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Submitted by Graciely Gomes Corrêa (gracielygc@hotmail.com) on 2019-08-19T18:59:18Z No. of bitstreams: 2 Tese de Doutorado_Graciely Gomes_Versão biblioteca parcial.pdf: 852567 bytes, checksum: ae1774ab9c4457f049717d0b994c85c8 (MD5) Tese de Doutorado_Graciely Gomes_Versão biblioteca completo.pdf: 2872254 bytes, checksum: f61f98ce0a5c18504b56801bd66ddfb3 (MD5) Approved for entry into archive by Maria Irani Coito (irani@fcfar.unesp.br) on 2019-08-19T19:30:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 correa_gg_dr_arafcf_par.pdf: 935519 bytes, checksum: b02ae7bf2fdcc04c9979de4e7257f091 (MD5) Made available in DSpace on 2019-08-19T19:30:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 correa_gg_dr_arafcf_par.pdf: 935519 bytes, checksum: b02ae7bf2fdcc04c9979de4e7257f091 (MD5) Previous issue date: 2019-07-29 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Os métodos de indução da expressão gênica disponíveis para linhagens bacterianas envolvem a adição de compostos indutores ao meio de cultura (por exemplo, isopropil β-D-1-tiogalactopiranosideo, xilose e arabinose), o que é indesejável para linhagens industriais, pois encarece o processo produtivo. Já a utilização da expressão constitutiva, alternativa à indução, pode ocasionar stress metabólico durante a fase lag de crescimento quando são utilizados promotores fortes. O objetivo do trabalho foi construir e padronizar um novo modelo de indução da expressão gênica para linhagens bacterianas industriais. O novo modelo de autoindução baseado no sistema de quorum-sensing bacteriano, permitindo que a célula se automonitore e induza a expressão gênica durante a fase exponencial de crescimento, eliminando assim não só a necessidade de adição de composto indutor como a necessidade de monitoramento da densidade celular pré-indução. Realizou-se amplificação e clonagem dos genes luxR e luxI, com e sem caudas de histidina, e suas respectivas sequências regulatórias de Aliivibrio fischeri, em plasmídeo contendo os genes responsáveis pela bioluminescência ou fluorescência com códons otimizados para Bacillus subtilis. Em seguida, foi realizada transformação e a integração do plasmídeo no cromossomo de B. subtilis. A funcionalidade do sistema foi avaliada em diferentes etapas de crescimento microbiano com o auxílio de um leitor de microplacas durante intervalos regulares. O sistema de autoindução mostrou-se funcional em B. subtilis, com indução acentuada da expressão do gene repórter, disposto downstream ao promotor Plux, durante a fase exponencial de crescimento. Verificou-se ainda que a inserção do sistema baseado no quorum-sensing não afetou o crescimento do microrganismo significativamente. Foram desenvolvidas e testadas dez otimizações do sistema inicial, com alterações na sequência do promotor Plux. Através dessas otimizações, construímos linhagens com diferentes níveis de expressão do sistema de autoindução e força do promotor variável. Ao caracterizar os sistemas, foi constatado alto nível de modularidade, podendo ser utilizados em diferentes linhagens de B. subtilis, diferentes contextos genéticos e para a produção de diferentes produtos. O modelo de indução desenvolvido se mostrou funcional e modular e poderá ser adaptado a diferentes espécies e compostos, configurando uma nova ferramenta para a biologia sintética. Current methods available for the autoinduction of gene expression in genetically engineered bacterial strains require addition of inducing compounds to the culture medium (e.g. Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, xylose, and arabinose), which is undesirable for industrial strains due to additional costs to the production process. Alternatively, constitutive gene expression is employed. However, the later can possibly cause metabolic stress during the lag growth phase if strong promoters are employed. The objective of this work was to construct and to standardize a new model for induction of gene expression in industrial bacterial strains. The new model is based on an autoinduction process triggered by the bacterial quorum-sensing system. It allows the cell to monitor itself and induce its own gene expression during the exponential growth phase, thereby eliminating both the need for an external inducing compound and the need for monitoring pre-inducing cell density. Bacterial cultures were grown in rich media, supplemented or not with antibiotics. Amplification and cloning of luxR and luxI genes, with and without histidine tags, and their respective regulatory sequences of Aliivibrio fischeri, were performed on a plasmid containing the genes responsible for bioluminescence or fluorescence with codons optimized for Bacillus subtilis. Next, transformation and integration of the plasmid into the B. subtilis chromosome were performed. The functionality of the system was evaluated at different stages of microbial growth, by luminescence or fluorescence measurement at regular intervals, using a microplate reader. The autoinduction system promoted accentuated induction of reporter gene expression located downstream of the Plux promoter during the exponential growth phase. It was also found that the insertion of the quorum-sensing system did not significantly affect the microorganism growth. Ten variations of the autoinduction system were generated and tested, which consisted of optimizations of the Plux promoter. Through the optimizations, we constructed strains showing a range of gene expression fold change and an array of promoter strengths. The constructed autoinduction systems show high level modularity, as they are functional in different strains of B. subtilis, in different genetic contexts and can efficiently control the production of different products. The developed induction model proved to be functional and modular, and it could be adapted to different species and compounds, configuring a new tool for synthetic biology. CAPES: 88882.330104/2018-01 FAPESP: 2014/17564-7 CAPES/DAAD: 88887.161394/2017-00

CNPQ; CAPES O bioma Caatinga é o principal ecossistema da Região Nordeste que apresenta características peculiares devido ao seu clima quente e seco, típico do semi-árido. As actinobactérias de regiões de condições extremas são importantes em decorrência dos mecanismos de adaptação que estimulam a produção de novos compostos com potencial biotecnológico. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi isolar e identificar actinobactérias da rizosfera da Caatinga, além de determinar a atividade antimicrobiana. O isolamento dos micro-organismos rizosféricos foi realizado pela técnica de diluição seriada, utilizando diferentes temperaturas e meios de cultura. Foram realizados testes antimicrobianos para seleção de actinobactérias com atividade para bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e fungos. No ensaio primário em blocos de gelose, foi selecionada a actinobactéria que apresentou melhor resultado no ensaio primário e, em seguida, realizado o ensaio secundário (fermentação), utilizando os meios MPE, M1, ISP3 e Ciclamicina. A partir da fermentação da actinobactéria selecionada, no melhor meio de produção e tempo de fermentação, foram realizados experimentos de extração do princípio bioativo da biomassa e do líquido metabólico, em diferentes pHs. Em seguida, foi determinada a concentração mínima inibitória (CMI) do extrato bruto, da biomassa e do líquido metabólico. A identificação das actinobactérias foi realizada pela técnica do microcultivo e análise molecular. Foram isoladas 96 actinobactérias, das quais 68% (65) foram oriundas da temperatura de 37° C e 46% (48) provenientes do meio de cultura HV-ágar. No ensaio em bloco de gelose, 55% (53) dos isolados apresentaram atividade contra pelo menos um dos micro-organismos testados. Após este ensaio, a actinobactéria 74 (HT 1A+17) foi selecionada para os testes secundários por apresentar excelentes halos de inibição frente às bactérias Gram positivas. Esta linhagem foi identificada como Sreptomyces sp. através de testes moleculares e verificou-se que o meio MPE foi o melhor para a produção do biocomposto em 72 horas de fermentação, os melhores solventes foram acetona e hexano, ambos em pH 7,0, para extração da biomassa e do líquido metabólico, respectivamente. O isolado 74 (HT 1A+17) apresentou resultados promissores na produção do composto bioativo e estudos mais detalhados deverão ser realizados para melhor caracterização.