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Trabalho final de mestrado para obtenção do grau de mestre em Engenharia Biomédica Charles Darwin (1809-1882) apresentou a sua teoria da evolução em 1859 quando publicou “Origem das Espécies por Meios de Seleção Natural ou a Preservação das Raças Favorecidas na Luta pela Vida” que indica que todos os seres vivos têm um ancestral comum. Esta teoria leva à conclusão de que a maioria das funções biológicas moleculares e celulares do organismo humano podem ser estudadas de uma forma mais eficiente e simples em organismos não-humanos. A utilização de modelos animais não humanos para determinados estudos de investigação em vez do ser humano traz vantagens a níveis experimentais e, principalmente, a nível ético. A experimentação animal traz benefícios não só ao ser humano mas também aos próprios animais. Organismos Modelo são assim espécies não humanas que são biologicamente estudadas na expectativa de descobrir funções de genes, curas para doenças ou melhorias na qualidade de saúde que podem ser aplicadas a outros organismos. Espécies como Danio rerio (peixe-zebra), Drosophila melanogaster (mosca-da-fruta) e Mus musculus (murganhos), são exemplos de animais usados como organismos modelo pela comunidade científica. Os murganhos por exemplo, constituem o organismo modelo geneticamente mais semelhante ao ser humano, sendo cerca de 85% das regiões codificadoras dos murganhos idênticas à do ser humano, chegando para alguns dos genes mesmo a 99% de semelhança. Apesar do genoma humano estar completamente sequenciado, para muitos genes ainda é desconhecida a sua função. Para estudar a função dos genes, um organismo knockout é essencial porque ao tornar o gene inativo permite quantificar/qualificar a consequência dessa inatividade, e daí inferir a função génica. Um knockout pode ser conseguido através de uma mutação no gene. A tecnologia de CRISPR/Cas9 é um mecanismo encontrado na resposta imunitária das bactérias, que tornou possível provocar mutações dirigidas a genes específicos. Para este sistema funcionar é necessário a proteína CRISPR associated 9 (Cas9) (para cortar o ADN), uma região proto-spacer adjacent motif (PAM) (região no ADN reconhecida pela proteína Cas9) e um guideRNA (que guia a Cas9 à região alvo). A proteína Cas9 provoca um corte na dupla cadeia de ADN e a célula tenta reparar esse corte através do mecanismo Non Homologous End Joining (NHEJ), mas durante este processo podem ocorrer várias mutações, como deleções ou inserções, provocando uma frameshift que, ou produz uma proteína deficiente ou impossibilita a produção da proteína - qualquer das opções é um knockout do gene. Não existe um protocolo de produção de guideRNA e consequente produção de knockouts que seja facilmente intermutável entre os 3 organismos modelo abordados neste projeto, sendo esse o nosso maior objectivo na elaboração deste trabalho. Para alcançar o objectivo da tese foi usado um protocolo já estabelecido para produção de guideRNA e consequente produção de animais mutantes em peixe-zebra: primeiramente como prova de princípio em peixe-zebra e posteriormente em mosca-da-fruta e murganho. Depois de estabelecido esse protocolo em peixe-zebra e de termos obtido animais mutantes estáveis, tentámos optimizar o mesmo protocolo para mosca-da-fruta e para murganho de acordo com as diferenças de desenvolvimento embrionário inerentes a cada organismo. Para a realização deste projeto, foram escolhidos genes que provocariam um efeito fenotipicamente visível aquando mutados de modo a facilitar o processo de rastreamento de mutantes. No caso do peixe-zebra e do murganho, o gene escolhido foi tyrosinase, envolvido na produção do pigmento preto no corpo e nos olhos dos animais. Para a mosca-da-fruta, o gene escolhido foi o yellow, também envolvido na produção do pigmento acastanhado da cutícula deste insecto. Em peixe-zebra, o gene tyrosinase foi mutado com sucesso, ficando assim inoperativo. Esta mutação causou mosaicismo fenotípico e genético: algumas células destes animais não tinham pigmento e confirmou-se a presença de diversos alelos mutantes diferentes no genoma. Exemplo de algumas limitações que existiram na elaboração deste projeto foi, no protocolo de produção de guideRNA e produção de animais mutantes e a extração de ARN a partir do ADN transcrito. Para extração de ARN o protocolo utiliza o Qiagen micro-RNA extraction kit. No entanto, a quantidade extraída de ARN com recurso a este reagente foi diminuta. Face a estes resultados, fizemos uma comparação direta entre a extração de ARN com esse mesmo kit e extração com fenol/clorofórmio a partir do mesmo produto de transcrição. Com o fenol/clorofórmio foi possível extrair quase 10 vezes mais ARN do que com o kit. Após estes resultados, todos os outros guideRNAs foram extraídos com o método de fenol/clorofórmio. Outra limitação existente no seguimento do protocolo usado neste projecto, foi a amplificação a partir de ADN genómico extraído de embriões com 24h de peixe-zebra. Para concluir que essa região do gene poderia não estar acessível no estadio de desenvolvimento de embrião de 24h, testámos dois factores: o protocolo de extração de ADN em embriões de 24h e os estadios de desenvolvimento até aos 5 dias de idade. Para testar a extração de ADN em embriões de 24h, comparámos a amplificação a partir de ADN genómico extraído de embriões de 24h para dois genes: tyrosinase e DIA1R (amplificação deste gene em embriões de 24h já tinha sido anteriormente observada) como controlo. Foi possível observar que para o o gene DIA1R continuava a existir amplificação do gene, ao contrário do gene da tyrosinase. De seguida, para testar em que estadio de desenvolvimento a amplificação da região pretendida do gene da tyrosinase começava a ser observada, extraímos ADN de embriões de 24h, larvas de 72h, larvas com 3 dias e larvas com 5 dias de idade, seguidas de reações de PCR para amplificação dessa mesma região. Amplificação da região pretendida do gene tyrosinase a partir de ADN genómico extraído de larvas de 5 dias foi observada, no entanto é uma amplificação muito diminuta. A microinjeção em mosca-da-fruta de guideRNA in vitro ao contrário de em plasmídeo, apesar de ter sido mostrado por outros investigadores, ser mais eficiente, leva a um processo de produção de guideRNA mais dispendioso e demorado. Ao optimizar este protocolo em mosca-da-fruta estaríamos a ultrapassar essas dificuldades. No entanto, não foi possível terminar a experiência sendo por isso necessária a continuação deste projecto. Pudemos apenas concluir que a co-microinjeção de guideRNA com proteína Cas9 não é eficiente, uma vez que a concentração necessária de proteína Cas9 é muito maior do que a que foi possível utilizar neste projeto. Por último, o protocolo foi utilizado em murganhos e neste caso, obtivemos 41 animais provenientes de microinjeção de guideRNA e proteína Cas9, mas nenhum apresentava fenótipo facilmente observável ao nível da pigmentação da pelagem. No entanto, estudos em tyrosinase em murganhos mostram resultados de animais sem fenótipo de pigmentação mas que apresentavam mutações quando genotipados, passo essencial para uma conclusão definitiva quanto à aplicabilidade deste método na geração de mutantes em murganho, mas que, infelizmente e por constrangimentos temporais não conseguimos efetuar em tempo útil. Concluimos que conseguimos reproduzir com sucesso o protocolo em peixe-zebra. Em mosca-da-fruta, o mesmo protocolo de produção e injeção de guideRNA poderá funcionar mas será preciso adpatar a entrega da proteína Cas9. Por útlimo, em murganhos parece que o protocolo a usar poderá ser muito semelhante ao do peixe-zebra, no entanto fica por confirmar o sucesso na produção de mutantes. Model organisms are non-human species, that due to similarities with the human organism, are studied in the expectation of discovering gene functions, cure for diseases, improvements in healthcare and welfare. Danio rerio, Drosophila melanogaster and Mus musculus are examples of model organisms widely used in all biomedical research fields. To study gene function, production of knockout animals is an important approach. The CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis technology offers the possibility of targeting any gene of interest as long as there is a proto-spacer adjacent motif (PAM) in that region, a gRNA and a Cas9 protein. Cas9 protein makes a DSB in the DNA that the cell tries to fix through the NHEJ mechanism. This mechanism is not always efficient and small base deletions or insertions may arise, causing a frameshift that leads to the production of a deficient protein or null protein, causing a knockout of the gene. A common protocol for gRNA production and knockout generation that fits all three model organisms above referred, is not yet available. In this project, we first did a proof of principle with a pre-existing protocol for gRNA production and knockout zebrafish production. When establishing the zebrafish protocol, the main objective was to use the same protocol structure to produce knockout animals in both fruit fly and mouse, making the necessary optimizations regarding differences in embryonic development. To do this, genes that would cause a phenotypic readout were chosen: tyrosinase in zebrafish and mouse, and yellow in fruit fly. The tyrosinase gene in zebrafish was successfully mutated and mosaic phenotypic and genotypic disruption was observed. Co-microinjection of gRNA for the yellow gene in fruit fly with Cas9 protein didn’t produce a positive result, since Cas9 protein is required in a much higher concentration in the cell. For this animal model, we concluded it was best to micro-inject the gRNA in embryos already producing the Cas9 protein. In mouse, injection of Cas9 protein and gRNA targeting the tyrosinase gene resulted in the successful generation of 41 animals, but we fail to observe a clear tyrosinase mutant. N/A