciados ambos con fondos FEDER. Zaira María Heredia está financiada por un contrato del programa FPU del Ministerio de Educación (referencia FPU15/03644).

The production of the compound 2-hexyl-5-propyl resorcinol (HPR) by the rhizobacterium Pseudomonas chlororaphis PCL1606 (PcPCL1606) is crucial for fungal antagonism and biocontrol activity against the phytopathogenic fungis. The production of HPR is also involved in plant root colonization. This pleiotrophic response prompted us to study the potential role of HPR production in biofilm formation. The swimming motility of PcPCL1606 is enhanced by the disruption of HPR production. Mutants deficient in HPR production, revealed that colony morphology, adhesion and typical air–liquid interphase pellicles were all dependent on HPR production. The role of HPR production in biofilm architecture was analyzed at the initial stage of biofilm maturation using flow-through flow cells chambers . These experiments revealed that the HPR mutant cells had less tight unions than those producing HPR, suggesting an involvement of HPR in the production of the biofilm matrix by PcPCL1606. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. AGL2017-83368-C2-1-R

Powdery mildew elicited by Podosphaera xanthii is a devastating disease of cucurbits worldwide and one of the most important diseases affecting these crops in Spain. Application of fungicides is the main control practice for managing P. xanthii; however, isolates resistant to multiple classes of site-specific fungicides have been recently reported in the Spanish cucurbit powdery mildew population. Succinate dehydrogenase inhibitors (SDHIs) constitute a relatively novel class of fungicides registered for powdery mildew control representing new alternatives for cucurbit growers. In the present study, 30 P. xanthii isolates were used to determine the effective concentration that reduces mycelial growth by 50% (EC50) to boscalid and fluopyram. The present study was also conducted to obtain discriminatory doses to monitor SDHI fungicide resistance in 180 P. xanthii isolates collected from several commercial cucurbit fields in Spain during 2017-2018. Three SDHI resistance patterns were observed in our population, which include patterns I (resistance to boscalid), II (resistance to fluopyram), and III (resistance to boscalid and fluopyram). The amino acid changes associated with these resistance patterns in the Sdh protein were also examined. Based on our results, SDHI fungicides are good alternatives for cucurbit powdery mildew control, although they should be applied with caution. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

El oídio, causado por el hongo biotrofo Podosphaera xanthii, es una de las enfermedades más importantes que afectan a los cultivos de cucurbitáceas en España. El control de esta enfermedad es principalmente químico, a través del uso continuado de fungicidas durante la campaña de cultivo; sin embargo, la rápida aparición de resistencias, por parte del patógeno, a estos compuestos es un hecho bien conocido, lo que dificulta el manejo de la enfermedad. En estudios previos, se detectaron altos niveles de resistencia a los fungicidas Metil Benzimidazol Carbamatos (MBC) en la población española de P. xanthii. La resistencia fue debida al cambio aminoacídico E198A en β-tubulina, diana de estos fungicidas. Para llevar a la práctica una agricultura más sostenible y productiva en el cultivo de cucurbitáceas, se hace necesario el desarrollo de nuevas técnicas que permitan reducir el número de aplicaciones de fungicidas y que optimicen los programas de aplicación para cada finca. En este estudio se ha usado por primera vez en el oídio de cucurbitáceas, la técnica LAMP (amplificación isotérmica mediada por bucle) para distinguir de forma rápida y fiable el genotipo mutante A198 en P. xanthii. Nuestros resultados han demostrado que la técnica LAMP es un método específico y reproducible que puede ser usado para monitorizar la resistencia a fungicidas MBC en P. xanthii en campo, proporcionando información exacta para cada finca analizada, y permitiendo a cada agricultor ajustar sus programas de aplicación de fungicidas antes de la pérdida de la cosecha. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

La resistencia a fungicidas en uno de los principales problemas de la agricultura y esto es especialmente patente en el caso de los oídios. En España y en las principales áreas productoras del mundo, el oídio de las cucurbitáceas es una amenaza muy grave, y Podosphaera xanthii es considerado como el principal agente causante de la enfermedad. Hasta la fecha, la aplicación de fungicidas y el uso de variedades resistentes son las principales herramientas para el control de la enfermedad. En cualquier caso, el oídio sigue imponiendo serias limitaciones en la producción agrícola, siendo necesario el desarrollo de nuevas estrategias de control. En este estudio se pretende proporcionar información sobre las bases moleculares de P. xanthii que pueda ser de utilidad para el desarrollo de nuevas herramientas de fitoprotección. Para lograr este objetivo, estamos centrando nuestra atención en un conjunto de proteínas fúngicas carentes de función, determinado en un estudio anterior. Ante la falta de homología con proteínas funcionalmente anotadas, para conocer la posible función de dichas proteínas, en primer lugar, llevamos a cabo un análisis in silico detallado de las proteínas que incluye modelado 3D, predicción de posibles ligandos e identificación de dominios funcionales. En segundo lugar, para la identificación de proteínas clave para la patogénesis de P. xanthii, silenciamos proteínas del hongo con función predicha bioinformáticamente mediante silenciamiento génico inducido por hospedador (HIGS) empleando Agrobacterium tumefaciens como vector para la expresión transitoria de construcciones de silenciamiento en células de melón, y desde ellas, al hongo diana. Finalmente, las proteínas con un fenotipo claro de silenciamiento serán seleccionadas para la caracterización de su actividad biológica. En este congreso se mostrarán los resultados más relevantes obtenidos hasta la fecha, relativos a la asimilación de azufre. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Este trabajo ha sido financiado por una ayuda del Programa Estatal de I+D+i Orientada a los Retos de la Sociedad (AGL2016-76216-C2-1-R), cofinanciada con fondos FEDER (UE). Los autores agredecen además ayudas del Plan Propio de Investigación de la Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Bacillus cereus es una bacteria responsable de importantes brotes de intoxicación alimentaria. La persistencia a través de la generación de biofilm y colonización de esta bacteria en frutos y vegetales supone un grave problema en la industria médica y alimentaria. Estudios previos revelan que durante la evolución en entornos estructurados como los biofilms, las poblaciones isogénicas tienden a diversificarse en variantes fenotípicas genéticamente distintas, que influyen en gran medida en la interacción con el resto de la población. Estudios previos en nuestro laboratorio han confirmado la aparición de mutantes espontáneos en las fracciones más externas de colonias de la cepa emética de B. cereus crecida en medio de movilidad swarming de forma recurrente. Este mutante da lugar a una colonia con morfología totalmente diferente y mayor capacidad de movilidad, originando un “punto de fuga” del biofilm. Estos morfotipos también fueron hallados in vivo en la supeficie de hojas de melón en inoculaciones realizadas en el laboratorio. La aparición de este tipo de mutantes ha estado asociada tradicionalmente al hecho de que la diversificación evolutiva tiende a mejorar la productividad de los biofilms, ya que las variantes recién surgidas se especializan en ocupar diferentes nichos, reduciendo así la competencia. Pero la historia evolutiva a nivel genético de estos morfotipos aun presenta grandes lagunas de conocimiento. Para profundizar en esta cuestión hemos desarrollado un flujo de trabajo llamado BacRiavility con el que se analizaron SNPs, recombinaciones, variantes estructurales, InDels y reorganizaciones genómicas de los diferentes morfotipos encontrados en placa y en plantas a partir de secuenciación masiva del genoma de diferentes morfotipos de colonias. Los resultados mostraron patrones comunes de mutaciones y cambios genómicos asociados a elementos de la matriz en todas las muestras analizadas. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Pseudomonas syringae es una bacteria ubicua a nivel ambiental. Presenta una taxonomía compleja en la que se han descrito más de 60 patovares que causan enfermedad en muchas especies de plantas diferentes. Entre los patovares más importantes se encuentra el pv. syringae debido a su amplio rango de hospedador, y al arsenal de mecanismos de virulencia que posee. A principios de los años 90, se describió a Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) como el agente causal de la necrosis apical del mango (NAM). Pss aisladas de mango muestran características importantes para su biología, tanto en sus mecanismos de virulencia como para el fitness epifítico. En este trabajo, se plantea conocer en profundidad cómo han evolucionado las poblaciones de Pss a lo largo del tiempo sobre el mango Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Este trabajo ha sido financiado por ayuda de la Consejería de Economía, Innovación y Ciencia, Junta de Andalucía (Pl2-AGR-1473), cofinanciados con fondos FEDER (UE)

Los biofilms son comunidades bacterianas complejas formadas en cualquier superficie y compuestas de células embebidas en una matriz extracelular. Esta estructura bacteriana dE B. subitlis está compuesta de exopolisacáridos (eps), la hidrofobina BslA y TasA y TapA, que forman las fibras amiloides que confieren robustez a la arquitectura del biofilm. Las rutas de señalización involucradas en la formación de biofilm están activas en la interacción de B. subtilis con la superficie de plantas. Trabajos previos han demostrado que la surfactina actúa como un autoinductor de la formación de biofilm en la fitosfera de plantas de melón, lo cual está relacionado con la actividad supresora de B. subtilis frente a determinados hongos fitopatógenos1. Teniendo en cuenta esto, el principal objetivo de este trabajo se centró en estudiar la contribución de los distintos componentes de la matriz extracelular en la ecología de B. subtilis sobre la superficie de la planta. Los resultados muestran que la proteína amiloide TasA tiene un papel importante y significativo en la adhesión y la formación de biofilm sobre hojas de melón; sin embargo, a pesar de la incapacidad del mutante en tasA (ΔtasA) para ensamblar un biofilm, presenta una actividad antagonista similar a la de la cepa silvestre (WT). El análisis transcriptómico del mutante reveló diferencias en los niveles de expresión de más de 800 genes. Estos resultados sugieren un cambio regulatorio global, que se traduce en que TasA, además de su papel estructural en el biofilm, podría tener una función reguladora del estado fisiológico de las células. Para demostrar esto, construimos un alelo de TasA incapaz de restaurar la formación de biofilm pero activo en la función fisiológica, devolviendo a las células al estado WT. Esto nos permitió separar ambas funciones, lo que respalda la importancia de este amiloide funcional en la regulación de la fisiología bacteriana y la supervivencia de la bacteria sobre la planta. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Podosphaera xanthii es un hongo biotrofo obligado y el principal agente causante del oídio de las cucurbitáceas. Hasta el momento, el control químico de la enfermedad ha resultado ser la herramienta más eficaz, aunque la aparición de aislados resistentes a las principales clases de fungicidas ha generado la necesidad de buscar alternativas y nuevas dianas para luchar contra este agente fitopatógeno. Con el objetivo de identificar nuevas dianas, partiendo de los perfiles transcriptómicos tanto haustorial como epifítico de P. xanthii previamente realizados en nuestro laboratorio, se han seleccionado secuencias desechadas en un principio por no presentar anotación ni siquiera como proteínas hipotéticas. Estas secuencias, sin embargo, mantenían un sitio de unión al ribosoma, un marco abierto de lectura y el mismo patrón codificante que el resto de las secuencias anotadas. Además, estudios anteriores realizados en nuestro laboratorio han validado funcionalmente algunas de ellas, verificando su expresión durante el proceso infectivo y su necesidad para el correcto desarrollo del hongo. Todo esto hace pensar que son secuencias codificantes presentes solo en P. xanthii y en otros hongos fitopatógenos cercanos. Estas secuencias han sido denominadas PNPCG (Podosphaera new protein-coding genes). Para conocer la posible función de dichas proteínas, en primer lugar, llevamos a cabo un análisis in silico detallado de las proteínas que incluye modelado 3D, predicción de posibles ligandos e identificación de dominios funcionales. En segundo lugar, una vez identificadas funciones de interés, llevamos a cabo experimentos de silenciamiento génico para la identificación de proteínas clave para la patogénesis de P. xanthii. El modelado proteico de algunas de estas nuevas secuencias ha revelado la presencia de posibles inhibidores de enzimas de la planta relacionadas con la resistencia a hongos fitopatógenos. Este trabajo ha sido financiado por una ayuda del Programa Estatal de I+D+i Orientada a los Retos de la Sociedad (AGL2016-76216-C2-1-R), cofinanciada por fondos FEDER (UE). Los autores agradecen además ayudas del Plan Propio de Investigación de la Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Bacillus subtilis es una bacteria Gram-positiva comúnmente presente en los suelos. Algunos aislados de esta especie son capaces de promover el crecimiento en plantas (actividad PGPR, del inglés plant growth promoting rhizobacteria) y de contribuir al control de diferentes enfermedades microbianas mediante la producción de una amplia batería de metabolitos secundarios con actividad antimicrobiana y la inducción de los mecanismos de defensa de la planta. Todo ello ocurre en el contexto de una eficiente colonización y persistencia sobre la raíz, la cual se cree estar asociada a la formación de biofilms: comunidades bacterianas donde las células están englobadas en una matriz extracelular de producción propia y compuesta principalmente por proteínas y exopolisacáridos. Estudios previos han demostrado que la surfactina, uno de los metabolitos secundarios producidos por esta bacteria, está involucrada en la cascada de señalización que dispara la formación del biofilm así como en la comunicación con la planta. Esta observación conduce a plantear la hipótesis de que alguno de los metabolitos secundarios u otros componentes estructurales de la matriz extracelular pueden ser mediadores de la comunicación bacteria-semilla y tener relevancia en la actividad PGPR. En este trabajo se evalúa el papel que los distintos componentes estructurales y metabolitos secundarios presentes en la matriz extracelular de B. subtilis puedan tener en la promoción de la germinación de semillas. Valiéndonos de una batería de mutantes en dichos elementos, realizamos ensayos de bacterización de semillas para estudiar posteriormente los patrones de colonización y persistencia bacteriana en la rizosfera y el efecto sobre la actividad PGPR. Los resultados obtenidos hasta la fecha sugieren que la molécula fengicina y la proteína TasA pueden ser claves en esta función de B. subtilis.

El cultivo de las cucurbitáceas en España se ve afectado, entre otros problemas, por Podosphaera xanthii, un hongo biotrofo obligado y principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas. Este hongo, que requiere células vivas de la planta para completar su ciclo de vida asexual, desarrolla unas estructuras especiales de parasitismo denominadas haustorios. Los haustorios prosperan dentro de las células epidérmicas y son responsables de la relación directa entre el patógeno y el hospedador, participando en la absorción de nutrientes de la planta y en la liberación de efectores en las células del huésped. Dada la estrecha relación entre los haustorios y las células vegetales, desarrollamos un transcriptoma haustorial de novo de P. xanthii y definimos su secretoma con la intención de encontrar proteínas secretadas que sean esenciales para la patogénesis. De esta manera pudimos identificar diferentes proteínas, la mayoría de ellas sin función anotada, expresadas específicamente en el haustorio. Gracias al modelado proteico obtuvimos información relevante sobre la posible función de alguna de estas proteínas secretadas sin anotación funcional y seleccionamos varias para su validación funcional mediante silenciamiento génico en el hospedador mediado por Agrobacterium (ATM-HIGS). Además, la expresión heteróloga de las proteínas seleccionadas y los subsecuentes ensayos enzimáticos nos ha permitido corroborar su actividad bioquímica predicha. Así, pudimos comprobar cómo proteínas secretadas específicamente por el haustorio son muy importantes para el desarrollo fúngico. Este abordaje multidisciplinar nos ha permitido identificar y dilucidar la función de proteínas esenciales para P. xanthii que, dado su papel clave, se convierten en dianas esperanzadoras para el desarrollo de nuevo fitosanitarios contra el oídio de las cucurbitáceas y otros hongos fitopatógenos. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2013-41939-R; AGL2016-76216-C2-1-R) cofinanciado con fondos FEDER (UE). Álvaro Polonio es beneficiario de un contrato predoctoral (BES-2014-068602) para la formación de doctores del Ministerio de Economía y Competitividad. Los autores también agradecen ayudas del Plan Propio de Investigación de la Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Plants are colonized by a vast variety of microbes, some of which promote plant growth and protection against pathogens. One way bacteria have evolved to succeed in this competitive scenario is the formation of biofilms which are communities of cells embedded in an extracellular matrix that protects the cells, modulates the flux of signals and controls cellular differentiation. Pseudomonas and Bacillus are among the most predominant bacterial genera within the group of plant-beneficial bacteria. The study of this interaction highlighted different aspects of how these two microbes manage to live together. Firstly, the absence of extracellular matrix in a B. subtilis (Δmatrix) led P. chlororaphis to penetrate in the Bacillus colony, a protection role mainly associated to the EPS. Time course experiments in confocal laser scanning microscopy using fluorescent-labeled strains defined different stages during the interaction: from the initial growth to the first contact where B. subtilis (Δmatrix) partially penetrated in the P. chlororaphis colony to the final overtaken of the entire B. subtilis (Δmatrix) colony by P. chlororaphis. Second, during the interaction, the 95% of the B. subtilis (Δmatrix) population entered in sporulation. Dual RNA-seq transcriptomic analyses highlighted the induction of the type VI secretion system and general metabolic changes in P. chlororaphis, and a strong repression of the sporulation, the carbon metabolism, oxidative phosphorylation, or the induction of chemotaxis and motility mechanisms, phages and DNA repair machinery in the remaining non-sporulated population of Bacillus cells (5%). Our findings argue in favor of the positive coexistence of these species on plant surfaces by using different strategies: Bacillus enters in two different cellular stages, resilience and escaping, while Pseudomonas deploy the metabolic versatility and the close contact defense mechanisms. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Induced microbial soil community after organic amendment, have a key role in suppressiveness against avocado white root rot (WRR) caused by the fungus Rosellinia necatrix. This suppressive phenotype is the result of the soil microorganisms activities where different kind of interactions could take place. In this study, a bacterial synthetic community, formed by previously isolated biological control agents against R. necatrix, have been designed in order to improve the knowledge of the multitrophic interactions that occur during biological control process. Stability and compatibility among the members of this artificial consortium have been confirmed, and the production of compounds with importance in microbial communication and antifungal activity will be studied. Furthermore, roots visualization assays will reveal the colonization pattern of the synthetic community and the stability of the bacterial consortium along the roots of different model plants. Additionally, plant assays will be used in order to check the biological control activity, plant growth promotion and induced tolerance to different abiotic stress. Finally, transcriptomic experiments directed to analyze the RNA sequences from microbial consortium interactions on avocado roots would be carried out to better understand the microbial ecology of the synthetic bacterial consortium. This work was supported by Plan Nacional I+D+I (MINECO, Spain; AGL2014-52518-C2-IR) and co-financed by FEDER funds (EU), and Universidad de Málaga. C. Vida was supported by a PhD fellowship from the FPI program of MINECO. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

En España, el control del oídio de las cucurbitáceas (Podosphaera xanthii) depende principalmente del empleo de fungicidas como los inhibidores de la quinona externa (QoI). En un trabajo anterior, se observó una resistencia generalizada a los fungicidas QoI en poblaciones de P. xanthii en el centro-sur de España, pero no se terminaron de aclarar los mecanismos moleculares implicados. En este trabajo hemos estudiado el papel de la proteína de Rieske-FeS (risp) y de las mutaciones en el gen del citocromo b (cytb) en la resistencia a fungicidas QoI en P. xanthii. No se detectaron mutaciones en el gen risp en los aislados resistentes analizados. Para cytb, el análisis de las secuencias reveló la presencia de la sustitución G143A, previamente descrita y asociada a la resistencia a QoI en varias especies. Esta mutación siempre se detectaba en aislados resistentes a QoI; sin embargo, también se detectaba en aislados sensibles aunque con menor frecuencia. Para comprobar si la heteroplasmia del gen cytb estaba implicada en la resistencia a los fungicidas QoI en P. xanthii, se desarrolló una reacción en cadena de la polimerasa específica de alelo y cuantitativa, para determinar la abundancia relativa de los alelos G143 (sensible) y A143 (resistente). En los aislados resistentes a los fungicidas QoI se observó una abundancia relativa de los alelos A143 del 70% y en los aislados sensibles estas frecuencias variaban entre el 10% y el 60%. Nuestros datos sugieren que la mutación G143A en el gen cytb es el principal factor implicado en la resistencia a QoI en P. xanthii, pero la proporción de los alelos G143 y A143 en cada aislado puede determinar su nivel de resistencia. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Pseudomonas chlororaphis PCL1606 es una rizobacteria aislada de arboles sanos de aguacate localizados en fincas afectadas de podredumbre blanca radicular, enfermedad causada por Rosellinia necatrix. PCL1606 muestra capacidad antagonista y de biocontrol frente a diferentes hongos fitopatógenos de suelo, mediada por la producción de un compuesto antifúngico denominado 2 hexil, 5 propil resorcinol (HPR), el cual resulta crucial para la actividad antagonista y de biocontrol característica de esta cepa. Además se ha comprobado que el HPR también influye en los procesos de colonización de PCL1606 en la raíz de aguacate. Estudios recientes han demostrado que los resorcinoles, a los que pertenece el HPR, pueden actuar como molécula señal uniéndose a receptores LuxR y regulando distintos aspectos de la virulencia del patógeno. Con estos antecedentes y teniendo en cuenta que el compuesto HPR, participa activamente en procesos claves de la biología de PCL1606, se analizarán los fenotipos dependientes de la producción de HPR durante el proceso de interacción multitrófica, que se produce durante el control biológico. Para abordar este objetivo, se llevará a cabo un análisis tanscriptómico que determinará el nivel de expresión/represión de los genes cuando se compara un mutante defectivo en la producción de HPR (debido a la interrupción por inserción plasmídica del gen darB) frente a la cepa silvestre, durante el control biológico de la podredumbre blanca radicular. Este trabajo está siendo financiado por el Plan Nacional de I+D+I del Ministerio de Economía (AGL2014-52518-C2-1-R; MINECO, España) y cofinanciado con fondos FEDER (EU) y la Universidad de Málaga. S. Tienda está siendo financiada con una ayuda del programa FPI del MINECO. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Gray mold, caused by Botrytis cinerea Pers., is one of the most economically important diseases of strawberries and its control involves the application of fungicides throughout the strawberry growing season. Succinate dehydrogenase inhibitors (SDHIs) constitute a novel class of fungicides representing new alternatives for strawberry growers. In the present study, B. cinerea isolates were used to determine the effective concentration that reduces mycelial growth by 50% (EC50) and to obtain discriminatory doses to monitor SDHI fungicides over the course of three-year monitoring period. The overall frequencies of resistance to the SDHI fungicides boscalid, fluopyram, fluxapyroxad and penthiopyrad were 56.9, 6.9, 12.9, and 24.6%, respectively. Four SDHI resistance patterns were observed in our population. Patterns I (resistance to boscalid) and II (resistance to boscalid and penthiopyrad) were associated with the amino acid substitutions H272R/Y; pattern III (resistance to boscalid, fluxapyroxad, and penthiopyrad) was associated only with the H272Y mutation; and finally, pattern IV (resistance to boscalid, fluopyram, fluxapyroxad and penthiopyrad) was associated with the N230I allele in the SdhB subunit. For gray mold management, it is suggested that the simultaneous use of boscalid and penthiopyrad should be limited to one application per season. The use of fluxapyroxad and fluopyram could be used as valid SDHI alternatives for our strawberry growers, but they should be applied with caution. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Pseudomonas syringae es una bacteria fitopatógena modelo, incluyendo aspectos sobre evolución microbiana y de la que se dispone de una gran cantidad de información genómica. Esta especie está compuesta por más de 60 patovares diferentes, siendo el patovar syringae uno de los más importantes. P. syringae pv. syringae (Pss) es el agente causal de la necrosis apical del mango, enfermedad que afecta a las principales áreas de cultivo de clima mediterráneo a nivel mundial. El objetivo principal de este trabajo es el estudio epidemiológico y evolutivo sobre la adaptación de la bacteria al ambiente y a su huésped. Para ello, se llevará a cabo la comparación de dos colecciones de cepas de Pss aisladas de mango en diferentes zonas geográficas, y separadas dos décadas en el tiempo. Ambas colecciones se han caracterizado desde el punto de vista fenotípico y genético en cuanto a sus características más relevantes implicadas tanto es su fase epifítica como patogénica. También se ha analizado la filogenia de las cepas incluidas en nuestro estudio, empleando secuencias parciales de dos genes housekeeping (gyrB y rpoD). Los resultados nos han permitido seleccionar un número representativo de cepas a las que se realizarán la secuenciación de sus genomas, y así poder llevar a cabo posteriormente estudios de genómica comparada que nos permitan descifrar los procesos evolutivos involucrados en la adaptación de las poblaciones de Pss al mango. Este trabajo ha sido financiado por ayuda de la Consejería de Economía, Innovación y Ciencia, Junta de Andalucía (P12-AGR-1473), cofinanciados con fondos FEDER (UE) y la Universidad de Málaga.

Comunicación a congreso en forma de póster Pseudomonas syringae is a bacterium which produces diseases in aerial parts of both herbaceous and woody plants. Otherwise, Pseudomonas chlororaphis interacts with the plant rhizosphere and is a biocontrol agent of plant fungal diseases. Both these bacterial species form biofilms and, despite their different life style (epiphyte-pathogen and rhizosphere-biocontrol agent), they are closely related in phylogenetic analyses. We think that because of this relatedness, they must contain some common and different components in the biofilm matrix, which may basically reflect the different lifestyle that these bacteria have while interacting with their host. Analysis in silico have showed some common and different regions that may codify proteins as candidates for producing biofilm-matrix components. We have constructed mutants of these regions and analysed their implications in aspects related to biofilm formation. These regions may reflect the different lifestyle between these two-bacterial species. This work is supported by Proyecto de Excelencia de la Junta de Andalucía (Spain) P12-AGR-1473 and Plan Nacional I+D+I from Ministerio de Economía (MINECO, Spain) AGL2014-52518-C2-IR. Zaira María Heredia is supported by a PhD Fellowship from the Spanish FPU program (FPU15/03644 reference code). Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Pseudomonas syringae es una especie bacteriana que produce enfermedades en la parte aérea de plantas tanto herbáceas como leñosas. Por otro lado, Pseudomonas chlororaphis interacciona con la raíz de la planta y es un agente de control biológico de enfermedades fúngicas en árboles de aguacate y plantas de tomate. Ambas especies bacterianas forman biopelícula y, a pesar de su diferente estilo de vida (epífito-patógeno y rizosfera - agente de biocontrol), están relacionadas filogenéticamente. Pensamos que, debido a esta relación filogenética, ambas bacterias deben contener componentes comunes y diferenciales en la matriz extracelular de la biopelícula que podrían tener un papel importante en la interacción con el huésped vegetal. Análisis in silico han mostrado que ambas presentan algunas regiones genómicas comunes y otras diferenciales que podrían codificar para proteínas implicadas en la síntesis de componentes de la matriz extracelular. Hemos construido mutantes de estas regiones y analizado su implicación en diferentes aspectos relacionados con la formación de biopelícula. Estos componentes podrían tener un papel importante en la interacción con el huésped. Este trabajo ha sido financiado por el Proyecto de Excelencia de la Junta de Andalucía (Spain) con referencia P12-AGR-1473 y el Proyecto del Plan Nacional I+D+I del Ministerio de Economía (MINECO, Spain) con referencia AGL2014-52518-C2-IR, y la Universidad de Málaga. Zaira María Heredia está financiada por una beca de doctorado del programa FPU del Ministerio de Educación (referencia FPU15/03644).

Biofilms are complex bacterial communities formed on any virtual surface and composed of cells embedded in an extracellular matrix. Studies on Bacillus subtilis have demonstrated this tissue-like structure comprised of diverse exopolymeric substances (eps) including exopolysaccharides, the protein BslA, and TasA and TapA the two main components of the amyloid fibers that confer robustness to the architecture of the biofilm. It has been demonstrated that the genetic pathways involved in formation of biofilms are active in the interaction of B. subtilis with plant surfaces. Indeed, we previously showed that surfactin acts as a self-trigger of biofilm in the plant phylloplane, which connected with the suppressive activity of B. subtilis against phytopathogenic fungi. These findings led us to hypothesize a major contribution of the extracellular matrix in the ecology of B. subtilis in the poorly explore plant phylloplane. In this work, we show that the amyloid protein TasA has a meaningful role in adhesion and biofilm formation over the plant phylloplane, however, despite the inability of the tasA mutant to form a biofilm, it still retained a similar antagonistic activity compared to the wild type strain. An in-depth transcriptomic analysis of the mutant led us to find unexpected variations in the expression levels of over 300 genes, including the overexpression of: i) production of acetoin ii) secondary metabolites and non-ribosomal peptides iii) eps and other biofilm-related components and iv) general stress, among others. These findings suggested that besides the structural role, TasA might have a regulatory function on the physiological stage of the cells. Indeed, an allele of TasA unable to restore biofilm formation allowed us to separate both functions, supporting the importance of this functional amyloid in regulating bacterial physiology and fitness. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Comunicación en póster Different strategies based on ecological principles have been approached in sustainable agriculture causing positive effects, including the induction of soil suppressiveness against a wide range of soilborne pathogens. Suppressiveness against the phytopathogenic fungus Rosellinia necatrix was observed after the application of composted almond shells in avocado crops. Previous works have analyzed the use of this traditional strategy and applied new microbial community analysis techniques in order to help in the identification of targeted sustainable agricultural strategies. These studies have focused on the microbial profile from an induced-suppressive soil where the soil microbiome had a proven essential role. Microbial profiles based on the 16S rRNA gene and ITS regions sequencing were analysed and an increase in Gammaproteobacteria and Dothideomycetes groups, as well as a reduction in Xylariales (where R. necatrix is allocated) were observed. These results led to the bacterial isolation of different groups of Gammaproteobacteria from this suppressive soil in order to identify new strains with biological control properties. Different characterization tests were performed, and a final selection of representative strains belonging to the genus Pseudomonas and related groups showed, all of them, plant disease protection abilities. Moreover, using previously described biological control agents against R. necatrix, a bacterial synthetic community have been design in order to improve the knowledge of the multitrophic interactions that occur during biological control process. This work was supported by Plan Nacional I+D+I (MINECO, Spain) (AGL2014-52518-C2-IR) and co-financed by FEDER funds (EU). C.Vida was supported by a PhD fellowship from the FPI program of MINECO. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

La familia de las cucurbitáceas incluye especies con gran relevancia económica entre las que destacan melón, sandía, calabacín, pepino y calabaza. Estos cultivos se ven afectados, entre otros, por el hongo biotrofo obligado Podosphaera xanthii, principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas. El conocimiento sobre las bases moleculares de las interacciones entre P. xanthii y las diferentes especies de cucurbitáceas es, aún, muy limitado. Por ello, en este trabajo se ha realizado un análisis RNA-seq con el fin de conocer los cambios de expresión génica ocurridos en melón durante los primeros estadios de la enfermedad (24, 48 y 72 hpi). Además, estas fases tempranas de la enfermedad también fueron estudiadas usando técnicas de captura de imágenes como fluorescencia multiespectral y termografía. El análisis bioinformático permitió detectar 1.114 genes de la planta diferencialmente expresados a 24 h, 3.785 a 48 h y 4.226 a 72 h. El posterior enriquecimiento funcional reveló que los principales procesos que se estaban viendo modulados durante la infección eran la fotosíntesis y varias rutas metabólicas relacionadas con la defensa vegetal, resultados que fueron corroborados mediante las técnicas de captura de imagen. La combinación de ambas técnicas nos ha permitido comprender mejor el desarrollo de esta enfermedad desde dos enfoques diferentes pero complementarios e integradores. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2013-41939-R; AGL2016-76216-C2-1-R) cofinanciado con fondos FEDER (UE). Álvaro Polonio es beneficiario de un contrato predoctoral para la formación de doctores del Ministerio de Economía y Competitividad. Los autores también agradecen ayudas de la Universidad de Málaga, Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech, para la asistencia a este congreso.

Plants are colonized by a vast variety of microbes. Among them, bacteria are the most predominant and are able to adapt to environmental changes and interact with other microorganisms using a wide array of molecules, metabolic plasticity and secretion systems. One way bacteria have evolved to succeed in this competitive scenario is the formation of biofilms which provides protection to the cells, modulates the flux of signals and controls cellular differentiation. Thus, efforts are encouraged to really determine the functionality of the bacterial extracellular matrix. In this study, we have employed microbiological and microscopic techniques to study the interaction between Bacillus subtilis 3610 and Pseudomonas chlororaphis PCL1606. We demonstrate the important role of the extracellular matrix in protecting B. subtilis colonies from infiltration by Pseudomonas. Furthermore, time-lapse confocal laser scanning microscopy (CLSM) analyses of the bacterial interactions have permitted to complete the study of the bacterial behaviors and to measure bacterial expansion rates. Surprising, we find that the Pseudomonas type VI secretion system (T6SS) is required in the cell-to-cell contact with matrix-impaired B. subtilis cells, revealing a novel role for T6SS against Gram-positive bacteria. In response to P. chlororaphis infiltration, we find that B. subtilis activates sporulation and expresses motility-related genes. Confocal microscopy of the bacterial interactions using plant organs highlights the functional importance of these different bacterial strategies in their coexistence as stable bacterial communities. The findings further our understanding of the functional role played by biofilms in mediating bacterial social interactions. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Contribución oral a conferencia. The major disease affecting avocado crops in the Mediterranean area is Rosellinia necatrix, causing the avocado white root rot. The biocontrol rhizobacterium Pseudomonas chlororaphis PCL1606 has been isolated from rhizosphere of healthy avocado trees, growing in an area affected by white root rot. As a main characteristic, PCL1606 showed a strong in vitro antagonism against R. necatrix and other important soil borne pathogens, mainly due to the production of the antimicrobial compound 2- hexyl, 5-propyl resorcinol (HPR), moreover, production of other antifungal compound has been also detected. PCL1606 has the ability to persist and to colonize the avocado roots, where, interacts closely and colonizes the fungal hyphae of R. necatrix, leading to a negative effect to the fungus. Those phenotypes, acting together allowed PCL1606 to display biocontrol activity towards R. necatrix in avocado plants. Interestingly, we have observed that PCL1606 shows no plant growth promoting activities. Finally, the availability of the complete genome sequence of PCL1606 will allow us to identify additional features involved in the biocontrol. This work is being funded by National plan I+D+I MINECO (AGL2014-52518-C2-1-R; MINECO, Spain) and co-funded with FEDER (EU). S. Tienda is funded by a grant from FPI program MINECO. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.