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Agradecimentos: The authors would like to thank the São Paulo Research Foundation—FAPESP (Process Number 2018/00432-1, 2018/11849-0, 2020/07470-6 and 2020/10809-5) and the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-CAPES (Finance Code 001 and Projeto INSPEQT, Edital No. 16/2020, Process Number 88887.516176/2020-00) for the financial support Abstract: We have developed and validated a high-sensitivity method to quantify lysergic acid diethylamide (LSD) and 2-oxo-3-hydroxy-LSD (OH-LSD) in oral fluid samples using liquid–liquid extraction and liquid chromatography—tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The method was applied to the quantification of both substances in 42 authentic oral fluid samples. A liquid–liquid extraction was performed using 500 µL each of samples (oral fluid samples collected using Quantisal™ device) and dichloromethane/isopropanol mixture (1:1, v/v). Enzymatic hydrolysis was evaluated to cleave glucuronide metabolites. The limit of quantification was 0.01 ng/mL for both LSD and OH-LSD. The linearity was assessed between 0.01 and 5 ng/mL. Imprecision and bias were not higher than 10.2% for both analytes. Extraction recovery was higher than 69%. The analytes were stable in the autosampler at 10 °C for 24 h, and up to 30 days at 4 and -20 °C. The method was applied to the analysis of 42 oral fluid samples. LSD was detected in all samples (concentrations between 0.02 and 175 ng/mL), and OH-LSD was detected in 20 samples (concentrations between 0.01 and 1.53 ng/mL). A high-sensitive method was fully validated and applied to authentic samples. To our knowledge, this is the first work to report concentrations of LSD and OH-LSD in authentic oral fluid samples FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES Aberto

Agradecimentos: The authors thank the Superintendence of the Technical Scientifc Police of the State of Sao Paulo for kind donation of data, and the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES—Projeto INSPEQT, Edital No. 16/2020), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Processo 2021/09857-8) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científco e Tecnológico (CNPq) for the fnancial support Abstract: MDA-19 or BZO-HEXOXIZID (N'-[(3Z)-1-(1-hexyl)-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-ylidene]-benzohydrazide), in a more recent nomenclature, was first synthesized in 2008 as a selective type-2 cannabinoid receptor (CB2) agonist due to its potential to treat neuropathic pain. In Brazil, this substance was identified in a series of 53 apprehensions between September 2021 and February 2022. Nevertheless, what intrigues toxicologists is that BZO-HEXOXIZID does not exert significant type-1 cannabinoid receptor (CB1) agonism—which is responsible for the well-known psychoactivity of ?-9-tetrahydrocannabinol. Thus, the objective of this work is to report the first apprehension and identification of BZO-HEXOXIZID in Brazil and to discuss pharmacologically the possible reasons why a CB2 agonist has been incorporated to the illicit market. Suspected seized samples were sent to the Laboratory of the Scientific Police of the State of Sao Paulo. After the screening, samples were confirmed for the presence of BZO-HEXOXIZID using chromatography gas—mass spectrometry, Fourier-transform infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance techniques. Of the 53 samples analyzed, 25 contained only BZO-HEXOXIZID and 28 with mixtures, of which 11 with the CB1 agonist ADB-BUTINACA. Other substances were found in association such as cocaine and caffeine. BZO-HEXOXIZID was detected in a series of seized materials for the first time in Brazil. Nevertheless, there are still unanswered questions regarding the use of this selective CB2 agonist as a drug of abuse COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Aberto

Agradecimentos: The authors would like to thank Dr. Barry Logan for a general review of the manuscript. This study was financed in part by the Coordenaç~ao de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior—Brasil (CAPES)—Finance Code 001 (INSPEQT Project, Edital 16/2020, Processo 88887.516176/2020-00) Abstract: Synthetic cathinones are a class of novel psychoactive substances, commonly tested in seized materials by forensic chemistry laboratories. These drugs have been found in different types of seized materials including powders, tablets, liquids, herbs, and blotters. A comprehensive review of the literature shows that the analyses of synthetic cathinones have been performed by a diverse repertoire of techniques, from more traditional to emerging methods. Techniques commonly used in the analysis of "traditional" illicit drugs, such as color and microcrystalline tests, chromatography, capillary electrophoresis, mass spectrometry (MS), and infrared (IR), and Raman spectroscopies, have been used for screening and/or confirmatory purposes, depending on the technique and laboratories preference. However, other emerging techniques, such as nuclear magnetic resonance, high-resolution MS, direct analysis in real-time MS, gas chromatography with IR detection, and so on, have been drawing the attention of forensic scientists due to the advantages of these techniques in providing important structural data. It is important to consider that each technique presents analytical benefits and limitations, which should be considered when analyzing synthetic cathinones in seized materials. Furthermore, the combination of more than one analytical technique is always recommended, especially when an unknown synthetic cathinone is suspected and/or encountered in the sample COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES Aberto

Agradecimentos: We are thankful to São Paulo Research Foundation (FAPESP) (Grant no. 2017/02147-0), National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (Grant nos. 142398/2018-7 and 308843/2019-3), and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Finance Code 001 Abstract: Cannabinoids are pharmacologically active compounds present in cannabis plants, which have become important research topics in the modern toxicological and medical research fields. Not only is cannabis the most used drug globally, but also cannabinoids have a growing use to treat a series of diseases. Therefore, new, fast, and efficient analytical methods for analyzing these substances in different matrices are demanded. This study developed a new packed-in-tube solid-phase microextraction (IT-SPME) method coupled to liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC–MS/MS), for the automated microextraction of seven cannabinoids from human urine. Packed IT-SPME microcolumns were prepared in (508 µm i.d. × 50 mm) stainless-steel hardware; each one required only 12 mg of sorbent phase. Different sorbents were evaluated; fractional factorial design 24-1 and a central composite design were employed for microextraction optimization. Under optimized conditions, the developed method was a fast and straightforward approach. Only 250 µl of urine sample was needed, and no hydrolysis was required. The sample pretreatment included only dilution and centrifugation steps (8 min), whereas the complete IT-SPME–LC–MS/MS method took another 12 min, with a sample throughput of 3 samples h-1. The developed method presented adequate precision, accuracy and linearity; R2 values ranged from 0.990 to 0.997, in the range of 10–1000 ng ml-1. The lower limits of quantification varied from 10 to 25 ng ml-1. Finally, the method was successfully applied to analyze 20 actual urine samples, and the IT-SPME microcolumn was reused over 150 times FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES Fechado

Agradecimentos: The author would like to thank Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (process number 830631/1999-2), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (process number 2020/10809-5) and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, Brazilian research funding agencies Abstract: Brazil is the third largest contributor to Green Analytical Chemistry, and there is significant participation of toxicologists in the development and improvement of environmental techniques. Currently, toxicologists have their own strategies and guidelines to promote the reduction/replacement or elimination of solvents, reduce the impacts of derivatization and save time, among other objectives, due to the peculiarities of toxicological analysis. Thus, this review aims to propose the concept of Green Analytical Toxicology and conduct a discussion about its relevance and applications specifically in forensic toxicology, using the microextraction methods developed for the determination of cocaine and its metabolites as examples FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO (FAPESP) CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO (CNPQ) COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR (CAPES) Fechado

Introduction:Ayahuasca is a traditional psychoactive tea of Amazonian indigenous, used medicinal and spiritual purposes. Wide variation in the concentration ofN,N-dimethyltryptamine (DMT), Harmaline (HRL), Harmine (HRM) and Tetrahydroharmine (THH) alkaloids in Ayahuasca has been reported worldwide. Objective:To evaluate the causes of variations in alkaloids concentrations of Ayahuasca prepared with fresh and dehydrated plants from different environments and determine the best drying method to plants according to alkaloids content and cytotoxicity of Ayahuasca tea. Material and methods:The environment interference on the alkaloids of the two species was evaluated in samples of Ayahuasca tea prepared with fresh plants. The most suitable drying process to the two species was evaluated in sample Ayahuasca tea prepared with plants submitted to drying under the sun conditions and five different temperatures in forced circulation oven. The concentration of the alkaloids determined by high performance liquid chromatography with UV-vis detector with diode array detection (HPLC-DAD). Thein vitrocytotoxicity of Ayahuasca was evaluated in human keratinocytes cells (HaCaT) by colorimetric assay. Results:Environmental characteristics, preparation process and temperature of plants drying interfered on DMT, HRL, HRM and THH concentrations of Ayahuasca. No effect cytotoxicity was detected with relationship to psychoactive alkaloids in samples of Ayahuasca tea prepared with fresh or dried plants. Conclusion:Concentration of DMT, HRL, HRM and THH alkaloids in Ayahuasca are influenced by plants environmental. The most suitable drying process was obtained in forced circulation oven at 43 and 45°C toP. viridisleaves andB. caapistems respectively. The Ayahuasca prepared with fresh or dry plants no showed cytotoxicity in human keratinocytes cells.

Agradecimentos: This work was supported by the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo -FAPESP (process number 2019-02845-4, 2020-10809-5) and by the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) (Projeto INSPEQT, Edital No 16/2020, Processo 88887.516176/2020-00). The authors have no other relevant affiliations or financial involvement with any organization or entity with a financial interest in or financial conflict with the subject matter or materials discussed in the manuscript apart from those disclosed Abstract: THC-COOH is the major metabolite of 'delta'9-tetrahydrocannabinol commonly tested in urine to determine cannabis intake. In this study, a method based on dispersive liquid-liquid microextraction was developed for testing THC-COOH in urine. Hydrolyzed urine specimens were extracted via dispersive liquid-liquid microextraction with acetonitrile (disperser solvent) and chloroform (extraction solvent). Derivatization was performed with N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trichloro(chloromethyl)silane. Analysis was performed by GC-MS/MS. The method showed acceptable linearity (5-500 ng/ml), imprecision (

Orientador: José Luiz da Costa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O uso abusivo de substâncias psicoativas (SPA) acompanha o homem desde o início dos tempos e, a partir da segunda metade do século XX, passou a aumentar substancialmente. A taxa de óbitos causados pelo abuso de drogas e medicamentos continua a aumentar, justificando a necessidade do desenvolvimento de estratégias analíticas que permitam a identificação de SPA em amostras biológicas, principalmente diante do grande número de novas substâncias psicoativas que vem surgindo nos últimos anos. Sendo assim, há necessidade de desenvolvimento de métodos sensíveis, porém abrangentes, que utilizem reduzido volume de solventes orgânicos. Neste trabalho, foi possível realizar uma análise crítica e avaliar a viabilidade do uso de técnicas emergentes de preparo de amostras nas análises toxicológicas realizadas em sangue postmortem, através do desenvolvimento de 3 métodos analíticos. Os métodos desenvolvidos utilizaram baixo volume de amostras, menor volume de solventes extratores (e de menor toxicidade) e de preparo mais simples do que o métodos frequentemente utilizados em laboratórios de toxicologia forense. Métodos quantitativos foram desenvolvidos e validados para determinação 49 SPA de interesse forense, utilizando a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial como técnica instrumental. No trabalho I, foi desenvolvido e validado um método quantitativo para a análise de fentanil e seus análogos, através de extração por precipitação de proteínas, com linearidade avaliada de 1 a 500 ng/mL. Os valores obtidos para imprecisão e inexatidão foram melhores que 13,8% e -10,9%, respectivamente. Nos trabalhos II e III, uma miniaturização da técnica de QuEChERS foi aplicada no preparo de amostras para a análise de 37 SPA e 4 produtos de biotransformação. No segundo trabalho, o método desenvolvido envolveu a análise de 16 antidepressivos, 7 antipsicóticos e 3 produtos de biotransformação, sendo observada linearidade de 1 a 500 ng/mL, além de valores de imprecisão e inexatidão de 19,0% e 19,7%, respectivamente. No trabalho III, um método para análises de 11 benzodiazepínicos, 1 produto de biotransformação e 1 sedativo-hipnótico em sangue postmortem foi desenvolvido e validado, com linearidade de 10 a 2000 ng/mL, imprecisão e inexatidão de 18,2% e 17,4%, respectivamente. Não foram observados interferentes exógenos, endógenos ou contaminação cruzada (carryover) em nenhuma das validações. As vantagens observadas para o método miniaturizado são o pequeno volume de amostra (100 µL), preparo simples e eficaz, além de melhores valores para o parâmetro de recuperação. Todos os métodos foram aplicados em amostras reais cedidas pelo Núcleo de Toxicologia Forense do Instituto Médico Legal, Superintendência da Polícia Técnico-científica de São Paulo (NTF/IML/SPTC-SP) ou Instituto de Análises e Pesquisas Forenses de Sergipe (IAPF-SE), demonstrando a eficiência do protocolo Abstract: The abusive use of psychoactive substances (PAS) has been with man since the beginning of time and, from the second half of the 20th century, began to increase rapidly. The death rate caused by pharmaceutical and drug abuse continues to rise, justifying the need for development of analytical strategies which allows the identification of PAS in biological samples, especially given the large number of new psychoactive substances that have been emerging in recent years. Therefore, there is a need for development of sensitive but comprehensive methods that use a reduced volume of organic solvents. In this work, through the development of 3 analytical methods, it was possible to perform a critical analysis and assess the feasibility of using emerging techniques of sample preparation for toxicological analyzes in postmortem blood. Quantitative methods were developed and validated for the determination of 49 PSA of forensic interest, using liquid chromatography-tandem mass spectrometry as instrumental technique. Work I, a method was developed and validated for quantitative analysis of fentanil and its analogues, by protein precipitation extraction, with linearity evaluated from 1 to 500 ng/mL. Value observed for imprecision and bias were better than 13.8% and -10.9%, respectively. Works II and III, a miniaturization of QuEChERS technique was applied to sample preparation for the analysis of 37 PSA and 4 metabolites. In the second work, the developed method involved the analysis of 16 antidepressants, 7 antipsychotics and 3 metabolites, being observed a linearity from 1 to 500 ng/mL, in addition to imprecision and inaccuracy values of 19.0% and 19.7%, respectively. In work III, a method for the analysis of 11 benzodiazepines, 1 metabolite and 1 hypnotic/sedative in postmortem blood was developed and validated, with linearity from 10 to 2000 ng/mL, imprecision and bias of 18.2% and 17.4%, respectively. No exogenous, endogenous or cross-contamination (carryover) interferents were observed in any of the validations. The advantages observed for the miniaturized method were low sample volume (100 µL), simple and effective preparation, in addition to better values of recovery parameter. All methods were applied on authentic samples provided by the Forensic Toxicology Laboratory of the Institute of Legal Medicine, São Paulo State Police (NTF/IML/SPTC-SP) or the Institute of Forensic Analysis and Research of Sergipe (IAPF-SE), demonstrating the efficiency of the protocol Doutorado Farmacologia Doutora em Farmacologia CAPES 88882.435302/2019-01

Orientador: José Luiz da Costa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O aparecimento de Novas Substâncias Psicoativas (NSP) no mercado ilícito mundial cresceu significativamente desde os anos 2000. Apesar da queda no número de novas identificações anualmente, elas ainda causam severos casos de intoxicações, diversos deles fatais. O presente trabalho desenvolveu e validou um método para a análise de mais de 100 NSP e drogas de abuso convencionais em amostras de fluido oral (OF) e analisado por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS). Foram coletadas 462 amostras em festas e festivais de música eletrônica em 3 estados brasileiros e analisadas com a metodologia desenvolvida. O 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA, 88%) ainda foi a substância mais identificada nas amostras, mas 39% das amostras continham alguma NSP. Cetamina (75%) foi a mais prevalente, seguido da metilona (15%) e N-etilpentilona (10%). Ainda assim, apenas 5% dos voluntários haviam reportado o consumo de alguma NSP. A ingestão de múltiplas substâncias foi muito prevalente, com 80% das amostras contendo duas ou mais substâncias. Este foi o primeiro dado publicado no Brasil contendo dados epidemiológicos do consumo de NSP através da análise de amostras biológicas em contexto recreacional. As amostras contendo catinonas sintéticas foram quantificadas usando microextração por sorvente empacotado (MEPS). Entre as 41 amostras, metilona, N-etilpentilona, eutilona, mefedrona e 4-CEC foram quantificadas. As amostras contendo LSD foram quantificadas, assim como seu principal produto de biotransformação, 2-oxo-3-hidroxi-LSD, com limite de detecção de 0,01 ng/mL. Este foi o primeiro dado publicado na literatura contendo quantificação de ambos analitos em amostras autênticas de fluido oral. Ainda, como forma de suprir a necessidade de obter mais informações sobre as NSP, foi realizado o ensaio de metabolismo in vitro do canabinóide sintético ADB-4en-PINACA usando microssomas hepáticos humanos (HLM) e analisado com espectrômetro de massas de alta resolução. Dos 11 metabólitos identificados in vitro, 7 foram confirmados em amostras de sangue e urina post mortem., sendo os metabólitos derivados de hidroxilação e hidroxilação seguida de hidrólise interna os mais intensos Abstract: New Psychoactive Substances (NPS) emergence of in the global illicit market has grown significantly since the 2000s. Despite the drop in the number of new identifications annually, they still cause severe cases of intoxication, many of them fatal. The present work developed and validated a method for the analysis of more than 100 NPS and conventional drugs of abuse in oral fluid (OF) samples and analyzed by liquid chromatography?tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). 462 samples were collected at parties and electronic music festivals in 3 Brazilian states and analyzed using the developed methodology. 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA, 88%) was still the most identified substance in the samples, but 39% of them contained some NPS. Ketamine (75%) was the most prevalent, followed by methylone (15%) and N-ethylpentylone (10%). Even so, only 5% of the volunteers had reported some NPS consumption. Ingestion of multiple substances was very prevalent, with 80% of samples containing two or more substances. This was the first data published in Brazil containing epidemiological data on NPS consumption through the analysis of biological samples in a recreational context. Samples containing synthetic cathinones were quantified using microextraction by packed sorbent (MEPS). Among the 41 samples, methylone, N-ethylpentylone, euthylone, mephedrone and 4-CEC were quantified. Samples containing LSD were quantified, as well as its main biotransformation product, 2-oxo-3-hydroxy-LSD, with limit of detection of 0.1 ng/mL. This was the first published data quantifying both analytes in authentic oral fluid samples. Also, to meet the need for more information regarding NPS, an in vitro metabolism assay of the synthetic cannabinoid ADB-4en-PINACA was performed using human liver microsomes (HLM) and analyzed with a high-resolution mass spectrometer. Of the 11 metabolites identified in vitro, 7 were confirmed in post mortem blood and urine samples, with the metabolites derived from hydroxylation and hydroxylation followed by internal hydrolysis being the most intense Doutorado Farmacologia Doutora em Farmacologia FAPESP 2018/11849-0 CAPES 88887.571786/2020-00

Orientador: Mary Ann Foglio Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Fórmulas da Medicina Tradicional Chinesa (MTC) são compostas geralmente por mais de uma planta medicinal, com o propósito de produzir efeitos sinérgicos através de interação entre as plantas ou diminuir possíveis efeitos adversos da planta principal. Com o aumento de uso dos fitoterápicos chineses após o regulamento RDC 21/2014 e a falta de estudos destes produtos no Brasil, foi feita uma triagem farmacológica de duas espécies muito utilizadas tradicionalmente na China, Rehmannia glutinosa e Eucommia ulmoides. Ambas as espécies são utilizadas como tonificante renal segundo as teorias clássicas da MTC. Estudos descrevem indicação contra osteoporose, artrite reumatoide e inflamação. Apesar de amplamente utilizada na China, essas espécies vegetais ainda são pouco estudadas no Brasil. Com base nestas informações, o presente trabalho teve como objetivo contribuir com dados de eficácia e qualidade destas plantas, visando validar o seu uso no Brasil atendendo as RDCs 21 e 26/2014 da ANVISA. Os marcadores descritos para as espécies foram monitorados através de espectrometria de massas. Foi verificado em teste de toxicidade aguda que em elevada dose (2000 mg/kg), R. glutinosa apresenta aumento de estímulo nos animais e para a espécie E. ulmoides nenhuma alteração comparada com grupo controle, o que indica baixa toxicidade das espécies isoladamente. Foram avaliadas as atividades anti-inflamatória e anti-ulcerogênica das espécies em modelos experimentais de edema de pata por carragenina e ulcera induzida por etanol respectivamente. Os resultados demonstraram ações complementares, ou seja, a espécie E. ulmoides inibiu 90% de úlcera em dose mais alta testada, 1000 mg/kg, e R. glutinosa apresentou área ulcerada aumentada em 217% na dose 300 mg/kg. No modelo de Edema de Pata, R. glutinosa mostrou atividade anti-inflamatória em até 70% e E. ulmoides não apresentou dados significativos. Os resultados sugerem que o mecanismo anti-inflamatório da espécie R. glutinosa pode estar envolvido com a inibição de cicloxigenase com diminuição de produção de PGs (prostaglandinas). A associação frequente destas duas espécies pelos praticantes da MTC poderia ter como objetivo minimizar efeitos adversos provocados pela R. glutinosa. Além disso, as PGs modulam função renal e a ação de E. ulmoides é utilizado tradicionalmente como tonificante renal, sugerindo possível mecanismo de ação. Porém mais estudos serão necessários para elucidar tais possibilidades, além da associação destas espécies Abstract: Traditional Chinese Medicine (TCM) formulas are generally composed of more than one medicinal plant, for the purpose of producing synergistic effects through interaction between plants or lessening possible adverse effects of the main plant. With the increased use of Chinese herbal medicines with RDC Regulation 21/2014 and the lack of studies of these products in Brazil, a pharmacological screening of two traditionally used species, Rehmannia glutinosa and Eucommia ulmoides, was carried out. Both species are used as renal toner according to classical TCM theories. Studies describe indication against osteoporosis, rheumatoid arthritis and inflammation. Although widely used in China, these plant species are still poorly studied in Brazil. Based on this, the present work had as objective to contribute with data of effectiveness and quality of these plants, aiming to validate its use in Brazil attending RDC 21 and 26/2014 of ANVISA. The markers described for the species were monitored by Mass Spectrometry. It was verified in the Acute Toxicity test that at high doses, 2000mg / kg, R. glutinosa shows increased stimulation in the animals and for the E. ulmoides no alterations compared to the control group, indicating low toxicity of the species alone. The anti-inflammatory and cytoprotective action of the species were evaluated in experimental models of Paw Edema by Carrageenan and ethanol-induced ulcer respectively. The results showed complementary actions, that is, the E. ulmoides inhibited 90% ulcer at the highest dose tested, 1000 mg / kg, and R. glutinosa presented an ulcerated area increased by 217% at the 300 mg / kg dose. In the Paw edema model, R. glutinosa showed anti-inflammatory activity in up to 70% and E. ulmoides did not present significant data. The results suggest that the anti-inflammatory mechanism of the R. glutinosa species may be involved with the inhibition of cyclooxygenase with decreased production of PGs (prostaglandins). The frequent association of these two species by TCM practitioners could be aimed at minimizing adverse effects caused by R. glutinosa. In addition, PGs modulate renal function and traditional use of E. ulmoides is renal toning, what suggest a possible mechanism of action. However, further studies are needed to elucidate those possibilities Mestrado Patologia Clínica Mestra em Ciências CAPES CNPQ

Orientador: Gilberto de Nucci Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Defeito do tubo neural (DTN) trata-se de uma malformação congênita resultante de um mal fechamento do tubo neural. Ocorre quando a placa neural embrionária falha em completar seu desenvolvimento e não se fecha em algum ponto ao longo do seu crescimento, por volta da quarta semana do desenvolvimento embrionário. Trata-se de uma má formação fetal que pode ser evitada com a utilização do ácido fólico desde o período pré concepcional até os primeiros meses de vida da criança. O folato é essencial e sua deficiência pode ser causada por dieta inadequada, por fatores genéticos ou pela interação de fatores genéticos e ambientais. A suplementação com ácido fólico previne 50-75% dos casos de defeitos do tubo neural. Este estudo objetivou avaliar a viabilidade da realização de suplementação do ácido fólico juntamente com anticoncepcional com a administração de etinilestradiol 0,02 mg + levonorgestrel 0,10 mg + ácido fólico 0,4 mg em comprimidos de administração oral, com base em comparações estatísticas dos níveis de folato no sangue. As concentrações foram medidas através de método analítico apropriado e validado, bem como avaliado sua segurança e tolerabilidade em voluntárias sadias do sexo feminino. Trata-se de um estudo de Fase II, monocêntrico, aberto, com um tratamento em três ciclos, com administração em doses múltiplas, nos quais as voluntárias recebem o produto teste e posteriormente o placebo. As trinta e seis voluntárias saudáveis receberam um comprimido revestido do produto teste - etinilestradiol 0,02 mg + levonorgestrel 0,10 mg + ácido fólico 0,4 mg por 21 dias e um placebo revestido contendo apenas 0,4 mg de ácido fólico somente nos últimos 7 dias de cada ciclo de tratamento, que foram realizados em 3 ciclos. Amostras de sangue foram coletadas para quantificar o folato por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa (LC-MS / MS), para mensuração do níveis de folato no sangue antes da primeira administração do primeiro, segundo e terceiro ciclo, após 21 dias do primeiro, segundo e terceiro ciclo e após 28 dias do primeiro, segundo e terceiro ciclo. A segurança foi avaliada pelo registro de eventos adversos, monitoramento de sinais vitais e avaliação de exames laboratoriais e ECG. A média do nível de ácido fólico no sangue no início (1º dia do 1º ciclo) foi de 42,7 ± 22,2 ng/mL enquanto no 28º dia do 3º ciclo foi de 47,6 ± 20,1 ng/mL, com uma variação de 11,32%. As voluntárias toleraram bem o protocolo clínico e não relataram efeitos adversos clinicamente significativos, apenas uma voluntária, por motivos particulares, abandonou o estudo durante a segunda sessão do primeiro ciclo. Os contraceptivos orais estudados nesse protocolo, podem ser considerados um veículo viável para a suplementação de folato em mulheres em idade reprodutiva Abstract: Neural tube defect (NTD) is a congenital malformation resulting from poor closure of the neural tube. It occurs when the embryonic neural plaque fails to complete its development and doesn¿t close at some point during its growth, around the fourth week of embryonic development. It is a fetal malformation that can be prevented with the use of folic acid from the preconception period until the first months of the child's life. Folate is essential and its deficiency may be caused by improper diet, genetic factors or the interaction of genetic and environmental factors. Folic acid supplementation prevents 50-75 % of cases of neural tube defects. The aim of this study was to assess the feasibility of supplemental contraceptive folic acid supplementation with ethinyl estradiol 0.02 mg + levonorgestrel 0.10 mg + folic acid 0.4 mg in oral administration, based on statistical comparisons of blood folate levels. Concentrations were measured using an appropriate and validated analytical method, as well as their safety and tolerability in healthy female volunteers. This is a monocentric, open, phase II, three-cycle, multidose study in which healthy female volunteers receive the test product and then the placebo. Thirty-six healthy female volunteers received one coated tablet of the test product - ethinyl estradiol 0.02 mg + levonorgestrel 0.10 mg + folic acid 0.4 mg for 21 days and a placebo coated tablet containing folic acid 0.4 mg only in last 7 days of each treatment cycle, which were performed in 3 cycles. Blood samples were collected to quantify folate by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) to measure blood folate levels before the first administration of the first, second and third cycle after 21 days of the first, second and third cycle and after 28 days of the first, second and third cycle. Safety was assessed by registration adverse events, monitoring vital signs and evaluating laboratory tests and ECG. The mean whole blood level of folic acid at baseline (1st day of 1st cycle) was 42.7 ± 22.2 ng/mL while on the 28th day of the 3rd cycle was 47.6 ± 20.1 ng/mL, with a variation of 11.32 %. The female volunteers well tolerated the clinical protocol and reported no clinically significant adverse effects, only one volunteer for particular reasons dropped out of the study during the second session of the first cycle. Oral contraceptives studied in this protocol may be considered a viable vehicle to folate supplementation in women at reproductive age Mestrado Farmacologia Mestra em Farmacologia

Orientador: José Luiz da Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O objetivo deste estudo foi identificar os produtos de biotransformação da 4-cloroetcatinona (4-CEC), utilizando modelos em dois estágios de desenvolvimento do zebrafish (Danio rerio), com o auxílio de técnica de predição in silico e cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa de alta resolução (LC-HRMS). O modelo baseado em experimentos no estágio larval consistiu em 10 larvas aos quatro dias pós-fertilização expostas a 1000 ?M por um período de 24 horas em uma placa de 6 poços. Após a exposição, as larvas foram coletadas e submetidas a eutanásia antes da extração líquido-líquido para análise em LC-HRMS. No modelo onde se realizou experimentos com zebrafish adulto, 8 peixes foram colocados em tanques de 200 mL contendo solução aquosa 4-CEC na concentração de 0,1 mg/mL, em triplicata. Alíquotas (5 mL) da água do tanque foram coletadas a cada hora durante o período de 8 horas de experimento, e extraídas por extração em fase sólida antes da análise por LC-HRMS. Em ambos os estágios de desenvolvimento do zebrafish os mesmos produtos de biotransformação foram identificados, sendo detectados quatro substâncias derivados do metabolismo de fase I, formados através das reações de redução, desalquilação, hidroxilação e redução seguida da reação de desalquilação. O modelo experimental empregando zebrafish adulto forneceu melhores perfis cromatográficos, com espectros de massas mais limpos (menos interferentes) e mais intensos (melhor relação sinal/ruído). O produto de biotransformação originado a partir de reação de redução foi o principal encontrado em ambos os estudos, sendo mais intenso nas 8 horas de experimento. Apesar da diferença entre os estágios de desenvolvimento do zebrafish, ambos os experimentos geraram os mesmos produtos, que foram condizentes com os identificados em amostras de urina de humanos expostos à 4-CEC. O zebrafish se mostrou um modelo experimental promissor para ser usado como ferramenta para estudos de metabolismo de drogas de abuso Abstract: The aim of this study was to identify metabolites of 4-chloroethcathinone (4-CEC) using larvae and adult zebrafish (Danio rerio) with assistance of in silico prediction and liquid chromatography–high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The larvae experiment consisted of 10 larvae at four days post fertilization exposed for 24 hours in a 6 well plate, the experiment was performed in six replicates. The larvae were collected and extracted before the analysis. The adult experiment consisted in 8 fish placed in a 200 mL tank containing water and 4-CEC solution, in triplicate. Aliquots were collected every hour up to 8 hour experiment and extracted through solid-phase extraction. The analysis was performed using liquid chromatography–high resolution tandem mass spectrometry to obtain separation and accurate mass spectra of metabolites. In both stages of zebrafish the same metabolites were identified. Four metabolite of phase I were observed, formed through reduction, dealkylation, hydroxylation and reduction followed by dealkylation reactions. The adult experiment provided cleaner and more intense mass spectra. The reduction metabolite was the main found in both studies, being most intense in the 8 hour of the experiment. Despite the difference between zebrafish life stages, both experiments generate the identical 4 metabolites, already described in in vitro study or human biological samples. The zebrafish has demonstrated itself as a promising experimental model to be use as a tool to drugs of abuse metabolism studies Mestrado Farmacologia Mestra em Farmacologia CAPES 88887473759202000

Orientador: Márcia Cristina Breitkreitz Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: O interesse na Cromatografia com Fluido Supercrítico (SFC) foi retomado há menos de uma década com o desenvolvimento de uma instrumentação inovadora e robusta que permitiu alcançar repetibilidade e confiabilidade nos resultados, dando origem à cromatografia com fluido supercrítico de ultra alta eficiência (Ultra High Performace Supercritical Fluid Chromatography, UHPSFC). A UHPSFC é uma técnica em exploração, que surge como alternativa verde às técnicas de separação empregadas atualmente, permitindo reduzir o consumo de solventes tóxicos, além de associar a capacidade de análise das técnicas de cromatografia líquida de fase normal, de fase reversa e gasosa. Este trabalho propôs o desenvolvimento de um método utilizando UHPSFC para uma separação, em uma mesma corrida, de uma mistura de 8 fármacos redutores de colesterol, uma tendência em laboratórios de desenvolvimento analítico conhecida como análise multiproduto. Esta proposta, associada à técnica de UHPSFC, busca alcançar resultados rápidos, com separação eficiente e impactos reduzidos sobre o meio ambiente. Na etapa inicial de desenvolvimento do método, uma triagem (screening) foi realizada para selecionar as condições mais promissoras de fase estacionária (FE), modificador orgânico (cossolvente) da fase móvel (FM), diluente para injeção das amostras e concentração do modificador no início de cada injeção. Nessa etapa, a vazão da fase móvel (1,50 mL min-1), pressão (1500 psi), temperatura (40 °C) e eluição em modo gradiente linear (6% de modificador min-1) foram mantidas constantes com aquisição de dados em 240 nm, usando detector por arranjo de fotodiodos. Os resultados dessa etapa permitiram a seleção da coluna Torus 1-AA, com composição de FM CO2:(EtOH:H2O 95:5 (v/v)), ACN:EtOH 3:2 (v/v) como diluente e 5% de modificador no início das corridas. Em seguida, um planejamento experimental do tipo composto central foi executado para avaliar os parâmetros pressão, temperatura e quantidade final de modificador no gradiente linear em 2 níveis fatoriais e em 2 níveis axiais e o ponto central. A influência dos parâmetros sobre as respostas cromatográficas dos compostos (fator de retenção, fator de separação, resolução, fator de assimetria, número de pratos) foi avaliada com base nas propriedades físico-químicas das interações soluto-FE e soluto-FM e uma condição ótima foi obtida a partir dos 19 experimentos realizados. Ao final, a vazão da fase móvel foi alterada para atingir uma separação entre todos os analitos até a linha de base. O design space foi obtido a partir do fator de separação para fornecer o espaço experimental robusto às alterações dos parâmetros experimentais. As condições otimizadas foram: vazão: 1,80 mL min-1, pressão: 2150 psi, temperatura: 42 °C, eluição: gradiente de 5% até 15,5% de modificador orgânico em 4 minutos, mantendo-se em regime isocrático por mais 2 minutos. A resolução foi superior a 2,0 e a eficiência da separação atingiu mais de 30.000 pratos. A validação do método seguiu a RDC 166/2017 da ANVISA, atingindo linearidade adequada (r > 0,990), exatidão e precisão dentro dos limites aceitáveis (recuperação de 95 ¿ 105% e coeficiente de variação máximo de 5,4%). O método foi aplicado a medicamentos comerciais, fornecendo resultados de teor dentro da faixa esperada. Outro enfoque, baseado na separação matemática de sinais de compostos coeluidos, utilizando o método resolução mutlivariada de curvas (MCR-ALS) foi avaliado e discutido neste trabalho. Este método pode ser utilizado quando a separação na coluna cromatográfica não é alcançada Abstract: The interest in Supercritical Fluid Chromatography (SFC) was renewed less than one decade ago by the development of innovative and robust instrumentation that provided to this technique greater repeatability and reliability of the results, giving rise to the ultra high performance supercritical fluid chromatography (UHPSFC). UHPSFC is a technique in exploration as a green alternative to the currently separation techniques, aiming at reducing the consumption of toxic solvents and converging the analysis capabilities of both liquid (reversed and normal-phases) and gas chromatography. This work aimed at the development of a single method using UHPSFC for eight cholesterol-lowering drugs, a trend in analytical laboratories called multiproduct analysis. This approach, associated with the UHPSFC technique, searches for environmentally-friend, efficient and fast results. As the first step, a screening was carried out to select the most promising conditions of stationary phase (SP), organic modifier (cosolvent) in mobile phase (MP), diluent for sample injection and starting modifier content. In this step, the following parameters were kept constant: flow rate of MP (1.50 mL min-1), pressure (1500 psi), temperature (40 °C) and linear gradient elution (6% modifier min-1). Acquisition of data was obtained in 240 nm using a photodiode array (PDA) detector. The selected conditions were: Torus 1-AA column, CO2:(EtOH:H2O 95:5 (v/v)) as MP, ACN:EtOH 3:2 (v/v) as diluent and 5% as the starting amount of the modifier content. In a second step, a Central Composite design was performed to evaluate the critical parameters pressure, temperature and final modifier content in the linear gradient with 2 factorial levels, 2 axial levels and 5 replicates of the center points. The influence of those parameters on chromatographic responses for all compounds (retention factor, separation factor, resolution, asymmetry factor, number of plates) was assessed based on interaction properties of solute-SP and solute-MP. The optimal condition was chosen and then the flow rate of the MP was changed to achieve a baseline separation for all the analytes. The Design Space, i.e., the robust region that remains unaffected by changes in the experimental conditions was achieved based on the separation factors. The optimized conditions were: flow rate: 1.80 mL min-1, pressure: 2150 psi, temperature: 42 °C and elution: gradient from 5% to 15.5% in organic modifier content for 4 minutes, plus 2 minutes in isocratic condition. Resolution was greater than 2.0 and the efficiency achieved more than 30,000 plates. Validation was performed accordingly to ANVISA guideline RDC 166/2017, achieving adequate linearity (r > 0.990), accuracy and precision within the acceptable limits (95 ¿ 105% of recovery and RSD not higher than 5.4%). The developed method was applied to commercial products, providing assay results within the expected ranges. Another approach, based on mathematical separation of co-eluted peaks by multivariate curve resolution alternating least squares (MCR-ALS) was evaluated and was discussed in this work. This method can be applied when the chromatographic separation of compounds in the column cannot be achieved Mestrado Química Analítica Mestre em Química CNPQ 131217/2017-8 FAPESP 16/05636-9 CAPES

Orientador: Paulo César Pires Rosa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Manganês é o décimo segundo elemento mais abundante na crosta terrestre. Trata-se de um micronutriente essencial ao organismo, que quando em excesso, torna-se prejudicial à saúde. Altas concentrações deste podem ocasionar neurotoxicidade resultando em sintomas como distonia, tremores, irritabilidade entre outros. No Brasil ainda não foi definido o nível sérico de manganês de referência nacional, fazendo com que sejam utilizadas referências internacionais. As referências internacionais podem ser incompatíveis com o nível sérico de manganês de populações específicas no Brasil possibilitando uma interpretação errônea dos dados coletados. Essa possibilidade torna-se foco de atenção, uma vez que, cada vez mais, se faz necessário a determinação dos níveis considerados normais para a população brasileira devido a um aumento considerável de uso de manganês por trabalhadores de diversas áreas, além da abundância natural desse metal. Por isso, viu-se a necessidade de se desenvolver um método de determinação de manganês em sangue total. Através do planejamento experimental foram determinadas faixas de temperaturas ótimas de pirólise e atomização e avaliadas tempo de pirólise e concentração de modificador a ser utilizado no método de forma que o método se tornasse mais robusto e preciso. A otimização multivariada foi desenhada com o objetivo de se obter maior precisão estatística possível na resposta analítica e o melhor rendimento do equipamento assegurando os melhores resultados com desempenho superior. A validação do método foi realizada avaliando-se os parâmetros de seletividade, efeito residual, efeito matriz, curva de calibração, precisão e exatidão. O método foi considerado seletivo, pois os resultados de p-valor obtidos pela comparação entre cada curva construída com a matriz substituta e a curva construída pela solução padrão foram maiores ou iguais a 0,05 indicando que as retas possuíam a mesma origem e a mesma inclinação sendo, portanto, paralelas. Na avaliação dos efeitos matriz e residual, em ambos os parâmetros, os resultados foram satisfatórios, demonstrando que não há interferências de reagentes ou da matriz na determinação do metal no sangue e que a autolimpeza do método realizada pelo equipamento utilizado foi suficiente em evitar resíduos em uma próxima análise de amostra. Na linearidade, além da análise do valor do desvio padrão relativo obtido, foram realizados testes para verificação da homoscedasticidade dos dados gerados pela curva (teste de Cochran), teste para avaliar a distribuição de normalidade dos resíduos (Shapiro Wilk) e um teste para avaliação da existência de qualquer relação de dependência entre os resíduos (Durbin-Watson). Todos os resultados obtidos nos testes usados para avalição da linearidade foram considerados satisifatórios sugerindo que o método é linear para concentrações superiores a 0,5 µgL-1, sendo adequado para a análise de manganês em sangue total em humanos. O método também demonstrou ser preciso (precisão intra-dia e inter-dia) e exato de acordo com os resultados estatísticos encontrados. Por fim, foram analisadas algumas amostras de sangue total de voluntários do próprio laboratório de análises toxicológicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas com o objetivo de testar a acuracidade e empregabilidade do método desenvolvido e validado Abstract: Manganese is the twelfth most abundant element in the earth's crust. It is an essential micronutrient for the body, which when in excess, becomes harmful to health. High concentrations of this can cause neurotoxicity resulting in symptoms such as dystonia, tremors, irritability, among others. In Brazil, the serum level of national reference manganese has not yet been defined, making international references used. Faced with a considerable increase in the use of manganese in addition to the natural abundance of the metal, there was a need to develop a method for determining manganese in whole blood. Through the experimental planning, optimal pyrolysis and atomization temperature ranges were determined and pyrolysis time and modifier concentration to be used in the method were evaluated. The multivariate optimization was designed with the objective of obtaining the highest possible statistical precision in the analytical response and the best performance of the equipment, ensuring the best results with superior performance. The validation of the method was performed by evaluating the parameters of selectivity, residual effect, matrix effect, calibration curve, precision and accuracy. The method proved to be selective through the F test of parallelism with results of P- value of the six curves analyzed greater than 0.05. In the evaluation of the matrix and residual effects, in both parameters, the results were satisfactory, demonstrating that there is no interference from reagents or matrix in the determination of the metal in the blood and that the self-cleaning of the method used was sufficient to avoid residues in an upcoming analysis of sample. In linearity, in addition to the analysis of the value of the relative standard deviation obtained, the Cochram test was performed to verify the homoscedasticity of the data obtained, normality test - Shapiro Wilk to evaluate the distribution of the results and Durbin-Watson test to verify whether there is dependence or not between residues (variations in analysis results). The method proved to be linear for concentrations above 0.5 µgL-1, being suitable for the analysis of manganese in whole blood in humans. The method also proved to be accurate (intra-day and inter-day) and accurate through statistical data. Finally, samples of whole blood from volunteers from laboratory of toxicological analyzes of Medical Sciences College of the Campinas State University were analyzed Mestrado Farmacologia Mestra em Farmacologia CAPES 001

Orientador: José Luiz da Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas Resumo: No meio ambiente, os agrotóxicos podem contaminar a água e o solo, além de acumular-se na biota, através da cadeia alimentar, podendo causar desequilíbrio ecológico. A alimentação dos tamanduás-bandeira é constituída principalmente de formigas e cupins, e a captura destes se dá através da língua. O tamanduá-bandeira come até 30 mil formigas e cupins por dia e, portanto, precisa de variados habitats para encontrar esta quantidade necessária de alimento. Assim, acredita-se que estes animais estão expostos a agrotóxicos utilizados nos cultivos agrícolas na região do Cerrado brasileiro. Este trabalho tem por objetivo avaliar a exposição do tamanduá-bandeira a agrotóxicos utilizados no Cerrado. Foi avaliada a exposição a agrotóxicos através de análises toxicológicas realizadas em amostras de sangue post mortem de animais atropelados em rodovias do estado do Mato Grosso do Sul. Também foram analisadas amostras de sangue de animais vivos, capturados e monitorados por coletes de GPS como parte do Projeto Bandeiras e Rodovias. As amostras foram armazenadas sob congelamento (-20 ºC) desde a coleta até o momento da análise. O método foi validado seguindo as recomendações do Scientific Working Group for Forensic Toxicology para análises qualitativas e quantitativas (SWGTOX). Os agrotóxicos investigados são aqueles dos principais cultivos do Cerrado (grãos, eucalipto, cana-de-açúcar e pastagens). As amostras foram submetidas ao método de extração QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe). Trata-se de uma extração simples, utilizando acetonitrila seguida de uma etapa de limpeza do extrato. Dentre as vantagens deste método, destacam-se a sensibilidade na detecção de substâncias de diferentes classes químicas em um único método, a pouca quantidade de solvente utilizada e a rápida execução. Após a extração, as amostras foram analisadas em cromatógrafo líquido acoplado a espectrômetro de massas sequencial (LC-MS/MS) modelo LCMS8060 (Shimadzu, Kyoto, Japão). Oito agrotóxicos (2,4-D, aldicarbe, atrazina, carbofurano, clorpirifós, fentiona, mevinfós e fipronil) e o produto de transformação do aldicarbe (aldicarbe sulfona) foram analisados. O método foi otimizado em monitoramento de reações múltiplas (MRM). O método proposto foi validado e aplicado para as análises de sangue, a fim de se avaliar a exposição do tamanduá-bandeira aos agrotóxicos selecionados. A linearidade foi avaliada entre as concentrações de 5 ng/mL e 1000 ng/mL, exceto para o 2,4-D, que foi avaliada entre 25 ng/mL e 5000 ng/mL. Para cinco dias de análise, a curva analítica apresentou r² maior que 0,98 (1/x2), imprecisão e inexatidão menor que 20% para todos os compostos. A recuperação variou entre 10,2% e 31,9%, enquanto o efeito matriz foi melhor que 38,1%, excetuando-se o clorpirifós e a fentiona. Foram analisadas 64 amostras, sendo 27 amostras post mortem e 37 amostras de animais vivos monitorados por GPS. Os compostos selecionados não foram detectados nas amostras analisadas. Além disso, o método proposto foi avaliado quanto à correlação de concentração entre sangue total e plasma para ser utilizado em rotina no laboratório para confirmação de suspeitas de intoxicações por agrotóxicos de pacientes que são admitidos no Hospital de Clínicas da UNICAMP. O método mostrou correlação linear entre as duas matrizes testadas (r² maior que 0,99 (1/x²). A recuperação variou entre 13,9% e 24,8%, enquanto o efeito matriz foi melhor que 41,2%, excetuando-se o clorpirifós e a fentiona. Foram analisadas três amostras de casos de tentativa de suicídio, das quais duas confirmaram intoxicação por aldicarbe (aldicarbe e aldicarbe sulfona foram detectados) e a terceira confirmou intoxicação por carbofurano Abstract: In the environment, pesticides can contaminate water and soil, besides accumulating in biota, through the food chain, which can cause ecological imbalance. The feeding of giant anteaters consists mainly of ants and termites, and their capture is done through the tongue. The giant anteater eats up to 30,000 ants and termites a day and therefore needs a variety of habitats to find this necessary amount of food. Thus, it is believed that these animals are exposed to pesticides used in agricultural crops in the Brazilian Cerrado region. This work aims to evaluate the exposure of the giant anteater to pesticides used in the Cerrado. Exposure to pesticides was assessed through toxicological analyzes carried out on post mortem blood samples from animals found in highways in the state of Mato Grosso do Sul. Also blood samples from live animals, captured and monitored by GPS vests as part of the Flags and Highways Project were analyzed. The samples were stored under freezing (-20 ºC) from collection to the moment of analysis. The method was validated following the recommendations of the Scientific Working Group for Forensic Toxicology for qualitative and quantitative analyzes (SWGTOX). The investigated pesticides are those of the main Cerrado crops (grains, eucalyptus, sugar cane and pastures). The samples were submitted to the QuEChERS extraction method (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe). It is a simple extraction, using acetonitrile followed by an extract cleaning step. Among the advantages of this method, stand out the sensitivity in detecting substances of different chemical classes in a single method, the small amount of solvent used and the fast execution. After extraction, the samples were analyzed in a liquid chromatograph tandem-mass spectrometer (LC-MS/MS) model LCMS8060 (Shimadzu, Kyoto, Japan). The total of 8 pesticides (2,4-D, aldicarb, atrazine, carbofuran, chlorpyrifos, fentiona, mevinfós and fipronil) and the aldicarb transformation product (aldicarb sulfone) were analysed. The method was optimized in multiple reaction monitoring (MRM). The proposed method was validated and applied for blood tests, in order to assess the exposure of the giant anteater to the selected pesticides. Linearity was assessed between the concentrations of 5 ng/mL and 1000 ng/mL, except for 2,4-D, which was evaluated between 25 ng/mL and 5000 ng/mL. For five days of analysis, the analytical curve showed r² value greater than 0.98 (1/x2), imprecision and inaccuracy less than 20% for all compounds. The recovery varied between 10.2% and 31.9%, while the matrix effect was better than 38.1%, except for chlorpyrifos and fenthion. 64 samples were analyzed, being 27 post mortem samples and 37 samples of live animals monitored by GPS. The selected compounds were not detected in the analyzed samples. In addition, the proposed method was evaluated for concentration correlation between whole blood and plasma to be used routinely in the laboratory to confirm suspected pesticide poisoning in patients admitted in the Hospital de Clínicas of UNICAMP. The method showed a linear correlation between the two matrices tested (r² value greater than 0.99 (1/x²). Recovery varied between 13.9% and 24.8%, while the matrix effect was better than 41.2%, except for chlorpyrifos and fenthion. Three samples of suicide attempt cases were analyzed, which two of them confirmed intoxication by aldicarb (aldicarb and aldicarb sulfone were detected) and the third confirmed carbofuran intoxication Mestrado Ciências Farmacêuticas - Insumos Farmacêuticos Naturais, Biotecnológicos e Sintéticos Mestra em Ciências

Orientador: José Luiz da Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O cabelo é um importante amostra biológica para evidenciar exposição pregressa às substâncias e pode ser utilizada como uma matriz alternativa ou complementar nas análises toxicológicas. O suicídio é um dos principais problemas de saúde pública, somando aproximadamente oitocentas mil mortes ao ano no mundo. Além disso, a cada suicídio consumado, outros vinte indivíduos estariam tentando cometê-lo. No presente trabalho, um método analítico foi desenvolvido, validado e aplicado na análise de amostras de cabelo coletadas de pacientes que tentaram suicídio e receberam atendimento no Hospital de Clínicas da UNICAMP, entre os anos de 2017 e 2018. O método desenvolvido permitiu a análise de morfina, codeína, 6-acetilmorfina, anfetamina, metanfetamina, femproporex, dietilpropiona, mazindol, MDA, MDMA, benzoilecgonina, cocaína, cocaetileno, éster metilecgonina, éster metilanidroecgonina (AEME) e THC. As amostras de cabelo foram extraídas utilizando pulverização, metanol como solvente extrator e sonicação sob aquecimento, sendo posteriormente analisadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial. Durante a validação, o método atendeu aos critérios recomendados internacionalmente para análise de drogas em cabelo, apresentando limites de detecção entre 2,5 e 50 pg/mg e linearidade entre 25 e 10.000 pg/mg. O método apresentou boa especificidade quando desafiado na presença de outras 41 substâncias (possíveis interferentes exógenos), e seletivo quando amostras de cabelo de diferentes doadores não usuários de substâncias psicoativas foram analisadas. A imprecisão foi melhor que 17,5%, inexatidão melhor que 7,5% e efeito matriz melhor que -16,7% para todos os analitos. Não foi observada contaminação cruzada (carryover). Das substâncias investigadas, apenas a AEME não atingiu valores aceitáveis de imprecisão e inexatidão, sendo investigada apenas de forma qualitativa. Foram analisadas 109 amostras de cabelo, sendo cada amostra seccionada em até cinco segmentos de 1,5 centímetros, totalizando 404 segmentos. Do total de amostras analisadas, 30,3% apresentaram resultado positivo para pelo menos uma substância psicoativa (SPA, n=33), dentre elas: cocaína (90,9%), codeína (12,1%), morfina (3,0%), MDMA (3,0%) e THC (3,0%). Na análise segmentar das amostras positivas para cocaína (n=30), 76,7% das amostras indicaram exposição recente à substância (aproximadamente 1 mês), uma vez que foi detectada a presença do analito no segmento proximal. Esse mesmo comportamento foi observado quando as amostras positivas para codeína (n=4) e morfina (n=1) foram analisadas. Para THC e MDMA, a análise segmentar foi positiva para segmentos menos recentes, indicando uso há 4 e 3 meses, respectivamente. Em conclusão, o método foi validado seguindo parâmetros recomendados internacionalmente para doze das principais substâncias psicoativas consumidas no país, além de dois metabólitos mais comumente encontrados. O método foi ainda aplicado para análise de amostras de cabelo de pacientes que tentaram suicídio, no qual demonstrou positividade em 30,3 % do total de amostras analisadas para pelo menos uma SPA, com maior frequência para cocaína. Na análise segmental das amostras positivas pôde-se observar uma maior frequência na exposição recente à substância (aproximadamente 1 mês) Abstract: Hair is an important biological sample to reveal chronic exposure to substances and can be used as an alternative or complementary matrix in toxicological analyzes. Suicide is one of the major public health problems accounting approximately eight hundred thousand worldwide deaths per year. In addition, for each consummated suicide, twenty other individuals are trying to commit it. In the present work, an analytical method was developed, validated and applied in hair samples collected from patients who attempted suicide and attended at University of Campinas Hospital (2017-2018). The method was developed for the following analytes: morphine, codeine, 6-acetylmorphine, amphetamine, methamphetamine, fenproporex, diethylpropion, mazindol, MDA, MDMA, benzoylecgonine, cocaine, cocaethylene, ecgonine methyl ester, anhydroecgonine methyl ester (AEME) and THC. Hair samples were extracted using methanol and sonicated under heating, and then analyzed using liquid chromatography tandem mass spectrometry. During validation, the method attended to international recommended criteria, with limits of detection between 2.5 and 50 pg/mg and linearity between 25 and 10,000 pg/mg. The method showed good specificity in the presence of 41 other substances (possible exogenous interferents) and selectivity when analyzed in different matrices. Imprecision was better than 17.5%, bias was better than 7.5% and matrix effect was better than -16.7% for all analytes. No carryover was observed. Among all investigated substances, only AEME did not reach acceptable values of imprecision and bias, which was validated only qualitatively. A total of 109 hair samples were analyzed, each segment had up to five parts of 1.5 cm, involving 404 segments. Between all samples analyzed, 30.3% were positive for at least one psychoactive substance (PSA, n = 33), such as: cocaine (90.9%), codeine (12.1%), morphine (3.0%), MDMA (3.0%) and THC (3.0%). In segmental analysis of cocaine positive samples (n = 30), 76.7% of the samples indicated recent exposure to cocaine (about 1 month), considering the substance was detected in the proximal segment. This same behavior was observed when analyzing codeine (n = 4) and morphine (n = 1) positive samples. For THC and MDMA, the segmented analysis was positive for less recent segments, indicating that drug use happened 4 and 3 months ago, respectively. In conclusion, the method was validated following international recommendations for twelve of the main psychoactive substances consumed in the country, as well as two of most common found metabolites. Then, the method was also applied to hair analysis of patients who attempted suicide, which demonstrated positivity in 30.3% of the total samples analyzed for at least one PSA, with a higher frequency of cocaine. In the segmented analysis of the positive samples, it was possible to observe a greater frequency in the recent exposure of the substance (approximately 1 month) Mestrado Farmacologia Mestra em Farmacologia CAPES 88882.435316/2019-01

Orientador: José Luiz da Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O fluido oral é a matriz biológica que surge como alternativa ao emprego de sangue e derivados. Dentre as vantagens do emprego desta matriz, estão a facilidade de coleta (não invasiva e pode ser realizada sob observação), difícil adulteração, fácil análise (quando comparada ao plasma, por exemplo) e a considerável correlação que pode ser traçada entre as concentrações salivares e plasmáticas de um fármaco. A validação é o ato de realizar ensaios experimentais visando evidenciar que o método funciona dentro de suas condições esperadas de emprego. No presente trabalho, um método foi desenvolvido, validado e aplicado na análise de amostras de fluido oral coletadas de voluntários presentes em festas de curta ou longa duração (festas de música eletrônica). O método permitiu a análise de 50 substâncias das classes dos antidepressivos, benzodiazepínicos e opioides. As amostras foram coletadas com o dispositivo de coleta Quantisal, e extraídas empregando extração líquido-líquido com éter metil-terc-butílico, sendo posteriormente analisadas por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas sequencial. Durante a validação o método atendeu os critérios recomendados internacionalmente, apresentando limites inferiores de quantificação na ordem de 0,5 e 1,0 ng/mL e linearidade de 0,5 à 50,0 ng/mL para antidepressivos, de 0,5 à 25,0 ng/mL para benzodiazepínicos e 1,0 à 50,0 ng/mL para opioides. Os valores de inexatidão e imprecisão foram melhores que 16% e 20%, respectivamente, e os valores de efeitos matriz melhores que 25%. Nenhuma evidência de contaminação cruzada (carryover), interferência endógena ou exógena (considerando fármacos e drogas de abuso comuns no país) foi observada. Estudos de estabilidade demonstraram que quase todos os analitos foram estáveis à -20 ºC por 60 dias (exceto por 7-aminoclonazepam, 7-aminoflunitrazepam, lorazepam, nordiazepam, naloxona, naltrexona e norsertralina), à 4 ºC por 7 dias (exceto por nordiazepam, metadona e naltrexona) e à temperatura ambiente (25 ºC) por 3 dias (exceto por sertralina e flunitrazepam). Em ciclos de congelamento e descongelamento, a grande maioria dos antidepressivos e opioides foram considerados estáveis, diferentemente foi observado para os benzodiazepínicos. A estabilidade pós processamento (em amostrador automático à 10 ºC) garantiu estabilidade por 24 horas para todos os analitos empregados no método, exceto nitrazepam, 7-aminoclonazepam e 7-aminoflunitrazepam (estáveis por até 18 horas). Foram analisadas 38 amostras de fluido oral dentre elas, 13 foram positivas para 2 dos analitos investigados, 10 apresentaram apenas 1 analito e 1 amostra mostrou positividade para 5 analitos. O citalopram foi a substância mais comumente encontrada (n = 10 amostras, 26,3%), com concentrações entre 1,4 e 150 ng/mL, seguido da venlafaxina (n = 9 amostras, 23,7%) com concentrações entre 0,6 e > 500 ng/mL. Das 38 amostras, 4 possuíam bupropiona (10,5%) e 7 possuíam seu produto de biotransformação, hidroxibupropiona (18,4%) com concentrações entre 1,2-334 e 0,6-189 ng/mL, respectivamente. Clomipramina, duloxetina, mirtazapina, paroxetina e zolpidem foram encontradas em apenas 1 amostra positiva cada, com concentrações entre 0,5-14,1 ng/mL. Em conclusão, o método foi desenvolvido e validado seguindo parâmetros recomendados internacionalmente para 50 substâncias, além de ter sido aplicado para análise de amostras de fluido oral coletadas de voluntários em festas de curta ou longa duração Abstract: Oral fluid is the biological matrix applied as alternative to the use of blood and its derivatives. Among the advantages of using this matrix are the ease of collection (non-invasive and can be performed under observation), difficult adulteration, easier analysis (when compared to plasma, for example) and the correlation between drug salivary and plasma concentrations. Method validation is the act of carrying out experimental tests in order to show that the method works within its expected conditions of employment. In the present work, a method was developed, validated and applied to the analysis of authentic oral fluid samples collected from volunteers attending university parties or electronic music festivals. The method allowed the analysis of 50 substances among antidepressants, benzodiazepines and opioids. The samples were collected using Quantisal¿ collector device, extracted using liquid-liquid extraction with MTBE, and then analyzed using liquid chromatography tandem mass spectrometry. During validation, the developed method fulfilled internationally recommended criteria, with lower limits of quantification of 0.5 and 1.0 ng/mL and linearity within 0.5-50.0 and 1.0-50.0 ng/mL for antidepressants, 0.5-25.0 ng/mL for benzodiazepines and 1.0-50.0 ng/mL for opioids. Bias and imprecision values were better than 16% and 20%, respectively and matrix effects, better than 25%. Neither evidence of carryover nor endogenous and exogenous (considering most common pharmaceuticals and drugs of abuse) interference were found. Stability studies showed that almost all analytes were stable at -20 ºC for 60 days (except for 7-aminoclonazepam, 7-aminoflunitrazepam, lorazepam, nordiazepam, naloxone, naltrexone and norsertraline); at 4 ºC for 7 days (except for nordiazepam, methadone and naltrexone) and at room temperature (25 ºC) for 3 days (except for sertraline and flunitrazepam). In freeze and thaw cycles, almost all antidepressants and opioids were considered stable, but differently was seen for benzodiazepines. Processed sample stability (in auto sampler at 10 ºC) guaranteed 24 hours stability for all analytes used in the method, except nitrazepam, 7-aminoclonazepam and 7-aminoflunitrazepam (stable for 18 hours). Thirty-eight authentic oral fluid samples were analyzed, among them, 13 were positive for 2 of the investigated analytes, 10 for only 1 analyte and 1 sample showed positivity for 5 analytes. Citalopram was the most found substance (n = 10 samples, 26.3%), with concentrations within 1.4 to 150 ng/mL, followed by venlafaxine (n = 9 samples, 23.7%) with concentrations between 0.6 to > 500 ng/ml. Among 38 samples, 4 had bupropion (10.5%) and 7 had their metabolite, hydroxybupropion (18.4%) with concentrations between 1.2-334 and 0.6-189 ng/mL, respectively. Clomipramine, duloxetine, mirtazapine, paroxetine and zolpidem were found in only 1 positive sample each, with concentrations between 0.5-14.1 ng/mL. In conclusion, the method was validated following internationally recommended guidelines for 50 substances and applied analyzing authentic oral fluid samples collected from volunteers at parties and electronic music festival Mestrado Farmacologia Mestra em Farmacologia CAPES 88882.435317/2019-01

Orientadores: José Luiz da Costa, Marcos Nogueira Eberlin Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: As novas substâncias psicoativas (NSP) são drogas de abuso de origem sintética que proporcionam ao usuário efeitos semelhantes aos produzidos pelas drogas de abuso "tradicionais" porém, em sua maioria, não são controladas por agências e órgãos internacionais. Atualmente, o uso de NSP vem se tornando um grande problema de saúde pública mundial, com relatos de intoxicações graves e mortes decorrentes do uso abusivo dessas drogas cada vez mais recorrentes. Devido à eficácia de NSP em doses baixas, a concentração destas substâncias em matrizes biológicas tais como sangue e seus derivados, urina, fluido oral e cabelo é extremamente baixa, exigindo técnicas analíticas extremamente sensíveis. Sendo assim, é necessário que o procedimento analítico que envolve desde o preparo de amostras à instrumentação analítica seja adequado para detectar e quantificar os analitos de maneira inequívoca. Considerando as desvantagens das técnicas tradicionais de extração, técnicas miniaturizadas vêm ganhando um foco devido à suas vantagens quanto à eficiência e baixo custo, bem como por serem procedimentos de preparos mais rápidos e fáceis. A microextração líquido-líquido dispersiva (dispersive liquid-liquid microextraction - DLLME) é uma miniaturização da técnica de extração líquido-líquido considerada muito simples, rápida e barata. O acoplamento da cromatografia líquida com a espectrometria de massas (LC-MS) além de possibilitar o desenvolvimento de métodos eficientes e em tempo de análise reduzido, oferece alta seletividade e detectabilidade, e se tornou uma das técnicas mais amplamente utilizadas na área da toxicologia em análises de fármacos e drogas de abuso em matrizes biológicas. O objetivo deste projeto foi otimizar, validar e implementar uma metodologia analítica qualitativa aliando a DLLME à técnica de LC-MS para a identificação de NSP em amostras de plasma. As análises foram realizadas em monitoramento de reação múltipla (MRM), utilizando ionização por electrospray (ESI) em modo positivo. A validação qualitativa foi realizada seguindo o guia do SWGTOX. O LOD variou de 0,1 a 1 ng / mL, concentrações esperadas em casos reais. As imprecisões foram inferiores a 20% (expressas em termos de repetibilidade). Os valores de efeitos de matriz que se encontram dentro da faixa aceitável de ±20% variaram entre 1,6 e 13,4% para SC; 0,7 a 8% para FD e de 8,6 a 14,9% para os NBOMes. A recuperação dos analitos após o método de extração apresentaram valores entre 29,8 e 114,4% para todos os analitos. Nas análises de estabilidade, foram avaliados os intervalos de 0, 4, 7 e 15 dias, em que os analitos se apresentaram em sua maioria decaimento com variações maiores do que ±20%. O método foi aplicado em dez amostras de de casos de tentativa de suicídio. A técnica de LDS-DLLME forneceu resultados satisfatórios para o objetivo do estudo, podendo ser amplamente utilizada em laboratórios de toxicologia clínica e forense de acordo com os parâmetros de validação qualitativos avaliados. Além disso, alia-se ao fato da utilização de uma técnica analítica tão sofisticada e completa como a de LC-MS, que permite uma maior e mais confiável identificação das NSP, que se tornaram um desafio mundial devido à sua grande variedade Abstract: New psychoactive substances (NPS) are synthetic drugs of abuse that provide users with effects similar to those produced by "traditional" substance abuse drugs, but most are not controlled by international agencies and agencies. Currently, the use of NSP has become a major public health problem worldwide, it has been reported of severe poisoning and deaths resulting from the abusive use of these increasingly recurrent drugs. Because of the effectiveness of NSP at low doses, the concentration in highly complex biological matrices such as blood, plasma, urine, oral fluid and hair of such compounds is generally below the detection limit of most analytical methods. Therefore, its necessary that the analytical procedure that involves from the preparation of samples to the analytical instrumentation is adequate to detect and quantify the analytes unequivocally. Regarding the disadvantages of traditional extraction techniques, miniaturized techniques have been gaining a focus due to their advantages in terms of efficiency and low cost, as well as being quicker and easier preparation procedures. The coupling of liquid chromatography with mass spectrometry (LC-MS) in addition to enabling the development of efficient methods and reduced analysis time, offers high selectivity and detectability, and has become one of the most widely used techniques in the field of toxicology in analysis of drugs of abuse in biological matrices. The objective of this project was to optimize, validate and implement a qualitative analytical methodology combining DLLME with the LC-MS technique for the identification of NSP in plasma samples. Analyses were performed in multiple reaction monitoring (MRM), utilizing electrospray ionization (ESI) in positive mode. Qualitative validation was performed following SWGTOX guideline. The LOD ranged from 0.1 to 1 ng/mL, concentrations expected to be found in real cases. The imprecisions were lower than 20% (expressed in terms of repeatability). The values of matrix effects that are within the acceptable range of ± 20% ranged from 1.6 to 13.4% for SC; 0.7 to 8% for FD and from 8.6 to 14.9% for the NBOMes. The recovery of the analytes after the extraction method presented values between 29.8 and 114.4% for all the analytes. For stability analyzes, the 0, 4, 7 and 15 day intervals were evaluated, in which the analytes were mostly decreased, with variations greater than ± 20%. The method was sucessfully applied to ten samples from suicide attempt cases. The LDS-DLLME technique provided satisfactory results for the purpose of the study and can be widely used in clinical and forensic toxicology laboratories, according to the qualitative validation parameters evaluated. In addition, it¿s combined with the use of a sophisticated and complete analytical technique such as LC-MS, which allows for a greater and more reliable identification of NSPs, which have become a worldwide challenge due to their wide variety Mestrado Patologia Clínica Mestra em Ciências FAPESP 2017/12850-0 CAPES

Orientador: Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Este trabalho teve como objetivo avaliar como os métodos de secagem das folhas de Mikania glomerata Spreng. e Mikania laevigata Schultz influenciam no perfil de constituintes presentes nos extratos obtidos, avaliar a composição e atividade biológica de extratos hidroetanólicos e aquosos de ambas as espécies e obtenção de frações enriquecidas através de Cromatografia de Contra Corrente. Os processos de secagem avaliados foram secagem em estufa e secagem à sombra em temperatura ambiente. Todos os extratos obtidos foram analisados quanto à sua composição por Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas (UHPLC-MS) para obter seu perfil químico. Os extratos foram avaliados quanto a sua citotoxicidade por: avaliação do efeito sobre células musculares e epiteliais de epiderme e de brônquios; avaliação do efeito sobre células tumorais; transativação por gene repórter; ensaio antidesnaturação em albumina sérica bovina. Sua atividade antioxidante foi avaliada por 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH) e por ORACFL. E Atividade antimicrobiana foi avaliada por placa de ágar perfurado. Estes mesmos extratos foram submetidos ao processo de fracionamento por Cromatografia de Contra Corrente para a obtenção de frações enriquecidas e suas composições foram analisadas em corrida similar ao que os extratos originais foram submetidos em UHPLC-MS. Através dos resultados obtidos nesta tese, é nítida a impossibilidade que estas espécies sejam intercambiáveis para a produção de fármacos como é usualmente discutido, sendo as vias de ação em que cada espécie atua diretamente associada a sua composição. Os testes de citotoxicidade apontam que não há prejuízo para as células locais em concentração até 112,5 µg/mL e com o benefício de estimulação da proliferação celular, indicando potencial cicatrizante. A atividade antioxidante está relacionada ao tipo de extrato, principalmente à concentração de ácidos cafeoilquínicos e compostos fenólicos presentes. A maioria das cepas bacterianas estudadas foram inibidas em concentração dos extratos de até 5 mg/mL. Quando submetidos aos testes de secagem, o tecido vegetal apresentou-se mais próximo a composição original após a secagem em estufa, possivelmente devido a inativação de enzimas e micro-organismos responsáveis pela degradação. A obtenção de frações enriquecidas através da Cromatografia de Contra Corrente demostrou que, apesar da complexidade dos extratos, este método é reprodutível quanto a obtenção de compostos, mesmo em concentração extremamente baixa no extrato original, robusta quanto ao aumento de escala e de baixa perda quando realizado o balanço de massas ao final do processo, menor que 17% Abstract: This study aimed to evaluate how the drying methods of leaves of Mikania glomerata Spreng. and Mikania laevigata Schultz influence on the profile of constituents present in their extracts, to evaluate the composition and biological activity of hydroethanolic and aqueous extracts of both species and obtaining enriched fractions by Counter Current Chromatography. The drying processes evaluated were oven drying and shade drying at room temperature. All extracts were analyzed for their composition by Ultra High Efficiency Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry (UHPLC-MS) to obtain their chemical profile. The extracts were evaluated for their cytotoxicity by: evaluation of the effect on muscle and epithelial cells of the epidermis and bronchi; evaluation of the effect on tumor cells; transactivation by gene reporter; immunoassay in bovine serum albumin. Their antioxidant activity was evaluated by 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazila (DPPH) and by ORACFL. Antimicrobial activity was evaluated by perforated agar plate. These same extracts were subjected to the fractionation process by Counter Current Chromatography to obtain enriched fractions and their composition was analyzed in a similar run as the original extracts were submitted to UHPLC-MS. Through the results obtained in this thesis, it is clearly impossible for these species to be interchangeable for the production of drugs as is usually discussed, as the pathways of action in which each species acts directly associated with its composition. Cytotoxicity tests indicate that there is no damage to cells in concentrations up to 112.5 ?g / mL and with the benefit of stimulation of cell proliferation, indicating potential healing. The antioxidant activity is related to the type of extract, mainly to the concentration of caffeoylquinic acids and phenolic compounds present. Most of the bacterial strains studied were inhibited at concentrations of extracts up to 5 mg / mL. When submitted to the drying tests, the plant tissue presented composition closer to the original composition than after drying in the greenhouse, possibly due to the inactivation of enzymes and microorganisms responsible for the degradation. The obtainment of enriched fractions through Counter Current Chromatography showed that, despite the complexity of the extracts, this method is reproducible in obtaining compounds, even when they are in extremely low concentration in the original extract, robust for scaling up and presented low loss when performed the mass balance at the end of the process, less than 17% Doutorado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Doutor em Ciências CAPES

Orientador: Stephen Hyslop Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A composição e as propriedades das peçonhas da maioria das serpentes da família Colubridae são pouco conhecidas, embora o interesse nestas secreções tenha aumentado consideravelmente nos últimos anos. Neste trabalho, investigamos o perfil bioquímico e algumas atividades biológicas da peçonha de Leptodeira annulata, espécie com ampla distribuição nas Américas. O perfil eletroforético da peçonha em SDS-PAGE mostrou que a maioria das bandas têm massas moleculares de 30-70 kDa. A zimografia revelou várias bandas de atividades caseinolítica e gelatinolítica. A atividade caseinolítica foi muito semelhante à de B. moojeni e maior que a de B. jararacussu, com pH e temperatura ótimos de 8,0 e 37 ºC, respectivamente. Esta atividade foi fortemente inibida por EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) e 1,10-fenantrolina, mas não por PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil) ou AEBSF (fluoreto de 4-2-aminoetil benzenosulfonil). A peçonha não mostrou atividade contra BApNA (n-benzoil-L-arginina p-nitroanilida) e foi mais ativa sobre o substrato natural elastina- Congo vermelho de que sobre o substrato sintético n-t-boc-L-alanina p-nitrofenil éster; houve pouca atividade sobre o hide powder azure. A peçonha mostrou moderada atividade fosfolipásica comparada às peçonhas de Bothrops spp. O perfil cromatográfico da peçonha em RP-HPLC apresentou 34 picos. A peçonha não coagulou o plasma citratado de ratos ou o fibrinogênio purificado, porém atenuou a extensão da coagulação em ~30% e atrasou o tempo de recalcificação do plasma em ~3 min. Também degradou a cadeia ? do fibrinogênio purificado, enquanto que a cadeia ? e a cadeia ? não foram afetadas, conforme avaliado por SDS-PAGE. Essa atividade fibrinogenolítica foi inibida por EDTA e 1,10-fenantrolina (10 mM), mas não por inibidores de serinoproteases (AEBSF, PMSF), indicando que as metaloproteases foram responsáveis por essa atividade. O ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) mostrou que a peçonha reagiu mais com o antisoro botrópico gerado contra Bothrops spp., seguido de antissoro elapídico (Micrurus spp.) e antisoro crotálico (Crotalus durissus terrificus). A dose hemorrágica mínima no rato foi de 95,8 µg e esta atividade foi atenuada pelo EDTA e 1,10-fenantrolina. A peçonha causou miotoxicidade em músculo esquelético de camundongo aumentando os níveis plasmáticos de CK e causando alterações histopatológicas. A peçonha também produziu relaxamento concentração-dependente de anéis de aorta e de artéria mesentérica de ratos, sendo esse último muito menos sensível. O efeito relaxante em aorta foi parcialmente inibido pela remoção do endotélio, pelo tratamento da peçonha com EDTA e pela pré-incubação dos anéis com indometacina, ODQ (1H-1,2,4 oxadiazolol 4,3-a quinoxalin-1-one) e L-NAME. Estes achados indicaram o envolvimento de pelo menos duas vias de sinalização na vasodilatação, uma envolvendo a via de óxido nítrico (NO)/guanilato ciclase solúvel (GCs)/GMPc e outra envolvendo metabólitos do ácido araquidônico. A liberação destes mediadores pode envolver a ação de SVMPs e PLA2 da peçonha ou endógenas, sem, porém, afetar a integridade do tecido. A peçonha não causou alterações nos parâmetros hemodinâmicos de ratos (6 mg/kg, i.v.), mas causou alterações histopatológicas nos pulmões de ratos (hemorragia, formação de trombos e inflamação) sem afetar o fígado, rim e coração. Estes resultados indicam que a peçonha de L. annulata exerce várias atividades biológicas, a maioria das quais parece ser mediada por SVMPs da peçonha Abstract: The venom composition and properties of most snakes of the family Colubridae are largely unknown, although interest in these secretions has increased considerably in recent years. In this work, we investigated the biochemical profile and some biological activities of the venom of Leptodeira annulata, a species with a wide distribution throughout the Americas. SDS-PAGE of L. annulata venom showed that most of the protein bands has molecular masses of 30-70 kDa. Zymography revealed caseinolytic and gelatinolytic activities in various protein bands. The caseinolytic activity of L. annulata venom was very similar to that of B. moojeni and greater than that of B. jararacussu, with pH and temperature optima of 8.0 and 37 ºC, respectively. This activity was strongly inhibited by EDTA and 1,10-phenanthroline (metalloproteinase inhibitors), but not by PMSF or AEBSF (serine protease inhibitors). The venom was more active towards the natural substrate elastin-Congo red than towards the synthetic substrate n-t-boc-L-alanine p-nitrophenyl ester, and showed low PLA2 activity compared to Bothrops venoms. The venom was not very active towards hide powder azure and did not degrade BApNA and TAME, two esterase substrates. RP-HPLC of the venom resulted in 34 peaks. The venom (10 ?g) did not clot rat citrated plasma even after 5 min at 37 ºC, whereas B. atrox venom (10 ?g) clotted citrated plasma in 49±12 s (mean±SD; n=6). The venom reduced the extent of coagulation by ~30% and prolonged the plasma recalcification time by ~3 min. The latter finding agreed with the ability of venom to degrade the A?-chain of purified fibrinogen, whereas the B?-chain and ?-chain were not affected, as assessed by SDS-PAGE. This fibrinogenolytic activity was inhibited by EDTA and 1,10-phenanthroline (10 mM) but not by PMSF and AEBSF (10 mM), indicating that metalloproteases but not serine proteases were involved. ELISA showed that L. annulata venom reacted most with antivenom raised against Bothrops spp., followed by coral snakes (Micrurus spp.) and rattlesnakes (Crotalus durissus terrificus). The minimum hemorrhagic dose in rats was 95.8 µg and this activity was inhibited by EDTA and 1,10-phenanthroline (10 mM). The venom caused concentration-dependent relaxation of aortic rings and relaxed mesenteric artery rings, being much less sensitive. The relaxing effect was partially inhibited by removal of the endothelium, the treatment of venom with EDTA, and the pre-incubation of rings with indomethacin, ODQ (inhibitor of soluble guanylate cyclase) and L-NAME (inhibitor of nitric oxide synthase). These findings indicated that at least two pathways (NO/GC/GMPc signaling and arachidonic acid metabolite formation) were involved, at least partially via the action of metalloproteinases and possibly PLA2; the venom had no effect on vessel reactivity (intactness). The venom did not cause any hemodynamic alterations in anesthetized rats at doses up to 6 mg/kg, i.v. However, histopathological alterations (hemorrhage, thrombus formation and inflammation) were observed in rat lungs, but not in liver, kidney and heart. These findings indicate that L. annulata venom exerts a variety of biological activities that are mediated primarily by venom metalloproteinases and possibly by PLA2 CNPQ

Orientadores: Marcos Nogueira Eberlin, José Luiz da Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: Para atender ao interesse jurídico da necessidade de armazenamento de amostra, a aplicação de métodos de coleta que utilizam volumes pequenos de fluidos biológicos, em escala de microlitros, tem se tornado popular e tem sido explorado por laboratórios clínicos e forenses. Uma das técnicas mais exploradas neste contexto é a dried blood spots (DBS). De forma análoga ao sangue, é possível realizar análises toxicológicas de drogas de abuso em urina utilizando este tipo de amostragem, que passa a ser conhecido como dried urine spots (DUS) e, embora esta técnica ainda não tenha sido tão explorada, ela deve ser de interesse supondo que compartilhe das mesmas vantagens do DBS. Considerando as baixas concentrações que estas drogas são encontradas nas matrizes biológicas, técnicas que possuam grande detectabilidade e sensibilidade são necessárias. Para suprir estas necessidades, a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC¿MS/MS) tem sido referenciada como padrão-ouro nos laboratórios de toxicologia analítica e é a técnica escolhida. Neste trabalho, o objetivo foi o desenvolvimento de métodos analíticos simples de amostragem por DUS com análise por LC¿MS/MS que pudessem ser aplicados em exames de confirmação e quantificação de duas das drogas de abuso mais utilizadas no mundo, a cocaína (COC) e o tetraidrocanabinol (THC) e seus principais metabólitos encontrados na urina... O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: In order to attend to the juridical necessity of sample storage, the use of collection devices which requires small amounts of biological fluids, in microliters scale, have become popular and explored in clinical and forensic laboratories. One of the most explored technique in this context is the dried blood spots (DBS). Similarly to blood, it is possible to perform toxicological analysis of drugs of abuse in urine using the same technique, known as dried urine spots (DUS) and, although this technique has not been explored as much, it should be of interest supposing that they share the same advantages as DBS. Considering the low concentration these drugs are found in the matrices, techniques that hold great detectability and sensitivity are needed. In order to fulfill these necessities, liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC¿MS/MS) has been heralded as "gold standard" in analytical toxicology laboratories and is the technique of choice. In this work, the goal was to develop simple analytical methods for DUS and LC-MS/MS that could be applied in the confirmation and quantification of two of the most abused drugs worldwide, cocaine (COC) and tetrahydrocannabinol (THC) and their main metabolites found in urine... The abstract is available with the full electronic document Mestrado Química Analítica Mestra em Química CAPES

Orientador: Paulo César Pires Rosa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os estados de ansiedade e os distúrbios do sono representam problemas comuns, e os agentes sedativo-hipnóticos estão entre as drogas mais largamente prescritas em todo o mundo. Clonazepam, é um derivado benzodiazepínico amplamente administrado como ansiolítico, anticonvulsivante, relaxante muscular e anestésico sedativo. O delineamento do estudo de interação de excipientes de formulação de Clonazepam e o desenvolvimento de método indicativo de estabilidade são as grandes dificuldades na área farmacêutica, desafiando profissionais de desenvolvimento de produtos farmacêuticos. Através deste estudo é possível evidenciar a estabilidade do medicamento. Este trabalho teve como principais objetivos, aplicar a análise por Infravermelho (IR) para verificação da degradação e alteração dos grupos funcionais; aplicar análise térmica, devido a importância no estudo de caracterização, a determinação do grau de pureza e a realização de ensaios de estabilidade e cinética de decomposição; e desenvolver e validar um método para a quantificação de Clonazepam, com uma nova análise cromatográfica sem uso de tampão na fase móvel, para ser aplicado nos estudos de estabilidade de formulações farmacêuticas e na análise de produtos de degradação. Os resultados obtidos da análise térmica mostraram que os excipientes estudados não evidenciaram mudanças no comportamento térmico das misturas binárias clonazepam-excipiente sem indicação de incompatibilidade. O método analítico desenvolvido por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE) mostrou-se adequado para a quantificação de Clonazepam e de suas impurezas, baseando-se nos parâmetros de validação da resolução da ANVISA (899/2003). A implementação da análise térmica e a aplicação de novos métodos analíticos têm sido consideradas importantes ferramentas nas diferentes áreas da indústria farmacêutica, fornecendo informações que determinam os parâmetros de qualidade tecnológicos do medicamento, visando o desenvolvimento de novas formulações Abstract: Anxiety and sleeping disturbs states represent common problems and the sedative-hypnotics agents are among the most widely prescribed drugs all over the world. Clonazepam is a benzodiazepine derivative largely given as an anxiolytic, anticonvulsant, muscle relaxant and sedative anaesthetic. The delineation of the study on the interaction of excipients of Clonazepam formulation and the development of indicative method of stability are the major difficulties in the pharmaceutic area, challenging pharmaceutics products developers. Through the present study, it is possible to demonstrate the medication stability. This study has had as main objectives to apply the analysis via Infrared (IR) to verify the degradation and alteration of the functional groups; to apply thermal analysis, due to their importance in the characterization study, the determination of the purity degree and the execution of stability and decomposition kinetic tests; and to develop and validate a method for the quantification of Clonazepam, with a new chromatographic analysis with no use of buffer in the mobile phase to be applied in the studies of stability of pharmaceutic formulations and in the analysis of degradation products. The results obtained from the thermal analysis have showed that the studied excipients did not reveal changes in the thermal behaviour of the binary mixtures, clonazepam-excipient, with no indication of incompatibility. The analytic method developed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) has been shown adequate for quantification of Clonazepam and its impurities, based on the validation parameters of the Brazilian Health Regulatory Agency¿s (ANVISA) resolution (899/2003). The implementation of thermal analysis and the application of new analytic methods have been considered important tools in the diverse areas of the pharmaceutical industry, providing information that define the technological quality parameters of the medication, aiming the development of new formulations Mestrado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Mestra em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos

Orientador: Patricia Moriel Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Crianças fazem parte de um importante segmento da população, entretanto elas são excluídas dos ensaios clínicos. Como consequência, estão mais vulneráveis a apresentar eventos adversos a medicamentos (EAMs) pois os possíveis prejuízos não foram estudados. Este estudo foi conduzido para determinar a taxa e caracterizar os EAMs em pacientes pediátricos e também para explorar a efetividade do acompanhamento farmacoterapêutico. Foi conduzido um estudo clínico e prospectivo em uma Unidade de Emergência Pediátrica, durante o período de fevereiro de 2014 a fevereiro de 2015. Os EAMs foram classificados em cinco categorias: Reação Adversa a Medicamento (RAM), Inefetividade Terapêutica, Erros de Medicação, Interação Medicamentosa, Uso off-label, Queixas Técnicas e Intoxicações. Sessenta e nove pacientes (4,5%) foram admitidos na UER com 81 EAMs. Os mais prevalentes foram srro de medicação (30; 40,5%), RAM (21; 25,9%) e ineficácia terapêutica (21; 25,9%). No que se refere a preventabilidade, 64,9% foram previsíveis. O farmacêutico clínico foi capaz de contribuir no plano de cuidados para resolver os EAMs em 84,7% dos pacientes pediátricos, através de 158 intervenções farmacêuticas, sendo esta redução estatisticamente significativa (p