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In the past years, extracellular vesicles (EVs) have become an important field of research since EVs have been found to play a central role in biological processes. In pathogens, EVs are involved in several events during the host–pathogen interaction, including invasion, immunomodulation, and pathology as well as parasite–parasite communication. In this report, we summarised the role of EVs in infections caused by viruses, bacteria, fungi, protozoa, and helminths based on the talks and discussions carried out during the International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) workshop held in São Paulo (November, 2016), Brazil, entitled Cross-organism Communication by Extracellular Vesicles: Hosts, Microbes and Parasites. Fil: Soares, Rodrigo P.. Fundación Oswaldo Cruz; Brasil Fil: Xander, Patrícia. Universidade de Sao Paulo; Brasil Fil: Costa, Adriana Oliveira. Universidade Federal de Minas Gerais; Brasil Fil: Marcilla, Antonio. Universidad de Valencia; España Fil: Menezes Neto, Armando. Fundación Oswaldo Cruz; Brasil Fil: Del Portillo, Hernando. Instituto de Salud Global de Barcelona; España Fil: Witwer, Kenneth. University Johns Hopkins; Estados Unidos Fil: Wauben, Marca. Utrecht University; Países Bajos Fil: Nolte-T Hoen, Esther. Utrecht University; Países Bajos Fil: Olivier, Martin. Mcgill University; Canadá Fil: Criado, Miriã Ferreira. Universidade de Sao Paulo; Brasil Fil: da Silva, Luis Lamberti P.. Universidade de Sao Paulo; Brasil Fil: Abdel Baqui, Munira Muhammad. Universidade de Sao Paulo; Brasil Fil: Schenkman, Sergio. Universidade Federal de Sao Paulo; Fil: Colli, Walter. Universidade de Sao Paulo; Brasil Fil: Alves, Maria Julia Manso. Universidade de Sao Paulo; Brasil Fil: Ferreira, Karen Spadari. Universidade Federal de Sao Paulo; Brasil Fil: Puccia, Rosana. Universidade Federal de Sao Paulo; Brasil Fil: Nejsum, Peter. University Aarhus; Dinamarca Fil: Riesbeck, Kristian. Lund University; Suecia Fil: Stensballe, Allan. Aalborg Universitet; Dinamarca Fil: Hansen, Eline Palm. Universidad de Copenhagen; Dinamarca Fil: Jaular, Lorena Martin. Institut Curie; Francia Fil: Øvstebø, Reidun. Oslo University Hospital; Noruega Fil: de la Canal, Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina Fil: Bergese, Paolo. Università Degli Studi Di Brescia; Italia Fil: Pereira-Chioccola, Vera. Instituto Adolfo Lutz; Brasil Fil: Pfaffl, Michael W.. Universitat Technical Zu Munich; Alemania Fil: Fritz, Joëlle. University Of Luxembourg; Luxemburgo Fil: Gho, Yong Song. Pohang University Of Science And Technology; Corea del Sur Fil: Torrecilhas, Ana Claudia. Universidade Federal de Sao Paulo; Brasil

Two xenic isolates and cloned cultures of Entamoeba dispar were submitted to monoxenization using Crithidia fasciculata as the associated organism. Growth in monoxenic cultivation and ability of xenic and monoxenic trophozoites to destroy VERO cells and produce lesions in hamster livers were compared to those of a virulent E. histolytica. Parental and cloned E. dispar under monoxenic cultivation showed a remarkable lower growth than the monoxenic E. histolytica and were avirulent in both in vivo and in vitro tests. When xenically cultured, trophozoites of E. dispar showed a moderate lytic activity against VERO cells (1.5 to 41.8% of destruction) but caused severe hepatic lesions in hamsters as those caused by the virulent E. histolytica (29 to 100% in prevalence and 0.86 to 4.00 in lesion degree). Although E. dispar has not been associated with invasive disease in men, the ability of xenic trophozoites to produce prominent tissue damage in experimental conditions has indicated that some strains have a considerable pathogenic potential when in presence of bacteria. Dois isolados de Entamoeba dispar em cultivo polixênico e culturas clonadas deles obtidas foram submetidos à monoxenização utilizando Crithidia fasciculata como organismo associado. O crescimento em cultivo monoxênico dos isolados e clones, bem como sua capacidade de destruir células VERO (efeito citopático) e de produzir lesões hepáticas em hamster foram comparados a uma cepa virulenta de E. histolytica. Os trofozoítos de E. dispar em cultivo monoxênico apresentaram um crescimento nitidamente menor que o de E. histolytica e foram avirulentos tanto no teste in vivo quanto in vitro. Entretanto, isolados e clones de E. dispar em cultivo polixênico exibiram uma atividade lítica moderada sobre as células VERO (1,5 to 41,8% de destruição) e causaram lesões hepáticas em hamster (29 a 100% em prevalência e 0,86 a 4,00 no grau de lesão) tão extensas quanto aquelas causadas pela E. histolytica. Embora E. dispar não seja associada à doença invasiva no homem, a ocorrência de lesões teciduais significativas, causadas por trofozoítos em condições experimentais, indica que esta espécie pode apresentar potencial patogênico considerável quando em presença de bactérias intestinais.

Orientadora: Profª. Drª. Larissa Magalhães Alvarenga Co-orientadores: Profª. Drª Adriana Oliveira Costa, Profª. Drª. Juliana Ferreira de Moura e Profº. Drº. Marcel Ramirez Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 01/09/2017 Inclui referências Resumo: O aumento da ocorrência de casos clínicos de ceratite amebiana (CA), grave infecção da córnea causada por amebas do gênero Acanthamoeba, tem levado a um crescente número de estudos sobre esse microrganismo. As amebas desse gênero são protozoários de vida livre, encontrados em diversos ambientes como ar, solo e água e são denominados anfizóicos, por sua capacidade de viver livremente no ambiente e de facultativamente causar infecções em animais e no ser humano. Atualmente, são admitidos diferentes genótipos de Acanthamoeba e alguns estudos demonstram relação entre o potencial de infecção e patogenicidade. Porém, fatores associados ao hospedeiro, como a interação do protozoário com o sistema imune, também tem sido avaliados como possível explicação para a ocorrência das infecções. Outra lacuna importante no conhecimento sobre as infecções por Acanthamoeba é a dificuldade no diagnóstico devido à similaridade com outras doenças, resultando em condutas clínicas inadequadas que agravam os casos. Recentemente nosso grupo produziu um anticorpo monoclonal, denominado mAb3, que apresentou reatividade por uma proteína que pode estar associada com potencial patogênico. O objetivo deste estudo é caracterizar os antígenos reconhecidos pelo mAb3, avaliar a importância desse antígeno no mecanismo de patogenicidade da CA e empregar este anticorpo na detecção de Acanthamoeba. No presente trabalho a reatividade do mAb3 foi avaliada por Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) , eletroforese SDS-PAGE, Western blotting e citometria de fluxo. Foi observado diferenças na expressão do antígeno alvo para diferentes isolados. Outros agentes também causadores de ceratite foram testados e não foram reconhecidos, confirmando a especificidade do mAb3. Foi possível identificar uma pequena quantidade de amostra de trofozoítos por citometria de fluxo, demonstrando uma alta reatividade do anticorpo. Dessa forma, seria possível melhorar a sensibilidade e tempo dos testes atualmente empregados para identificação de isolados com o uso deste anticorpo. O reconhecimento pelo mAb3 é influenciado pela inibição de N-glicosilações. A identificação da proteína alvo por espectrometria de massas sugeriu ser uma proteína transportadora de membrana da família CPA2. Foram observadas diferenças em relação à lise mediada pelo sistema complemento nos isolados analisados. Dois deles (AP2 e R2P5), com variações no reconhecimento pelo mAb3, foram avaliados quanto à capacidade de ativar diferentes vias do complemento, sendo que R2P5 apresentou maior tempo de sobrevivência, após a exposição ao soro normal humano. A via alternativa foi mais ativa quando as vias da Lectina e Clássica foram inibidas, sugerindo que na presença das três vias poderia existir algum efeito inibidor da via alternativa. Porém, mais estudos envolvendo a ação biológica dessa proteína, precisam ser investigadas para elucidar os mecanismos de reconhecimento do mAb3 e resistência da ativação do sistema complemento, as quais podem estar associadas a infectividade das Acanthamoeba na CA. Palavras-chave: Acanthamoeba. Citometria de fluxo. Anticorpo monoclonal. Sistema Complemento. Abstract: Increased occurrence of clinical cases of amebic keratitis (CA), a severe corneal infection caused by amoebas of the genus Acanthamoeba, has led to a growing number of studies on this microorganism. Amoebas of this genus are free-living protozoa, found in several environments such as air, soil and water and are called amphizóicos, for their ability to live freely in the environment and to cause infections in animals and in humans at will. Different Acanthamoeba genotypes are currently recognized and some studies show differences between potential for infection and pathogenicity. However, factors related to the host, such as the interaction of the protozoan with the immune system, have also been evaluated as a possible explanation for the occurrence of infections. Another important dificulty related to Acanthamoeba infections is mis-diagnosis due to the its similarity with other diseases, resulting in inadequate clinical procedures that may aggravate the infection. Recently our group produced a monoclonal antibody, called mAb3, that recognizes antigens present in pathogenic strains. The aim of this study is to characterize the antigens recognized by mAb3, to evaluate the importance of this antigen in the mechanism of CA pathogenicity and to use this antibody in the detection of Acanthamoeba. In the present work, the reactivity of mAb3 was evaluated by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), electrophoresis SDSPAGE, Western blotting and flow cytometry. The mAb3 antibody, already described in previous studies, showed reactivity to a protein that may be associated with pathogenic potential. Differences in the expression of the target antigen were observed for different isolates. Other agents also causing keratitis were tested and were not recognized, conforming to the specificity of mAb3. It was possible to identify a small amount of trophozoite sample by mAb3 by flow cytometry, demonstrating a high antibody reactivity. Using this antibody, it would be possible to improve the sensitivity and reduce the time currently needed to identify isolates. Recognition by mAb3 is influenced by the inhibition of N-glycosylations. Identification of the protein by mass spectrometry suggested it to be a membrane carrier of the CPA2 family. Differences were observed in relation to lysis mediated by the complement system in the isolates analyzed. Two of them (AP2 and R2P5), with variations in recognition by mAb3, were evaluated for the ability to activate different complement pathways, and R2P5 presented more resistance to death after exposure to normal human serum. The alternative pathway was more active when the Lectin and Classical pathways were inhibited, suggesting that in the presence of the three pathways there could be some inhibitory effect of the alternative pathway. However, further studies involving the biological action of this protein are needed to investigate and to elucidate the mechanisms of mAb3 recognition and resistance of complement system activation, which may be associated with the infectivity of Acanthamoeba in CA. Key-words: Acanthamoeba. Flow cytometry. Monoclonal antibody. Complement system.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cynara Oliveira Possamai.pdf: 3245812 bytes, checksum: 7de0caeadb98d478a083db43020f22f8 (MD5) Previous issue date: 2012-08-28 O gênero Acanthamoeba compreende protozoários anfizóicos que estão presentes nos mais diversos ambientes, podendo causar no homem doenças graves, como a ceratite amebiana e a encefalite amebiana granulomatosa. Os fatores envolvidos na patogenicidade de Acanthamoeba não são inteiramente conhecidos, por isso, alguns marcadores vêm sendo investigados na tentativa de identificar linhagens capazes de causar infecção. O objetivo deste trabalho foi investigar a ocorrência de Acanthamoeba em amostras clínicas e ambientais, bem como caracterizar os isolados obtidos por parâmetros morfológicos, genotipagem e avaliação do potencial patogênico. Foram coletadas amostras de raspado de córnea de pacientes com suspeita de ceratite amebiana e amostras ambientais provenientes de poeira, solo, piscina, água potável, água de inundação e água do mar da região metropolitana de Vitória-ES. Todas as amostras foram cultivadas em meio ágar soja. Além da cultura, as amostras de raspado de córnea também foram coletadas em salina de Page e submetidas a uma reação de semi-nested PCR. Culturas positivas para Acanthamoeba, identificadas com base na morfologia dos cistos e trofozoítos, foram selecionadas, clonadas e classificadas nos grupos morfológicos I, II ou III. A genotipagem dos isolados foi realizada a partir do sequenciamento parcial do gene 18S rDNA e o potencial patogênico das culturas clonadas foi avaliado por meio de ensaios de termotolerância e osmotolerância. Foram cultivadas em ágar 90 amostras ambientais, 16 de raspado de córnea e nove de lentes de contato (LC). Dessas, 38 (33 ambientais, quatro clínicas e uma de LC) foram positivas para Acanthamoeba, sendo obtidos 28 clones (24 ambientais, três clínicos e um de LC). Dentre eles, 26 apresentaram características morfológicas do grupo II, um do grupo I (solo) e um clone (água potável) não foi classificado de acordo com os parâmetros morfológicos de classificação. Quatro casos de ceratite amebiana foram confirmados somente por diagnóstico molecular. Todos os isolados clínicos, o de LC e a maioria dos isolados ambientais sequenciados foram classificados como pertencentes ao genótipo T4. Dentre os isolados ambientais, dois foram agrupados no genótipo T11 (piscina) e um no T1 (poeira). Todos os isolados clonados submetidos aos ensaios de termotolerância apresentaram crescimento a 28ºC e a 37ºC. Em contrapartida, nenhum isolado cresceu a 42ºC. Nos testes de osmotolerância, todos os isolados se desenvolveram a 0,1M e a 0,5M de manitol e a maioria deles cresceu à concentração de 1,0M. Os resultados deste estudo pioneiro no Espírito Santo confirmam a predominância do grupo morfológico II e do genótipo T4 em isolados clínicos e ambientais de Acanthamoeba e relata pela primeira vez no Brasil o isolamento de Acanthamoeba pertencente ao genótipo T1. Este trabalho demonstra também a presença de isolados potencialmente patogênicos no ambiente, inclusive em amostras de água de inundação e de água do mar, o que pode representar um fator de risco para o desenvolvimento de infecções causadas por Acanthamoeba. Além disso, a metodologia desenvolvida neste estudo poderá ser utilizada para um diagnóstico mais rápido, sensível e específico de ceratite por Acanthamoeba The genus Acanthamoeba comprises amphizoic protozoa with a wide environment distribution. They can cause serious diseases in humans, such as amoebic keratitis and granulomatous amoebic encephalitis. Thus, the factors involved in the pathogenicity of Acanthamoeba are being investigated as major interests to identify strains able to cause infection. The aim of this study was to investigate the occurrence of Acanthamoeba both in clinical and environmental samples, characterize the isolates by morphological parameters, genotyping and also evaluate the pathogenic potential. Clinical samples were collected from patients with a suspicious diagnosis of amoebic keratitis throughout corneal scrapings. Environmental samples were collected from dust, soil, swimming pool, tap, sea, and flood waters in Vitoria metropolitan regions, Espirito Santo State, Brazil. All samples were cultured on soy agar. Samples from corneal scrapings were also collected in Page saline and subjected to a reaction of semi-nested PCR. Positive cultures for Acanthamoeba, previously identified based on the cysts and trophozoites morphology, were selected, cloned and classified into morphological groups I, II or III. Genotyping of isolates was performed by partially sequencing the 18S rDNA gene while the pathogenic potential of cloned cultures was assessed by thermo and osmotolerance assays. From all samples cultured on agar, 90 were from environmental sources, 16 from corneal scrapings and nine from contact lenses (CL). Of these, 38 (33 from environmental samples, four from clinical samples and one from CL sample) were positive for Acanthamoeba. Among the 38 positive isolates, 28 were successfully cloned (24 from environmental isolates, three from clinical isolates and one from CL isolate). Twenty six cloned samples showed morphological characteristics of group II, one of group I (soil) and one (tap water) could not be classified according to morphological parameters. Four cases of amoebic keratitis could only be confirmed by molecular diagnosis. All clinical, CL and most of the environmental isolates sequenced were classified as T4 genotype. Among the environmental isolates, two were grouped in genotype T11 (pool) and one in T1 (dust). All cloned isolates subjected to the thermotolerance assay grew at 28 ºC and 37 ºC. The same result was observed in osmotolerance tests at 0.1M and 0.5M mannitol. Neverthless, while most of the cloned isolates were able to grow at 1.0M mannitol, none of the isolates were able to grow at 42 ºC. The present study confirms the predominance of morphological group II and genotype T4 in clinical and environmental isolates of Acanthamoeba in Espirito Santo State and first time reports the T1 genotype isolation of Acanthamoeba in Brazil. This work also demonstrates the presence of potentially pathogenic isolates at the environment, including samples of flood and sea waters, which may represent a risk factor for the development of infections caused by Acanthamoeba. Furthermore, the methodology used in this study could be used for a fast, sensitive and specific diagnosis of Acanthamoeba keratitis