Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2020 Trabalho de laboratório desenvolvido no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge. Dissertação orientada por: Doutor João Gonçalves (Departamento de Genética Humana – Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge) e Professor Doutor Francisco Pina Martins ( Departamento de Biologia Animal - Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa). As doenças/patologias do desenvolvimento sexual, por definição, correspondem a manifestações clínicas congénitas nas quais o sexo cromossómico, gonadal ou anatómico é atípico. Neste âmbito, existe um largo espectro de indivíduos com um diagnóstico clínico provável onde, utilizando a abordagem analítica clássica baseada em PCR e Sequenciação de Sanger, em muitos doentes não se encontra a causa genética. Nestas situações, os indivíduos afetados poderão permanecer numa situação indefinida por muitos anos, não sendo possível receberem a orientação clínica e o tratamento mais adequados, nem o melhor aconselhamento genético, tanto o próprio indivíduo como os seus progenitores/familiares. A incidência das doenças em causa é muito variável, podem compreender situações raras (ex. Disgenesia Gonadal Completa) com incidência inferior a 1/50 000 nascimentos, ou manifestações de criptorquidismo e de hipospádias cuja incidência ao nascimento varia entre ~1,5% a ~9% . Face ao conhecimento atual sobre o genoma humano, aos múltiplos genes que se conhecem associados às patologias do desenvolvimento sexual, e ao desenvolvimento da tecnologia de Sequenciação de Nova Geração (NGS), este estudo teve como objetivos: i) Encontrar o defeito molecular/genético que estará na base de diversas patologias do desenvolvimento sexual presentes em doentes 46,XX ou 46,XY; ii) Validar a análise por NGS de um painel alargado de genes associados a patologias do desenvolvimento sexual; iii) Proporcionar um diagnóstico molecular mais célere e com custo significativamente menor que a análise convencional baseada em PCR-sequenciação de Sanger, iv) Contribuir para um diagnóstico mais efetivo e de suporte a um melhor aconselhamento genético. Com base nas características das referidas doenças, desenhou-se um painel com pelo menos 40 genes, e analisou-se um conjunto de amostras de DNA de 59 doentes com diferentes DDS, para as quais, embora já tendo sido analisadas para alguns genes, não tinha sido ainda possível identificar a alteração molecular determinante da sua patologia. As amostras foram analisadas por NGS utilizando a tecnologia Ampliseq da Illumina. Esta tecnologia compreende, sucintamente, a seleção dos genes alvo a analisar, preparação do painel de sondas/amplicões específicos, preparação da biblioteca baseada em PCR-multiplex, sequenciação no equipamento MiSeq®(Illumina) e análise in silico dos resultados utilizando software específico (Variant Interpreter da Illumina). Complementarmente, realizou-se a visualização e interpretação dos resultados usando o software Integrative Genomics Viewer e, sempre que aplicável, procedeu-se à análise in silico de variantes relevantes para avaliação das suas consequências funcionais, frequência de alelos na população, conservação de aminoácidos, consulta de bases de dados e interpretação biopatológica dos resultados. Através desta abordagem, e no contexto deste estudo foram submetidas 39 amostras e 90 alterações para validação. Foi possível validar em 35 amostras um conjunto de 86 variantes em 18 genes (DDS e outras patologias), obteve-se uma taxa de validação de variantes de 95.6%. Para duas das amostras em estudo e resultando do alargamento da análise molecular a vários genes, foi possível identificar o defeito genético mais provável que constituirá a causa da doença. Na amostra PSU26, foi possível encontrar duas alterações, presumivelmente em heterozigotia composta, no gene HSD17B3 (c.876_877dupAA e c.645A>T) associadas ao fenótipo de deficiência enzimática em 17-beta-hidroxiesteróide desidrogenase. Na amostra PSU55 foi possível encontrar uma variante, em homozigotia, também no gene HSD17B3: c.277+4A>T, também associada à referida deficiência enzimática. Por último foi também possível encontrar uma alteração na amostra PSU53, NOBOX:c.1354G>A, associada a insuficiência ovárica prematura. IV Assim este estudo permitiu-nos inferir que a análise molecular que compreenda um número alargado de genes contribui para aumentar a taxa de deteção de alterações patogénicas e permite, em alguns casos, encontrar a causa da doença. Disorders of sex development are defined as congenital conditions in which development of chromosomal, gonadal, or anatomical sex is atypical. In this context, there is a broad spectrum of individuals with a probable clinical diagnosis where, using the classical analytical approach based on PCR and Sanger sequencing, the molecular change associated with the pathological phenotype is not found in many patients. In these situations, affected individuals will remain in an undefined situation for many years, not being able to receive the most appropriate clinical guidance and treatment, nor the best genetic counselling for both the individual and his / her family. The incidence of these diseases is very variable, it encompasses rare clinical conditions (e.g. Complete Gonadal Dysgenesis) with an incidence of less than 1/50 000 births, or manifestations of cryptorcquidism and hypospadias, diseases whose incidence at birth range from ~1.5% to ~9%. Considering the current knowledge about the human genome, the multiple genes known to be associated with disorders of sex development, and the development of Next Generation Sequencing (NGS) technology, this study aims were: i) to find the molecular/genetic defect in the basis of several pathologies of sexual development present in 46,XX or 46,XY patients; (ii) validate the NGS analysis for an enlarged panel of genes associated with pathologies of sexual development; iii) Provide a faster molecular diagnosis with significantly lower costs than conventional PCR-sanger sequencing analysis, and iv) Contribute to a more effective diagnosis and better genetic counselling. Based on the characteristics of these diseases, a panel with at least 40 genes was drawn, and a set of DNA samples from 59 patients with different disorders of sex development were analysed, although they had already been analysed for some genes, it had not yet been possible to identify the molecular alteration determining their pathology. The samples were analysed by NGS using Illumina's Ampliseq technology. This technology succinctly comprises the selection of target genes to be analysed, the preparation of a panel of specific probes/amplicons, preparation of the PCR-multiplex-based library, sequencing in the MiSeq®(Illumina) equipment, and in silico analysis of the results using specific software (Variant Interpreter da Illumina). In addition, the results were visualized and interpreted using the Integrative Genomics Viewer software and, whenever applicable, in silico analysis of relevant variants was performed to evaluate their functional consequences, frequency of alleles in the population, amino acid conservation, database consultation and biopathological interpretation of the results. Through this approach, and in the context of this study, 39 samples and 90 alterations were submitted for validation. It was possible to validate in 35 samples a set of 86 variants in 18 genes (DDS and other pathologies), a validation rate of variants of 95.6% was obtained. For two of the samples under study and resulting from the widening of the molecular analysis to several genes, it was possible to identify the most likely genetic defect that will constitute the cause of the disease. In the PSU26 sample, it was possible to find two alterations, presumably in compound heterozygous, in the HSD17B3 gene (c.876_877dupAA and c.645A>T) associated with the phenotype of enzymatic deficiency in 17-betahydroxysteroid dehydrogenase. In the PSU55 sample it was possible to find a variant, in homozygous, also in the HSD17B3 gene, c.277+4A>T, also associated with this enzymatic deficiency. Thus, this study allowed us to infer that a molecular analysis comprising a wide number of genes contributes to increase the detection rate of pathogenic changes and allows, in some cases, to find the cause of the disease. Descrição: Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020 N/A