Search

Els receptors acoblats a proteïnes G (GPCRs) són importants dianes terapèutiques per a nombroses malalties. Si bé els GPCRs s'han estudiat àmpliament en les últimes dècades, els mecanismes moleculars que determinen la seva activació així com la seva modulació al·lostèrica per lípids de membrana no han estat elucidats íntegrament. La present tesi examina els processos de (de)activació de dos GPCRs prototípics de la classe A, β2-adrenèrgic i adenosina A2a, en membranes de diferent composició lipídica mitjançant simulacions de dinàmica molecular. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) son importantes dianas terapéuticas para numerosas enfermedades. Si bien los GPCRs se han estudiado ampliamente en las últimas décadas, los mecanismos moleculares que determinan su activación así como su modulación alostérica por lípidos de membrana no han sido elucidados en su totalidad. La presente tesis examina los procesos de (de)activación de dos GPCRs prototípicos de la clase A, β2-adrenérgico y adenosina A2a, en membranas de diferente composición lipídica mediante simulaciones de dinámica molecular. G-protein-coupled receptors (GPCRs) are important therapeutic targets for numerous diseases. Although GPCRs have been extensively studied in recent decades, the molecular mechanisms that determine their activation as well as their allosteric modulation by membrane lipids have not been fully elucidated. This thesis examines the processes of (de)activation of two prototypical class A GPCRs, β2-adrenergic and adenosine A2a receptors, in membranes of different lipid composition by means of molecular dynamics simulations.

UDTAULÍ The activation process of G protein-coupled receptors (GPCRs) has been extensively studied, both experimentally and computationally. In particular, Molecular Dynamics (MD) simulations have proven useful in exploring GPCR conformational space. The typical behaviour of class A GPCRs, when subjected to unbiased MD simulations from their crystallized inactive state, is to fluctuate between inactive and intermediate(s) conformations, even with bound agonist. Fully active conformation(s) are rarely stabilized unless a G protein is also bound. Despite several crystal structures of the adenosine A2a receptor (A2aR) having been resolved in complex with co-crystallized agonists and G protein, its agonist-mediated activation process is still not completely understood. In order to thoroughly examine the conformational landscape of A2aR activation, we performed unbiased microsecond-length MD simulations in quadruplicate, starting from the inactive conformation either in apo or with bound agonists: endogenous adenosine or synthetic NECA, embedded in two homogeneous phospholipid membranes: 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoglycerol (DOPG) or 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (DOPC). In DOPC with bound adenosine or NECA, we observe transition to an intermediate receptor conformation consistent with the known adenosine-bound crystal state. In apo state in DOPG, two different intermediate conformations are obtained. One is similar to that observed with bound adenosine in DOPC, while the other is closer to the active state but not yet fully active. Exclusively, in DOPG with bound adenosine or NECA, we reproducibly identify receptor conformations with fully active features, which are able to dock G protein. These different receptor conformations can be attributed to the action/absence of agonist and phospholipid-mediated allosteric effects on the intracellular side of the receptor. Unbiased microsecond-length MD simulations of the adenosine A2a receptor (A2aR) were performed in quadruplicate, starting from the inactive conformation either in apo or with bound agonists: adenosine or NECA, each of them embedded in two different homogeneous phospholipid membranes. Different intermediate or active receptor conformations were found depending on the presence/absence of bound agonist and type of lipid environment. Exclusively, in DOPG with bound agonist, we reproducibly identify receptor conformations with fully active features, which are able to dock G protein. These different receptor conformations can be attributed to the action/absence of agonist and phospholipid-mediated allosteric effects on the intracellular side of the receptor. Dynamic structural data are key for the understanding of agonist-mediated GPCR activation simulated in realistic membrane environments.

Un estudi, publicat a la revista Journal of Medicinal Chemistry pels investigadors Óscar Díaz, James Dalton i Jesús Giraldo de l'Institut de Neurociències, descriu el possible mecanisme d'activació del receptor cannabinoide 1 (CB1). Aquest receptor és activat pel principal component psicoactiu del cànnabis; així doncs, conèixer i comprendre el seu mecanisme d'activació afavorirà el desenvolupament de fàrmacs que modulen el seu funcionament de manera més econòmica i eficient. Un estudio, publicado en la revista Journal of Medicinal Chemistry por los investigadores Óscar Díaz, James Dalton y Jesús Giraldo del Instituto de Neurociencias, describe el posible mecanismo de activación del receptor cannabinoide 1 (CB1). Este receptor es activado por el principal componente psicoactivo del cannabis; así pues, conocer y comprender su mecanismo de activación favorecerá el desarrollo de fármacos que modulen su funcionamiento, de manera más económica y eficiente. A study published in the Journal of Medicinal Chemistry by the Neuroscience Institute researchers Óscar Díaz, James Dalton and Jesús Giraldo, describes the potential activation mechanism of cannabinoid receptor 1 (CB1). This receptor is activated by the main psychoactive component of cannabis; thus, knowing and understanding its mechanism of activation will favor the development of drugs that modulate their functioning, in a more economic and efficacious way.

Correction for ‘Rational design of a peptide capture agent for CXCL8 based on a model of the CXCL8:CXCR1 complex’ by Dorothea Helmer et al., RSC Adv., 2015, 5, 25657–25668. The authors regret that the original article included some results which were subsequently found to be based on a slightly different peptide sequence than the sequence originally reported. This issue is addressed in the following text, which is an update to the original article. Upon further investigation of the IL8 capture peptide IL8-RP-Loops introduced in the original article, we found that during synthesis of the intended peptide sequence AKWRMVLRI–Ahx–ADTLMRTQ we had obtained the peptide AKWRMVLRI–Ahx–ADTLMRTE, in which the C-terminal glutamine was replaced with glutamic acid. This was confirmed by high resolution mass spectrometry. The reported high affinity (0.5 ± 0.3 μM) was reproduced by the E-mutant within experimental error (1.1 ± 0.1 μM) but not for the original sequence ending with glutamine. We conclude that all experiments were performed with the peptide AKWRMVLRI–Ahx–ADTLMRTE. The affected amino acid Q271 was shown to be non-essential for receptor function by Hébert et al.1 So no essential amino acid of the original sequence was omitted in the exchange. In the original publication we claimed that preorganization of the peptide is responsible for the high affinity of the receptor-derived peptide, as CD-spectroscopy had revealed a helical structure for the synthesized peptide. To test the effect of the exchange of glutamine with the structurally closely related glutamic acid on the preorganization of the peptide in solution, we ran a new set of molecular dynamics simulations on the peptide containing the original receptor sequence and the actually synthesized peptide IL8-RP-Loops. The helical content of the peptide structure over the course of the simulation was higher for IL8-RP-Loops with C-terminal glutamic acid (23.6%) than for the peptide ending with glutamine (6.0%). Thus, the serendipitous exchange of the polar glutamine at the C-terminus with negatively charged glutamic acid enhanced preorganization and led to the capture peptide with high affinity. In conclusion, a capture peptide could be designed based on a binding region identified from a computational model of the CXCL8:CXCR1 complex. The peptide comprises receptor residues known to form essential contacts with the chemokine ligand and the exchange of the non-essential C-terminal glutamine for glutamic acid enhances the preorganization into a partially helical structure in solution responsible for its high affinity to the chemokine. In the design of receptor-derived capture peptides it is therefore important to examine the propensity to form secondary structure elements in solution to obtain high affinity peptide mimetics.

Els receptors acoblats a proteïnes G (GPCR) constitueixen la família més gran de proteïnes de membrana del genoma humà. Aquestes proteïnes de membrana estan formades per set hèlixs transmembrana connectades per bucles intracel·lulars i extracel·lulars. Aquesta superfamília es pot classificar en cinc famílies o classes, amb moltes implicacions en la regulació del sistema nerviós central (SNC). Per tant, representen principals dianes farmacològiques per regular terapèuticament trastorns neurològics com l'Alzheimer, la demència frontotemporal, la malaltia de Parkinson, la malaltia de Huntington, l'esquizofrènia, el dolor i l'addicció. Aquests receptors transmembrana han guanyat un interès creixent per tal de dilucidar els determinants moleculars de la seva activació i l'efecte que l'entorn de la membrana té sobre la seva funcionalitat. Mitjançant l'ús de tècniques computacionals, aquest estudi examina l'efecte que té la unió del lligand sobre el receptor, així com la seva oligomerització dins el panorama conformacional dels GPCR. Les simulacions de dinàmica molecular permeten l'estudi temps-dependent a un nivell atòmic dels receptors. Les trajectòries poden permetre la descripció mecànica de les interaccions atòmiques que tenen lloc a l'estructura del receptor en una escala de temps de microsegons i que en determinen l'estat d'activació i funcionalitat. Els resultats obtinguts a través d'aquestes tècniques computacionals tenen com a objectiu proporcionar explicacions estructurals teòriques a l'evidència funcional dels GPCR. Aquest estudi inclou diversos GPCR. Breument, s'analitza la viabilitat de formació, l'estabilitat molecular i la modulació creuada receptor-receptor per a: heterotetràmers del receptor d'angiotensina 1 (AT1R) i del receptor d'adenosina 2A (A2AR), el receptor de serotonina 2A (5-HT2AR) i el receptor metabotròpic de glutamat 2 (mGlu2R), així com heterooligòmers i protòmers del receptor de dopamina D2 (D2R) dins de complexos homodimèrics. A més d'aquests estudis sobre l'oligomerització dels GPCR, es realitza un anàlisi detallat de l'activació del receptor opioide μ en forma monomèrica, comparant dos agonistes estructuralment i funcionalment diferents, morfina i fentanil. Els resultats presentats en aquesta tesi mostren la influència temps-dependent de les interaccions lligant-proteïna i proteïna-proteïna en la modulació del paisatge conformacional i la funcionalitat dels GPCR de classe A i classe C. El treball computacional s'ha fet en col·laboració amb grups experimentals o de manera independent. Els resultats mostren la contribució del modelatge molecular, les simulacions de dinàmica molecular i altres tècniques computacionals en la comprensió mecànica de la funció dels GPCR. Aquests enfocaments computacionals complementen els experimentals sobre el disseny de fàrmacs dirigits als GPCR, basat el coneixement en estructures i mecanismes moleculars. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) constituyen la familia más grande de proteínas de membrana en el genoma humano. Estas proteínas de membrana están formadas por siete hélices transmembrana conectadas por bucles intracelulares y extracelulares. Esta superfamilia se puede clasificar en cinco familias o clases, con muchas implicaciones en la regulación del sistema nervioso central (SNC). Por lo tanto, representan principales dianas farmacológicas para regular terapéuticamente trastornos neurológicos como el Alzheimer, la demencia frontotemporal, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la esquizofrenia, el dolor y la adicción. Estos receptores transmembrana han ganado un interés creciente para dilucidar mecánicamente los determinantes moleculares de la activación del receptor y el efecto que el entorno de la membrana tiene sobre su funcionalidad. Mediante el uso de técnicas computacionales, este estudio examina el efecto que tiene la unión del ligando sobre el receptor, así como la oligomerización de estos en el panorama conformacional de los GPCR. Las simulaciones de dinámica molecular permiten el estudio tiempo-dependiente a un nivel atómico. Las trayectorias pueden permitir la descripción mecánica de las interacciones atómicas que ocurren en la estructura del receptor en una escala de tiempo de microsegundos y que determinan su estado de activación y funcionalidad. Los resultados obtenidos a través de estas técnicas computacionales, tienen como objetivo proporcionar explicaciones estructurales teóricas a la evidencia funcional de los GPCR. En este estudio se incluyen varios GPCR. Brevemente, se analiza la viabilidad de formación, la estabilidad molecular y la modulación cruzada receptor-receptor para: heterotetrámeros del receptor de angiotensina 1 (AT1R) y del receptor de adenosina 2A (A2AR), el receptor de serotonina 2A (5-HT2AR) y el receptor metabotrópico de glutamato 2 (mGlu2R), así como hetero-oligómeros y protómeros del receptor de dopamina D2 (D2R) dentro de complejos homodiméricos. Además de estos estudios sobre la oligomerización de los GPCR, se realiza un análisis detallado de la activación de los GPCR en su forma monomérica, comparando dos agonistas estructural y funcionalmente diferentes, morfina y fentanilo, sobre la activación del receptor opioide μ. Los resultados presentados en esta tesis muestran la influencia tiempo-dependiente de las interacciones ligando-proteína y proteína-proteína en la modulación del paisaje conformacional y la funcionalidad de los GPCR de clase A y clase C desde una perspectiva atómica. El trabajo computacional se ha realizado en colaboración con grupos experimentales o de forma independiente. Los resultados muestran la contribución del modelado molecular, las simulaciones de dinámica molecular y otras técnicas computacionales a la comprensión mecánica de la función GPCR. Estos enfoques computacionales complementan los experimentales sobre el diseño de fármacos GPCR basados en estructuras y las terapias moleculares basadas en mecanismos. G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of membrane proteins in the human genome. These membrane proteins are made up of seven transmembrane helices connected by intracellular and extracellular loops. The GPCR superfamily can be classified into five families or classes, with many implications in the regulation of the central nervous system (CNS). Therefore, they represent main drug-targets to therapeutically regulate neurologic disorders such as Alzheimer's disease, frontotemporal dementia, Parkinson's disease, Huntington's disease, schizophrenia, pain and addiction. These seven-helix transmembrane receptors have gained increasing interest to mechanistically elucidate the molecular determinants of receptor activation and the effect that the membrane environment has on their functionality. By making use of molecular computational techniques, this study examines the effect that either ligand binding or receptor oligomerization has on the conformational landscape of GPCRs. Molecular dynamics simulations enable the time-dependent study of GPCRs at an atomic level. Trajectories at a microsecond time-scale may allow the mechanistic description of dynamic atomic interactions that occur in the receptor structure and determine its activation state and functionality. Results obtained from these computational techniques were aimed to provide theoretical structural explanations to experimental functional evidence. A number of GPCRs are included in this study. Briefly, the viability of formation, molecular stability and receptor-receptor cross-modulation are analyzed for: angiotensin 1 receptor (AT1R) and adenosine 2A receptor (A2AR) heterotetramers, serotonin 2A receptor (5-HT2AR) and metabotropic glutamate receptor 2 (mGlu2R) hetero-oligomers, and dopamine D2 receptor (D2R) protomers within homodimeric complexes. In addition to these studies on GPCR oligomerization, a detailed analysis of monomeric GPCR activation is made by comparing two structurally and functionally different agonists, morphine and fentanyl, on the activation of the μ-opioid receptor. The results presented in this thesis show the influence of time-dependent ligand-protein and protein-protein interactions on the modulation of the conformational landscape and functionality of class A and class C GPCRs from an atomic perspective. The computational work has been done either in collaboration with experimental groups or independently. The results show the contribution of molecular modelling, molecular dynamics simulations and other computational techniques to the mechanistic understanding of GPCR function. These computational approaches complement experimental ones on structure-based GPCR drug design and mechanistic-based molecular therapies.

[This corrects the article DOI: 10.1039/C4RA13749C.]., (This journal is © The Royal Society of Chemistry.)