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Cells continuously adapt to their microenvironment. In particular, they modulate their morphology, growth, division, and motility according to the biochemical and physical properties of the extracellular matrix (ECM). Cells are equipped with adhesive structures called FAs, allowing them to interact with ECM proteins through the core transmembrane proteins called integrins and to sense the nature and the rigidity of the ECM. This information are transduced by FA proteins and lead, for instance, to changes in acto-myosin-mediated mechanical tension. Downstream signalling pathways also reach the nucleus; gene expression is then modified and may, in return, affect the composition of FAs or of the ECM proteins for adaptative cell response. Here, we hypothesized that, in addition to signalling pathways, a direct mechanical coupling between the events occurring at the cell periphery and the nucleus may participate in the transmission of mechanical cues and the regulation of nuclear functions. Although intermediate filaments (IFs) have extremely interesting mechanical properties and resist high tension load, their involvement in mechanotransduction pathways remains elusive. Using astrocyte as a model, due to its specific combination of IFs: vimentin, GFAP, nestin, and synemin, we studied first the effect of substrate rigidity on the nucleus morphology and function, and on the organisation of IFs around the nucleus. Then, we investigated the role of IFs in rigidity-induced nuclear changes. Using a combination of microfabrication techniques, biochemical and microscopy methods, we showed that substrate rigidity affects the nucleus shape, volume, and structure of the chromatin and the recruitment of transcription factor (YAP) and IFs are mediating these changes. Our results suggest that IFs form a cage-like structure around the nucleus in a rigidity-dependent manner: stiffer substrates promote the formation of a cage of vimentin and nestin. In the absence of IFs, the nuclear changes induced by rigidity are different than with IF. The nucleus increases its size in soft substrate, together with an increase in tension measured by YAP localising in the nucleus. The structure of the chromatin is changed. Altogether, the results obtained during our investigation give a better understanding of the role of intermediate filaments in the mechanosensitive nuclear responses., Les cellules s'adaptent en permanence à leur microenvironnement. En particulier, elles modifient leur morphologie, leur croissance, leur division et leur motilité en fonction des propriétés biochimiques et physiques de la matrice extracellulaire (MEC). Elles sont équipées de structures adhésives appelées plaques d’adhérences, permettant aux cellules d'interagir avec les protéines de la MEC via les protéines transmembranaires appelées intégrines et de détecter la nature et la rigidité de la MEC. Le signal est transduit par les protéines des plaques d’adhérences et résulte par exemple en une modification de la tension mécanique induite par l'acto-myosine. Les voies de signalisation en aval peuvent également atteindre le noyau. L'expression des gènes peut alors être modifiée, ce qui peut en retour affecter la composition des plaques d’adhérences et de la MEC pour une réponse cellulaire adaptative. Nous avons émis l'hypothèse qu'en plus des voies de signalisation, un couplage mécanique direct entre les événements se produisant à la périphérie de la cellule et le noyau pourrait participer à la transmission de signaux mécaniques. Bien que les filaments intermédiaires (FIs) aient des propriétés mécaniques extrêmement intéressantes et résistent à des charges de tension élevées, leur implication dans les voies de mécanotransduction est encore mal connue. En utilisant l'astrocyte comme modèle, en raison de sa combinaison spécifique de FIs : vimentine, GFAP, nestine et synémine, nous avons d'abord étudié l'effet de la rigidité du substrat sur la morphologie, la structure et les fonctions du noyau, ainsi que sur l'organisation des FIs autour du noyau. Nous avons ensuite étudié l’impact de l’absence de FI les changements nucléaires observés en réponse à la rigidité du substrat. En utilisant une combinaison de techniques de microfabrication, de méthodes biochimiques et de microscopie, nous avons montré que la rigidité du substrat affecte la forme, le volume du noyau, la structure de la chromatine et le recrutement des facteurs de transcriptions (YAP). Nos résultats suggèrent que les FI forment une structure en forme de cage autour du noyau d'une manière dépendante de la rigidité : un substrat plus rigide induit la formation d’une cage de vimentine et de nestine. Cette interaction avec le noyau pourrait expliquer les modifications nucléaires observées en réponse à la rigidité du substrat. Au total, les résultats obtenus au cours de notre étude permettent de mieux comprendre le rôle des filaments intermédiaires dans les réponses nucléaires aux propriétés mécaniques du substrat.

Epithelia are tissues of organisms that provide a role of barrier against chemical and physical aggressions and undergo morphogenesis, repair or regenerate thanks to cell division. Epithelial cells are polarized and linked by bicellular junctions (BCJ) called adherens junction (AJ) at the apical level or septate junction (SJ) below and tricellular junctions (TCJ) where three cells met. Recently, TCJ have emerged as a key regulator of processes regulating cell division, stem cells but also tumourigenesis. Surprisingly, little is known concerning TCJ itself. During my PhD work, I used Drosophila notum, a monolayered epithelium, in combination with genetics, imaging and biophysics tools to decipher TCJ homeostasis. Four proteins have been described at TCJ: Sidekick (Sdk), enriched at the AJ level, and Gliotactin (Gli), Anakonda (Aka) and M6 at the SJ level. I first characterized TCJ components de novo recruitment at TCJ that assemble during epithelial cytokinesis. Second, I reported that Aka and M6 are the keystone of TCJ assembly. However, while Gli is not required for Aka recruitment at TCJ, Gli activity is needed to stabilize Aka there. I also uncovered that loss of TCJ components results in SJ morphology impairment leading to a major defect of the epithelium. Conversely, the specificity of localization of TCJ components relies on SJ integrity. In parallel, I observed that loss of TCJ integrity leads to E-cadherin as well as acto-myosin cytoskeleton enrichment at both TCJ and BCJ. These phenotypes also appear upon loss of pSJ proteins. Moreover, the AJ and acto-myosin cytoskeleton remodeling comes with ESCRT components HRS and Shrub defects along with Crumbs enrichment at the apical part of the cell. Moreover, I observed that the establishment of the new daughter/daughter cell interface is impaired upon TCJ loss of function. Hence, my PhD work sheds light on the links between TCJ, pSJs and AJs in the tissue and how defects at a specific junctional level, results in a global impairment of cell homeostasis.; Les épithélia sont des tissus de l’organisme, jouant un rôle de barrière contre l’extérieur et impliqués dans le développement, la morphogénèse et la réparation tissulaire grâce à la division cellulaire. Ils sont composés de différentes cellules polarisées qui forment des jonctions bicellulaires (BCJ) dites adhérentes (AJ) ou septées (SJ) ainsi que des jonctions tricellulaires (TCJ) au contact de trois cellules. De récentes études démontrent que les TCJs sont impliquées dans de nombreux processus intervenant dans la division cellulaire, la régulation de cellules souches ou encore la tumorigénèse. Curieusement, les TCJs demeurent méconnues. J’utilise le notum de Drosophile, un épithélium monocouche, en combinaison avec des outils génétiques, d’imagerie et de biophysique pour étudier l’homéostasie des TCJs. Quatre protéines transmembranaires sont reportées enrichies aux TCJs : Sidekick (Sdk) dans le plan des AJs ; Gliotactine (Gli), Anakonda (Aka) et M6 dans le plan des SJs. J’ai caractérisé leur dynamique d’assemblage dans la division et démontré que M6 et Aka étaient les pièces maîtresses des TCJs en recrutant Gli. Cette dernière, bien que non nécessaire à la présence d’Aka à la TCJ, la stabilise. J’ai ensuite observé que la perte d’intégrité de la TCJ conduit à des déformations des SJs entraînant un défaut majeur de l’intégrité de l’épithélium. A l’inverse, la spécificité de localisation des protéines de la TCJ est régulée par l’intégrité des SJs. En parallèle, j’ai également remarqué que la perte d’intégrité de la TCJ entraîne un enrichissement d’E-Cadhérine et d’acto-myosine tout comme la perte de protéines des pSJs. De plus, j’ai pu observer que ces défauts étaient accompagnés d’agrégats des protéines ESCRT HRS et Shrub ainsi qu’un enrichissement de Crumbs au niveau apical de la cellule. De plus, enlever la protéine Aka conduit à un défaut d’établissement de la nouvelle jonction cellulaire lors de la division. Ce travail de thèse a donc permis de comprendre le lien qui existe entre la TCJ, les pSJs et AJs au sein du notum et comment des défauts dans un certain plan jonctionnel conduisent à des problèmes généralisés dans la cellule.

Although extensively studied in vitro, the mechanics of the cytoskeleton is still largely unexplored in living cells. We use an intracellular optical tweezers-based micromanipulation technique to apply forces directly on cytoskeletal filaments in order to probe microtubules and intermediate filament mechanics and focus on how they interact mechanically. Measuring simultaneously the force applied to the filaments and their deflection, i.e. the deformation of the filaments perpendicular to their axis, as a function of time, allows us to deduce the force-deflection curves of the filaments and to characterize the rigidity of vimentin intermediate filaments and microtubules. By fitting the force-deflection curves at small forces, we show that microtubules have a lower effective stiffness than vimentin upon deflection. We then apply forces twice on the same cytoskeletal bundle to show that vimentin filaments, but not microtubules, stiffen more than three times upon repeated deflections. We further characterize the mechanical coupling between vimentin filaments and microtubules by using microtubule destabilizing and stabilizing drugs and by increasing microtubule acetylation. Interestingly, we find that these modifications do not affect the effective stiffness of vimentin filaments while destabilizing or acetylating microtubules significantly reduces vimentin filament stiffening upon repeated deflection. Altogether, these results suggest that microtubules promote stiffening of vimentin bundles under repeated mechanical stress. In sharp contrast, in cells knockout for vimentin, the mechanical properties of microtubules are unchanged. Our findings highlight the importance of the interactions between microtubules and intermediate filaments in cell mechanics and suggest that vimentin intermediate filaments are mechanosensitive structures which exhibit history-dependent mechanoresponses., Bien que largement étudiée in vitro, la mécanique du cytosquelette reste encore peu explorée dans les cellules vivantes. Nous utilisons une technique de micromanipulation intracellulaire basée sur des pinces optiques pour appliquer des forces directement sur les filaments du cytosquelette afin de sonder la mécanique des microtubules et des filaments intermédiaires et de nous intéresser à leur interaction mécanique. En mesurant simultanément la force appliquée aux filaments et leur déflexion, c'est-à-dire la déformation des filaments perpendiculairement à leur axe longitudinal, en fonction du temps, nous pouvons déduire les courbes force-déflexion des filaments et caractériser la rigidité des filaments intermédiaires de vimentine et des microtubules. Par un ajustement linéaire des courbes force-déflexion dans le régime des faibles forces, nous montrons que les microtubules ont une rigidité effective plus faible que la vimentine lors de la déflexion. Nous appliquons ensuite des forces deux fois sur le même faisceau de cytosquelette pour montrer que les filaments de vimentine, mais pas les microtubules, se rigidifient d'un facteur supérieur à trois lors de déflexions répétées. Nous caractérisons plus en détail le couplage mécanique entre les filaments de vimentine et les microtubules en utilisant des agents déstabilisateurs et stabilisateurs des microtubules et en augmentant l'acétylation des microtubules. De façon intéressante, nous constatons que ces modifications n'affectent pas la rigidité effective des filaments de vimentine alors que la déstabilisation ou l'acétylation des microtubules réduit significativement la rigidité des filaments de vimentine lors de déflexions répétées. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que les microtubules favorisent la rigidification des faisceaux de vimentine lors de contraintes mécaniques répétées. En revanche, dans les cellules où la vimentine est inactivée, les propriétés mécaniques des microtubules sont inchangées. Nos résultats soulignent l'importance des interactions entre les microtubules et les filaments intermédiaires dans la mécanique cellulaire et suggèrent que les filaments intermédiaires de vimentine sont des structures mécano-sensibles qui présentent des réponses dépendantes des contraintes mécaniques passées.

Formins are key regulators of the assembly of actin filaments in cells. Formins induce the nucleation and rapid elongation of actin filaments. The activity of formins thus participates in the generation of functional structures such as filopodia, stress fibers or the cytokinetic ring. Hence, formins are involved in fundamental cellular processes such as migration or cell division. At the molecular level, formins are homodimers capable of interacting with the barbed ends of elongating actin filaments via their FH2 domains. The conformational changes involved in tracking the barbed ends have never been directly observed. However, a set of biochemical, biophysical and structural biology studies evidence that the FH2 dimer moves stepwise at the barbed end, following an equilibrium between two states : "closed" and "opened". In the closed state, no new actin subunit can be added to the barbed end, while it is allowed in the opened state. Several models, under discussion, describe the structural nature of these two states and how they alternate. One can then evoke the « stair-stepping » model and the « stepping second » model.My thesis aims at elucidating the debate about the conformational states adopted by formin at the barbed end, focusing on the mammalian formin mDia1. Our goal was undertaken using electron microscopy. So far, formins bound to the barbed ends of actin has not been described using electron microscopy. Indeed, to pursue single particle analysis by EM, a sufficient density of objects of interest randomly oriented have to be displayed within an image. Formins bound to actin rapidly generate long filaments, preventing the obtention of enough short filaments exhibiting formins at their barbed ends. Thus, a bottleneck had to be overcome to make the samples suitable for single particle structural analysis. A sonication approach was chosen to produce short actin filaments. A first 3D reconstruction of the FH2 dimer-actin complex was obtained from negative stain electron microscopy samples. This envelope corresponds to the open state of the « stair stepping » model. After optimizing the image analysis protocol, a second 3D conformation of the complex could be determined, corresponding to the closed state of the so-called « stair stepping » model, which was minoritary. A further 2D study also revealed conformational variations within the open state. These observations led to the hypothesis that, for extreme conformations, the FH2 dimer can be found not only at the barbed end but also on the body of the actin filaments. The search for such a configuration could be validated by 2D analyses and a preliminary 3D density of an FH2 dimer complex encircling the body of an actin filament. We have adapted our samples to cryo-electron microscopy. Graphene-Oxide was added to the surface of the EM grids to preserve a sufficient actin filament ends density. A limited quantity of filament ends could be analyzed through 2D and 3D classifications. It thus confirms the non-artefactual nature of the previously observed open state.In addition, through a collaborative project, I also showed the synergistic action of Formin with Arp2/3 in the presence of Spin90 by highlighting the formation of a tetramer.; Les Formines sont des protéines régulatrices clés pour l'assemblage de filaments d'actine dans les cellules. Les formines y stimulent la nucléation et l'élongation rapide de filaments d'actine. L’activité des formines participe ainsi à la génération de structures fonctionnelles et se retrouvent impliquées dans des processus cellulaires fondamentaux comme la migration ou la division cellulaire. À l’échelle moléculaire, les formines constituent des homodimères capables d’interagir avec les extrémités barbées des filaments d’actine en élongation via leurs domaines FH2. Bien que les changements conformationnels impliqués dans cette traque des bouts barbés n'aient jamais été observés directement, des études de biochimie, biophysique et biologie structurale suggèrent que le dimère de FH2 se déplace pas à pas à l'extrémité barbée polymérisante, à travers un équilibre entre deux états dits "fermé" et "ouvert". Dans l’état fermé, aucune nouvelle sous-unité d’actine ne peut être ajoutée à l’extrémité barbée tandis que cet évènement est permis dans l’état ouvert. Plusieurs modèles coexistent et sont en discussion pour décrire la conformation structurale de ces deux états ainsi que la transition de l’un vers l’autre. On peut alors évoquer le modèle de la « marche enjambée » et le modèle du « saut enclenché ».Mon projet de recherche a eu pour objet de lever les interrogations qui persistent quant à la nature des états conformationnels adoptés par la formine au bout barbé, plus particulièrement pour la formine de mammifère mDia1. Pour cela j’ai utilisé essentiellement des méthodes de biologie structurale par microscopie électronique. Aucune structure en microscopie électronique n’avait été obtenue jusqu’à présent. En effet, rapidement, en présence de formines, de longs filaments d’actine sont générés et ne permettent pas l’obtention d’une densité élevée de courts filaments coiffés de formines, nécessaire à une analyse en particules isolées. Un goulot d'étranglement a donc dû être surmonté afin d’optimiser les échantillons pour une telle analyse. Une approche par sonication a ainsi été choisie. Une première enveloppe 3D du complexe formé par l’extrémité barbée et le dimère de FH2 a pu être déterminée en coloration négative. Cette enveloppe correspond à l’état ouvert du modèle de la « marche enjambée ». Après une optimisation du protocole de traitement d’images, une seconde conformation 3D du complexe a pu être déterminée correspondant cette fois à l’état fermé du modèle de la « marche enjambée » minoritaire. Une étude à deux dimensions plus poussée a également permis de mettre en évidence des variations conformationnelles au sein même de l’état ouvert. Ces observations ont permis de proposer l'hypothèse que, pour des conformations extrêmes, le dimère de FH2 peut se retrouver non plus à encercler l’extrémité barbée mais le corps même des filaments d’actine. La recherche d’une telle configuration a pu être validées par des analyses 2D ainsi qu’une densité 3D préliminaire d’un complexe d’un dimère de FH2 encerclant le corps d’un filament. L’adaptation de mes échantillons vers la cryo-microscopie a été débutée. En particulier, des feuilles d'oxide de graphène ont été déposées sur les grilles de microscopie pour conserver une densité d’extrémités de filaments d’actine suffisante. Une quantité limitée d’extrémités a pu être analysée par classification 2D et 3D confirmant tout au moins la nature non artéfactuelle de l’état ouvert précédemment observé.Enfin, j’ai également pu contribuer à travers cette thèse à l’étude de l’action synergique de la Formine avec Arp2/3 en présence de Spin90 via la mise en évidence d’un complexe tétramérique.

Many cellular and molecular mechanisms are involved in the structural changes (morphogenesis) taking place during embryonic development. Indeed, the cytoskeleton is dynamically modified by intracellular signaling cascades, controlling cell morphogenesis during division or epithelial organization. Signal transduction mechanisms establishes homeostasis during morphogenetic processes. The cell cortex, composed by plasma membrane and underlying cytoskeleton meshwork, is responsible for integrating cell shape changes and organizing structural elements required for intercellular communication. The composition of the cell cortex is thus constantly changing in response to morphogenetic needs. However, the signaling network controlling this cortical plasticity is still unclear. This work has identified a new signaling pathway involved in cell cortex organization. The laboratories of Dr Carréno and Dr Hipfner use Drosophila as a model organism to study cell and tissue morphogenesis. Dr Carréno and Dr Hipfner had previously found that Ste20 Slik kinase was responsible for dMoesin activation by phosphorylation. dMoesin acts as a cross-linker between the cytoskeleton and the plasma membrane. This way, activation of dMoesin by Slik controls cortical stability during mitosis and epithelial integrity in Drosophila. This research project found that dSTRIPAK phosphatase activity promotes cortical localization of Slik in order to activate dMoesin at the plasma membrane. In addition, it showed that dSTRIPAK, as Slik and dMoesin, controls mitotic morphogenesis and epithelial tissue integrity. On top of that, Dr Hipfner has previously shown that Slik induces growth signaling at distance and independently of its catalytic activity. My research has led to the discovery that Slik is located along specialized signaling filopodia, called cytonemes. In addition, our data showed that Slik lengthens cytonemes, while dSTRIPAK is necessary for their biogenesis and signaling function. Slik and dSTRIPAK thus control tissue growth during the embryonic development of Drosophila. We have not determined the molecular mechanisms involved in the formation of cytonemes by dSTRIPAK/Slik yet. Together, our research projects led to the discovery that the dSTRIPAK complex regulates the catalytic and non-catalytic functions of Slik. We have thus identified a new signaling pathway controlling cell and tissue morphogenesis, through the cytoskeleton and intercellular communication. These processes are essential for maintaining homeostasis during embryogenesis. However, alteration of these morphogenetic processes can cause tumorigenesis. Our research might lead to the exploration of new anti-cancer therapeutic avenues., De nombreux mécanismes moléculaires et cellulaires sont à la base des changements structurels (appelés la morphogenèse) qui ont lieu durant le développement d’un organisme. En effet, le cytosquelette est dynamiquement modifié par des cascades de signalisation intracellulaires contrôlant ainsi la morphogenèse cellulaire durant la division ou l’organisation d’un épithélium. L’homéostasie entre les différents processus morphogénétiques est établie grâce à des échanges de molécules signalisatrices. Le cortex de la cellule, composé de la membrane plasmique et du réseau de protéines du cytosquelette sous-jacent, est responsable d’intégrer les changements de forme cellulaire et d’organiser les éléments structurels requis pour la communication intercellulaire. Donc la composition du cortex cellulaire varie constamment en réponse aux besoins morphogénétiques. Toutefois, les réseaux de signalisation qui contrôlent cette plasticité corticale ne sont pas toujours connus. Ce travail a identifié une nouvelle voie de signalisation impliquée dans l’organisation du cortex cellulaire. Le laboratoire d’accueil (Dr Carréno) ainsi que celui du Dr Hipfner utilisent la drosophile comme organisme modèle pour l’étude fondamentale de la morphogenèse cellulaire et tissulaire. Le Dr Carréno et le Dr Hipfner avaient précédemment découvert que la kinase Ste20 Slik était responsable d’activer la dMoésine par phosphorylation. Celle-ci lie le cytosquelette à la membrane plasmique. L’activation de la dMoésine par Slik contrôle ainsi la stabilité corticale durant la mitose et l'intégrité épithéliale chez la drosophile. Durant mon projet de recherche, nous avons ensuite mis en évidence que le complexe phosphatase-kinase dSTRIPAK promeut la localisation corticale de Slik afin d’activer la dMoésine à la membrane plasmique. Nous avons également révélé que dSTRIPAK contrôle, tout comme Slik et dMoésine, la morphogenèse mitotique et l’intégrité du tissu épithélial. D'autre part, le Dr Hipfner avait précédemment constaté que Slik induisait une signalisation de croissance à distance, de façon indépendante de son activité catalytique. Mes recherches ont amené à découvrir que Slik est localisée le long de filopodes spécialisés dans la signalisation à distance, appelés cytonèmes. En outre, nos résultats révèlent que Slik allonge les cytonèmes, alors que dSTRIPAK est nécessaire à leur biogenèse et fonction de signalisation. Slik et dSTRIPAK contrôlent ainsi la croissance tissulaire au cours du développement embryonnaire de la mouche. Il reste à déterminer les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation des cytonèmes par dSTRIPAK/Slik. Au final nos recherches ont mené à la découverte que le complexe dSTRIPAK régule les fonctions catalytiques et non-catalytiques de Slik. Nous avons ainsi identifié une nouvelle voie de signalisation contrôlant la morphogenèse cellulaire et tissulaire, par le biais du cytosquelette et de la communication intercellulaire. Ces processus sont essentiels au maintien de l’homéostasie durant l’embryogenèse. Toutefois, l’altération de ces processus morphogénétiques peut causer la tumorigenèse. Notre travail de recherche participe donc potentiellement à l’exploration de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses.

Actin network architecture and dynamics play a central role in cell contractility and tissue morphogenesis. Local modulations of Actomyosin network dynamics depend largely on the activation of the RhoA activation cascade. In my thesis, I combined quantitative microscopy using TIRFM, single-molecule imaging, numerical simulations and simple mathematical modeling, to explore the dynamic network architecture underlying pulsed contractions in a simple model, the C. elegans early embryo. Focusing on the Actin elongator Formin, we observed that F-Actin elongation was catalyzed by a specific subpopulation of cortical Formins – termed elongating Formins – that displayed a characteristic ballistic mobility. My results also showed that Formin-mediated F-Actin elongation rate was dependent on the phase of the cell cycle and embryonic stage. We subsequently showed that elongating Formins saturate available barbed ends of Actin filaments, converting a local biochemical gradient of RhoA activity into a polar network architecture. In second study, focusing on the kinetics of the RhoA activation cascade, we developed and functionally challenged a simple numerical model. This model takes advantage of the measurements of the dynamical parameters of the Myosin, downstream effector of the RhoA activation cascade, to predict the temporal evolution of this cascade. I propose that this simple and generic model – which can in essence fit any activation cascade – offers a simple mathematical framework to understand the temporal dynamics of signaling cascades, and the delay and change in the shape of the response which can be observed between the input and the output of a cascade., L’architecture et la dynamique du cortex d’Actine joue un rôle central dans la contractilité cellulaire et la morphogénèse des tissus. La modulation locale de la dynamique du réseau d’Actomyosine dépend majoritairement de la cascade d’activation de RhoA. Dans ma thèse, j’ai combiné des approches de microscopie quantitative en TIRFM, de l’imagerie en molécule unique, des simulations numériques et de la modélisation mathématique simple pour explorer l’architecture dynamique du réseau sous-jacent aux contractions pulsées dans un modèle simple : le jeune embryon de C. elegans. En se concentrant sur la Formine, élongateurs de l’Actine, nous avons observé que l’élongation de la F-Actine était catalysée par une population spécifique de Formines corticales – appelées Formines élongatrices – qui montrent une mobilité de type balistique. Nous avons ensuite montré que les Formines saturent les extrémités barbées disponibles et convertissent un gradient biochimique local de l’activité de RhoA en un réseau d’architecture polaire. Dans une seconde étude, en se concentrant sur la cinétique de la cascade d’activation de RhoA, nous avons développé un modèle numérique simple. Celui-ci tire profit des mesures des paramètres dynamiques de la Myosine, un effecteur terminal de la cascade d’activation de RhoA, pour prédire l’évolution temporelle de cette cascade. Je propose ici que ce modèle simple et générique – qui peut par essence s’adapter à n’importe quelle cascade – offre un cadre mathématique simple pour comprendre la dynamique temporelle des cascades d’activation, et le délai et changement dans la forme de la réponse qui peuvent être observés entre l’entrée et la sortie.

Actin network architecture and dynamics play a central role in cell contractility and tissue morphogenesis. Local modulations of Actomyosin network dynamics depend largely on the activation of the RhoA activation cascade. In my thesis, I combined quantitative microscopy using TIRFM, single-molecule imaging, numerical simulations and simple mathematical modeling, to explore the dynamic network architecture underlying pulsed contractions in a simple model, the C. elegans early embryo. Focusing on the Actin elongator Formin, we observed that F-Actin elongation was catalyzed by a specific subpopulation of cortical Formins – termed elongating Formins – that displayed a characteristic ballistic mobility. My results also showed that Formin-mediated F-Actin elongation rate was dependent on the phase of the cell cycle and embryonic stage. We subsequently showed that elongating Formins saturate available barbed ends of Actin filaments, converting a local biochemical gradient of RhoA activity into a polar network architecture. In second study, focusing on the kinetics of the RhoA activation cascade, we developed and functionally challenged a simple numerical model. This model takes advantage of the measurements of the dynamical parameters of the Myosin, downstream effector of the RhoA activation cascade, to predict the temporal evolution of this cascade. I propose that this simple and generic model – which can in essence fit any activation cascade – offers a simple mathematical framework to understand the temporal dynamics of signaling cascades, and the delay and change in the shape of the response which can be observed between the input and the output of a cascade., L’architecture et la dynamique du cortex d’Actine joue un rôle central dans la contractilité cellulaire et la morphogénèse des tissus. La modulation locale de la dynamique du réseau d’Actomyosine dépend majoritairement de la cascade d’activation de RhoA. Dans ma thèse, j’ai combiné des approches de microscopie quantitative en TIRFM, de l’imagerie en molécule unique, des simulations numériques et de la modélisation mathématique simple pour explorer l’architecture dynamique du réseau sous-jacent aux contractions pulsées dans un modèle simple : le jeune embryon de C. elegans. En se concentrant sur la Formine, élongateurs de l’Actine, nous avons observé que l’élongation de la F-Actine était catalysée par une population spécifique de Formines corticales – appelées Formines élongatrices – qui montrent une mobilité de type balistique. Nous avons ensuite montré que les Formines saturent les extrémités barbées disponibles et convertissent un gradient biochimique local de l’activité de RhoA en un réseau d’architecture polaire. Dans une seconde étude, en se concentrant sur la cinétique de la cascade d’activation de RhoA, nous avons développé un modèle numérique simple. Celui-ci tire profit des mesures des paramètres dynamiques de la Myosine, un effecteur terminal de la cascade d’activation de RhoA, pour prédire l’évolution temporelle de cette cascade. Je propose ici que ce modèle simple et générique – qui peut par essence s’adapter à n’importe quelle cascade – offre un cadre mathématique simple pour comprendre la dynamique temporelle des cascades d’activation, et le délai et changement dans la forme de la réponse qui peuvent être observés entre l’entrée et la sortie.

Lorsque j’ai découvert les sciences physiques et les sciences naturelles, au collège, j’ai été fascinée par ces mondes, « comprendre »…ma vocation était née ! Puis, j’ai pris conscience des études longues qui m’attendaient, et j’ai craint que tout ne soit découvert avant que je n’atteigne mon but. Cette naïveté me fait encore sourire. Nous n’aurons jamais fini de comprendre, de découvrir, d’imaginer, de postuler, de rêver…Mon parcours est un peu atypique : ingénieure chimiste de formation avec une belle coloration de biologie, j’ai ensuite opté pour cette couleur (qui sent bien meilleure, au sens propre !) en réalisant une thèse en biochimie/biophysique sur la PEBP (Phosphatidylethanolamine binding protein) extraite du cerveau de bœuf, puis un Post-Doc sur la synthèse des sphingolipides chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Recrutée au CNRS pour étudier les PEBPs de levure, un premier crible double hybride avait mené l’équipe à Ira2p l’homologue de Nf1 chez l’homme. Nous nous sommes alors progressivement réorientées vers l’étude de la Neurofibromatose de type I (NF1), maladie génétique très fréquente due à des mutations du gène NF1 codant pour la protéine Nf1, neurofibromine. Actuellement aucun traitement n’existe pour soigner la NF1. Un deuxième crible double hybride nous a conduites à LIMK2, une kinase impliquée dans le remaniement du cytosquelette. Ces dernières années, je me suis focalisée sur cette LIMK2 et son lien avec Nf1, mais aussi sur ses trois isoformes, LIMK2a, LIMK2b et LIMK2-1, et tout particulièrement LIMK2-1 qui apparaît très atypique et pourrait donner de nouvelles informations sur l’activité kinase de ces protéines sur la cofiline, leur principal substrat impliqué dans la régulation des filaments d’actine. Par ailleurs, de nombreuses études ont montré l’implication de LIMK2 et de son homologue, LIMK1, dans des pathologies variées : cancers, résistance de certains cancers à des drogues ciblant les microtubules, maladies neurologiques, infections virales, douleur chronique, reproduction. Les LIMKs sont donc de nouvelles cibles thérapeutiques. Différents inhibiteurs « petites molécules chimiques » ont été développés depuis 10 ans ciblant ces kinases, seulement 2 molécules ont été montrées être efficaces dans des essais précliniques (cancers du sein et du pancréas et leucémie), et 1 autre a franchi le cap des essais cliniques de phase I et II, sans résultats publiés. Ce champ d’investigation reste donc très ouvert. En collaboration avec des chimistes, nous avons développé de nouveaux inhibiteurs, dont certains se révèlent très efficaces in cellulo. La prochaine étape est la réalisation d’essais précliniques des inhibiteurs les plus efficaces sur des souris modèles de la sclérose latérale amyotrophique, des souris xénogreffées d’ostéosarcome, et des souris modèles de la NF1. Les financements ont été obtenus pour ces trois essais qui vont prochainement débuter.

During cell migration, adhesion complexes control the production of force and the adaptation to the mechanical properties of the environment. The aim of this project was to understand the molecular mechanisms by which these complexes control the force produced by actin assembly and encode mechanical information into biochemical reactions. The first study shows that the proteins talin, RIAM and VASP assemble on the surface of a membrane to stimulate actin assembly by a novel. mechanism The second part is based on the reconstitution of the mechanosensitive machinery of the adhesion complexes with pure proteins on a micropatterned surface observed in microscopy. The study reveals that the stretchable protein talin exchanges its partner RIAM for vinculin in response to the force transmitted by the actin cytoskeleton. Talin thus codes mechanical information by recruiting partners that correspond to its degree of stretch.; Lors de la migration cellulaire, les complexes d’adhérence contrôlent la production de force et l’adaptation aux propriétés mécaniques de l’environnement. Le but de ce projet était de comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels ces complexes contrôlent la force produite par l’assemblage du cytosquelette d’actine et codent une information mécanique en réaction biochimique. La première étude montre que les protéines taline, RIAM et VASP s’assemblent à la surface d’une membrane pour stimuler l’assemblage de l’actine par un nouveau mécanisme. La deuxième partie est basée sur la reconstitution de la machinerie mécano-sensible des complexes d’adhérence avec des protéines pures sur une surface micro-imprimée observée en microscopie. L’étude montre que la protéine étirable taline échange son partenaire RIAM contre la vinculine en réponse à la force du cytosquelette. La taline code donc l’information mécanique en recrutant les partenaires qui correspondent à son degré d’étirement.

Cell migration is essential in various biological processes such as embryogenesis,wound healing, metastatic invasions or immune response. The objective of this thesiswas to identify and extract parameters useful for the establishment of physical modelsand the biological understanding of collective migration. To do this, we study cellmigration around an obstacle. Indeed, the presence of an obstacle in a flow induces heterogeneities which are discriminating for the establishment of models and we wantedto add to the information of velocities and deformations those of the forces exerted bythe cells on the substrate. Initally, the protein pattern geometry on which our cells are deposited is that of a band with an obstacle. Cells are confined by a block which, once removed, allows the tissue to invade free space and flow around the obstacle. The first part of this thesis studies this configuration, from a kinematic and proteinic levels point of view. In particular,we obtain master curves in velocity and deformation, a correlation between velocity and density, and an enrichment of the vimentin at the edge of the confined pattern andat the migration front. A set of relationships between actin, vimentin levels, density,deformation, and velocity is also found. Finally, it is shown that the direction of polarizationdefined by the core to center of mass vector of the cell is on average orthogonalto the direction of velocity. The strip geometry has the advantage of forcing the flow and being very controlled but has the disadvantage of requiring the installation of a block. It is not possible to lay the block on a substrate of low rigidity for force measurements, and to get around this problem we closed the boundary conditions and worked on a racetrack geometry that has two obstacles in the middle of each arm. We wagered on spontaneous generationof large-scale flow, which proved to be correct. The third part of the results studies theracetracks on a hard substrate (as opposed to a soft substrate for forces). The possibilityof generating a long-range flow and the presence of vimentin at the edge of the pattern are retained. We also note that the velocity- density relationship is no longer valid in this geometry, which attests that when it exists, it is in fact a consequence of the spreading dynamics of the monolayer and not of the migration dynamics as such. There is also a relationship between actin and vimentin which illustrates three possible cell states. The first corresponds to very deformed and vimentin-rich cells, the second to very dense and actin-rich cells, and the third to intermediate states of deformation and density where the cells move and where actin and vimentin vary together. The last part of this thesis consists in studying the forces (soft substrate) by traction force microscopy. These experiments confirm that a migrating monolayer is contractile and we show that it is equivalent to measure the displacement of beads in the substrate or the displacement of cells at small scale on phase images. In other words, the instantaneous velocity (the one used by the theoreticians but not experimentally measurable) is equal to the bead position derivative.We conclude that there is continuity of motion between the substrate and the cell. Keeping in mind our first goal to study the migration around an obstacle, the development of a large-scale system oracetracksallows us to better understand the underlying ingredients of migration while developingthe experimental framework that allows quantitative comparisons between systems.; La migration cellulaire est essentielle dans divers processus biologiques tels que l’embryogenèse, la cicatrisation ou les invasions métastatiques. L’objectif de cette thèse était d’identifier et d’extraire les paramètres utiles à l’établissement de modèles physiques ainsi qu’à la compréhension biologique de la migration collective. Pour cela,nous étudions la migration cellulaire autour d’un obstacle. Cela induit des hétérogénéités qui sont discriminantes pour l’établissement de modèles. Nous voulions mesurer dans cette géométrie les champs de vitesses, de déformations et de forces exercées par les cellules sur le substrat.La géométrie initiale du motif protéique sur lequel nos cellules sont déposées est celle d’une bande avec un obstacle sur laquelle des cellules sont confinées par un bloc qui,une fois retiré, permet au tissu d’envahir l’espace libre. La première partie de cette thèse étudie cette configuration, d’un point de vue cinématique et protéique. On retient en particulier l’obtention de courbes maîtresses en vitesse et déformation, la corrélation entre vitesse et densité, et l’enrichissement de la vimentine en bord de motif confiné et en front de migration. Un ensemble de relations entre niveaux d’actine, de vimentine, densité, déformation, et vitesse est également trouvé. Enfin, on montre que la direction de la polarisation définie par le vecteur centre de masse du noyau à centre de masse de la cellule est en moyenne orthogonale à la direction de la vitesse.La géométrie en bande à l’avantage de forcer l’écoulement et d’être très contrôlée mais a le désavantage de nécessiter la pose d’un bloc qui n’est pas possible sur un substrat de faible rigidité pour l’étude des forces. Pour contourner ce problème nous avons fermé les conditions aux limites et travaillé sur une géométrie en hippodrome qui possède deux obstacles aux milieux de chacun des bras. Nous avons parié sur la génération spontanée d’un écoulement à grande échelle, ce qui s’est révélé exact. La troisième partie des résultats étudie les hippodromes sur un substrat dur (en opposition au substrat mou pour les forces). On retient la possibilité de générer un flot de longue portée et la présence de vimentine en bord de motif. On retient également que la relation vitesse densité n’est plus valable dans cette géométrie, ce qui atteste que lors qu’elle existe, elle est en fait une conséquence de la dynamique d’étalement du tissu et non de la dynamique de migration en tant que tel. On trouve également une relation entre actine et vimentine qui met en évidence trois états cellulaires possibles. Le premier correspond aux cellules très déformées et riches en vimentine, le second aux cellules très denses et riches en actine, le troisième aux états intermédiaires de déformation et densité où les cellules bougent et où actine et vimentine varient ensemble.La dernière partie de cette thèse consiste à étudier les forces (substrat mou) par microscopie de force de traction. Ces expériences confirment qu’une monocouche en migration est contractile et nous montrons qu’il est équivalent de mesurer le déplacement des billes dans le substrat ou le déplacement des cellules à petite échelle sur des images de phase. En d’autre terme, la vitesse instantanée (celle utilisée par les théoriciens mais non mesurable expérimentalement) est égale à la dérivée des positions des billes. Nous concluons qu’il y a continuité du déplacement entre le substrat et la cellule.À partir d’un objectif initial qui était d’étudier la migration autour d’un obstacle, le développement d’un système à grande échelle sur des hippodromes permet de mieux comprendre les ingrédients sous-jacents de la migration, tout en développant le cadre expérimental qui permet de faire des comparaisons quantitatives entre systèmes.

Metastatic melanoma is an aggressive form of cancer that progresses rapidly due to resistance to anti-cancer drugs. This thesis studies the hypothesis that molecules purified from plants or marine microalgae can improve the efficacy of anti-melanoma drugs by sensitizing cancer cells to chemotherapy. After a review of studies devoted to chemosensitization by natural molecules, we selected plants from Brazil and New Caledonia (Bixa orellana and Gardenia oudiepe) as well as marine microalgae (Rhodomonas salina and Tisochrysis lutea) to purify original flavonoids and carotenoids and evaluate their chemosensitization potential in a melanoma cell model treated with dacarbazine and vemurafenib. Our work on B. orellana seeds allowed us to detail their phytochemical composition, to identify two novel apocarotenoids and to demonstrate the chemosensitizing potential of Z-bixin by ROS generation. We also show that 5,7-dihydroxy-3,6,4'-trimethoxyflavone, purified from G. oudiepe, sensitizes melanoma cells to dacarbazine by inducing cytoskeleton disruption. After redefining the pigment profile of R. salina and T. lutea, we developed a process for the purification of fucoxanthin by CPC and demonstrated its chemosensitizing potential as well as that of alloxanthin. These results validate in vitro the concept of sensitization to chemotherapy by cytostatic carotenoids and flavonoids and contribute to the understanding of the cellular and molecular mechanisms involved in this chemosensitization.; Le mélanome métastatique est une forme agressive de cancer évoluant rapidement du fait de résistances aux anticancéreux. Cette thèse étudie l’hypothèse que des molécules purifiées de plantes ou microalgues marines peuvent améliorer l’efficacité de médicaments anti-mélanome en sensibilisant les cellules cancéreuses à la chimiothérapie. Après une revue des études consacrées à la chimiosensibilisation par des molécules naturelles, nous avons sélectionné des plantes du Brésil et de Nouvelle-Calédonie (Bixa orellana et Gardenia oudiepe) ainsi que des microalgues marines (Rhodomonas salina et Tisochrysis lutea) pour purifier des flavonoïdes et des caroténoïdes originaux et évaluer leur potentiel de chimiosensibilisation dans un modèle cellulaire de mélanome traité par la dacarbazine et le vemurafenib. Nos travaux sur les graines de B. orellana ont permis de détailler leur composition phytochimique, d’identifier deux nouveaux apocaroténoïdes et de démontrer le potentiel chimiosensibilisant de la Z-bixine par génération de ROS. Nous montrons également que la 5,7-dihydroxy-3,6,4'-triméthoxyflavone purifiée de G. oudiepe sensibilise les cellules de mélanome à la dacarbazine en perturbant le cytosquelette. Après avoir redéfini le profil pigmentaire de R. salina et T. lutea, nous avons développé un procédé de purification de la fucoxanthine par CPC et démontré son potentiel chimiosensibilisant ainsi que celui de l’alloxanthine. Ces résultats valident in vitro le concept de sensibilisation à la chimiothérapie par des caroténoïdes et flavonoïdes cytostatiques et contribuent à la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans cette chimiosensibilisation.

Migration of dental pulp stem cells (DPSCs) is a fundamental aspect of dental tissue engineering. The objective of this thesis is to investigate the influence of substrate stiffness on DPSCs migration. In the first part of this thesis, we showed that DPSCs are able to survive and proliferate on polydimethylsiloxane substrates (PDMS) with a Young's modulus of 1.5 kPa to 2.5 MPa without differentiating themselves. We observed that the average speed of DPSCs is increased on substrates with low stiffness. In addition, the Yes-associated protein (YAP) maintains a nuclear localization even on PDMS with low rigidity. Finally, we have shown that on a substrate with two different stiffnesses, DPSCs do not adopt any preferential migration direction, unlike the process of durotaxis classically described in the literature., La migration des cellules souches de la pulpe dentaire (DPSCs) est un aspect fondamental de l’ingénierie tissulaire dentaire. L’objectif de cette thèse est de déterminer l’influence de la rigidité du substrat sur la migration des DPSCs. Dans une première partie, nous avons montré que les DPSCs sont capables de survivre et de proliférer sur des substrats de polydiméthylsiloxane (PDMS) avec un module de Young de 1,5 kPa à 2,5 MPa sans se différencier. Nous avons observé que la vitesse moyenne des DPSCs est augmentée sur les substrats de faible rigidité. De plus, la Yes-associated protein (YAP) conserve une localisation nucléaire même sur les PDMS de faible rigidité. Finalement, nous avons montré que sur un substrat comportant deux rigidités différentes, les DPSCs n’adoptent pas de direction de migration préférentielle, contrairement au phénomène de durotaxie classiquement décrit dans la littérature.