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Objetivo: Avaliar os efeitos moduladores e antioxidantes da ergotioneína (ERT) sobre vias de sinalização redox em camundongos falcêmicos. Materiais e métodos: Camundongos transgênicos para Anemia Falciforme (AF) foram gerados e mantidos na CEMIB/UNICAMP. Avaliou-se 3 grupos de camundongos humanizados: o controle, constituído de animais transgênicos para S+Fetal (SF); animais transgênicos para AF (SS) e transgênicos tratados com ERT (SS+ERT; VO 35 mg/kg), durante 60 dias. Os animais foram eutanasiados por aprofundamento da anestesia (CEUA 5955-1/2022) e a medula óssea foi utilizada para análise de RT-qPCR, em pseudo quintuplicatas, de membros de vias de sinalização centrais da biologia redox (ATF4, NFE2L2, FoxO3, CAT, SOD1, GPx1, PRDX1, TRX, TXNIP), do transportador específico de ERT (SLC22A4); e de um fator de iniciação da tradução eucariótica (EIF2α). O fold change do nível de mRNA foi calculado usando a fórmula 2-ΔΔCT. Para as análises estatísticas, adotou-se o General Linear Model, no formato one-way ANOVA, seguido pelo teste post hoc de Bonferroni. Resultados: No grupo SS foi observado uma indução dos fatores de transcrição NFE2L2 (̃9 vezes), FoxO3 (̃3 vezes) e das enzimas antioxidantes CAT (̃4 vezes) e GPX1 (̃6 vezes), enquanto para ATF4, TRX, SOD1 e PRDX1 houve uma inibição em relação ao grupo SF. Já no grupo SS+ERT observou-se uma expressão aumentada de ATF4 (̃2 vezes), TXNIP (̃6 vezes), CAT (̃8,5 vezes), SOD1 (̃1,2 vezes) e GPX1 (̃3,5 vezes), enquanto os níveis de NFE2L2, TRX1, PRDX1 se mantiveram similares ao controle. Interessantemente, houve uma indução da expressão do SLC22A4, tanto no grupo SS (̃7 vezes) quanto SS+ERT (̃13 vezes). Em relação ao EIF2α, sua expressão foi inibida nos SS e manteve-se similar ao controle em SS+ERT. Discussão: A AF é caracterizada pela geração incessante de espécies reativas de oxigênio, o que compromete a capacidade antioxidante das células eritroides. Assim, a fim de atenuá-lo, o mecanismo de resposta redox pode ocorrer de duas formas, pelo controle da atividade enzimática ou em nível transcricional, foco deste estudo, ao induzir as vias de sinalização redox e, consequente, aumentando síntese dos antioxidantes em situações de distresse oxidativo. Esta última, observada no grupo SS, como demonstrado pelos transcritos avaliados. No grupo SS+ERT, como esperado, a suplementação com ERT apresentou uma ação citoprotetora in vivo ao modular vias de adaptação redox. Resultados este que corroboram, nosso estudo prévio in vitro, em células K562 induzidas à diferenciação eritroide e submetidas a estresse oxidativo. Ainda, os altos níveis de SLC22A4 tanto nos SS quanto nos SS+ERT, demonstra que esse antioxidante é altamente acumulado em células hematopoiéticas. Ressaltando que a maior expressão desse transportador nos SS tratados sugere uma maior internalização da ERT após sua prolongada administração, reforçando seu papel crítico durante a hematopoiese. Atuação que é corroborada pela elevação de ATF4 e TXNIP que vem sendo propostos como novos reguladores da proliferação e diferenciação eritroide. Por fim, a análise da expressão de EIF2α, possibilita a proposição que os padrões observados em nível gênico se manteriam em nível proteico. Conclusão: ERT é um modulador com espectro ainda mais amplo do que o previamente disposto na literatura, atuando em vias essenciais para homeostasia redox e eritropoiese.

Objetivo: Avaliar a associação de polimorfismos de base única (SNPs) do sistema endocanabinoide (ECS) com o subfenótipo de acidente vascular encefálico (AVE) em pacientes com anemia falciforme (AF). Materiais e métodos: O grupo amostral foi composto por 217 pacientes com AF, provenientes da Fundação de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco (Hemope, PE), subdivididos em: (1) 73 com AVE (mediana do desenvolvimento de AVE de 8 anos [1-58 anos]) e (2) 144 pacientes como grupo controle, sem AVE (mediana de 29 anos [18-65 anos]). O fenótipo da AF foi diagnosticado por HPLC e confirmado por PCR-RE, e mutação da -α3,7kb talassemia foi detectada por GAP-PCR. Com base no impacto funcional e nas frequências alélicas mínimas (MAF) > 10%, selecionamos quatro SNPs do ECS que poderiam estar relacionados com o AVE na AF (FAAH rs324420, MAGL rs604300, CNR1 rs7766029 e CNR2 rs35761398) e a genotipagem foi realizada com ensaios TaqMan no PCR em Tempo Real, QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific). Resultados: Os dados de gênero, hemoglobina total (Hb), contagem de reticulócitos, bilirrubina indireta, desidrogenase láctica, quantidade de crise vaso oclusivas (VOCs)/ano e o genótipo para -α3,7kb-talassemia não foram associados ao AVE, enquanto níveis mais baixos de Hb F (%) foram associados ao desenvolvimento de AVE (AVE, Hb F 5 ± 3,3 vs. grupo de controle, Hb F 9,6 ± 5,6, p < 0,0001). Em relação aos SNPs, todos encontraram-se dentro do Equilíbrio de Hardy Weinberg (p > 0,05), e o modelo de herança adotado foi o de dominância para o MAGL rs604300 e sobredominância para os demais. As frequências alélicas e genotípicas não diferiram estatisticamente entre os grupos, bem como a distribuição dos alelos não diferiu do MAF para a população adotada (NCBI's ALFA dataset, Latin America 1). Os modelos de regressão logística binária, ajustados para a Hb F como covariável, não demonstraram associação entre os SNPs e o desenvolvimento de AVE. Discussão: O AVE é um subfenótipo da AF relacionado à hemólise, à disfunção endotelial e à lesão vascular. No âmbito do ECS, estudos com modelos animais de AVE isquêmico já demonstraram a ação neuroprotetora do antagonismo de receptores CB1, codificados pelo gene CNR1, e do agonismo de receptores CB2 (CNR2), estes últimos ainda relacionados à neurogênese pós AVE. Portanto, ainda que nossos dados tenham revelado que os SNPs analisados não são bons preditores para o AVE, existem evidências crescentes para considerar estes genes como candidatos na modulação desse e de outros subfenótipos da AF. Além disso, nosso estudo fornece pela primeira vez um modelo de herança para os SNPs do ECS na AF e sua caraterização em uma coorte brasileira. O modelo de herança de um SNP pode ser vital para desvendar as características genéticas de doenças complexas, como a AF, e associar fenótipos da doença a genótipos específicos. Conclusão: Fornecemos aqui a primeira associação de SNPs do ECS com o subfenótipo da AVE na AF. Considerando os recentes avanços no sentido da utilização de canabinoides nessa e em diversas outras doenças, nossos resultados também abrem caminho para futuros estudos de caraterização dos polimorfismos genéticos do ECS nesta população.

Objetivo: Demonstrar os efeitos protetores da melatonina (MEL) no controle do estresse oxidativo em modelo de camundongos transgênicos para anemia falciforme (AF). Materiais e métodos: Os camundongos foram gerados e mantidos no CEMIB/UNICAMP e divididos em três grupos: grupo controle constituído pelos animais S+Fetal (SF); animais transgênicos não tratados (SS); e animais transgênicos tratados com MEL (SS+MEL; VO 10 mg/kg) por 60 dias. Os animais foram eutanasiados por aprofundamento da anestesia (CEUA 5955-1/2022) e a medula óssea foi utilizada para análise de RT-qPCR, em pseudo quintuplicatas, de importantes genes de vias redox, tais como: NRF2, FOXO3, MST1, YWHAQ (14-3-3z), CAT, SOD1, GPX1, PRX1, TRX1 e TXNIP. A quantificação dos resultados se baseou na derivação da fórmula 2-ΔΔCT. As análises estatísticas foram realizadas pelo General Linear Model, no formato one-way ANOVA, seguido pelo teste post hoc de Bonferroni. Resultados: Os resultados demonstraram que a expressão do NRF2 (̃3 vezes), FOXO3 (̃3 vezes) e MST1 (̃6 vezes) foram induzidas nos SS, resultado este não observado nos SS+MEL; além disso, o YWHAQ foi induzido no SS+MEL (̃2 vezes) e se manteve similar ao controle no SS. Já para via TRX1/TXNIP, para os SS+MEL, a TRX1 se manteve similar ao SF e a TXNIP foi inibida (̃3 vezes), enquanto para os SS ocorreu uma inibição da TRX1 (̃3 vezes) e os níveis de TXNIP se mantiveram similares ao controle. Em relação aos genes que codificam antioxidantes, CAT e GPX1 foram induzidas 4 e 8 vezes, respectivamente, nos SS; porém, não quando sob tratamento com MEL. Já a SOD1 e PRX1 foram mantidos similares aos SF nos SS+MEL e inibidos nos SS. Discussão: Vários mecanismos moleculares têm sido propostos como contribuintes para uma elevada taxa oxidativa em pessoas com AF. Intermediários da homeostase redox não são apenas marcadores potenciais da gravidade da doença, mas também alvos importantes para terapias antioxidantes. Nossos resultados evidenciaram a atuação essencial dos fatores de transcrição NRF2 e FOXO3, em resposta ao distresse oxidativo característico da doença, como observado nos camundongos SS através da indução de seus transcritos associada a de genes sob seu controle, como das enzimas CAT e GPX1. Por outro lado, observamos uma restauração dos níveis de transcritos semelhante ao controle no grupo tratado com MEL. Já foi demonstrado que a MEL pode eliminar até dez espécies radicalares antes que o metabólito final seja eliminado do corpo, o que resulta em um efeito antioxidante em cascata. Esses resultados sugerem a noção de que a MEL atuou diretamente na detoxificação das espécies reativas no modelo usado, não sendo necessária a ativação das vias de sinalização redox. Além disso, alguns antioxidantes, como TRX, PRX1 e SOD1, que desempenham diversas outras funções celulares e são atualmente sugeridos como possíveis fatores de transcrição, foram mantidos com níveis de transcritos similares ao controle, demonstrando assim a modulação da MEL sobre genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo e outros processos celulares. Conclusão: A suplementação de camundongos transgênicos com MEL evidenciou o uso promissor dessa indolamina como estratégia terapêutica antioxidante na AF por meio da restauração dos níveis de transcritos de importantes genes envolvidos na manutenção redox para valores semelhantes ao grupo controle.

Objetivo: Relatar um estudo de caso de uma hemoglobina (Hb) rara denominada Hb I-Interlaken, a qual foi recebido e diagnosticado pelo Laboratório de Genética e Biologia Molecular da UFMS/CPTL. Materiais e métodos: Amostra de sangue de uma paciente do sexo feminino de 64 anos de idade, procedente de Campinas/SP, foi encaminhada para Laboratório de Genética e Biologia Molecular (UFMS/CPTL) para análise laboratorial de perfil hemoglobínico inconclusivo, juntamente com exames hematológicos complementares. Para determinar as frações hemoglobínicas da paciente, a amostra foi submetida à Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC-Premier Resolution, Trinity Biotech). Para confirmação molecular do genótipo, os genes da α-globina (HBA2 e HBA1) foram amplificados por PCR-Touchdown e sequenciados pelo método de Sanger (sequenciador 3730xl DNA Analyzer, Thermo Fisher Scientific). Resultados: Após análises por HPLC, o perfil cromatográfico da paciente apresentou Hb A (67,9%), Hb A2 (2,0%) e Hb variante (22,2%) com o tempo de retenção relativo (RRT) a Hb A de 0,84 (RRT/A = 0,84). O sequenciamento completo do gene HBA2 não demonstrou presença de mutações para Hb variantes, enquanto o sequenciamento do gene HBA1 demonstrou a presença da mutação HBA1:c.47G>A em heterozigose, correspondente à Hb I-Interlaken (genótipo αα/ααI-Interlaken). Em relação aos dados hematológicos, os seguintes parâmetros foram observados: Eritrócitos de 4,27 milhões/mm3, Hb de 13,3 g/dL, Hct de 39,7%, VCM de 93 fl, HCM de 31,2 pg, CHCM de 33,5 g/dL e RDW de 13,3 %. Discussão: A Hb I-Interlaken (também conhecida como Hb J Oxford) corresponde a uma Hb α-variante rara, caracterizada por uma substituição de glicina na posição 15 da cadeia α por um ácido aspártico (GlyAsp), e ocorre principalmente entre os indivíduos descendentes de ingleses e italianos. Relatamos aqui o segundo caso dessa Hb no Brasil, sendo seu primeiro relato curiosamente também em paciente proveniente de Campinas/SP, demonstrando o efeito da imigração europeia e da miscigenação na composição gênica dessa população. Apesar da alteração estrutural na proteína final, a Hb Interlaken não apresenta alterações funcionais, sendo estável e possuindo afinidade normal pelo oxigênio; portanto, seus portadores não apresentam manifestações clínicas, com parâmetros hematológicos dentro dos valores de referência. No entanto, mesmo assintomática, a detecção dessa e de outras variantes raras de Hb é imprescindível para a determinação de sua incidência e para o entendimento do fluxo dessas mutações na população brasileira. Além disso, a combinação de Hb α-variantes com outras mutações estruturais ou talassemias pode resultar em fenótipos clinicamente relevantes, realçando a importância da identificação dessas Hb. Nesse sentido, a associação de diferentes metodologias laboratoriais, como análises cromatográficas e moleculares, permite a detecção correta de Hb raras. Conclusão: A Hb I-Interlaken é uma Hb α-variante rara e tem pouco significado clínico. A presença de Hb anormais podem refletir o grau de miscigenação no Brasil e evidenciam a importância do estabelecimento de padrões e estratégias cromatográficas e moleculares para análises das amostras de Hb da população, além de desenvolver estudos com métodos combinados visando um diagnóstico preciso.

Objetivo: Avaliar a dinâmica do metabolismo redox, ao longo do tempo, comparando eritrócitos falcêmicos e saudáveis, em um modelo de autoincubação celular prolongada; considerando o impacto sobre marcadores de hemólise e lesões oxidativas. Materiais e métodos: O estudo envolveu 12 brasileiros consentidos (19-42 anos), não aparentados e independente do sexo, dentre os quais, seis não apresentavam hemoglobinopatia (grupo controle - CG) e os demais possuíam anemia falciforme (grupo de estudo – AF). As amostras de sangue foram devidamente coletas e processadas, obtendo ao final, os eritrócitos lavados, os quais foram suspensos no seu próprio plasma na concentração celular de 40% (v/v) e submetidos a seis horas de incubação à 37°C, com dois períodos de análise (t0h e t6h). Ao final de cada período, a fragilidade osmótica, os níveis de hemoglobina livre [Hb livre (μM)] e atividade de enzimas antioxidantes, incluindo catalase [CAT (U/L)], glutationa peroxidase [GPx (U/mL)], glutationa redutase [GR (U/mL)], metahemoglobina redutase [metaHb-redutase (U/mL)] e tiorredoxina redutase [TrxR (U/mL)] foram avaliados por espectrofotometria. Ademais, a proporção de colesterol [Ch (nM)] para colesterol-aldeído [ChAld (uM)] foi analisada, como marcador de lesão oxidativa, utilizando HPLC-UV e HPLC-FD, respectivamente. Comparou-se os grupos celulares e os períodos de incubação isoladamente e em seguida a interação deles. Resultados: Na comparação entre os grupos, os eritrócitos falcêmicos apresentaram resistência osmótica na concentração de 5 g/L de NaCl, aumento de 33,8% nos níveis de Hb livre [AF:1,72 ± 0,30; p < 0,01], redução de 22,8% e 27,4% na atividade das enzimas CAT [AF:15,39 ± 4,02; p < 0,05] e GPx [AF: 2,91 ± 0,74; p < 0,01], respectivamente. Ademais, houve o aumento de 31,5% na atividade da metaHb-redutase [AF:3,75 ± 0,90; p < 0,01] e acúmulo de 22,5% de produtos oxidativos da membrana celular [AF: 2,45 ± 0,17; p < 0,01] nos eritrócitos falcêmicos. Entretanto, não houve interação significativa entre os grupos e o período de incubação, quanto as enzimas CAT (p = 0,93), GPx (p = 0,59), GR (p = 0,69), TrxR (p = 0,34), metaHb-redutase (p = 0,53), assim como nos níveis de Hb livre (p = 0,58) e na proporção ChAld/Ch (p = 0,12). Discussão: A estrutura e a bioquímica da hemoglobina S induzem um estado hiperoxidativo nos eritrócitos falcêmicos. Isso leva ao consumo de enzimas antioxidantes, danos oxidativos na membrana celular e aumento da hemólise, evidenciado na comparação entre os grupos CG e AF, desconsiderando o tempo. Entretanto, ao longo da incubação, houve um prejuízo semelhante das enzimas antioxidantes e um grau equivalente de lesão oxidativa nos grupos estudados, demonstrando que apesar das condições oxidativas distintas a que são submetidos, ambos os grupos eritrocíticos mantiveram uma dinâmica de metabolismo redox similar ao longo do tempo testado, fornecendo subsídio argumentativo para pesquisas futuras focadas na análise das características metabólicas dessas células durante a eritropoiese, a fim de averiguar a adaptabilidade celular nos precursores eritrocitários e possíveis alvos terapêuticos. Conclusão: A curiosa semelhança na dinâmica do metabolismo redox de eritrócitos falcêmicos e saudáveis sugere que os primeiros apresentam alta adaptabilidade celular em seus precursores, possibilitando respostas redox semelhantes aos saudáveis no período testado.

Objetivo: Demonstrar o impacto da alfa-talassemia em um caso heterozigoto de hemoglobina (Hb) variante Hope como auxílio de diagnóstico. Materiais e métodos: Amostra de sangue total de uma paciente do sexo feminino (20 anos) proveniente do Instituto de Pesquisas, Ensino e Diagnósticos da APAE (IPED-APAE) de Campo Grande/MS, foi recebida no Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LGBM) para diagnóstico confirmatório de hemoglobinopatias. Em seu hemograma constava Hb (11,1 g/dL), VCM (72.5 fl), HCM (22.6 pg), CHCM (31.1 %) e RDW (13.7 %). Com base nos dados, foram realizadas análises eletroforéticas de Hb em pH alcalino e ácido, cromatográficas (HPLC de troca iônica, Premier Resolution, Trinity Biotech) e moleculares (GAP-PCR e sequenciamento de DNA por método de Sanger, sequenciador 3730xl DNA Analyzer, Thermo Fisher Scientific). Resultados: Na corrida de eletroforese alcalina, a Hb variante migrou anodicamente para a posição da Hb A e, na eletroforese ácida, na posição da Hb F. O perfil cromatográfico indicou a presença de Hb A (49,9%, RRT/A 0.99), Hb A2 (3,7%, RRT/A2 1.00) e uma fração globínica de 30,0% eluindo no tempo de retenção da Hb F (RRT/F 0.99). A associação das análises eletroforéticas e cromatográficas, bem como informações do hemograma, orientaram a investigação molecular de Hb beta(β)-variante com coerança de alfa(α)-talassemia. A GAP-PCR detectou a mutação delecional de α-talassemia (-α3.7kb) em homozigose, e o sequenciamento do gene da β-globina (HBB) identificou a mutação de ponto HBB:c.410G>A em heterozigose, compatível com a Hb Hope. Discussão: O conjunto dos resultados possibilitou o diagnóstico de heterozigoto para Hb Hope (Hb A/Hb Hope) e homozigoto para -α3.7kb -talassemia (-α3.7kb/-α3.7kb). Hb β-variantes com carga global mais positiva do que a Hb A, como a Hb S, Hb C e Hb D-Los Angeles, formam menos dímeros (globinas-β mutante com globinas-α) do que a Hb A e, por isso, apresenta menores concentrações quando analisadas, por exemplo, por HPLC. Na presença de α-talassemia, a menor disponibilidade de globinas-α impacta ainda mais na formação dessas Hb β-variantes (atingindo 20-30%), onde a menor atração eletrostática das globinas-β variantes se torna uma etapa limitante na competição entre cadeias para a formação dos dímeros. Este pode ser um indicativo de α-talassemia na ausência de análises moleculares, sendo proporcional ao número de mutações de α-talassemia herdadas. No referido caso, era de esperar, como na maioria dos casos, a diminuição da concentração da Hb variante devido a coerança de alfa talassemia. Entretanto, a Hb Hope é uma variante de cadeia β [(G>A) β136 Gly>Asp] carregada negativamente e sua concentração em heterozigose, sem α-talassemia, é de 30 a 40%. O indivíduo apresentou Hb de 30,0%, mesmo em homozigose para α-talassemia e não houve diminuição da concentração da Hb Hope devido a relação à carga das globinas-β Hope, próxima das globinas-βA. Conclusão: Conhecer os princípios teórico-práticos, desde o comportamento das globinas com suas interações até as associações dos métodos laboratoriais para identificação e determinação genotípica, garantem a compreensão e diagnóstico preciso das hemoglobinopatias. Levando posteriormente a um aconselhamento genético adequado e condizente. Além disso, o estudo dessas interações amplia o conhecimento sobre a fisiopatologia de hemoglobinopatias complexas, como a α-talassemia.

Objetivo: : Descrever o perfil cromatográfico de recém-nascidos (RN) com hemoglobinas (Hb) alfa variante como direcionamento de diagnóstico para as hemoglobinopatias. Materiais e métodos: : Oito amostras de sangue total de RN com idades entre 0 e 3 meses, provenientes da APAE/IPED-Campo Grande/MS, foram enviadas ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular da UFMS/CPTL para confirmação de Hb variante inconclusiva. O perfil cromatográfico dos RN foi obtido por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (Ultra2 , Trinity Biotech , Kit Resolution ). Para os estudos moleculares, após a extração de DNA genômico, foram realizados protocolos de PCR para amplificação dos genes HBA1 e HBA2 e sequenciamento pelo método de Sanger. Resultados: As análises cromatográficas de quatro RN: Hb Hasharon (n = 2), Hb Chapel Hill (n = 1) e Hb Stanleyville II (n = 1) apresentaram Hb F (48 ±5,8%); Hb A (24 ±7,3%), fração híbrida (10,8 ±6,6%) e Hb variante (7,9 ±1,9%). Por outro lado, as outras quatro amostras de RN: Hb Stanleyville II (n = 2) e Hb Hasharon (n = 2), apresentaram F (31,6 ± 21,6%), Hb A (46,8 ±10,6%), onde fração híbrida eluiu no tempo da Hb A, e Hb alfa variante (14,5 ± 8,3%). O sequenciamento dos genes HBA2 e HBA1 confirmaram as mutações correspondentes as Hb alfa variantes em heterozigose diagnosticadas, Hb Hasharon (HBA2 :c.142G>C), Hb Stanleyville II (HBA2 :c.237C>A) e Hb Chapel-Hill (HBA1 :c.224A>G). Discussão: As Hb alfa variantes em RN resultam, além do pico no HPLC correspondente a Hb alfa variante (cadeias alfa mutantes com beta normais), na formação das frações híbridas que são correspondentes à associação das cadeias alfa mutantes com as gama normais. Tais frações são importantes no direcionamento de diagnóstico de Hb alfa variantes em RN, o que não ocorre nas Hb beta variantes. Cada Hb alfa variante terá suas respectivas frações híbridas eluindo em tempo de retenção específicos, às vezes, próximas às Hb normais, como a Hb A. Dessa forma, observamos que no cromatograma haverá quatro picos característicos, exceto quando há sobreposição da fração híbrida com Hb A. Conclusão: A compreensão e identificação precisa do perfil cromatográfico das Hb alfa variantes e suas frações híbridas, garantem um direcionamento de diagnóstico adequado o que permite a combinação de metodologias laboratoriais para confirmação diagnóstica em recém-nascido.

Objetivo: Investigar a associação de polimorfismos de base única (SNPs) nos genes ACE2 e CNR2 e a severidade da infecção pelo vírus SARS-CoV-2. Materiais e métodos: Pacientes diagnosticados com COVID-19 por RT-qPCR (n = 469) foram triados no Laboratório de Doenças Infecciosas e Parasitárias (LABDIP/UFMS) quanto à gravidade clínica da infecção entre casos leves (sem necessidade de hospitalização) ou graves (com a necessidade de hospitalização e suplementação de O2). Amostras de sangue total foram coletadas e enviadas ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LGBM/UFMS). O DNA genômico foi extraído (PureLink Genomic DNA Mini Kit) e as amostras foram genotipadas para os polimorfismos ACE2 rs2285666 (C>T) e CNR2 rs35761398 (TT>CC) via TaqMan Genotyping SNP Assays em qPCR (QuantStudio5, Thermo Fisher Scientific). Foram realizados modelos ajustados de regressão logística binomial, com cálculo de razão de probabilidades (OR) e intervalo de confiança para 95% dos dados (p < 0,05). Resultados: Para o SNP ACE2 rs2285666 , os indivíduos foram clinicamente classificados em leves (n = 245) e graves (n = 224), e os fatores associados ao risco aumentado da forma grave de COVID-19 foram: gênero masculino [OR = 2,99 (1,96–4,57)], idade ≥ 60 anos [OR = 4,43(2,32–8,44)] e apresentar comorbidades [OR = 4,40(2,87–6,74)]. Em mulheres, o risco maior de COVID-19 severa foi associado ao polimorfismo de ACE2 em homozigose para o alelo mutante [TT = 7,1%; OR = 2,97(1,02–8,62)], e em homens (hemizigotos), o maior risco foi também associado ao alelo mutante [T = 29,9%; OR = 2,37(1,18–4,75)]. Já para o SNP CNR2 rs35761398 , obteve-se maior frequência em casos leves (n = 235) comparativamente aos graves (n = 203), de modo que os fatores idade ≥ 60 anos [OR = 1,06(1,04–1,08)], ser do gênero masculino [OR = 3,17(1,99–5,03)] e a presença de comorbidades [OR = 3,52(2,20–5,64)], foram também associados à maior severidade. A presença do alelo mutante desse SNP em heterozigose (TT-CC) demonstrou ter efeito protetivo à forma grave da doença [TT-CC; OR = 0,35(0,19–0,64)]. Discussão: A Enzima Conversora de Angiotensina-2 (ECA2), codificada pelo gene ACE2 , é responsável pela internalização do SARS-CoV-2 nas células hospedeiras. O SNP rs2285666 está localizado no início do íntron 3 deste gene, no cromossomo X, possivelmente responsável por aumentar sua expressão. Portanto, o risco aumentado de desenvolver o fenótipo grave da COVID-19 estaria associado aos portadores do alelo mutante devido ao aumento da ECA2 nas células hospedeiras, potencializando a carga viral. Já o SNP rs35761398 é caracterizado por uma mutação missense no códon 63 do gene CNR2, sendo o receptor mutante (CB2-R63) menos funcional e, portanto, associado a uma resposta imune desbalanceada ao inibir a proliferação de linfócitos. Indivíduos heterozigotos poderiam, possivelmente, manter a expressão equilibrada dos receptores CB2 Q63/R63, garantindo uma resposta imune balanceada e um menor risco de desenvolver a forma grave da doença em até 2 vezes. Conclusão: A presença do SNP rs2285666 no gene ACE2 em homozigose (mulheres) ou hemizigose (homens) está relacionado com o aumento de chance, em até 3 vezes, no estabelecimento do quadro mais grave da COVID-19. Já a presença do SNP rs35761398 em heterozigose está associada a um risco reduzido, em aproximadamente 3 vezes, no desenvolvimento de quadros severos da infecção por SARS-CoV-2.

Objetivo: O estudo se refere ao relato de caso de uma criança com dupla heterozigose de beta talassemia, sendo portanto, o primeiro registro da interação entre as mutações HBB:c.48G>A (Códon 15) e HBB:c.137C>T (Códon 87). Materiais e métodos: Uma amostra de sangue total de um paciente com 12 anos proveniente do estado do Maranhão (MA) foi encaminhada ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LGBM - UFMS/CPTL), juntamente às informações do indivíduo e seu hemograma para uma confirmação de diagnóstico de hemoglobinopatias. A análise cromatográfica foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC), Trinity Biotech (Premier Resolution) e o DNA genômico foi extraído por fenol clorofórmio. A caracterização dos alelos mutantes para o gene HBB foi realizado por sequenciamento de DNA pelo método de Sanger e análise de Persistência Hereditária da Hemoglobina Fetal (PHHF) por PCR-Multiplex. Resultados: O hemograma do paciente evidenciou anemia hemolítica (reticulócitos = 166.300 mm3), microcítica (VCM = 62,5 fL) e hipocrômica (HCM = 20,60 pg), enquanto o resultado da cromatografia indicou Hb F (86,5%), Hb A (3,3%) e Hb A2 (2,7%), inicialmente levando à suspeita de heterozigose composta para beta talassemia e PHHF. Entretanto, a PCR-GAP não identificou mutações para PHHF. O sequenciamento demonstrou duas mutações, ambas em heterozigose, HBB:c.48G>A (Códon 15) e HBB:c.137C>T (Códon 87), ou seja, uma de Beta0 e uma de Beta+ talassemia, respectivamente. Discussão: Na presença de uma beta talassemia, a síntese da cadeia beta globina é reduzida (Beta+) ou ausente (Beta0), levando a formação de cadeias alfa globínicas em excesso, as quais são instáveis e precipitam nas membranas dos precursores eritróides e dos eritrócitos, ocasionando a eritropoiese ineficaz e a hemólise. Por isso, a anemia hemolítica, microcítica e hipocrômica detectada no hemograma indicou a existência desta hemoglobinopatia, a qual por apresentar uma ampla variedade de alterações genéticas, se faz essencial a realização do sequenciamento a fim da correta identificação da mutação no gene HBB. A PHHF foi investigada pela alta concentração de HbF para idade do investigado, porém não condizente com perfil do hemograma. Dessa forma, a amostra foi sequenciada e duas mutações foram detectadas sendo equivalentes a uma redução parcial e uma total da síntese das cadeias beta-globina. Ou seja, um dos alelos não sintetiza cadeia beta-globina, enquanto o outro produz em baixa concentração, explicando os níveis reduzidos de HbA. A elevação da HbF se trata de uma reação de compensação, em que o gene gama, localizado no cluster do gene HBB, é hiperexpresso para suprir a demanda da beta-globina deficiente. Conclusão: A associação de diversas metodologias de análises hematológicas e moleculares laboratoriais foi determinante para o diagnóstico preciso do paciente, dado que a beta talassemia apresenta vasta possibilidades de mutações, especialmente as de ponto. Além disso, a determinação acurada da hemoglobinopatia serve de base para o tratamento e cuidado adequado ao indivíduo, além de ser essencial para o responsável pelo aconselhamento genético à família e ao afetado.

Objectives: Evaluate the association of single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the endocannabinoid system (ECS) with the hemolytic and vasculopathy subphenotypes in sickle cell anemia (SCA) patients. Methodology: The study was performed with 297 SCA patients (median age 30 years, range 6 to 66 years, 171 males, 57.6%), enrolled and regularly followed in a reference center in northeast Brazil. Clinical and laboratory data were obtained from medical records. Patients were divided into subgroups according to clinical complications. The control group was patients without complications. Peripheral blood samples from all patients were collected, and genomic DNA was extracted using the phenol-chloroform protocol. The SCA genotype was confirmed with PCR followed by restriction analysis with Dde I, and alpha thalassemia (-α3.7kb) mutation was detected with GAP-PCR. MAGL (rs604300, A>G), FAAH (rs324430, C>A), CNR1 (rs7766029, T>C), and CNR2 (rs35761398, TT>CC) polymorphisms were genotyped using TaqMan assays. Results: Overall, 73 patients developed stroke (24.6%), 80 of the men presented priapism (46.8%), and 144 (48.5%) were assigned as the control group (for priapism, n = 58). Regarding clinical and laboratory data, gender, total hemoglobin (Hb), reticulocyte count, indirect bilirubin, and lactate dehydrogenase were not associated with clinical complications. Lower levels of Hb F (%) were associated with stroke (stroke, Hb F 5 ± 3.3% vs. control group, Hb F 9.6 ± 5.6, p < 0.0001), and the non-mutated genotype for -α3.7kb was associated with priapism (p < 0.0001). Due to a better fit of data, the overdominant model of inheritance was adopted for all SNPs. The TT-CC genotype for CNR2 SNP (33 [42.3%] in the priapism group and 31 [53.4%] in control) was independently associated with priapism, even when -α3.7kb was included as a confounder (OR = 0.386 [0.175 – 0.854], p = 0.019). No statistical association was found for the other SNPs analyzed. Discussion: SCA is an inherited disease characterized by the homozygous genotype of HBB:c.20 T>A mutation, which encodes Hb S. The main determinant of SCA severity is the Hb S polymerization level, leading to hemolysis, vasculopathy, vaso-occlusion, and an inflammatory state. In a quest for new insights into the pathophysiology and therapies in SCA, the ECS posts as a potential candidate once it demonstrates a significant role in several biochemical and physiological pathways of clinical interest. The receptor cannabinoid 2 (CB2), encoded by the CNR2 gene, is mainly expressed in immune cells and plays a crucial role in the regulation of the immune system. Activation of CB2 receptors exerts potent anti-inflammatory effects, reducing the production of pro-inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-1β and reducing leukocyte infiltration and migration, decreasing tissue damage and inflammation. In our study, the lower chance of developing priapism associated with the TT-CC genotype for CNR2 demonstrates a potential CB2 effect in regulating SCA complications by modulating inflammation. Conclusion: The genetic and biochemical basis of SCA complications still needs to be completed, and searching for new predictors is essential. Based on CB2 functions and our findings, this gene represents a potential candidate for modulating SCA pathophysiology. Now, it's important to find out how this modulation functionally occurs.

Objetivos: Realizar a caracterização de mutações de beta talassemia em pessoas com doença falciforme (Hb S/Beta-talassemia). Material e métodos: No período de cinco anos, 29 amostras de pessoas com diagnóstico molecular inconclusivo para a doença falciforme foram enviadas ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular da UFMS/CPTL. As análises laboratoriais consistiram em cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (Ultra 2 Kit Resolution, Trinity Biotech) e análises moleculares por PCR-AE, PCR-RE e sequenciamento do gene HBB pelo método de Sanger. Resultados: Das 29 amostras avaliadas, 14 mutações de beta talassemia foram detectadas e apresentadas da seguinte forma: 03 HBB:c.-151C>G com Hb S (40,2% ± 5,4) e Hb A (29,9% ±8,9); 04 HBB:c.118C>T com Hb S (51,4% ±20,9); 04 HBB:c.92+5G>A com Hb S (50,5% ±12,5) e Hb A (7,5% ±12,2); 01 HBB:c.75T>A com Hb S (60,6%) e Hb A (16,9%); 01 HBB:c.93-21G>A com Hb S (77,7%); 03 HBB:c.92+6T>C com Hb S (60,3 ± 3,8) e Hb A (22,6% ±5,4); 01 HBB:c.*110T>C com Hb S (59,5%); 05 HBB:c.-79A>G (-29>G) com Hb S (57,9% ± 4,3) e Hb A (14,3 ± 3,5); 01 HBB:c.93-2A>G com Hb S (64,9%); 01 HBB:c.316-7C>A com Hb S (48,9%) e Hb A (34,1%), 02 HBB:c.92+5G>C com Hb S (64,8% ±7); 01 HBB:c.315+1G>A com Hb S (72,8%); 01 HBB:c.-126C>T com Hb S (45,5%) e Hb A (34,7%); e 01 HBB:c.48G>A com Hb S (72,6%). Discussão: A beta talassemia é resultante da redução parcial ou inibição total da produção de globinas. A combinação da hemoglobina (Hb) S com beta talassemia gera uma condição de heterozigoto composto conhecida como Hb S/Beta talassemia, que pode ser classificada conforme a expressão das globinas em Hb S/Beta0-talassemia e Hb S/Beta+-talassemia. No primeiro caso, como não há produção de Hb A, a clínica é quase indistinguível da anemia falciforme, já na Hb S/Beta+-tal, como ainda há presença de Hb A, o fenótipo é mais brando. Dentre as mutações encontradas, 07 foram classificadas como Beta+-tal (HBB:c.92+5G>A, HBB:c.75T>A, HBB:c.93-21G>A, HBB:c.92+6T>C, HBB:c.*110T>C, HBB:c.-79A>G e HBB:c.92+5G>C), 04 Beta0-tal (HBB:c.118C>T, HBB:c.93-2A>G,HBB:c.315+1G>A e HBB:c.48G>A) e 03 Beta+ silenciosa (HBB:c.-151C>G, HBB:c.316-7C>A e HBB:c.-126C>T). A caracterização adequada das mutações de Hb S/Beta-tal é importante para direcionamento de conduta médica adequada, aconselhamento genético e estudos de prevalência nas populações. Conclusão: As Hb S/Beta talassemia resultam de diferentes mutações e geram uma variedade de fenótipos, podendo levar a quadros muito semelhantes a anemia falciforme. O rastreio e diagnóstico correto dessas mutações é essencial para ampliar o conhecimento e, consequentemente, melhorar o acompanhamento e tratamento.

Objetivos: Avaliar o efeito terapêutico da Hidroxicarbamida (HC) em pessoas com Anemia Falciforme (AF), cadastradas no Programa de Atenção à Pessoa com Doença Falciforme de Barreiras, Bahia, Brasil. Materiais e métodos: Tratou-se de um estudo longitudinal a partir de dados de acompanhamento clínico obtidos por meio de consulta aos prontuários de pessoas com AF, sob a supervisão da hematologista responsável, após a assinatura do termo de (CEP-FASB: CAAE 29075620.6.0000.5026). Inicialmente 10 pacientes com diagnóstico clínico e laboratorial para AF foram incluídos no estudo, porém ocorrem duas perdas de segmento por falta de dados laboratoriais após o uso de HC. Foram coletados dados de hemograma, transaminase oxalacética (TGO), transaminase pirúvica (TGP), ferritina, lactato desidrogenase (LDH), fosfatase alcalina, gama-glutamiltransferase (GGT), ureia, creatinina, bilirrubina direta e indireta e os valores das subfrações hemoglobínicas. Teste-t emparelhado ou teste de Wilcoxon Signed-Rank foram adotados para verificar o efeito da HC sobre os parâmetros avaliados. Resultados: Foi observado aumento significativo dos níveis de hemoglobina fetal (HbF) (p < 0,01) e diminuição do percentual da hemoglobina S (HbS) e da concentração de bilirrubina indireta (p < 0,03) após o uso de HC. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas nos demais parâmetros, porém, foi possível perceber um padrão de resposta desejado para o uso de HC, com aumento do hematócrito, e diminuição da concentração de ferritina. Discussão: Este estudo mostrou que os pacientes apresentaram diferenças consideráveis em alguns parâmetros bioquímicos após o tratamento com HC, como por exemplo, o aumento do percentual de HbF, que está de acordo com dados da literatura que correlacionam estes eventos com uma diminuição na frequência e gravidade das crises vaso-oclusivas dolorosas e outras complicações associadas à AF. Além disso, o estudou mostrou que houve a diminuição da concentração de bilirrubina indireta, associada por autores com a melhora dos quadros de icterícia decorrentes da AF. É importante salientar que esta pesquisa traz à luz os primeiros dados reportados sobre os efeitos da HC nessa população. Conclusão: Como esperado, o tratamento com HC culminou na melhora da expressão de marcadores do acompanhamento clínico de pessoas com AF do oeste baiano, destacando a importância de mais estudos nessa população amostral.

Objetivo: Determinar a influência do tratamento com Hidroxicarbamida (HC) em pessoas com anemia falciforme (AF) avaliando níveis de expressão de genes associados às vias de sinalização redox. Materiais e métodos: Foram analisadas 21 amostras de sangue total, acondicionados em tubos de EDTA, de indivíduos com idade entre 18-40 anos com AF – sendo 12 sob uso de HC e 9 não – em acompanhamento no programa de Doença Falciforme de Barreiras-BA, localizado no Centro de Saúde Leonídia Ayres (CAAE nº 29075620.6.0000.5026). O RNA foi extraído de reticulócitos utilizando TRI reagente. Os níveis de transcritos dos genes que codificam para os fatores de transcrição NRF2 e ATF4, seus moduladores (KEAP1, AKT e PI3K), bem como de importantes antioxidantes (SOD1, CAT, PRDX1 e GPX) foram avaliados por RT-qPCR. O gene Beta Actina foi utilizado como controle endógeno. Análises foram realizadas utilizando General Linear Models (GLM) no formato ANCOVA, com correção para idade e gênero, sendo p < 0,05 considerado estatisticamente significativo. Resultados: Os genes que codificam para AKT, PI3K e NRF2 mostraram-se hiperexpressos ̃10, 2 e 4x no grupo em uso de HC, respectivamente. Por outro lado, os genes que codificam para CAT e GPX1 mostraram-se hipoexpressos, ̃1,5x em ambos. Além disso, foi observado um padrão de indução ̃4x da expressão de KEAP1 no grupo sob uso de HC, e um padrão de redução para os genes PRDX1 e SOD1 nas amostras de indivíduos sem HC. Discussões: Dados in vitro, em modelos PBMC e HUVEC, sugerem que a HC elimina diretamente espécies reativas e induz a expressão de genes antioxidantes induzindo a via de sinalização do NRF2. Os dados deste estudo, in vivo, corroboram parcialmente os dados in vitro, uma vez que se observou modulação da expressão de genes da via, mas não se relacionando com aumento dos níveis de transcritos dos antioxidantes avaliados, sendo explicado pelos altos níveis de KEAP1. A hipótese é que os níveis de proteína codificada por este gene sejam semelhantes aos níveis de transcritos produzidos, afetando diretamente ativação da transcrição dos genes antioxidantes avaliados. Outra hipótese é que a regulação da via ocorra majoritariamente em momento anterior à eritropoiese. Conclusão: A homeostase redox é importante para a função e viabilidade celular. Por isso, há cada vez mais evidências da sua relação com mecanismos fisiopatológicos primários ou secundários da AF. Nesse sentido, os dados apresentados demonstram a influência da HC em vias centrais da homeostase redox e a importância da expansão da compreensão dos mecanismos envolvidos nessa resposta adaptativa. A relação deste medicamento sobre os mecanismos celulares de adaptação redox pode revelar resultados promissores na determinação do mecanismo de ação do HC alavancando preceitos fundamentais para futura implementação de antioxidantes como alternativas terapêuticas no tratamento da AF.

Objetivo: Avaliar a influência da alfa talassemia em portadores da hemoglobina S (Hb AS) e determinar as concentrações de hemoglobina S (Hb S) como suporte de diagnóstico laboratorial. Materiais e métodos: Foram encaminhadas 182 amostras de sangue total com suspeitas de traço falciforme, provenientes de doadores de sangue do Centro de Hematologia e Hemoterapia de Mato Grosso do Sul (HEMOSUL), ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular (UFMS/CPTL) para a confirmação de diagnóstico molecular. Os perfis cromatográficos foram obtidos por Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) - Ultra 2 Resolution e Premier Resolution (Trinity Biotech). As análises moleculares foram realizadas após extração do DNA genômico, seguido de PCR-RE (Hb S) e GAP-PCR (alfa talassemia). Para as análises estatísticas foram realizados testes de ANOVA com post hoc de Tukey, p < 0,05. Resultados: Dos 182 doadores avaliados, 139 indivíduos (76,4%) apresentaram o perfil Hb AS sem alfa talassemia e 43 (23,6%) apresentaram alfa talassemia, sendo 37 (86%) heterozigotos para mutação -α3.7 e 6 (14%) homozigotos para deleção -α3.7. A concentração da Hb S obtida no HPLC Premier e Ultra 2 em indivíduos Hb AS foi de 36,33 ±3,15% e 38,37 ±2,29%, respectivamente. Indivíduos Hb AS com alfa-talassemia em heterozigose apresentaram Hb S de 32,25 ± 3,58% (Premier) e 32,96 ± 2,94% (Ultra2). Nos indivíduos Hb AS com alfa-talassemia em homozigose a média de Hb S foi 27,86 ±3,18% (Premier) e 29,58 ±3,41% (Ultra2). Foi observado diferença significativa (p < 0,0001) em relação às concentrações médias de Hb S nos perfis encontrados, sendo menor para o perfil AS/homozigoto para alfa talassemia, independente dos equipamentos avaliados. Discussão: De acordo com os resultados apresentados podemos verificar que houve diminuição da concentração de Hb S nos indivíduos Hb AS com coerança de alfa talassemia. Tal diminuição é reflexo da característica das Hb beta-variantes, como a Hb S, mais carregada positivamente em comparação com a Hb A, e forma menos dímeros de Hb (globinas-beta com globinas-alfa), por isso, sua concentração é reduzida. Na presença de alfa-talassemia, a menor disponibilidade de globinas-alfa impacta ainda mais na formação de Hb beta-variante e este pode ser um indicativo de alfa-talassemia na ausência de análises moleculares. Logo, é importante estabelecer os valores de corte da Hb S em indivíduos com a presença e ausência da alfa talassemia para auxiliar no direcionamento de diagnóstico, principalmente, em diferentes modelos de HPLC disponíveis no mercado. Conclusão: Compreender a coerança de alfa talassemia em indivíduos com Hb AS é importante para auxiliar no diagnóstico laboratorial das hemoglobinopatias, principalmente, na ausência de análise molecular para alfa-talassemia, uma vez que com dados da análise cromatográfica foi possível estabelecer a concentração da Hb S para os diferentes tipos de indivíduos que foram avaliados neste estudo.

Objetivo: Descrever a importância do Sequenciamento de DNA para conclusão de diagnóstico de hemoglobinas (Hb) raras em recém-nascidos relatando o primeiro caso descrito no Brasil de Hb Basking Ridge. Materiais e métodos: Amostras de sangue total, procedente do centro de triagem neonatal, APAE/IPED- Campo Grande/MS, da probanda (22 dias) e da mãe (25 anos) foram enviadas para o Laboratório de Genética e Biologia Molecular da UFMS/CPTL afim de identificar perfis de Hb inconclusiva triadas na triagem neonatal. Os perfis cromatográficos foram avaliados por HPLC (Ultra2, Trinity Biotech, Kit Resolution) e o estudo molecular foi realizado, após a extração de DNA genômico, por sequenciamento do gene HBB (método Sanger - sequenciador 3730xl DNA analyser). Resultados: A análise cromatográfica da probanda evidenciou a presença de Hb F (71,3%), Hb A0 (14,4%), Hb A2 (0,2%) e uma variante com o Tempo de Retenção Relativo a Hb A (RRTA) de 0,99 (11,7%). A mãe apresentou Hb A0 (42,8%), Hb A2 (2%) e Hb variante com RRTA de 1,00 (32,4%). O sequenciamento completo do gene HBB demonstrou a presença da mutação HBB:c.250G>A em heterozigose, tanto na probanda quanto na mãe. A mutação no éxon 2 do gene HBB correspondente a Hb Basking Ridge. Discussão: De acordo com os dados relatados, nós sugerimos a presença de Hb variante de cadeia beta devido a concentração apresentada na amostra da mãe (Hb variante proporcional à Hb A) e ausência de pico híbrido na amostra do recém-nascido (pico híbrido = frações formadas por globinas alfa mutante com gama normal). Avaliando os exemplares de cromatografia presentes no manual do fabricante, o RRTA de 0,99 (probanda) e RRTA de 1,00 (mãe) foram compatíveis com as Hb variantes: Hb Calais e Hb La Desirade (ambas de cadeia beta). Descartando a possibilidade de Hb variante de cadeia alfa, realizamos o sequenciamento do gene HBB e identificamos a presença da Hb Basking Ridge, ou seja, o primeiro relato no Brasil desta Hb. Essa variante é resultante da substituição do aminoácido glicina (apolar) pela serina (polar não carregada) na posição 83; portanto sugere-se que alterações nas propriedades estruturais e/ou funcionais da hemoglobina possam estar presentes. No entanto, não há relatos na literatura que corroborem essa hipótese, até o presente momento. Conclusão: Os métodos de triagem neonatal para as hemoglobinopatias disponíveis atualmente são sensíveis e permitem a detecção de perfis de Hb anormais em diferentes combinações. Entretanto, a conclusão de diagnóstico só é possível perante a associação de técnicas laboratoriais e pessoal qualificado. Diante disso, a identificação da Hb Basking Ridge só foi possível pela alta sensibilidade do HPLC na triagem, conhecimento profissional sobre diagnóstico e a utilização do sequenciamento de DNA.

Objetivo: Relatar um estudo familial de um caso de coeranças de três mutações nos genes que expressam as cadeias alfa e beta da hemoglobina (Hb), o qual foi recebido e diagnosticado pelo Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LGBM) da UFMS/CPTL. Materiais e métodos: Amostra de sangue total de uma criança do sexo feminino de cinco meses, proveniente da APAE ‒ Salvador/BA, foi recebida com a suspeita de Hb beta-variante (Hb C) com beta talassemia. No hemograma constava RBC (4,92 milhões/mm3), Hb (8,69 g/dL), VCM (60 fl), HCM (17,65 pg), CHCM (29,54 g/dL) e RDW 16,5%). O solicitante informou, adicionalmente, que o probando possuía uma irmã de seis anos diagnosticada com Hb C/Beta talassemia. Com base nesses dados, a amostra do probando, bem como, a de ambos os genitores, foram submetidas a Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC), Trinity Biotech (Premier Resolution) e análises moleculares (PCR-RE, PCR-Multiplex e Sequenciamento de DNA por Sanger). Resultados: O perfil cromatográfico do probando indicou a presença de Hb variante com tempo de retenção relativo a Hb C em uma concentração (63%) distante dos valores esperados para heterozigose ou homozigose, acompanhada de uma elevada concentração de Hb A2 (4,8%) e de Hb F (24,6%) e baixa concentração de Hb A (3,9%), sugerindo a presença de beta-talassemia. A cromatografia da mãe apontou a presença de Hb variante compatível com Hb C em uma concentração (33,2%) similar à de um perfil heterozigoto, porém, mais baixa do que o esperado e, por isso, a suspeita de alfa-talassemia. O pai apresentou concentração de Hb A (87,2%) e elevada concentração de Hb A2 (5,8%). As análises moleculares dos genitores identificaram um alelo para a mutação HBB:c.19G>A (Hb C) para mãe e um alelo para a mutação HBB:c.92+5G>A (beta+ grave talassemia IVS-I-5) no pai. Ademais, as análises dos pais, bem como a baixa concentração da Hb C da mãe, foram confirmadas pela presença da mutação delecional -α3.7em heterozigose em ambos os genitores. Por fim, as análises moleculares do probando confirmaram a dupla heterozigose no gene HBB, formada pela presença de um alelo mutante para Hb C e de outro para talassemia beta+ grave IVS-I-5, e de alfa+ talassemia em homozigose. Discussão: Os resultados obtidos permitiram a conclusão do diagnóstico do probando como Hb C/Beta+ grave talassemia com alfa+ talassemia homozigota (βC/βtal e -α3.7/-α3.7), justificando assim as pequenas variações observadas no hemograma e a possível anemia microcítica e hipocrômica que a criança venha a desenvolver, haja vista que em casos de coerança de Hb beta variantes e beta+ talassemia grave, a redução quase total da síntese de cadeias beta normais leva ao aumento da concentração da Hb variante. Em contrapartida, a alfa talassemia reduz a síntese de cadeias alfa, resultando na concentração de Hb C abaixo do esperado para a heterozigose e melhora clínica de Hb C/Beta+ talassemia grave devido a diminuição de cadeias alfas livres. Conclusão: A frequência de casos complexos como o relatado, em que há a associação de Hb variante com talassemias ainda são subestimados, haja vista que a emissão de um diagnóstico confirmatório, como o descrito, só é possível mediante a combinação de metodologias laboratoriais, em específico as análises moleculares. Esses diagnósticos permitem o acompanhamento e tratamento clínico correto do paciente, além de uma orientação genética para os membros da família.

Introduction: Studies have shown that the loss of the FOXO3 transcriptional function is involved in the pathophysiology of some chronic erythroid disorders, including beta-thalassemia (β-thal). Therefore, the single nucleotide polymorphism (SNP) rs3800231 (35-2764A > G) could contribute to alterations in its transcriptional activity, acting as a modifier of β-thal phenotypic manifestations., Objective and Method: In order to better understand the genotypic and/or allelic distributions among β-thal patients, we evaluated 83 β-thal heterozygous and 20 homozygous, compared to 117 individuals without hemoglobinopathies (control group). Additionally, we verified any influence of the FOXO3 polymorphism on clinical manifestations among β-thal homozygotes., Results: We obtained higher frequencies of the wild-type homozygous (AA) and the wild-type allele (A) in the β-thal group (p < 0.0001 and p = 0.00014, respectively). The most common clinical manifestations found among β-thal homozygotes were iron overload (90%), splenomegaly (65%) and bone complications (35%), e.g., osteopenia/osteoporosis. We observed that close to 80% of the patients presenting such manifestations had the genotype AA. However, we did not find any significant involvement of the FOXO3 polymorphism in clinical manifestation occurrences., Conclusion: Thus, we concluded that the SNP rs3800231 did not play a significant role as a modifier of the clinical manifestations observed in the β-thal homozygotes studied., (Copyright © 2020 Associação Brasileira de Hematologia, Hemoterapia e Terapia Celular. Published by Elsevier España, S.L.U. All rights reserved.)

Hibernation is a natural condition of animals that lives in the temperate zone, although some tropical lizards also experience hibernation annually, such as the lizard native from South America, Salvator merianae, or "tegu" lizard. Even though physiological and metabolic characteristic associated with hibernation have been extensively studied, possible alterations in the red blood cells (RBC) integrity during this period remains unclear. Dehydration and fasting are natural consequences of hibernating for several months and it could be related to some cellular modifications. In this study, we investigated if the osmotic tolerance of RBCs of tegu lizard under hibernation is different from the cells obtained from animals while normal activity. Additionally, we indirectly investigated if the RBCs membrane of hibernating tegus could be associated with oxidation by quantifying oxidized biomolecules and the activity of antioxidant enzymes. Our findings suggest that RBCs are more fragile during the hibernation period, although we did not find evidence of an oxidative stress scenario associated with the accentuated fragility. Even though we did not exclude the possibility of oxidative damage during hibernation, we suggested that an increased RBCs volume as a consequence of hypoosmotic blood during hibernation could also affect RBCs integrity as noted.

The occurrence of pharmaceuticals in the aquatic environment has increased considerably in the last decades, causing negative biochemical, physiological, and behavioral effects in aquatic organisms. In this study, we evaluated the effects of methylphenidate (MPH) on the aggressive behavior, dopamine-related gene transcript levels, monoamine levels, and carboxylesterase transcript levels and activity in the brain of male Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Carboxylesterase activity was also measured in the liver and gills. Fish were exposed for 5 days to MPH at 20 and 100 ng L -1 . Fish exposed to 100 ng L -1 of MPH showed increased aggressiveness and decreased dopamine (DA) and serotonin (5-HT) levels. No changes were observed in plasma testosterone levels and in the transcript levels of D1 and D2 dopamine receptors, dopamine transporter (DAT), and carboxylesterase 2 (CES2). Exposure to 100 ng L -1 of MPH caused a decrease in the transcript levels of carboxylesterase 3 (CES3) and an increase in tyrosine hydroxylase (TH), while exposure to 20 ng L -1 of MPH increased the transcript levels of D5 dopamine receptor. Carboxylesterase activity was unchanged in the brain and liver and increased in the gills of fish exposed to 20 ng L -1 . These results indicate that MPH at 100 ng L -1 increases aggressiveness in Nile tilapia, possibly due to a decrease in 5-HT levels in the brain and alterations in dopamine levels and dopamine-related genes.

Given the increasing use of carbon nanotubes (CNT) in several industries and technological applications, it is essential to perform in vivo toxicological studies with these nanomaterials to evaluate their potential ecotoxicity. Dopamine (DA) and serotonin (5HT) are key neurotransmitters for brain functions and behavioral responses. Determination of DA and 5HT were performed in brain samples from zebrafish Danio rerio exposed i.p. to single-walled CNT (SWCNT), besides analyzing acetylcholinesterase (AChE) and ectonucleotidases activity, lipid peroxidation and total antioxidant capacity. Results showed that treatment with SWCNT increased between 3 and 6-fold the concentration of DA and 5HT (p < 0.05). Similarly, a significant reduction (p < 0.05) in AChE activity was observed in the brains of SWCNT exposed zebrafish when compared to the control groups. Cholinergic, serotonergic, and dopaminergic systems, through AChE activity and serotonin and dopamine levels, respectively were affected by SWCNT in the zebrafish brain. Alterations in these neurotransmitters can potentially affect several physiological and behavioral that they control., (Copyright © 2018 Elsevier Inc. All rights reserved.)

β-S globin haplotype (β S haplotype) characterization in sickle cell anemia (SCA) patients is important because it assists individualized treatment. However, the patient with atypical haplotypes do not present detailed studies such as clinical and laboratory data. To understand the phenotypic expression of atypical haplotype patients in relation to typical haplotype ones, it may be necessary to assess the main clinical and laboratorial parameters and investigate transcription factors, as possible genetic modulators that can contribute to the improvement of the SCA patients' clinical condition. The study group was composed of 600 SCA Brazilian patients of both genders ranging in age from 1 to 68 years. The atypical haplotypes were the third most frequent (5.7%) with 11 patterns numerically ranked according to occurrence. We verified that patients with atypical 1 haplotype in combination with Bantu haplotype presented milder clinical outcomes in relation to Bantu/Bantu and Benin/Benin patients, according to improved values of hemoglobin and hematocrit. In clinical severity, we did not observe significant statistical differences between typical and atypical haplotype patients, and this result can be explained with reference to the action of transcription factors in β-globin cluster. Thus, we presented the atypical haplotype relationship with SCA pathophysiology, reinforcing the hypothesis that individual genetic factors may be responsible for phenotypic diversity of the disease.

The mercapturic acid pathway (MAP) is a major phase II detoxification route, comprising the conjugation of electrophilic substances to glutathione (GSH) in a reaction catalyzed by glutathione S-transferase (GST) enzymes. In mammals, GSH-conjugates are exported from cells, and the GSH-constituent amino acids (Glu/Gly) are subsequently removed by ectopeptidases. The resulting Cys-conjugates are reabsorbed and, finally, a mercapturic acid is generated through N-acetylation. This pathway, though very well characterized in mammals, is poorly studied in non-mammalian biological models, such as bivalve mollusks, which are key organisms in aquatic ecosystems, aquaculture activities and environmental studies. In the present work, the compound 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) was used as a model electrophile to study the MAP in Pacific oysters Crassostrea gigas. Animals were exposed to 10μM CDNB and MAP metabolites were followed over 24h in the seawater and in oyster tissues (gills, digestive gland and hemolymph). A rapid decay was detected for CDNB in the seawater (half-life 1.7h), and MAP metabolites peaked in oyster tissues as soon as 15min for the GSH-conjugate, 1h for the Cys-conjugate, and 4h for the final metabolite (mercapturic acid). Biokinetic modeling of the MAP supports the fast CDNB uptake and metabolism, and indicated that while gills are a key organ for absorption, initial biotransformation, and likely metabolite excretion, hemolymph is a possible milieu for metabolite transport along different tissues. CDNB-induced GSH depletion (4h) was followed by increased GST activity (24h) in the gills, but not in the digestive gland. Furthermore, the transcript levels of glutamate-cysteine ligase, coding for the rate limiting enzyme in GSH synthesis, and two phase II biotransformation genes (GSTpi and GSTo), presented a fast (4h) and robust (∼6-70 fold) increase in the gills. Waterborne exposure to electrophilic compounds affected gills, but not digestive gland, while intramuscular exposure was able to modulate biochemical parameters in both tissues. This study is the first evidence of a fully functional and interorgan MAP pathway in bivalves. Hemolymph was shown to be responsible for the metabolic interplay among tissues, and gills, acting as a powerful GSH-dependent metabolic barrier against waterborne electrophilic substances, possibly also participating in metabolite excretion into the sea water. Altogether, experimental and modeled data fully agree with the existence of a classical mechanism for phase II xenobiotic metabolism and excretion in bivalves., (Copyright © 2016 Elsevier B.V. All rights reserved.)

Erythrocytes have an environment of continuous pro-oxidant generation due to the presence of hemoglobin (Hb), which represents an additional and quantitatively significant source of superoxide (O2(-)) generation in biological systems. To counteract oxidative stress, erythrocytes have a self-sustaining antioxidant defense system. Thus, red blood cells uniquely function to protect Hb via a selective barrier allowing gaseous and other ligand transport as well as providing antioxidant protection not only to themselves but also to other tissues and organs in the body. Sickle hemoglobin molecules suffer repeated polymerization/depolymerization generating greater amounts of reactive oxygen species, which can lead to a cyclic cascade characterized by blood cell adhesion, hemolysis, vaso-occlusion, and ischemia-reperfusion injury. In other words, sickle cell disease is intimately linked to a pathophysiologic condition of multiple sources of pro-oxidant processes with consequent chronic and systemic oxidative stress. For this reason, newer therapeutic agents that can target oxidative stress may constitute a valuable means for preventing or delaying the development of organ complications., (© 2013 Elsevier Inc. All rights reserved.)