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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As doenças relacionadas ao metabolismo têm aumentado em todo o mundo, transformando em epidemia, sendo que a síndrome metabólica, que é definida com um grupo de fatores de risco que diretamente contribuem para o desenvolvimento de doença cardiovascular, diabetes do tipo 2 e doenças hepáticas. Dentre as doenças hepáticas, a esteatose hepática, está associada a carência nutricional. Com a dificuldade pela aquisição de alimentos de alto valor nutricional e funcional, o consumo de insetos tem apresentado resultados satisfatórios quanto ao alto valor nutricional e benefícios à saúde. A abelha Apis mellifera é fonte de alimento nutricional e funcional quando relacionado a benefícios para a saúde. Dentro desse contexto, o presente estudo avaliou os efeitos da inclusão da farinha de abelha Apis mellifera sobre o metabolismo de camundongos obesos induzidos por dieta hiperlipídica. Para isso, camundongos da linhagem swiss, machos, após uma indução à obesidade, foram alimentados por 4 semanas e distribuídos em 6 grupos, sendo eles: Dieta Padrão (AIN93G); Dieta Padrão (AIN93G + 15% de farinha de Apis mellifera); Dieta Padrão (AIN93G + 30% de farinha de Apis mellifera); Dieta Alto teor de gordura (HFD); Dieta Alto teor de gordura (HFD + 15% de farinha de Apis mellifera); Dieta Alto teor de gordura (HFD + 30% de farinha de Apis mellifera). Foram avaliados como parâmetros o peso do fígado, dados antropométricos, histologia do tecido hepático e expressão de mRNA. Os principais resultados da inclusão de farinha de Apis mellifera mostram que a mesma induziu a redução de esteatose hepática, peso, redução da adiposidade e mudanças específicas nos parâmetros histológicos. Além disso, também houve mudanças significativas na expressão genética, uma vez que, a farinha de Apis mellifera modulava a expressão do gene SREBP1c e o gene PPARg, importante modulador de lipídios. Modulou também positivamente o gene GPX4, que exerce proteção celular contra danos causados por estresse oxidativo, destacando assim, os efeitos benéficos da farinha de abelha Apis mellifera na saúde metabólica dos camundongos. Os principais achados mostraram o potencial da farinha integral de abelha Apis mellifera na redução da esteatose hepática no organismo. Portanto, conclui-se que a inclusão de farinha de insetos Apis mellifera na dieta gera efeitos benéficos à saúde metabólica. The diseases related to metabolism have increased worldwide, becoming epidemic, and the metabolic syndrome, which is defined as a group of risk factors that directly contribute to the development of cardiovascular disease, type 2 diabetes and liver disease. Among liver diseases, hepatic steatosis is associated with nutritional deficiency. With the difficulty in acquiring foods with high nutritional and functional value, the consumption of insects has shown satisfactory results regarding the high nutritional value and health benefits. The Apis mellifera bee is a source of nutritional and functional food when related to health benefits. Within this context, the present study evaluated the effects of the inclusion of Apis mellifera bee meal on the metabolism of obese mice induced by a hyperlipidic diet. For this, male mice of the swiss strain, after an induction to obesity, were fed for 4 weeks and distributed in 6 groups, being them: Standard Diet (AIN93G); Standard Diet (AIN93G + 15% Apis mellifera meal); Standard Diet (AIN93G + 30% Apis mellifera meal); High Fat Diet (HFD); High Fat Diet (HFD+ 15% Apis mellifera meal); High Fat Diet (HFD + 30% Apis mellifera meal). Liver weight, anthropometric data, liver tissue histology and mRNA expression were evaluated as parameters. The main results of inclusion of Apis mellifera flour induced reduction of hepatic steatosis, weight, reduction of adiposity and specific changes in histological parameters. In addition, there were also significant changes in gene expression, since, Apis mellifera flour modulated the gene expression the SREBP1 gene and the PPARg gene, an important lipid modulator, also modulated positively the GPX4 gene, which exerts cellular protection against damage caused by oxidative stress, thus highlighting the beneficial effects of Apis mellifera bee flour, on the metabolic health of mice. The main findings showed the potential of Apis mellifera bee meal in reducing hepatic steatosis in the body. Therefore, it is concluded that the inclusion of Apis mellifera insect meal in the diet generates beneficial effects on metabolic health.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz O fígado é um órgão de importância vital e qualquer disfunção terá consequências graves para o nosso corpo em geral. A cirrose, a patologia crónica mais frequente do fígado, constitui um grande problema de saúde pública. A cirrose hepática é uma doença crónica que se desenvolve devido à destruição de células hepáticas, bem como sua regeneração de forma desordenada. É uma doença que ocorre na fase final das doenças hepáticas crónicas com uma perturbação irreversível da sua estrutura e função normais. Dependendo da sua etiologia e gravidade, a doença apresenta diferentes sintomas e complicações, bem como manifestações orais com a influência de bactérias. Estas bactérias desempenham um papel importante no aparecimento da periodontite, bem como no desenvolvimento de doenças crónicas do fígado, principalmente da esteatose hepática não alcoólica. O microbioma intestinal e a doença hepática comunicam através da veia porta. Portanto, na doença hepática, a disbiose intestinal é formada com a presença de bactérias orais. Por outro lado, a inflamação crónica associada à periodontite parece contribuir para a fisiopatologia e progressão natural da doença hepática crónica. Assim parece existir uma certa relação bidirecional, razão pela qual está a emergir um novo eixo oral-intestinal-fígado. No entanto, esta associação ainda não está totalmente estabelecida. The liver is a vitally important organ and any dysfunction will have serious consequences for our body in general. Cirrhosis, the most common chronic liver disease, is a major public health problem. Liver cirrhosis is a chronic disease that develops as a result of the destruction of liver cells as well as their regeneration in a disordered way. It is a disease that occurs in the final phase of chronic liver diseases with an irreversible disruption of its normal structure and function. Depending on its aetiology and severity, the disease presents different symptoms and complications, as well as oral manifestations with the influence of bacteria. These bacteria play an important role in the onset of periodontitis as well as in the development of chronic liver diseases, especially non-alcoholic fatty liver disease. The gut microbiome and liver disease communicate through the portal vein. Therefore, in liver disease, gut dysbiosis is formed with the presence of oral bacteria. Also, the chronic inflammation associated with periodontitis appears to contribute to the pathophysiology and natural progression of chronic liver diseases. Thus, there seems to be a certain bidirectional relationship, which is why a new oral-intestinal-liver axis is emerging. However, this association is not yet fully established.

Multiacinar regenerative nodules are benign hepatocellular nodules related to vascular disturbances of the liver. They strongly resemble conventional focal nodular hyperplasia but are connected to different clinical settings, typically chronic liver disease. The purpose of the present study was to describe the key imaging features of these lesions and compare them with a control arm of focal nodular hyperplasia.A blinded consensus review of liver magnetic resonance consisting of 26 cases of multiacinar regenerative nodules and 25 cases of focal nodular hyperplasia was performed. Lesion size, shape, margins, structure, T1 and T2 signal intensity, diffusion and contrast-enhanced features (including hepatobiliary phase), presence of a central scar and of a peripheral hypointense rim were compared between the two groups.Significant differences between multiacinar regenerative nodules and focal nodular hyperplasia included size (median 2.35 cm, IQR: 2.13, vs 6.00 cm, IQR: 5.20, respectively, p0.001), presence of a peripheral hypointense rim after contrast (n = 9 vs n = 2 cases, p = 0.038) and of a central scar (n = 9 vs n = 20, p = 0.002). There were no other significant differences.Overall multiacinar regenerative nodules and focal nodular hyperplasia have very similar imaging features but lack of a central scar and presence of a hypointense rim should suggest a diagnosis of multiacinar regenerative nodules.Recognition of the imaging findings of multiacinar regenerative nodules can explain some atypical cases of focal nodular hyperplasia, avoiding unnecessary biopsies. They may also be the trigger to investigate an unsuspected underlying liver vascular abnormality.Introdução: Nódulos regenerativos multiacinares são nódulos hepatocelulares benignos relacionados com alterações vasculares hepáticas. São muito semelhantes à hiperplasia nodular focal mas ocorrem num contexto diferente de doença hepática crónica. O objectivo deste trabalho foi descrever os achados imagiológicos principais destes nódulos e compará-los com um grupo controlo de hiperplasia nodular focal. Material e Métodos: Foi efectuada uma revisão cega de estudos por ressonância magnética de 26 casos de nódulos regenerativos multiacinares e 25 de hiperplasia nodular focal, sendo os dois grupos comparados quanto à dimensão das lesões, morfologia, margens, estrutura, aspecto em T1, T2, difusão e após contraste (incluindo na fase hepatobiliar), presença de cicatriz central e halo hipointenso. Resultados: Foram encontradas diferenças significativas entre nódulos regenerativos multiacinares e hiperplasia nodular focal quanto às dimensões das lesões (mediana 2,35 cm AIQ: 2,13 vs 6,00 cm AIQ: 5,20 respectivamente, p0,001), presença de halo hipointenso após contraste (n = 9 vs n = 2, p = 0,038) e de cicatriz central (n = 9 vs n = 20, p = 0,002). Não se observaram outras diferenças significativas. Discussão: Nódulos regenerativos multiacinares e hiperplasia nodular focal são globalmente muito semelhantes mas a ausência de cicatriz central e a presença de halo hipointenso deve sugerir o diagnóstico de nódulos regenerativos multiacinares. Conclusão: O reconhecimento dos achados imagiológicos de nódulos regenerativos multiacinares pode explicar alguns dos casos atípicos de hiperplasia nodular focal e prevenir biopsias desnecessárias. Pode também desencadear uma investigação mais aprofundada de anomalias vasculares hepáticas subjacentes eventualmente desconhecidas.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de Farmácia Pharmacokinetics is usually referred to as the study of the actions of the body on a drug. It includes four major processes: absorption, distribution, metabolism and excretion. It is highly influenced by several factors, of particular interest when considering the heterogeneity of the world population. This is the reason why pharmacokinetic studies are a critical requirement during drug’s development process. Liver plays an essential role on pharmacokinetics. It is greatly involved in its major processes and it is one of the main organs responsible for the metabolism and excretion of drugs. However, liver function is diminished in some diseases which makes these patients more susceptible to drug toxicity. Choosing an appropriate dosing regimen may be particularly difficult. Furthermore, there are different levels of hepatic impairment and various enzymes involved in the metabolism and excretion of specific drugs which leads to different types of impact on pharmacokinetics. Therefore, patients with hepatic impairment are an important subgroup of the population where pharmacokinetic studies should be thoroughly performed. There are specific guidelines for the conduction of clinical trials specific for this population of patients, aiming to understand and/or quantify that impact.As the burden of liver disease in the world increases and there is a lack of markers for characterizing hepatic function regarding the prediction of drug elimination, the need for scientific development in this field rises as well.The aim of this work is to review the involvement of the liver in the whole pharmacokinetics process and to understand the consequences of liver impairment in this process and its repercussion on drug development and clinical studies. In this context, the regulatory framework of this area will be analyzed both in the perspective of the European Medicines Agency and the Food and Drug Administration. A farmacocinética é normalmente descrita como o estudo das ações de um fármaco no organismo. Inclui quatro processos principais: absorção, distribuição, metabolism e excreção. É altamente influenciada por vários fatores, o que é particularmente interessante considerando a heterogeneidade da população mundial. Esta é a razão pela qual os estudos de farmacocinética representam uma necessidade crítica no desenvolvimento de um medicamento.O fígado tem um papel essencial na farmacocinética. Está envolvido nos seus processos mais importantes e é um dos órgãos principais responsáveis pelo metabolismo e excreção de fármacos. No entanto, a função do fígado encontra-se diminuída em algumas doenças, o que torna estes sujeitos mais suscetíveis a toxicidade medicamentosa. Escolher um regime de dose apropriado pode ser particularmente difícil. Além disso, existem vários níveis de insuficiência hepática e várias enzimas envolvidas no metabolismo e excreção de certos fármacos, o que resulta em diferentes níveis de impacto na farmacocinética. Assim, doentes com insuficiência hepática são um subgrupo importante a onde estudos farmacocinéticos devem ser conduzidos. Existem guidelines específicas para a realização deste tipo de ensaios e para esta população de doentes, cujo objetivo é compreender e/ou quantificar este impacto. Com o aumento do peso das doenças hepáticas no mundo e a falta de marcadores para a caracterização da função hepática com a capacidade de prever a eliminação de fármacos, uma necessidade de desenvolvimento científico também cresce. O objetivo deste estudo é rever o envolvimento do fígado em todo o processo da farmacocinética e compreender as consequências da insuficiência hepática no mesmo e a sua repercussão no desenvolvimento de fármacos e ensaios clínicos. Neste contexto, o enquadramento regulamentar também será analisado, tanto da perspetiva da European Medicines Agency como da Food and Drug Administration.

Os tumores hepáticos são a segunda causa de morte relacionada com cancro em seres humanos. Já no cão, o carcinoma hepatocelular é raro mas o prognóstico é igualmente mau. Os critérios histopatológicos para o diagnóstico do carcinoma hepatocelular não estão bem estabelecidos, especialmente no caso dos tumores bem diferenciados, podendo-se tornar estes casos um desafio. Por esse motivo, o papel da reticulina no diagnóstico de carcinomas hepatocelulares na Medicina Humana já é utilizado de forma relativamente recorrente. O presente trabalho teve como objetivo determinar qual a utilidade da reticulina no diagnóstico do carcinoma hepatocelular num modelo de murganho e qual a sua aplicação à espécie canina. Avaliou-se de forma qualitativa e quantitativa a capacidade da reticulina para diferenciar os tumores dos focos de displasia e fígado saudável em murganhos. No cão foi comparado o padrão de reticulina apresentado por carcinomas hepatocelulares, hiperplasias nodulares e cirrose. Verificou-se que no murganho as fibras coradas a negro estão empurradas para a periferia do tumor, comprimidas de encontro ao tecido adjacente, formando uma rede compacta que permite estabelecer limites bastante precisos do anterior. No cão, os padrões apresentados nas mais variadas lesões assemelham-se ao que está descrito na literatura em Medicina Humana. A reticulina pode assim ser um importante auxílio na diferenciação do carcinoma hepatocelular de lesões benignas, devendo no entanto ser utilizada com cautela e suportar o diagnóstico feito pela hematoxilina e eosina., Hepatic tumors are the second leading cause of cancer-related death in humans. In the dog, hepatocellular carcinoma is rare but the prognosis is equally bad. Histopathological criteria for the diagnosis of hepatocellular carcinoma are not well established. For this reason, the role of reticulin in the diagnosis of this tumor in human medicine has been gaining ground. The aim of the present study was to determine the usefulness of reticulin in the diagnosis of hepatocellular carcinoma in a mouse model and its application to the canine species. The ability of reticulin to differentiate tumors from foci of dysplasia and healthy liver in mice was qualitatively and quantitatively evaluated. In the dog the reticulin pattern presented by hepatocellular carcinomas, nodular hyperplasia and cirrhosis was compared. It was noted that in the mouse the fibers are pushed to the periphery of the tumor, compressed against the adjacent tissue, forming a compact net that allows establishing quite precise limits of the carcinomas. In the dog, the patterns presented in the most varied lesions resemble what is described in the literature in human medicine. Reticulin may thus be an important aid in the differentiation of hepatocellular carcinoma from benign lesions, but should be used with caution and support the diagnosis made by hematoxilin and eosin., Orientação: Pedro Faísca

Sawfly larval poisoning (SLP) is an acute hepatotoxicosis documented in livestock in Australia, Denmark and in countries of South America. It is caused by the ingestion of the larval stage of insects of the suborder Symphyta, order Hymenoptera, commonly known as "sawfly". Three species of sawfly are reportedly involved in the toxicosis. The insect involved in Australian SLP is Lophyrotoma interrupta (Pergidae), in Denmark the cause of SLP is the ingestion of the larvae Arge pullata (Argidae), and in South American countries documented outbreaks of SLP were caused by the ingestion of yet another sawfly, Perreyia flavipes (Pergidae). In all geographical areas where it occurred, SLP causes important livestock losses. In cattle, as well as in other affected species, the disease has a short clinical course and in many outbreaks affected cattle can be found dead. When observed, clinical signs include apathy, recumbence, tremors, paddling movements and death in 24-48 hours. Neurological signs such aggressiveness attributable to hepatic encephalopathy are also observed. In cases with a more protracted course icterus and photodermatitis may develop. Gross findings included ascites, petechiae and ecchymosis over serosal surfaces of thoracic and abdominal cavities, and an enlarged liver that displays accentuation of the lobular pattern and edema of the gall bladder wall. Sawfly larval body fragments and heads are consistently found in the fore stomachs and occasionally abomasum of affected cattle. Main microscopic lesions are restricted to the liver and consist of centrolobular (periacinar) to massive hepatocellular necrosis. In most lobules necrotic areas extended up to the portal triads where only a few viable hepatocytes remain. Mild to moderate lymphocyte necrosis is seen in lymphatic tissues. Cases occur in the winter months when the larval stages of the sawfly are developing. D-amino acid-containing peptides have been found to be the toxic principle in each sawfly involved in SLP. The octapeptide lophyrotomin is the major toxin in the in the larvae of Australian and Danish sawflies and is present in small amounts in the larvae of South American sawfly. The heptadecapeptide pergidin is the main toxin in the South American sawfly while small amounts of pergidin have been found in the other two species of toxic sawfly. During the winter of 2011 (July-August) four outbreaks of SLP were diagnosed in the State of Rio Grande do Sul, Brazil. The findings in those outbreaks are reported here and a brief review of the literature regarding SLP around the world is provided. A intoxicação por larvas de mosca serra (ILMS) é uma hepatotoxicose aguda documentada em animais de fazenda na Austrália, Dinamarca e em países da América do Sul. É causada pela ingestão de larvas de insetos da subordem Symphyta, ordem Hymenoptera, conhecidos popularmente como mosca serra. Três espécies de moscas serra são relatadas como envolvidas na intoxicação. O inseto envolvido na ILMS australiana é Lophyrotoma interrupta (Pergidae); na Dinamarca a causa da ILMS é a ingestão de larvas de Arge pullata (Argidae) e nos países de América do Sul a ingestão de larvas de ainda outra espécie de mosca serra, Perreyia flavipes (Pergidae), é a causa de ILMS. Em todas essas áreas geográficas, a ILMS causa importantes perdas na pecuária. Em bovinos, como nas outras espécies afetadas, a doença tem um curso clínico breve e em muitos surtos os bovinos afetados podem ser encontrados mortos. Quando observados, os sinais clínicos incluem apatia, decúbito, tremores, movimentos de pedalagem e morte em 24-48 horas. Sinais neurológicos como agressividade, atribuídos à encefalopatia hepática, são também observados. Em casos com curso clínico mais protraído, pode ocorrer icterícia e fotodermatite. Achados de necropsia incluem ascite, petéquias e equimoses em superfícies serosas das cavidades torácica e abdominal e um fígado aumentado de volume e com acentuação do padrão lobular, e edema da parede da vesícula biliar. Em todas as necropsias de bovinos afetados, fragmentos do corpo e cabeças de larvas são encontrados nos pré-estômagos e, ocasionalmente, no abomaso. As principais lesões microscópicas são restritas ao fígado e consistem de necrose hepatocelular centrolobular (periacinar) a massiva. Na maioria dos lóbulos as áreas de necrose estendem-se até as tríades portais onde apenas algumas lâminas de hepatócitos viáveis permanecem. Leve a moderada necrose de linfócitos é observada nos tecidos linfáticos. Os surtos de ILMS ocorrem nos meses de inverno quando os estágios larvais estão em desenvolvimento. Peptídeos que contêm D-aminoácidos constituem os princípios tóxicos de cada uma das moscas serra envolvidas na ILMS. O octapeptídeo lofirotomina é a principal toxina nas larvas das moscas serra australianas e dinamarquesas e também ocorre em pequenas quantidades nas larvas da mosca serra sul-americana. O heptadecapeptídeo pergidina é a principal toxina das larvas da mosca serra sul-americana, enquanto que pequenas quantidades de pergidina foram encontradas nas outras duas espécies tóxicas de mosca serra. Durante o inverno de 2011 (Julho-Agosto) quatro surtos de ILMS foram diagnosticados no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Os achados desses surtos são relatados aqui e é feita uma breve revisão da literatura sobre ILMS ao redor do mundo.

Foram realizados dois experimentos para determinar os efeitos tóxicos de diferentes doses de aflatoxinas em bezerros, considerando-se aspectos clínicos, produtivos e patológicos. No primeiro experimento, nove bezerros, Holandês, com 2-4 meses de idade, receberam ração contendo 500±100 ppb de aflatoxina, na quantidade equivalente a 1,5% do peso vivo/dia, durante dois meses. Três bezerros de idade e peso semelhantes foram usados como controle e, exceto por terem recebido ração livre de aflatoxinas, foram mantidos nas mesmas condições. No segundo experimento, três bezerros, Holandês, com 4-5 meses de idade, receberam, por via oral, pequenas porções diárias de um concentrado de aflatoxinas, diluídas em 500ml de água, correspondendo a doses de 1.250, 2.500 e 5.000 ppb de aflatoxina B1 (AFB1). Um bezerro, Holandês, 4 meses, macho, foi usado como controle. No primeiro experimento, o ganho de peso dos bezerros recebendo AFB1 foi equivalente ao do grupo controle durante todo período experimental. Nesse experimento não foram observadas alterações na atividade sérica da enzima aspartato transaminase (AST), nos níveis da albumina sérica (AS), da proteína total (PT) e no hematócrito, quando comparados os resultados semanais do grupo tratamento e controle. No entanto, observou-se diferença significativa nas atividades séricas das enzimas fosfatase alcalina (FA) e gama glutamil transferase (GGT) entre o grupo tratamento e o grupo controle, na coleta do 63º dia do experimento. Durante o período experimental, e três semanas após o término desse período, não foram observados sinais clínicos e alterações histopatológicas associadas ao consumo de aflatoxinas, em qualquer dos bezerros do grupo tratamento do primeiro experimento. No segundo experimento, sinais clínicos observados nos três bezerros intoxicados incluíram perda de apetite, diminuição do ganho de peso e emagrecimento. Icterícia, diarreia intermitente, tenesmo e apatia severa, foram observadas apenas no bezerro que recebia 5.000 ppb de AFB1. Esses sinais clínicos foram a razão para eutanásia desse bezerro. Níveis alterados da atividade sérica de FA e GGT foram observados em todos os bezerros do grupo tratamento durante grande parte do período experimental. Queda acentuada do nível da AS sérica foi observada na coleta do 49º dia do experimento no bezerro que recebia a maior dose de aflatoxina. Não foram observadas variações no hematócrito e na atividade sérica da AST, nem nos níveis séricos de proteína total, bilirrubina total e bilirrubina direta em qualquer dos bezerros desse experimento. Alterações histopatológicas nos bezerros intoxicados incluíram proliferação de ductos biliares, degeneração citoplasmática vacuolar consistente com acumulação hepatocelular de lipídios, fibrose periportal, ou em ponte, megalocitose, fibrose subendotelial das veias hepáticas terminais e edema. Achados de necropsia do bezerro recebendo a maior dose de AFB1 incluíram fígado levemente aumentado de tamanho, difusamente amarelo-claro e firme, discreta ascite, edema de mesentério e submucosa do abomaso. Os dados obtidos nesses experimentos permitem afirmar que doses de 500±100 ppb de AFB1 não causam alterações patológicas e produtivas em bezerros em condições experimentais, mas podem estar associadas à mínimas alterações bioquímicas, enquanto doses de 1.250, 2.500 e 5.000 ppb de aflatoxina B1 causam doença hepática crônica em bezerros em condições experimentais.

O objetivo deste trabalho foi verificar a influência da idade, sexo, manejo e estado gestacional sobre a atividade sérica das enzimas: aspartato aminotransferase (AST), creatina quinase (CK) e gama-glutamiltransferase (GGT) em cavalos da raça Crioula. Foram utilizados 142 eqüinos, divididos em seis grupos: potros até um ano de idade; cavalos adultos em regime de atividade livre; cavalos adultos em treinamento; machos adultos; fêmeas não gestantes; fêmeas gestantes. O valor da CK foi mais elevado em animais adultos do que em potros, o mesmo tendo ocorrido em animais em atividade livre, comparados a animais em treinamento. Fêmeas não gestantes apresentaram valores das enzimas CK e GGT maiores que os machos; o valor da CK em fêmeas gestantes foi mais elevado do que em fêmeas não gestantes. A idade, o sexo, o manejo e o estado gestacional influenciam a atividade sérica da CK, e o sexo influencia a atividade sérica da GGT. The objective of this work was to evaluate the influence of age, sex, management and pregnancy status on aspartate aminotransferase (AST), creatine kinase (CK) and gamma-glutamyltransferase (GGT) enzymes serum activities of Crioulo horses. One hundred and forty-two horses, divided into six group were analyzed: yearlings; free activity of adult horses; training adult horses; male adult horses; nonpregnant and pregnant females. The CK enzyme activity value was higher in adult horses than in yearlings, and the same result was found when comparing free activity and training horses. Nonpregnant females had higher values for CK and GGT comparing to male horses, and CK values were higher in pregnant comparing to nonpregnant females. Age, sex, management and pregnancy status influence on CK serum activity, and sex influences on GGT serum activity.

The authors report the case of a young woman presenting with asymptomatic hypertransaminasemia whose etiologic investigation led to the diagnosis of celiac disease. The concomitant existence of antinuclear and anti-smooth muscle antibodies and of elevated sérum immunoglobulin G concentrations raised the hypothesis of autoimmune hepatitis, reason for performing a liver biopsy. The final diagnosis was celiac hepatitis, resolved with dietary treatment alone. Celiac disease is a systemic disorder primarily affecting the small bowel. A variety of liver manifestations have been described and there is an established association with autoimmune hepatic disorders. Isolated elevation of aminotransferases is the most common hepatic presentation, usually reversible with gluten avoidance. Although rarely necessary, liver biopsy may be crucial in selected cases. Os autores relatam o caso de uma jovem, assintomática, com elevação das aminotransferases, cuja investigação etiológica conduziu ao diagnóstico de doença celíaca. A existência concomitante de anticorpos antinucleares e antimúsculo liso e de elevação dos níveis de imunoglobulina G deu origem à hipótese diagnóstica de hepatite autoimune, tendo-se realizado uma biópsia hepática. O diagnóstico final foi de hepatite celíaca, com resolução completa em resposta à terapêutica nutricional. A doença celíaca é uma patologia sistémica com envolvimento primário do intestino delgado. Estão descritas várias manifestações hepáticas, existindo uma associação com as doenças hepáticas autoimunes. A elevação isolada das aminotransferases é a forma de apresentação mais comum, sendo geralmente reversível com a eliminação do glúten da dieta. Apesar de raramente necessária, a biópsia hepática pode ser determinante em casos selecionados.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico In the first part of the thesis, the spontaneous occurrence of an outbreak of chronic aflatoxicosis is reported in dairy calves. Forty 4-month-old male Holstein calves of approximately 100kg were fed a ration constituted by alfalfa hay, broken corn and milk substitute. Six calves (15%) died after presenting a disease characterized by general unthriftiness, diarrhea, rough hair coats, abdominal pain, prolapsed rectum and grinding of teeth. The clinical course, was 2-3 days; however many calves in this lot that did not die, remained underdeveloped. Three calves were necropsied. Necropsy findings included firm, light tan livers and marked hydrothorax, ascites and edema of the mesentery, mesocolon and of the mucosal folds of the abomasum. Main histopathological changes were restricted to the liver and consisted of fibrosis, moderate megalocytosis, biliary duct hyperplasia and venoocclusive disease. The analysis by thin layer chromatography of the corn fed to calves revealed 5,136 ppb of aflatoxin B1. A diagnosis of aflatoxicosis was made based on the characteristic clinical signs and pathology, on the absence of Senecio spp. in the food and on the presence of high levels of aflatoxin in the corn fed to the calves. In the second part of the thesis, two experiments were performed in order to determine the toxic effects of varying doses of aflatoxins in calves. Clinical, productive and pathologic aspects of affected calves were considered. In the first experiment, nine 2-4- month old calves Holstein Friesian calves were fed, for two months, daily amounts corresponding to 1.5% of their body weight of a ration containing 500±100 ppb of aflatoxins. Three calves were used as controls. In the second experiment, three 4-5-month old Holstein Friesian calves, were orally fed daily small parcels of a concentrate of aflatoxins diluted in 500 ml of water corresponding to 1,250, 2,500 e 5,000 ppb of B1 aflatoxin (AFB1). A male calf was used as control. During all the experimental period of the first experiment, the weight gain of the calves receiving AFB1 was equivalent to that of the control group and no differences were observed between treated and control calves when the values of serum activity of aspartate transaminase (AST), serum albumin (SA), total serum protein (TP), and PVC, determined weekly, were compared. A significant difference in the serum activities of alkaline phosphatase (AP) and gamma glutamyl transferase when the serum sampled on the 63th day of the experiment was considered. During the whole experimental period and up to three weeks after the final of the experiment, no clinical signs or histopathological changes associated with the consumption of aflatoxins were observed in any of the calves of the first experiment. In the second experiment, clinical signs observed in three treated calves included loss of appetite, decrease in weight gain, and loss of weight Jaundice, intermittent diarrhea, tenesmus and apathy were only observed in the calf receiving 5,000 ppb of AFB1. Increased activity of AF and GGT were observed in all the calves of the treated group. No changes were observed regarding PCV, TP, total bilirubin, direct bilirubin and in the serum activity of AST in any of the calves of the second experiment. Histopathological changes in intoxicated calves included bile duct proliferation, cytoplasmic vacuolar hepatocelular degeneration consistent with hepatocelular deposit of lipids, periportal to bridging fibrosis, megalocytosis, subendothelial edema and fibrosis in terminal hepatic veins. Necropsy findings in the euthanatized calf which receive de largest doses of AFB1 included slight enlargement of the liver which was firm and diffusely light-yellow, mild ascites, and edema of the mesentery and of abomasal folds. Na primeira parte dessa tese, relatamos a ocorrência de um surto de aflatoxicose crônica bezerros de raça leiteira. Quarenta bezerros holandeses, machos, de quatro meses de idade e aproximadamente 100 kg eram alimentados com feno de alfafa, milho quebrado e substituto de leite. Seis bezerros (15%) morreram após apresentar uma doença caracterizada por mau desenvolvimento geral, diarreia, pelagem áspera, dor abdominal, tenesmo, prolapso de reto e bruxismo. A duração do curso clínico foi de 2-3 dias; muitos terneiros desse lote que não morreram permaneceram pouco desenvolvidos. Os achados de necropsia de três bezerros incluíam fígado firme e castanho-claro, marcados hidrotórax e ascite, e edema do mesentério, mesocólon e das dobras da mucosa do abomaso. Os principais achados histopatológicos estavam restritos ao fígado e consistiam de fibrose, moderada megalocitose, hiperplasia de ductos biliares e lesão veno-oclusiva. A análise do milho do alimento dos bezerros por cromatografia de camada delgada revelou 5.136 ppb de aflatoxina B1 (AFB1). O diagnóstico de aflatoxicose foi feito baseado nos sinais clínicos e patologia característicos, na ausência de Senecio spp. na alimentação dos terneiros e na presença de altos níveis de aflatoxina no milho da alimentação dos bezerros. Na segunda parte da tese, dois experimentos foram realizados para determinar os efeitos tóxicos de diferentes doses de aflatoxinas em bezerros, considerando-se aspectos clínicos, produtivos e patológicos. No primeiro, nove bezerros, Holandês, com 2-4 meses de idade, receberam ração contendo 500±100 ppb de aflatoxina, na quantidade equivalente a 1,5% do peso vivo/dia, durante dois meses. Três bezerros foram usados como controle. No segundo experimento, três bezerros, Holandês, com 4-5 meses de idade, receberam, por via oral, pequenas porções diárias de um concentrado de aflatoxinas, diluídas em 500 ml de água, correspondendo a doses de 1.250, 2.500 e 5.000 ppb de AFB1. Um bezerro foi usado como controle. No primeiro experimento, o ganho de peso dos bezerros recebendo AFB1 foi equivalente ao do grupo controle durante todo período experimental e não foram observadas alterações na atividade sérica da enzima aspartato transaminase (AST), da albumina sérica (AS), da proteína total (PT) e no hematócrito, quando comparados os resultados semanais do grupo tratamento e controle. Diferenças significativas nas atividades séricas das enzimas fosfatase alcalina (FA) e gama glutamil transferase (GGT) ocorreram na coleta do 63º dia do experimento. Não foram observados sinais clínicos e alterações histopatológicas de aflatoxicose em qualquer dos bezerros do grupo tratamento desse experimento. No segundo experimento, sinais clínicos observados nos bezerros intoxicados incluíram perda de apetite, diminuição do ganho de peso e emagrecimento. Icterícia, diarreia intermitente, tenesmo e apatia severa, foram observadas apenas em um bezerro (5.000 ppb de AFB1). Níveis alterados da atividade sérica de FA e GGT foram observados em todos os bezerros do grupo tratamento. Não foram observadas variações no hematócrito e na atividade sérica de AST, nem nos níveis séricos de PT, bilirrubina total e bilirrubina direta em qualquer dos bezerros desse experimento. Alterações histopatológicas nos bezerros intoxicados incluíram proliferação de ductos biliares, degeneração citoplasmática vacuolar consistente com acumulação hepatocelular de lipídios, fibrose periportal, ou em ponte, megalocitose, fibrose subendotelial das veias hepáticas terminais e edema. Achados de necropsia do bezerro recebendo a maior dose de AFB1 incluíram fígado levemente aumentado de tamanho, difusamente amarelo-claro e firme, discreta ascite, edema de mesentério e submucosa do abomaso.

O vírus da hepatite delta (HDV) é o único vírus satélite humano conhecido até à data e membro do género Deltavirus. A replicação do HDV ocorre de forma independente da replicação do vírus da hepatite B (HBV) no entanto para formar partículas infecciosas o HDV necessita das proteínas de superfície do HBV. Após a entrada no núcleo o RNA genómico de cadeia simples do HDV replica por um mecanismo de círculo rolante com a produção da cadeia de RNA complementar, o RNA antigenómico. O HDV apenas codifica uma proteína da qual existem duas formas, o antigénio pequeno e o antigénio grande. Apesar de ambos os antigénios partilharem grande parte da cadeia de aminoácidos eles possuem papéis distintos na replicação do HDV. O antigénio pequeno é essencial para a replicação viral enquanto o antigénio grande é necessário para a formação de partículas infecciosas. Apesar da simplicidade do HDV este provoca um agravamento dos sintomas dos pacientes. Na primeira parte do trabalho pretendeu-se compreender as alterações provocadas pela replicação do HDV no proteoma das células. Verificou-se que a replicação do HDV provoca alterações no padrão de expressão de 43 proteínas celulares. Destas muitas encontram-se também diferencialmente expressas durante a replicação de outros vírus de hepatite como a chaperona molecular K, a proteína regulada pelo oxigénio 105kDa ou a ribonucleoproteína La. Também foram identificadas algumas proteínas relacionadas com a defesa da célula à infecção viral nomeadamente a copina I e a anfoterina. Posteriormente analisou-se as alterações no proteoma das células causadas pela expressão transiente de cada um dos constituintes do HDV. Observou-se alterações no padrão de expressão de 25 proteínas na presença do antigénio pequeno e do antigénio grande. Apesar do número de proteínas com o padrão de expressão alterado ser o mesmo os antigénios delta provocam alterações distintas na célula. O antigénio pequeno altera o padrão de expressão de várias proteínas relacionadas com o metabolismo dos ácidos nucleicos como a proteína 1 do complexo alfa, a proteína ribonuclear heterogénea L ou a proteína zinc finger 326. Enquanto a presença do antigénio grande provocava alterações em proteínas relacionadas com o transporte celular, como a proteína relacionada com o transporte de vesículas e com as vias energéticas. Quando as células expressam o RNA genómico apenas se observam alterações no padrão de expressão de 14 proteínas, a maioria delas envolvida em processos relacionados com o metabolismo celular, transporte enquanto que o RNA antigenómico provoca alterações no padrão de expressão de 23 proteínas relacionadas principalmente com o metabolismo de proteínas e com as vias energéticas. Os resultados obtidos por análise do proteoma foram validados por quantificação da expressão da lamina A/C e da ribonucleoproteína La na presença das RNPs virais por western blot. A validação dos resultados obtidos por 2DE para as proteínas: triosefosfato isomerase, proteína H1 de ligação às histonas, ribonucleoproteína nuclear heterogénea H, ribonucleoproteína nuclear heterogénea D e da proteína de choque térmico 105kDa foi efectuada por quantificação do mRNA utilizando qPCR. As proteínas diferencialmente expressas na presença das RNPs virais foram utilizadas na construção de uma rede de interacções proteína-proteína. Foram identificadas várias proteínas nesta rede, que interagem com as proteínas anteriormente identificadas, que estão envolvidas na replicação de vários vírus, nomeadamente a proteína c-myc, e no desenvolvimento de células cancerosas, nomeadamente a proteína 2 de ligação ao receptor do factor de crescimento. Na segunda parte deste trabalho pretendeu-se analisar a capacidade dos shRNAs em inibir a replicação do HDV. Para isso foram construídos vários vectores que expressam shRNAs dirigidos para os diferentes tipos de RNA do HDV. De seguida quantificou-se o número de células que exprimia os antigénios delta na presença dos shRNAs por imunofluorescência indirecta. Verificou-se que todas as sequências utilizadas eram capazes de diminuir o número de células que exprimia os antigénios delta em cerca de 70%. Posteriormente quantificou-se a expressão dos antigénios delta por western blot. Aqui os resultados foram bastante diferentes pois apenas as sequências que tinham como alvo o mRNA viral conseguiam diminuir os níveis de expressão dos antigénios delta. A diminuição dos níveis de expressão do antigénio pequeno chega a ser de 30% enquanto para o antigénio grande observou-se uma diminuição de 60%. Observou-se mesmo um aumento da expressão dos antigénios quando se utilizava shRNAs dirigidos para o RNA antigenómico. Finalmente, para tentarmos perceber a importância da sobreexpressão de algumas proteínas durante a presença do HDV na célula, analisou-se a capacidade do HDV em replicar em células que exprimiam shRNAs contra proteínas celulares. A expressão da lamina A/C, da ribonucleoproteína La, da chaperona molecular DNA K, da proteína regulada pelo oxigénio 150KDa, da chaperonina GroEL e da lamina B2 foi inibida. De seguida quantificou-se os níveis de mRNA do HDV nestas condições. Verificou-se que a inibição da expressão da lamina B2 provocava uma diminuição drástica nos níveis de mRNA do HDV enquanto a diminuição da expressão da lamina A/C provocava um ligeiro aumento nos níveis do mRNA viral. Analisou-se ainda a expressão dos antigénios delta por western blot. Aqui verificou-se que apenas a inibição da expressão da lamina B2 provocava uma diminuição da quantidade de antigénio pequeno presente na célula. No entanto, os níveis do antigénio grande diminuíam durante a inibição da expressão da ribonucleoproteína La, da chaperona molecular DNA K, da proteína regulada pelo oxigénio 150kDa e da chaperonina GroEL. Este trabalho constitui uma primeira abordagem na compreensão das alterações celulares causadas pela replicação do HDV. Permitindo a identificação de várias proteínas envolvidas em carcinomas ou na replicação de outros tipos de hepatite. Foram também identificadas várias proteínas celulares sobreexpressas durante a replicação do HDV que parecem desempenhar um papel importante no ciclo de replicação do vírus. Este trabalho possibilita o desenvolvimento de novas abordagens de modo a investigar e identificar novos alvos terapêuticos. The hepatitis delta virus (HDV) is the only known human satellite virus and the only member of the floating genus Deltavirus. The replication of the HDV occurs independently of the replication of the helper virus, the hepatitis B virus (HBV), but to form infectious particles it needs the HBV surface proteins. Upon entering the nucleus the HDV single stranded, genomic RNA replicates by a rolling circle mechanism with the production of a complement strain of RNA, the antigenomic RNA. The HDV only encodes for one protein that exists in two forms, the small antigen and the large antigen. The delta antigens share most of their aminoacid sequence however they display different roles in the HDV life cycle. The small antigen is essential for viral replication whereas the large antigen in necessary for viral encapsidation. Despite its simplicity the HDV causes an increase in symptom severity. Thus, in this work we analysed the changes in the cellular proteome caused by the HDV replication. We identified 43 differentially expressed proteins in the presence of the HDV RNPs. Several of these proteins were involved in the replication of other viral hepatitis, namely the molecular chaperone DNA K, the oxygen regulated protein 150kDa and the ribonuclearprotein La. We also identified some proteins related to the cellular defence against viral infection such as the copine I protein and the anfoterin protein. After this primary analysis we also identified differentially expressed proteins in the presence of each of the HDV components. We observed 25 proteins with the expression pattern altered in the presence of the small antigen and the large antigen. Both antigens cause changes in the same number of proteins however these proteins have different functions in the cell. The small antigen causes changes in proteins related the nucleic acid metabolism like the alpha-complex protein 1, the heterogeneous ribonuclear particle protein L and the zinc finger protein 326. Whereas the large antigen causes changes in the expression pattern of proteins related with the cellular transport like the vesicle transport related protein and with the energy pathways of the cell. In the cells that expressed the genomic RNA we observed 14 differentially expressed proteins and we observed 23 differentially expressed proteins in the cells expressing the antigenomic RNA. These proteins were primary related with the protein metabolism and with the energy pathways of the cell. The results obtained by proteomic analysis were confirmed by quantification of the expression of the ribonuclearprotein La and the lamin A/C protein in the presence of the HDV RNPs by western blot. Whereas the results for the proteins: oxygen-regulated protein 150K, triosephosphate isomerase, heterogeneous nuclear ribonuclearprotein D, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H and histone H1-binding protein were confirmed by quantification of the mRNA by qPCR. We used the proteins differentially expressed in the presence of the viral RNPs to construct a protein-protein interactions network. We identified several proteins in this network that interacted with the previously identified proteins that are involved in the replication of several viruses, namely the c-myc protein, and in the development of cancer cells, namely the growth factor receptor-bound protein 2. The second part of this work aimed at analysing the ability of shRNAs in inhibiting the replication of the HDV. We constructed several vectors that expressed shRNAs targeting the different types of viral RNA. Then we analysed the number of cells expressing the viral proteins in the presence of the shRNAs by indirect immunofluorescence. All the sequences used were capable of decreasing the number of cells expressing the delta antigens in about 70%. Finally we quantified the expression of the delta antigens by western blot. Here we observed quite different results because only the sequences that targeted the viral mRNA were capable of inhibiting the expression level of the delta antigens. The small antigen was 30% repressed whereas the large antigen showed a 60% decrease in the expression levels. Interestingly we observed an increase in the levels of the delta antigens when we targeted the antigenomic RNA. Finally we analysed the changes in the viral replication in cells that expressed shRNAs against cellular proteins. In order to understand the importance of these overexpressed proteins, during the presence of the HDV, in the replication of the HDV. We inhibit the expression of these proteins: ribonuclearprotein La, lamin A/C, oxygen-regulated protein 150kDa, molecular chaperone DNA K, chaperonin GroEL and the lamin B2 protein. We then analysed the changes in the HDV mRNA level under these conditions. The results indicated a drastic decrease in the HDV mRNA level in the cells where the expression of the lamin B2 was decreased. Whereas, in the cells in which we repressed the expression of the lamin A/C we observed only a slight increase in the HDV mRNA level. We then analysed the changes in the expression of the HDV antigens by western blot. We observed a decrease in the expression levels of both the HDV antigens only when we repressed the expression of the lamin B2 protein. However the levels of the large antigen were found to be downregulated when we inhibit the expression of the ribonuclearprotein La, the molecular chaperone DNA K, the oxygen-regulated protein 150kDa and the chaperonin GroEL. This work constitutes a first approach to understand the cellular changes that occur during the HDV replication that might explain the increase in symptom severity in HDV infected patients. We identified several proteins involved in the replication of other hepatitis viruses and in the development of carcinoma. Several of the upregulated proteins appear to be important in the HDV replication cycle. Thus providing additional information to further investigate and identify novel therapeutic targets.

WHAT IS ALREADY KNOWN ABOUT THIS SUBJECT • HIV-1 co-infection with HBV/HCV is the most important factor determining efavirenz-induced liver toxicity. Higher efavirenz plasma concentrations have been reported in these patients facilitating concentration drug-related adverse effects. • It is not known whether changes in efavirenz disposition are due to the hepatitis infection/inflammation or to liver failure. As a consequence, the guidelines for the application of therapeutic drug monitoring of efavirenz in HBV/HCV co-infected patients have not been established. WHAT THIS STUDY ADDS • The present study has shown that HBV/HCV infection in itself does not predispose to higher efavirenz plasma concentrations. In the absence of hepatic failure, the risk of efavirenz concentration-dependent toxicity is not increased. • Thus, therapeutic drug monitoring indications in co-infected patients with hepatic function within the normal range should be the same as in HIV-1 mono-infected patients. AIMS Data on efavirenz in HIV/viral hepatitis co-infected patients is non-consensual, probably due to liver function heterogeneity in the patients included. METHODS A case control study was performed on 27 HIV-infected patients, with controlled and homogenous markers of hepatic function, either mono-infected or co-infected with HBV/HCV, to ascertain the influence of viral hepatitis on efavirenz concentrations over a 2-year follow-up period. RESULTS No differences were found in efavirenz concentrations between groups both during and at the end of the follow-up period: control (2.43 ± 1.91 mg l–1) vs. co-infected individuals (2.37 ± 0.37 mg l–1). CONCLUSION It was concluded that HBV/HCV infections in themselves do not predispose to an overexposure to efavirenz.

Dissertação de Mestrado em Comunicação em Saúde apresentada à Universidade Aberta O Transplante Hepático é um dos reflexos do avanço da Medicina no tratamento de algumas doenças hepáticas graves, às quais antigamente não se sobrevivia. É um processo longo, em que desde a tomada de decisão por este processo terapêutico, passando pelas expectativas em torno do transplante, pelo isolamento afectivo e sensorial, pelo stress e tensões constantes, requer todo um processo de adaptação psicológica com dimensões cognitivas e emocionais. É realizado em Portugal há 14 anos em três Unidades no País (Lisboa, Porto e Coimbra). A presente investigação, teve como finalidade a realização de um estudo exploratório e descritivo, enquadrado no paradigma qualitativo e quantitativo, onde se pretendeu conhecer o impacto da doença e do transplante hepático na qualidade de vida de doentes com cirrose. Neste contexto, pretendemos enfatizar a experiência humana da cirrose tal como é vivida, colectando materiais predominantemente narrativos, onde foram estudados aspectos relativos às percepções, pensamentos e sentimentos dos doentes com expectativa de transplante hepático e já transplantados, comparando a qualidade de vida na fase terminal da cirrose, 6 meses e 1 ano após o transplante hepático. Foi constituída uma amostra não probabilística de 61 participantes da Unidade de Transplante do Hospital Curry Cabral (Hospital Público de Lisboa) utilizando uma técnica de amostragem de conveniência, onde se constituiu uma amostra de 28 participantes em lista activa para transplante, 18 participantes com seis meses de transplante e 15 participantes com 1 ano de transplante. De acordo com a conceptualização, desenvolvemos um estudo transversal com metodologia mista, em que a colheita de dados foi feita com base no inquérito sob a forma de entrevista semi-estruturada, com a aplicação da versão espanhola traduzida para português do instrumento LDQOL 1.0. Após a transcrição integral da análise de conteúdo das entrevistas e da análise dos dados dos questionários com o apoio do software informático (SPSS 13.0), foram retiradas como principais conclusões: - Má qualidade de vida dos participantes em fase terminal da cirrose, com perca acentuada da independência, limitações progressivas, partilhando entre si problemas físicos e psicossociais semelhantes. O sucesso do procedimento cirúrgico traz melhoria significativa, apesar do acompanhamento médico para o resto das suas vidas com a permanente toma de drogas imunosupressoras para evitar a rejeição do enxerto. - Melhoria acentuada da qualidade de vida ao ano de transplante, com menor expressão aos 6 meses de transplantação, referente aos sintomas relacionados com a doença, transplante e funcionamento físico. - Melhoria menos acentuada da qualidade de vida referente ao funcionamento psicológico e social dos participantes transplantados - Necessidade de intensificação de programas psicossociais e de acompanhamento psicológico nos doentes com patologia associada ao transplante hepático - A aplicação estruturada da avaliação da qualidade de vida em doentes hepáticos referenciados para transplante ou já transplantados pode ser de mais valia para a decisão do transplante e reabilitação em saúde. - As doenças autoinfligidas, no caso doentes com cirrose alcoólica e cirrose viral por comportamentos de risco, devem ser socialmente prevenidas mas medicamente tratadas da mesma forma que outras cirroses terminais La transplantation hépatique représente un des réflexes du progrès de la Médicine pour le traitement de quelques maladies hépatiques graves auxquelles on ne survivait pas autrefois. C’est un processus long, depuis la prise de décision pour cette thérapeutique, passant par des expectatives autour du greffe par la solitude affective et sensorielle, par le stress et les pressions constantes. C’est un processus qui demande toute une méthode d’adaptation psychologique avec ses dimensions cognitives et émotionnelles. La transplantation hépatique se réalise au Portugal depuis 14 années en trois unités hospitalières du pays (Lisbonne, Oporto et Coimbra). La présente investigation a eu comme but la réalisation d’une étude exploratrice et descriptive encadrée dans le paradigme qualitatif et quantitatif. On a essayé de connaître l’impact de la maladie et du greffe du foie sur la qualité de vie des malades souffrant de cirrhose. Dans ce contexte, nous avons prétendu ampouler l’expérience humaine de cirrhose ainsi qu’elle est vécue, recueillant du matériel prédominament narratif où nous avons pu étudier des aspects concernant les perceptions, les pensées et les sentiments des malades qui attendaient une transplantation hépatique et des malades déjà greffés, examinant le rapport entre la qualité de vie de ceux déjà en phase terminale de la cirrhose et les patients déjà greffés, depuis 6 mois et 1 an, respectivement. Ainsi, on a établit un échantillon non probatoire de 61 participants de l’Unité de Transplantation de l’Hôpital Curry Cabral (Hôpital Publique de Lisbonne) en utilisant une technique d’échantillonnage de convenance tout en rassemblant un échantillon de 28 candidats en liste active pour la transplantation, 18 participants greffés depuis 6 mois et 15 depuis un an. D’après la conceptualisation, on a développé une étude transversale d’une méthodologie mixte dont le rassemblement des données a reposé sur une enquête sous la forme d’interview demi-structurée, appliquant la version espagnole de l’instrument LDQOL 1.0, traduite en portugais. Après la transcription intégrale de l’analyse du contenu des interviews et de l’analyse des données des enquêtes avec l’appui du software informatique (SPSS 13.0) nous sommes arrivés aux conclusions suivantes : - mauvaise qualité de vie des participants en phase terminale de cirrhose avec forte perte d’indépendance, limitations progressives et partageant entre eux les mêmes problèmes physiques et psychosociaux. - Le succès du processus chirurgical apporte une amélioration significative, non obstant l’accompagnement médical continué pendant toute la vie et la prise permanente de médicaments spécifiques pour éviter le rejet du greffe. - Amélioration remarquable de la qualité de vie une année après la transplantation, un peu moins après les premiers six mois, en ce qui concerne les symptômes typiques de la maladie, de la transplantation et du fonctionnement physique. - Amélioration moins remarquable de la qualité de vie en ce qui concerne le fonctionnement psychologique et social des participants greffés. - De toute nécessité l’intensification de programmes psychosociaux et d’accompagnement psychologique chez les malades souffrant de pathologie associée à la transplantation hépatique. - L’application structurée de l’appréciation de la qualité de vie chez les malades hépatiques qui attendent le greffe ou même déjà greffés, peut contribuer significativement pour la prise de décision concernant la transplantation et pour la réhabilitation de la santé. - Les maladies auto contractées, dans le cas des malades souffrant de cirrhose alcoolique et de cirrhose virale, dues à des conduites périlleuses, doivent être socialement prévenues mais soignées du point de vue médical de la même façon que d’autres cirrhoses terminales The liver transplant is one of the consequences of the advance in medicine in the treatment of some acute hepatic illnesses, to which patients did not survive in the past. It is a long process since the decision is taken for this therapeutic process, including the expectations around the transplant, the affective and sensorial isolation, the stress and constant pressure, which requires a full process of psychological adaptation with emotional and cognitive dimensions. This has been done in Portugal for the last 14 years in three hospital units of the country (Lisbon, Oporto and Coimbra). The current investigation consisted in an exploratory and descriptive study, both qualitative and quantitative, with the intention of knowing the impact of the illness and liver transplant in the quality of life of the patients with cirrhosis. In this context, we try to emphasize the human experience of cirrhosis as it is lived, by collecting essentially narrative material, where the relative aspects of the perception, thoughts and feelings of the hepatic patients with expectations of transplant or already transplanted were studied, by comparing the qualify of life in the terminal phase of the cirrhosis, 6 months and 1 year after the liver transplant. A non-probabilistic sample was gathered of 61 patients of the Transplant Unit of the Curry Cabral Hospital (a public Lisbon hospital). A technical convenience sample was used, where 28 patients in the waiting list for transplant, 18 patients with six months transplants and 15 patients with one year transplants were included. We carried out a transversal study with mixed methodology. The data was obtained based on a semi-structured interview inquest by making use of the Spanish version translated into Portuguese of the LDQOl 1.0 instrument. After the complete transcription of the analysis of the contents of the interviews and the questionnaires with the support of computer software (SPSS 13.0), the following conclusions were reached: - Bad quality of life of the participants in the terminal phase of cirrhosis with a significant loss of independence and progressive limitations, sharing amongst them similar physical and psycho-social problems. - The success of the surgical process reflects significant improvement in spite of the need of medical support for the rest of their lives, with the permanent ingestion of immune-depressive drugs to avoid the rejection of the transplant. A perceptible improvement in the quality of life one year after the transplant, with a lesser expression at six months after the operation, when referring to the symptoms related to the illness transplant and physical functioning. - A less perceptible improvement in the quality of life with reference to psychological and social behaviour of the transplanted participants. - A need to intensify the psycho-social programmes and the psychological and social support of the transplanted participants. - The structured application of the evaluation of the quality of life of hepatic patients awaiting transplant or already transplanted, may be a good contribute for the transplant´s decision and the rehabilitation in health. - The self-provoked illnesses, in the case of the alcoholic and viral cirrhosis by risk behaviours must be socially prevented but medically treated in the same way as other terminal cirrhosis

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Ethanol is one of the most ingested substances among the different societies. So, it becomes target of several studies that intent to elucidate its mechanisms of toxicity. This study was aimed to better understand the link between ethanol and oxidative stress. Taking into account that thiol depletion is observed in ethanol injuries, two antioxidant compounds, N-acetylcysteine and ebselen, were tested, alone or simultaneously, against the effects of the chronic ethanol consumption on the cellular sulfhydryl status. The activities of glutathione peroxidase and δ-aminolevulinate dehydratase were evaluated in mice liver. Male Swiss albino mice received, during 30 days, a single administration of ethanol (3 g/kg) by gavage. This treatment caused a significant reduction in the levels of liver nonprotein thiols (NPSH). Daily intraperitoneal injections of either Nacetylcysteine (300 mg/kg) or ebselen (5 mg/kg) were able to blunt NPSH to the control levels. However, the simultaneous administration of N-acetylcysteine and ebselen did not show additive protective effect in this parameter. This phenomenon was also observed for the activities of liver glutathione peroxidase and δ-aminolevulinate dehydratase. Their activities were inhibited by ethanol and blunted by the individual treatment with N-acetylcysteine or ebselen. Liver NPSH were positively correlated with glutathione peroxidase and δ-aminolevulinate dehydratase activities. These results demonstrated that either N-acetylcysteine or ebselen, alone, are able to restore the harmful effects of ethanol consumption on enzymes whose catalytic activities depend on their thiol (δ-ALA-D) and selenol (GSH-Px) groups. The in vitro effects of crescent concentrations of acetaldehyde in the activities of mice liver glutathione peroxidase and glutathione reductase, cellular sulfhydryl status, thiol peroxidase activity of ebselen and the interaction between ebselen and glutathione were evaluated to better comprehend the relationship between acetaldehyde and the nucleophilic groups of biomolecules. Glutathione peroxidase and glutathione reductase activities in mice liver supernatants were not changed after pre-incubation with acetaldehyde. Acetaldehyde, up to 300 μM, did not affect the thiol-peroxidase activity of ebselen. Total sulfhydryl status was significantly reduced after the incubation with acetaldehyde (300 μM) and this phenomenon was also observed for NPSH at acetaldehyde concentrations of 100 and 300 μM. Taking into account that acetaldehyde, under these same above-mentioned conditions, did not oxidize glutathione and dithioerythritol in the absence of hepatic supernatant, these results indicate that the acetaldehyde-dependent oxidation of glutathione seems to depend, at least in part, on liver constituents. O etanol é uma das substâncias mais consumidas entre as diferentes sociedades. Torna-se, assim, alvo de numerosos estudos que buscam o aprimoramento dos conhecimentos acerca de sua toxicidade. Esse estudo foi realizado com a finalidade de se compreender melhor a relação existente entre o etanol com o dano oxidativo direta ou indiretamente a ele associado. Levando em conta o fato de que esses danos estão geralmente ligados à depleção de compostos sulfidrílicos, dois compostos antioxidantes, a N-acetilcisteína e o ebselen, foram testados, sozinhos ou em combinação, frente aos efeitos da ingestão crônica de etanol sobre o estado tiólico celular. As atividades das enzimas glutationa peroxidase e δ-aminolevulinato desidratase foram investigadas no fígado de camundongos. Camundongos machos da espécie Swiss albino receberam, durante 30 dias, uma única administração diária de etanol (3 g/kg) por gavagem, o que levou a uma significativa diminuição na concentração de tióis não protéicos no fígado. Injeções intraperitoneais diárias com N-acetilcisteína (300 mg/kg) ou ebselen (5 mg/kg) foram capazes de restabelecer estes níveis aos do grupo controle. Entretanto, a combinação dos dois compostos não demonstrou efeito protetor aditivo neste parâmetro analisado. Este fenômeno se repetiu nas atividades das enzimas glutationa peroxidase e δ-aminolevulinato desidratase, as quais tiveram suas atividades diminuídas pela exposição ao etanol e restabelecidas pelo tratamento individual com as drogas. Os compostos sulfidrílicos de fonte não protéica apresentaram uma correlação significativa com a atividade das enzimas glutationa peroxidase e δ-aminolevulinato desidratase. Estes resultados demonstraram que a N-acetilcisteína e o ebselen, sozinhos, são capazes de restabelecer os danos provocados pelo consumo de etanol em enzimas cuja função catalítica depende da integridade de seus grupamentos tiol (δ-ALA-D) ou selenol (GSH-Px). Os efeitos in vitro de concentrações crescentes de acetaldeído sobre as atividades das enzimas glutationa peroxidase e glutationa redutase de fígado de camundongos, estado tiólico celular, atividade tiol peroxidase do ebselen e a interação entre ebselen e glutationa foram avaliados para a melhor compreensão da relação entre o acetaldeído e os grupamentos nucleofílicos de biomoléculas. As atividades das enzimas glutationa peroxidase e glutationa redutase hepáticas não foram modificadas pela incubação com acetaldeído, assim como a atividade tiol peroxidase do ebselen. O estado tiólico total apresentou uma diminuição significativa frente à incubação com 300 μM de acetaldeído, fato que se repetiu nos níveis de compostos tiólicos não protéicos nas concentrações de 100 e 300 μM de acetaldeído. Tendo em vista que o acetaldeído, nestas mesmas condições, não oxidou a glutationa e o ditioeritritol na ausência de sobrenadante hepático, estes resultados indicam que a oxidação de glutationa hepática causada pelo acetaldeído depende, ao menos em parte, do seu metabolismo por constituintes do fígado.O etanol é uma das substâncias mais consumidas entre as diferentes sociedades. Torna-se, assim, alvo de numerosos estudos que buscam o aprimoramento dos conhecimentos acerca de sua toxicidade. Esse estudo foi realizado com a finalidade de se compreender melhor a relação existente entre o etanol com o dano oxidativo direta ou indiretamente a ele associado. Levando em conta o fato de que esses danos estão geralmente ligados à depleção de compostos sulfidrílicos, dois compostos antioxidantes, a N-acetilcisteína e o ebselen, foram testados, sozinhos ou em combinação, frente aos efeitos da ingestão crônica de etanol sobre o estado tiólico celular. As atividades das enzimas glutationa peroxidase e δ-aminolevulinato desidratase foram investigadas no fígado de camundongos. Camundongos machos da espécie Swiss albino receberam, durante 30 dias, uma única administração diária de etanol (3 g/kg) por gavagem, o que levou a uma significativa diminuição na concentração de tióis não protéicos no fígado. Injeções intraperitoneais diárias com N-acetilcisteína (300 mg/kg) ou ebselen (5 mg/kg) foram capazes de restabelecer estes níveis aos do grupo controle. Entretanto, a combinação dos dois compostos não demonstrou efeito protetor aditivo neste parâmetro analisado. Este fenômeno se repetiu nas atividades das enzimas glutationa peroxidase e δ-aminolevulinato desidratase, as quais tiveram suas atividades diminuídas pela exposição ao etanol e restabelecidas pelo tratamento individual com as drogas. Os compostos sulfidrílicos de fonte não protéica apresentaram uma correlação significativa com a atividade das enzimas glutationa peroxidase e δ-aminolevulinato desidratase. Estes resultados demonstraram que a N-acetilcisteína e o ebselen, sozinhos, são capazes de restabelecer os danos provocados pelo consumo de etanol em enzimas cuja função catalítica depende da integridade de seus grupamentos tiol (δ-ALA-D) ou selenol (GSH-Px). Os efeitos in vitro de concentrações crescentes de acetaldeído sobre as atividades das enzimas glutationa peroxidase e glutationa redutase de fígado de camundongos, estado tiólico celular, atividade tiol peroxidase do ebselen e a interação entre ebselen e glutationa foram avaliados para a melhor compreensão da relação entre o acetaldeído e os grupamentos nucleofílicos de biomoléculas. As atividades das enzimas glutationa peroxidase e glutationa redutase hepáticas não foram modificadas pela incubação com acetaldeído, assim como a atividade tiol peroxidase do ebselen. O estado tiólico total apresentou uma diminuição significativa frente à incubação com 300 μM de acetaldeído, fato que se repetiu nos níveis de compostos tiólicos não protéicos nas concentrações de 100 e 300 μM de acetaldeído. Tendo em vista que o acetaldeído, nestas mesmas condições, não oxidou a glutationa e o ditioeritritol na ausência de sobrenadante hepático, estes resultados indicam que a oxidação de glutationa hepática causada pelo acetaldeído depende, ao menos em parte, do seu metabolismo por constituintes do fígado.

O TT vírus (TTV) foi primeiramente descrito no Japão, em 1997, por T. Nishizawa, no soro de pacientes com hepatite, pós-transfusão, não-A-G. Tem sido intensivamente investigado, desde então, como uma possível adição à lista dos vírus indutores de hepatite. O TTV é um vírus DNA não-envelopado, de fita simples. Uma considerável variabilidade genética tem sido demonstrada por parte do TTV, o que tem levado pesquisadores a agrupar isolados do vírus em inúmeros genótipos e subtipos. No entanto a significância clínica da infecção por TTV permanece desconhecida. Ele é freqüentemente detectado em fluidos corporais e seu componente mais bem elucidado atualmente é o genoma. Conhecimentos relacionados ao TTV têm aumentado constantemente, porém vários aspectos fundamentais permanecem obscuros. Esta revisão apresenta algumas das propriedades moleculares do TT vírus. TT virus (TTV) was first reported in Japan in 1997 by T. Nishizawa in sera from non-A to non-G post-transfusion hepatitis patients. It has been intensively investigated, ever since, as a possible addition to the list of hepatitis-inducing viruses. The TTV is an unenveloped, single-stranded DNA virus. Considerable genetic variability of TTV has been demonstrated and has led investigators to group its isolates into numerous genotypes and subtypes. However, the clinical significance of TTV infection remains unknown. It is frequently detected in the serum and in other body fluids of humans. The component of TTV currently best understood is its genome. Knowledge related to TTV has increased rapidly, but many fundamental aspects remain unclear. This review shows some of the molecular properties of TT virus.

Submitted by Ana Quininha (ana.quininha@chlc.min-saude.pt) on 2014-01-14T16:18:57Z No. of bitstreams: 1 AMP 1996 103.pdf: 847297 bytes, checksum: b9a36bfe57b8189ea98d03b9b7e56ac9 (MD5) Made available in DSpace on 2014-01-14T16:18:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AMP 1996 103.pdf: 847297 bytes, checksum: b9a36bfe57b8189ea98d03b9b7e56ac9 (MD5) Previous issue date: 1996

A determinação dos níveis séricos de transferrina deficiente em carbo-hidratos (CDT) e do rácio de transferrina no consumidor abusivo persistente de álcool aparece com promissora utilidade na área da alcoologia. Na série actual demonstra-se excelente especificidade (970 o) no entanto com fraca sensibilidade (52° o) para o CDT. Contudo o rácio CDT Tft adiciona-lhe uma sensibilidade acrescida atingindo 740 o mantendo a elevada especificidade. Nos consumidores abusivos 70g dia) persistentes, este índice que se correlaciona positivamente com a transferrina sérica, é capaz de escurtinar em elevada frequência estas capitações de álcool e mostra uma informação independente pois não se correlaciona significativamente com os níveis dos marcadores biológicos tradicionais (AST, ALT, GGT, VGM). Embora com limitações metodológicas definidas, estes índices prenunciam, com melhoria da acessibilidade técnica, uma aplicabilidade prática no rastreio de consumidores abusivos crónicos. Na área da hepatologia o comportamento do CDT e ácio da transferrina é capaz de afirmar em elevada frequência o envolvimento do etanol no estudo da natureza de uma doença hepática crónica. No entanto, o grau de lesão do figado tomado pelo índice hepático PGA, não influencia apreciavelmente os níveis séricos do CDT e rácio de transferrina. Na presente série, as circunstancias e condições do consumo de álcool parecem ser o determinante independente do carácter informativo que estes índices revelam.

O vírus da hepatite delta (HDV) é o agente etiológico responsável pelas formas mais graves e mortais de doença viral hepática para as quais não existe uma terapia eficaz. O virião do HDV é formado por uma molécula de RNA circular e de cadeia simples associada a múltiplas cópias do antigénio delta e pelos antigénios de superfície do HBV (HBsAg). Os HBsAgs são glicoproteínas associadas ao reticulo endoplasmático das células e são indispensáveis para a montagem e empacotamento de partículas delta infecciosas capazes de infecção e transmissão. A replicação do genoma do HDV ocorre no núcleo das células por um mecanismo de círculo rolante, onde o RNA genómico do vírus serve de molde à síntese de moléculas multiméricas de RNA antigenómico, as quais possuem actividade ribozímica e se auto-clivam a intervalos precisos. Após clivagem, os antigenomas monoméricos religam-se e servem de molde à síntese de novas cadeias de RNA genómico por um mecanismo semelhante. Tanto o RNA como os HDAgs acumulam-se preferencialmente no núcleo das células. No entanto, a interacção das RNPs do HDV com os HBsAgs tem lugar exclusivamente no citoplasma. Foi demonstrado que as RNPs do HDV fazem um vai-vém contínuo entre o núcleo e o citoplasma e que a exportação nuclear das RNPs virais é um processo independente da presença de HBsAg, sendo mediado pelo RNA do HDV. O mecanismo oposto, ou seja, a importação das RNPs do HDV é um mecanismo mediado pelos antigénios delta que envolve o reconhecimento de sinais de localização nuclear pelas proteínas celulares especializadas no transporte nuclear através do poro nuclear.O presente trabalho teve como objectivo identificar os sinais presentes no RNA do HDV e nos HDAgs, e as proteínas celulares envolvidas no transporte núcleo-citoplasmático das RNPs do vírus. Com o objectivo de identificar os elementos de exportação nuclear presentes no RNA do HDV procedeu-se à construção e expressão de uma série de mutantes de deleção de um plasmídeo (pDL542) que codifica exclusivamente para o RNA genómico do vírus. Para a construção dos mutantes de deleção utilizou-se uma abordagem que se baseia na utilização da exonuclease III (Exo III). Os cDNAs do HDV com dimensões progressivamente menores, resultantes da digestão com a Exo III, foram clonados e utilizados para transfectar células Huh7. A identificação dos RNAs defectivos na exportação nuclear foi efectuada por comparação do padrão de distribuição intracelular de cada mutante de deleção com a localização do RNA genómico do HDV do tipo selvagem, através de experiências de hibridação in situ. A presença de sinais de exportação nuclear no RNA do HDV foi também estudada por quantificação dos níveis de expressão da proteína CAT em extractos de células transfectadas com o vector repórter pDM138, no qual foram inseridos vários fragmentos de cDNA que codificam para diferentes partes do RNA genómico e antigenómico do vírus. Como resultado da transcrição do vector repórter pDM138 são produzidos mRNAs que possuem a ORF da proteína CAT inserida numa região intrónica do genoma do HIV-1. A exportação e acumulação citoplasmática destes mRNAs depende da presença de sequências funcionais na exportação e está correlacionada com o aumento dos níveis da expressão da proteína CAT. Deste modo, a presença de um sinal de exportação numa sequência de RNA pode ser facilmente investigada por quantificação da proteína repórter CAT. O estudo da distribuição intracelular dos RNAs produzidos a partir dos mutantes de deleção do plasmídeo pDL542 não permitiu identificar nenhuma sequência no RNA genómico do vírus essencial para a exportação nuclear, uma vez que todos os mutantes de deleção do RNA genómico do HDV apresentam o mesmo padrão de distribuição intracelular do RNA genómico do tipo selvagem. No entanto, registou-se uma redução significativa no número de células transfectadas em que o RNA viral foi detectado no citoplasma, quando se analisaram as formas truncadas do RNA genómico sem as sequências compreendidas entre os nucleótidos 1211 e 1487, e 476 e 512. Os resultados dos ensaios de quantificação da expressão da proteína CAT após transfecção de células Huh7 com os vectores pDM138 que codificam para diferentes partes do RNA genómico do HDV mostraram a presença de três sequências no genoma do vírus capazes de causar um aumento na expressão da proteína CAT superior ao observado em células transfectadas com o vector pDM138 parental. Duas das sequências analisadas (nt 1191-1414 e 415-613) sobrepõem-se parcialmente com as regiões identificadas no genoma do HDV, na ausência das quais se observa uma redução significativa na percentagem de células com marcação citoplasmática. Em conjunto, estes resultados poderão indicar que o RNA genómico possui mais do que um elemento cis envolvido na exportação nuclear e que a eficiência do transporte do núcleo para o citoplasma está relacionada com o número de sinais de exportação presentes no genoma do vírus. A aplicação da mesma abordagem experimental para a pesquisa de sinais de exportação no antigenoma do HDV mostrou que este RNA viral possui um elemento cis, situado entre os nt 1263 a 1466, funcionalmente equivalente ao PRE do HBV. A actividade do sinal de exportação do antigenoma do HDV parece depender, da orientação da sequência identificada em relação à ORF da proteína CAT e da exportina CRM1. Demonstrou-se ainda, que o aumento da expressão da proteína repórter, induzido pela sequência compreendida entre os nt 1263 e 1466 do RNA antigenómico do HDV, resulta da exportação e acumulação citoplasmática de mRNAs repórter contendo a ORF da proteína CAT inserida no intrão. Estes ensaios foram conduzidos na ausência de replicação viral e consequente acumulação dos HDAg, sugerindo que os antigénios delta não são necessários para o transporte do RNA antigenómico do HDV do núcleo para o citoplasma. A análise funcional do elemento de exportação no transporte do RNA antigenómico para o citoplasma foi efectuada por comparação da distribuição intracelular do antigenoma do HDV com e sem o sinal de exportação nuclear. A redução de 60% na proporção de RNA no citoplasma em relação à quantidade de RNA antigenómico nas fracções nucleares, avaliada por qRT-PCR, mostra que o sinal de exportação situado entre os nt 1263 e 1466 altera a distribuição do antigenoma do HDV. Adicionalmente, utilizando uma abordagem similar demonstrou-se que os RNAs genómicos e antigenómicos do HDV, na ausência de replicação do vírus, são exportados em quantidades semelhantes. A abordagem utilizada para a identificação das sequências de aminoácidos do HDAg necessárias para a importação nuclear consistiu na expressão de diferentes subregiões do cDNA do HDAg clonadas na mesma grelha de leitura do gene da proteína repórter c-myc-PK que, na ausência de NLS funcionais, se acumula exclusivamente no citoplasma das células. Após análise detalhada dos aminoácidos do HDAg necessários e suficientes para promover a importação nuclear da proteína c-myc-PK confirmou-se a importância do NLS identificado na localização intracelular do HDAg nativo.Neste trabalho, obtiveram-se evidências sólidas que a importação nuclear do HDAg é dirigida por um único NLS, constituído por uma sequência contínua de 10 aminoácidos (EGAPPAKRAR), que se situam nas posições 66 a 75 na proteína. Esta sequência corresponde ao primeiro domínio do NLS bipartido anteriormente identificado no HDAg como sendo essencial para a importação nuclear de uma proteína repórter, diferindo apenas pela presença de um resíduo de ácido glutâmico adicional. Foi ainda demonstrado, que o NLS do HDAg não é específico para células hepáticas. As experiências de cromatografia de afinidade e de espectrometria de massa realizadas com o objectivo de identificar as proteínas celulares que interagem especificamente com o NLS do HDAg não permitiram elucidar o mecanismo pelo qual o antigénio delta é importado para o núcleo. Contudo, a identificação de proteínas de ligação a elementos do citoesqueleto poderá indicar o envolvimento desta estrutura no mecanismo de importação nuclear dos HDAg e das RNPs do HDV. The hepatitis delta virus is the causative agent of one of the most severe and mortal forms of virus-induced liver disease for which there is no effective treatment. HDV infectious particles consist of a circular ssRNA molecule of about 1.7 Kb, small and large delta antigens, and hepatitis B surface antigens (HBsAgs). The HBsAgs are localised in the cytoplasm inside the endoplasmic reticulum and are essential in assembly of hepatitis delta virus particles capable of infection and transmission. HDV genome replication occurs in the nucleus via a rolling-circle mechanism where the incoming genome serves as a template for production of complementary multimeric antigenomic RNA that harbour ribozymes capable of self-cleaving at precise monomeric intervals. After cleavage, the resulting monomeric antigenomes recircularize and are used as templates for genome synthesis by a similar mechanism. Both HDV RNA and HDAg accumulate preferentially in the cell nucleus. Nevertheless, the interaction between HDV RNPs and HBsAgs takes place in the cytoplasm. It was shown that HDV RNPs shuttle continuously between the nucleus and the cytoplasm and nuclear export of HDV RNPs is a mechanism independent of the presence of HBsAgs, possibly being mediated by the virus RNA. In contrast, HDV RNPs nuclear import is a process mediated by HDAg that relies on nuclear localization signal recognition by the cellular proteins specialised in the nuclear transport across the nuclear pore. The main objective of this work was to identify the signals present on the HDV RNA and HDAgs, and the cellular proteins involved in the nucleocytoplasmic traffic of HDV RNPs. In order to identify the cis elements responsible for HDV RNA export we constructed and expressed a series of sequential deletion mutants of a plasmid (pDL542) that exclusively encodes for the genomic HDV RNA. For the construction of HDV cDNA deletion mutants we employed a strategy that utilizes the enzyme Exo III. The resulting cDNAs fragments were then subcloned and used to transfect Huh7 cells. The screening procedure to identify virus RNAs defective in nuclear export was performed comparing the intracellular distribution pattern of each deletion mutant to the wild type HDV genomic RNA. The presence of export signals on HDV RNA was further investigated by quantification of CAT protein expression after transfection of Huh7 cells with pDM138 reporter plasmids containing several cDNA fragments that code for different parts of genomic and antigenomic HDV RNA. The mRNA molecules derived by transcription of pDM138 reporter plasmid contain the CAT gene inserted within the second intron of HIV-1 sequence. Export and cytoplasmic accumulation of the unspliced reporter mRNAs depends on the presence of a functional transport element and is correlated to an increase in CAT protein expression. Therefore, the export activity of a RNA sequence can be easily determined by quantifying the CAT protein expression levels after transfection. Analysis of intracellular distribution pattern by in situ hybridization assays of the HDV RNAs produced by plasmid pDL542 deletion mutants did not allow us to identify any sequence motifs essential for HDV RNA nuclear export. All of the deletion mutants analysed displayed the same pattern of distribution as observed for wild type HDV genomic RNA. However, we noticed a significant reduction in the number of cells displaying cytoplasmic staining when HDV RNA deletion mutants without the sequences comprising nucleotides 1211 to 1487 and 476 to 512 were analysed. Quantification of CAT protein expression after transfection with pDM138 vectors coding for different parts of genomic HDV RNA showed the presence of three sequences in the virus genome capable of enhancing CAT protein expression above the background level detected in cells transfected with empty plasmid pDM138. Two of the sequences tested (nt 1191-1414 and 415-613) partially overlap the regions identified in genomic HDV RNA by deletion analysis that cause a reduction in the percentage of cells displaying cytoplasmic staining for virus RNA. Taking together, these studies suggest that HDV genome possibly contains more than one nuclear export signal and the efficiency of HDV RNA nuclear export may be related to the number of export signals present in virus genome. Using the same approach to search for export motifs in the virus antigenome we found that antigenomic HDV RNA contains a cis element, localised between nucleotides 1263 and 1466 that is functionally equivalent to HBV PRE. The activity of the HDV antigenome export signal seems to be orientation-dependent and may rely on CRM1 function. We also showed, that the increment in expression of the reporter protein induced by the sequence comprising nt 1263 to 1466 of antigenomic HDV RNA results from nuclear export and cytoplasmic accumulation of reporter mRNAs that carry the ORF of the reporter protein within the intron.The experiments described above were conducted in the absence of viral replication and the consequent accumulation of HDAg, implying that delta antigens are not necessary for the transport of antigenomic HDV RNA from the nucleus to the cytoplasm. The functional analysis of the identified transport element in transport of HDV antigenome to the cytoplasm was performed by comparing the intracellular distribution of antigenomic HDV RNA with or without the nuclear export signal, by qRT-PCR experiments. We observed, a 60% reduction in the proportion of RNA detected in the cytoplasm relative to the amount of antigenomic HDV RNA in the nuclear fractions of Huh7 cells transfected with a construct that expresses HDV antigenome without the export element. These results show that the sequence between nucleotides 1263 and 1466 interferes with intracellular distribution of HDV antigenome. Additionally, using an identical approach we demonstrated that genomic and antigenomic HDV RNA in the absence of virus replication are exported at similar amounts to the cytoplasm. The strategy adopted for identification of the amino acid sequence in HDAg necessary for nuclear import consisted in expression of different portions of HDAg cDNA fused in frame with the coding sequence for c-myc-PK protein, which untagged to a functional NLS localises solely in the cytoplasm. After the identification and characterization of the minimal amino acid sequence in the delta antigen capable of promoting nuclear import of c-myc-PK we analysed the functional importance of the NLS identified here in the intracellular localization of the native HDAg. We obtained strong evidence that nuclear import of HDAg is directed by a 10-amino acid NLS (EGAPPAKRAR), located in positions 66-75. This sequence corresponds to the first amino acid stretch, differing only in the presence of an additional glutamic acid residue, of a bipartite NLS previously identified in HDAg and considered to be essential for nuclear localization of a reporter protein. We also demonstrated that HDAg NLS Is not specific for hepatic cells. The affinity chromatography experiments followed by mass spectrometry performed in order to identify the cellular proteins that interact with the HDAg NLS did not allowed to elucidate the mechanism of HDAg nuclear import. However, the identification of cytoskeleton binding proteins as HDAg NLS interacting partners may indicate the involvement of this structure in the mechanism of HDAg and HDV RNPs nuclear import.

A encefalopatia hepática é uma síndrome neuropsiquiátrica decorrente de distúrbios cerebrais induzidos por doenças do fígado. A encefalopatia hepática crónica é associada com a cirrose e é caracterizada por uma fibrose progressiva do parênquima do fígado, o que conduz à hipertensão portal e à deterioração da função do fígado. A alteração na síntese e secreção de ácidos e de outros componentes biliares contribui para a disbiose intestinal, a qual, juntamente com a hipertensão portal, altera a permeabilidade intestinal e, consequentemente, promove a translocação bacterial. A hipertensão portal, em associação com um comprometido processo de detoxificação, permite que toxinas, entre as quais amónia, passem para a circulação sistémica. O aumento de amónia em circulação, denominado hiperamonémia, é uma das principais características da encefalopatia hepática. Os probióticos surgem assim como uma possível forma de tratamento para a encefalopatia hepática, uma vez que estes previnem a translocação bacterial e reduzem a produção e consequente absorção de amónia. A encefalopatia hepática é também acompanhada por um défice cerebral de creatina e, assim, a suplementação oral com creatina emerge também como um potencial tratamento. Esta tese é baseada em estudos preliminares para avaliar o papel do VSL#3®, um cocktail probiótico, e da suplementação oral com creatina na neuroprotecção, em ratos com o ducto colédoco obstruído, um modelo de doença do fígado crónica. Para isso, a técnica de espectroscopia de protões por ressonância magnética foi utilizada, permitindo a análise do metabolismo cerebral, dado que a encefalopatia hepática induz alterações na osmorregulação, neurotransmissão e metabolismos antioxidante e energético cerebrais. Os nossos resultados foram promissores, demonstrando a viabilidade dos estudos e permitindo-nos melhorar o protocolo experimental para estudos futuros.