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Anche se i virus influenzali di tipo A sono noti da quasi un secolo, molto resta ancora da capire sulla loro complessa epidemiologia. Studi sul campo hanno contribuito a spiegare meglio la loro relazione con gli uccelli acquatici.

Conjunctival swabs from 44 free-living wild boars culled during a demographic control program applied in a Regional Park located in the Northern Italy were examined by 16S rRNA encoding gene nested PCR. In total, 22 (50%) wild boars were PCR positive. Sequencing of the amplicons identified Chlamydia suis and Chlamydia pecorum in 12 and 5 samples, respectively. For one sample found PCR positive, the nucleotide sequence could not be determined. Four conjunctival samples showed 92% sequence similarities to 16S rRNA sequences from Chlamydia-like organisms, as well as large intestine, uterus, and vaginal swab from the same four animals. Amoeba DNA was found in one Chlamydia-like organism positive conjunctival swab. To our knowledge, this is the first detection of members of the Parachlamydiaceae family in wild boars, confirming a large animal host range for Chlamydia-like organisms.

Exploring the reassortment ability of the 2009 pandemic H1N1 (A/H1N1pdm09) influenza virus with other circulating human or avian influenza viruses is the main concern related to the generation of more virulent or new variants having implications for public health. After different coinfection experiments in human A549 cells, by using the A/H1N1pdm09 virus plus one of human seasonal influenza viruses of H1N1 and H3N2 subtype or one of H11, H10, H9, H7 and H1 avian influenza viruses, several reassortant viruses were obtained. Among these, the HA of H1N1 was the main segment of human seasonal influenza virus reassorted in the A/H1N1pdm09 virus backbone. Conversely, HA and each of the three polymerase segments, alone or in combination, of the avian influenza viruses mainly reassorted in the A/H1N1pdm09 virus backbone. Of note, A/H1N1pdm09 viruses that reassorted with HA of H1N1 seasonal human or H11N6 avian viruses or carried different combination of avian origin polymerase segments, exerted a higher replication effectiveness than that of the parental viruses. These results confirm that reassortment of the A/H1N1pdm09 with circulating low pathogenic avian influenza viruses should not be misjudged in the prediction of the next pandemic.

Recent studies showed that low-pathogenic (LP) avian influenza viruses (AIVs) stuck on wild ducks' feathers during migration can be infectious. In addition, experimental reproduction of AIV infection by allopreening route, showed that viruses stuck on ducks’ feathers could be infectious several weeks after the end of enteric viral shedding. In this work we investigated whether infectious AIVs covering feathers may evade the duck’s immune system. Cloacal swabs, feather swabs and serum samples were collected from 202 wild mallards trapped in Central Italy during the wintering and spring migration (December 2006-March 2007). Both feather and cloacal swabs were screened by reverse transcription (RT)-PCR, specific for virus matrix gene, and then tested by virus isolation (VI) assays. Sera were tested for the presence of antibodies against influenza A virus nucleoprotein by NP-ELISA. Seroprevalence for influenza A virus was 89% (179/202); 51.4% (92/179) and 19.5% (35/179) of these seropositive mallards, tested RT-PCR positive for AIVs on feather and in cloaca respectively. LPAIVs were isolated from 12 feather swabs and from 11 cloacal swabs. NP-ELISA positive sera from 10 ducks found to be H10N7 VI-positive on feathers and VI-negative from cloaca were also investigated by hemagglutination inhibition assay (HI), using as antigen an LPAIV H10N7 strain isolated from feather swabs in this study. HI results showed that one of 10 mallards was immune against homologous H10N7, showing an HI titre of 1:32-64. Our results show evidences suggesting that birds carrying viruses on their feathers might have a post-infection immunity and play an active role in spreading AIVs infection in nature.

Sardinia is a Mediterranean island with a long geological history, leading to a separation process from continental Europe during Miocene. As a consequence, in this insular habitat some wild bird species developed endemic forms, some of which are currently threatened. The aim of this study is to evaluate the presence and the possible health risk associated with a potential avian influenza virus (AIV) circulation in Sardinian wild bird populations. Overall 147 cloacal swabs were sampled in the Sardinia Region from June 2009 to September 2011. Samples were obtained from 12 different taxonomic orders including 16 family and 40 species of birds. Based on the endangered host status or on the ecology of the host/virus interaction, samples were divided into three groups of species: endemic and/or endangered (n. 17 species), potential reservoir (n. 21 species) and potential spill-over (n. 2 species). Cloacal swabs were tested by reverse transcription (RT)-PCR for influenza A virus M-gene amplification. Forty-one serum samples were tested for antibodies against influenza A virus nucleoprotein by NP-ELISA and for detection of seropositivity against H5 and H7 AIV subtypes. No cloacal swabs tested RT-PCR positive for AIV, while two weak serological positive results were detected by NP-ELISA in a Mallard duck (Anas platyrhynchos) and in a Yellow-legged gull (Larus michahellis). The low or absent AIV circulation detected in Sardinia's wild birds during the study period, suggests a naїve status in these avian populations. A possible occurrence of AIV exposure of susceptible endemic species, might represent a cause of transition from compensatory to additive mortality which can contribute to increase a possible extinction process.

La tubercolosi, importante patologia riemergente sostenuta da micobatteri, causa nell’uomo e negli animali morbilità, mortalità e danni economici. In particolare Mycobacterium bovis rappresenta un importante problema di sanità pubblica per la sua capacità di infettare animali domestici, selvatici e uomo, mentre M. avium è patogeno per il suino ed è segnalato come patogeno umano in soggetti immunodepressi. L’infezione da M.bovis, M. avium e altri micobatteri è stata diagnosticata nel cinghiale (Sus scrofa) in molti Paesi europei, compresa l’Italia. Erysipelothrix rhusiopathiae è l’agente causale del mal rosso, malattia zoonosica diffusa in tutto il mondo con importante impatto economico sull’allevamento suino. Sebbene descritta nel cinghiale, esistono attualmente pochi studi sulla suscettibilità all’infezione e sul ruolo epidemiologico di tale suide selvatico. Nel presente lavoro sono state svolte indagini microbiologiche volte alla ricerca di tali agenti zoonosici in una popolazione di cinghiali a vita libera in Provincia di Bologna, per valutare l’implicazione di questo ungulato, in continua espansione demografica, nell’epidemiologia di tali infezioni.

Il maiale domestico (Sus scrofa domestica), condividendo con gli uccelli e i mammiferi i recettori cellulari per i virus influenzali, svolge un ruolo epidemiologico chiave nell’ecologia del virus dell’influenza di tipo A ed in particolare nell’emergenza di nuovi ceppi, come confermato dall’origine suina del virus pandemico H1N1 del 2009. Il cinghiale (Sus scrofa) è il progenitore selvatico del maiale domestico, con cui condivide sia una stretta affinità genetica sia la suscettibilità verso numerosi agenti patogeni, tra cui i virus influenzali. La sottospecie nominale (Sus scrofa scrofa) è la più comune e diffusa in Eurasia, dove può arrecare gravi danni economici e ambientali. Se da un lato l’epidemiologia delle infezioni da virus influenzali di tipo A ed il relativo impatto economico negli allevamenti suini sono noti, vi sono ancora scarse informazioni sulla dinamica di circolazione del virus nelle popolazioni di cinghiali a vita libera. Nel presente lavoro è stata condotta un’indagine sierologica per valutare l’esposizione a virus influenzali di tipo A di una popolazione di cinghiali a vita libera distribuiti in un'area protetta della Provincia di Bologna. Metodi. Durante i periodi maggio 2002-luglio 2003 e aprile 2010-aprile 2011, sono stati raccolti 741 campioni di sangue prelevati da cinghiali catturati o abbattuti selettivamente nel Parco Regionale dei Gessi Bolognesi e Calanchi dell’Abbadessa. In questa area protetta di 4.844 ettari situata nella fascia collinare preappenninica bolognese, dal maggio 2002 è applicato un modello di gestione demografica densità-dipendente basato sulla selezione ed il mantenimento di una popolazione a densità nota strutturata in base ad una piramide di popolazione sesso-età dipendente. In funzione dell’eruzione dentaria, gli animali campionati sono stati suddivisi in tre classi di età: 1a classe, 14 mesi. Per differenziare le positività sierologiche dovute ad immunità passiva materna (IPM) da quelle indotte da una risposta sierologica attiva (RSA) post-infezione, la 1a classe è stata ulteriormente suddivisa nelle sottoclassi 1a-IPM e 1a-RSA che comprendono rispettivamente i cinghiali di età

Sus scrofa scrofa, the most common and invasive Eurasian subspecies of wild boar, is the wild ancestor of domestic pig (Sus scrofa domestica), with which it shares close genetic affinity and susceptibility to most pathogens, including influenza viruses. Although much is known about the occurrence of influenza A virus infection in domestic swine herds, there is little information concerning the virus circulation in wild boar populations. During the periods May 2002-July 2003 and April 2010-April 2011, 741 serum samples were collected from free-living wild boars, captured in the Gessi Bolognesi Regional-Park (48.15 km2 area, located in the Emilia-Romagna Region, Northern Italy). Animals were categorised in 3 age classes: 1st class, 14 months. Two-fold serial dilutions of sera were tested for the presence of antibodies against influenza A nucleoprotein by a standard ELISA technique. Antibody titres of 1:8 or more were considered positive. The highest overall seroprevalence was found in the second period: 1.8% (9/502) in 2002-2003 vs. 18.8% (45/239) in 2010-2011. Likewise, age class-based seroprevalences showed higher values in the 2010-2011 period: 1st class, 2.3% (6/263) vs. 24.7% (20/81); 2nd class, 0.8% (1/132) vs. 11.1% (6/54); 3rd class, 1.9% (2/107) vs. 18.3% (19/104). Nine seropositive subjects were characterised by 1:8 titre in the first period, whereas in the second one the following seropositive frequencies were detected: n. 25 (1:8), n. 12 (1:16), n. 6 (1:32), n. 1 (1:64), n. 1 (1:128). Serologic data show an increased circulation of influenza A viruses in the second study period, despite a demographic control program has reduced population density in the area from about 13.5 wild boars/km2 (2002-2003) to about 7.3 wild boars/km2 (2010-2011). Although data from the end of 2003 to mid 2010 are missing, the higher antibody prevalences found in the second period in all age classes, could be the consequence of a new virus introduction in the study area. Infected wild boars could contribute to maintenance of the viral transmission cycle in natural habitats, thus representing a potential threat not only to humans involved in game and wildlife management programs but also to other wild and domestic susceptible species.

Nelle prime due settimane di gennaio 2011, circa 3.000 carcasse di tortore dal collare (Streptopelia decaocto) a vita libera sono state rinvenute nei pressi di un sito industriale, in provincia di Ravenna, dedito alla lavorazione di partite di semi o loro residui. L’esame autoptico di 322 soggetti evidenziava prevalentemente un grave danno renale, epatomegalia e ipoplasia splenica. Gli esami istologici a livello del rene mostravano nefrosi associata a necrosi tubulari e una nefrite interstiziale linfoplasmacellulare. Inoltre, si osservavano deplezione linfocitaria nella milza unitamente ad emosiderosi splenica ed epatica. La stima dell’età su 46 soggetti identificava il 78% di adulti e il 22% di giovani (entro il primo anno di vita). Le analisi chimiche sulle ingesta e su pool di fegati non evidenziavano tossicità da pesticidi clorurati e fosforati, carbammati, triazine, piretroidi, stricnina, neonicotinoidi, Pb, Cd, Cr, Hg, Zn, Cu, micotossine, perossidi. Indagini molecolari (RT-PCR Real-Time) escludevano la presenza di virus influenzali, mentre veniva evidenziato RNA di Paramyxovirus aviario tipo 1 (APMV-1) tramite RTPCR in 176 su 193 animali analizzati. L’isolamento di 27 ceppi di APMV-1 è stato ottenuto inoculando pool di organi su uova embrionate di pollo SPF. Tali ceppi risultavano patogeni in base alla sequenza aminoacidica del sito di clivaggio della proteina di fusione. Il sequenziamento parziale del gene F ha permesso di identificare 2 differenti genotipi cocircolanti: il lineaggio 4b (APMV-1 ceppo piccione) e un distinto cluster genetico del lineaggio 4.

Wild aquatic birds are reservoir hosts perpetuating the genetic pool of all influenza A viruses, including pandemic ones. High viral loads in feces of infected birds allow fecal-oral transmission. However, this route does not fully account for the efficiency of avian influenza virus (AIV) spread since dilution of infectious feces in water progressively decreases the chances of virus/host interaction. We investigated whether preen oil gland secretion, by which all aquatic birds make their feathers waterproof, could support a natural concentration mechanism of AIVs from water to birds’ bodies, thus favouring virus spread and persistence in the aquatic environment. First, we detected consistently both viral genome and infectious AIVs on swabs taken by rubbing preened feathers of 345 wild mallards and examined by reverse transcription (RT)-PCR and virus isolation (VI) assays. Second, in two laboratory experiments using a quantitative real-time (qR) RT-PCR, we demonstrated that feather samples (n=5) and cotton swabs (n = 24) experimentally impregnated with preen oil, when soaked in AIV-contaminated waters, attracted and concentrated AIVs on their surfaces, as shown by statistical analysis. Third, we experimentally coated 7 mallards with a preen oil-AIV mix, and housed them with a control, uncoated, duck. Through self- and/or allopreening behaviour, all birds ingested the virus, as shown by virus detection in both oro-pharyngeal and cloacal samples. Virus isolation from cloacal swabs and virus-specific antibody response confirmed the occurrence of mallards’ infection. Infectious AIVs were isolated from ducks’ body surface until 32 days after the experimental coating.Our field and experimental results indicate that AIVs can be naturally concentrated and carried on the feather surface of infected ducks (i.e., those VI-positive from both cloacal and feathers swabs) and uninfected ones (i.e., those VI-positive from feathers only). In such a context, the natural preening behaviour, by which waterbirds spread preen oil all over their plumage (self-preening) or other birds’ plumage (allo-preening), could facilitate the ingesion of AIV particles stuck on birds’ feathers, thus promoting a preening-mediated infection route. Our findings also suggest that during the time period between the virus adhesion to the bird’s body and the infection (possibly due to self- and/or allopreening), the virus could move in nature with the host by an undescribed circulation mechanism. We demonstrate here a novel viral transmission route that adds to, and possibly contributes to explain the knowledge of longdistance movements and long-term infectivity of lowly and highly pathogenic AIVs in nature.

La scoperta e le sue implicazioni I risultati di laboratorio hanno dimostrato la presenza di un meccanismo attivo di raccolta e concentrazione dei virus influenzali che consente e facilita la comparsa di nuove infezioni nel sistema serbatoio , e che permette ai virus di esistere nel tempo. Alla luce di ciò, è possibile ipotizzare un nuovo ciclo naturale che spiega molti aspetti sconosciuti del rapporto tra virus e ospite selvatico. Agli occhi di questa scoperta, il ciclo naturale ipotetico che potrebbe avvenire durante la migrazione degli uccelli selvatici è così riassunto. I soggetti infetti posso contaminare gli specchi d’acqua con quantità variabilissime di virus che possono dare origine all’infezione diretta di altri soggetti attraverso la classica via oro fecale con conseguente malattia e morte per alcuni di loro. Nello stesso stormo altre anatre non interagiranno con l’ambiente contaminato, mentre alcune di loro che hanno nuotato dove l’acqua era contaminata da virus migreranno verso nuove aree portando con se concentrazioni elevate di virus adesi al piumaggio. Non ammalarsi subito permetterà loro di proseguire la migrazione per migliaia di chilometri. Nelle nuove aree di sosta, dopo ore ed ore di volo gli stormi di uccelli ricomporranno ed impermeabilizzeranno nuovamente il piumaggio, ed è attraverso questo comportamento che si potranno infettare. E’ comune infatti nelle anatre selvatiche oltre a pulire il proprio (self preenig) pulirsi reciprocamente il piumaggio (allopreenig). Questo meccanismo permette quindi al virus di fissarsi all’ospite e di trasformarne il comportamento in una sorta di Timer dove una potenziale infezione può avvenire anche a un mese di distanza dal “contatto” con il virus incontrato e “fissato” in natura

Ecologicamente, I virus influenzali si comportano in natura come micropredatori dal ruolo eclettico. Evolversi in questo “Universo” cellulare dove i pianeti sono individui e le loro popolazioni un potenziale infinito non visibile con occhi molecolari, è tutt’altro che facile. Questa situazione è alquanto instabile perché condizionata dalla lotta tra i nuovi virus appena mutati all’interno della popolazione (varianti) che con l’incrementare del loro numero tendono ad occupare le aree centrali di questa nuvola. Nelle specie di nuova colonizzazione da parte del virus, il turnover con la comparsa di nuovi individui (varianti) in forte competizione tra loro è particolarmente rapida. È alla base di tale velocità replicativa che origina l’incremento potenziale di aggressività. Più alto è il numero di replicazioni del virus (tasso di replicazione) e maggiore diviene quello delle mutazioni (tasso di mutazione). Per un virus il cui acido nucleico è costituito da RNA, non è possibile intervenire per riparare qualsiasi errore accidentale avvenga nelle diverse fasi della replicazione di se stesso.

Il riassortimento genetico umano/aviario nei virus responsabili delle pandemie influenzali umane del 1957 (H2N2) e 1968 (H3N2), ha evidenziato l'importante ruolo degli uccelli nell'emergenza e diffusione nella popolazione umana di virus influenzali di tipo A. La via di trasmissione indiretta dell'infezione, attraverso specie mixing vessel quali il suino, è stata inizialmente ritenuta fondamentale per il salto di specie dai volatili all'uomo. Tuttavia, a partire dall'emergenza del virus A/H5N1 nel 1997, le evidenze virologiche e sierologiche di trasmissione diretta di virus influenzali dal pollame all'uomo, precedentemente sporadiche, sono aumentate risultando talora associate a infezioni letali (H5N1, H7N7). Tali eventi sottolineano, inoltre, il rischio pandemico legato a un eventuale riassortimento genetico tra Virus Influenzali Aviari (AIVs) ed umani. Al fine di valutare la possibile trasmissione di AIVs di sottotipo H5/H7 in operatori del settore avicolo italiano, è stata effettuata un'indagine sierologica per la ricerca di anticorpi specifici. Un totale di 81 sieri umani è stato incluso nello studio. Di questi, 50 sono stati raccolti nel 2005-2006 da lavoratori operanti in allevamenti avicoli free range nella provincia di Ravenna, precedentemente interessata dalla circolazione di sottotipi H5N9 e H7N1 di AIVs. Gli altri 31 sieri sono stati prelevati da lavoratori esposti al contagio, in seguito ad alcuni focolai di influenza aviaria verificatisi in allevamenti dell'Italia settentrionale e causati dai seguenti sottotipi virali a bassa patogenicità (LP): A/H7N3, Veneto, 2007; A/H5N2, Emilia-Romagna, 2007; A/H5N1, Veneto, 2008. Per la ricerca di anticorpi, è stato impiegato un test di inibizione della emoagglutinazione (HI) modificato, con emazie di equino. I 50 sieri raccolti nel 2005-2006, sono stati saggiati nei confronti di 8 diversi ceppi antigenici LP H5 e H7 (1 H5N1, 3 H5N2, 1 H5N3, 1 H5N9, 1 H7N1, 1 H7N3), isolati negli ultimi 15 anni in Italia. Nelle analisi effettuate sui campioni di siero 40 raccolti nell'ambito di specifici focolai nel pollame, gli stessi stipiti virali isolati durante il focolaio, ove possibile, sono stati impiegati come antigeni. Risultati e conclusioni. Tutti i sieri esaminati sono risultati negativi. L'elevata sensibilità del metodo HI impiegato, dovuta all'utilizzo delle emazie di cavallo, caratterizzate da una maggiore capacità di legarsi ai virus influenzali aviari rispetto a quelle di tacchino/pollo, unita ad una scelta mirata degli antigeni virali impiegati nelle prove, indicano l'assenza di anticorpi specifici anti-H5/H7 nei sieri dei soggetti esaminati. Ciò potrebbe essere dovuto a vari fattori quali la non-trasmissibilità all'uomo dei virus circolanti nei volatili o la limitata esposizione dei lavoratori dovuta alla rapida estinzione dei focolai nel pollame.

Nonostante P. apennina sia una specie ad areale contratto e quindi prevedibilmente sottoposta a deriva genetica, presenta un livello di variabilità intraspecifica moderatamente alto. Questo può essere dovuto a fattori quali la recente speciazione avvenuta in seguito alla frammentazione dell’habitat di una specie a più ampia diffusione durante i cicli glaciali ed interglaciali del Pleistocene, o agli alti tassi di allogamia favorita dall’eterostilia che facilita lo scambio di polline tra individui geneticamente diversi, mantenendo un elevato flusso genico. La modesta differenziazione tra le popolazioni potrebbe essere attribuita ad una recente frammentazione dell’areale in conseguenza a cambiamenti climatici recenti e all’influenza delle attività umane. Le previsioni per questa specie sono quindi incoraggianti considerando l’alto tasso di variabilità intraspecifica mantenuta fino ad oggi, tuttavia sarebbe opportuno attuare strategie di protezione delle popolazioni naturali di P. apennina allo scopo di preservare tale variabilità.

La variabilità genetica è un importante strumento per lo studio e la conservazione della biodiversità in specie rare e minacciate di estinzione. Durante il mio dottorato mi sono quindi occupata di mettere a punto diverse metodologie molecolari al fine di valutare la diversità genetica in due specie rare della flora italiana che presentano problematiche diverse e specifiche. I marcatori arbitrari RAPD e i marcatori semi-arbitrari ISSR sono stati utilizzati per valutare la diversità genetica in Quercus crenata Lam. e per confermare l’ipotesi della sua origine ibridogena dalle due specie presunte parentali Quercus cerris L. e Quercus suber L., essendo Q. crenata presente in Italia settentrionale dove Q. suber è attualmente assente. I marcatori SSR o microsatelliti sono invece stati messi a punto su una specie a rischio di estinzione, endemica dell’Appennino Tosco-Emiliano, Primula apennina Widmer, applicando una metodologia specifica, basata sulla costruzione di una libreria genomica arricchita per l’isolamento di primer specifici. I marcatori RAPD e ISSR, utilizzati su un totale di 85 campioni, hanno mostrato alti livelli di diversità molecolare entro le specie studiate, eccetto per Q. suber le cui popolazioni rappresentano il margine orientale di distribuzione della specie, per questo più sottoposte ad impoverimento genetico. Oltre alla cluster analysis (UPGMA) e alla Analisi delle Componenti Principali effettuate per entrambi i marcatori, che confermano l’ipotesi dell’origine ibrida degli individui di Q. crenata diffusi in Italia Settentrionale, sono stati calcolati l’indice di ibridità basato sul maximum likelihood, che dimostra una introgressione asimmetrica di Q. crenata verso il parentale caratterizzato da superiorità demografica (Q. cerris) e il test di Mantel. Quest’ultimo ha permesso di confrontare i due marcatori RAPD e ISSR utilizzati ottenendo una bassa correlazione, a conferma del fatto che, amplificando tratti differenti del DNA nucleare, i dati non sono sovrapponibili, sebbene forniscano risultati analoghi. Per l’isolamento di loci microsatelliti ipervariabili ho utilizzato il protocolllo FIASCO (Fast isolation by AFLP of sequences containing repeats- Zane et al. 2002) che permette di costruire una libreria genomica arricchita partendo dal DNA estratto da P. apennina. Tale procedura ha previsto la digestione del DNA genomico per la produzione di una miscela di frammenti di DNA. Tramite ibridazione con opportune sonde sono stati isolati i frammenti contenenti i microsatelliti. Sequenziando i cloni ricombinanti, ho ottenuto sequenze contenenti repeats sulle cui regioni fiancheggianti sono stati costruiti 15 coppie di primer che potranno, in seguito, essere utilizzate per definire la quota di riproduzione clonale in P. apennina e per valutare la diversità genetica delle popolazioni che coprono l’areale di distribuzione della specie. Data la loro natura altamente variabile e la loro abbondanza nel DNA, gli SSR saranno, come i marcatori RAPD e gli ISSR, ugualmente validi per lo studio della variabilità genetica e per l’analisi di problematiche specifiche legate alle specie rare.

Influenza A viruses (IAV) have been repeatedly demonstrated to circulate in wild suid populations. In this study, serum samples were collected from 2618 free-ranging wild boars in a protected area of Northern Italy between 2007 and 2014, and firstly screened by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the presence of antibodies against IAV. The ELISA-positive samples were further tested by hemagglutination inhibition (HI) assays performed using antigen strains representative of the four major swine IAV (sIAV) lineages circulating in Italy: avian-like swine H1N1, pandemic-like swine H1N1, human-like swine H1N2 and human-like swine H3N2. An overall seroprevalence of 5.5% (145/2618) was detected by ELISA, with 56.7% (80/141) of screened sera tests positive by HI assay. Antibodies against H1N1 subtypes were the most prevalent beginning in 2009—with the highest detection in the first quarter of the year—until 2013, although at a low level. In addition, antibodies to H3N2 subtype were found during six years (2007, 2009, 2010, 2011, 2012 and 2014) whereas H1N2 antibodies were detected in 2012 only. Of the HI-positive samples, 30% showed reactivity to both H1N1 and H3N2 subtypes. These results provide additional insight into the circulation dynamics of IAV in wild suid populations, suggesting the occurrence of sIAV spillover events from pigs to wild boars.

A. nebrodensis (Nebrodi fir, Sicilian fir) is restricted to a small area of the Madonie Natural Park in Sicily. According to recent estimates, its only population consists of 30 adult individuals and a fluctuating number of juveniles derived from natural regeneration; besides, some hundreds of cultivated plants are preserved as ex situ collection. We used RAPD data from six 10-mer primers to examine the consequences of extensive historical clearance and human pressures on the extant population. Data from multiple life stages and different habitat conditions were considered, affording an opportunity to ascertain for the first time the structure of genetic variation in the extant uneven-aged population on both spatial and temporal scale. Consistent with previous works, we found that the history of disturbance and past land use did not affect drastically the biological diversity of the present-day population. Considerable levels of genetic variation were detected both in adult and juvenile sets. The non-significant correlation between genetic and physical distances (Mantel test; r = - 0.075) revealed a random distribution of genotypes in the natural stand. When the juvenile set was divided in 17 subsets, based on maternal provenance and growing conditions, Shannon's index (54%) and AMOVA analysis (84%) indicated that most of genetic variation resides within subsets. Neighbour-joining cluster analysis supported the hypothesis of high crossfertilization rates expected for a woody perennial species; nevertheless some grouping of related individuals suggested partial inbreeding and a weak pattern of genetic structure. Changes in structure can occur as the progeny ages and offspring thinning is responsible for moulding patterns of genetic diversity and population structure in time.