Search

Catecholamines' stimulation of beta- adrenergic receptors (β-ARs) activates cAMP-Protein Kinase A (PKA) signaling pathway leading to dromotropic positive effect, i.e., increase in action potential (AP) conduction velocity. AP is spread by gap junction (GJ) localized at cardiomyocytes intercalated discs (ID) which are composed by connexin 43 (Cx43). They ensure anisotropic AP conduction and thereby synchronous and homogenous heart contraction. Cardiac Cx43 altered expression and/or localization are known to affect AP conduction and favors ventricular arrhythmias after myocardial infarction (MI). MI is a major public health problem characterized by an ischemic lesion leading to irreversible cardiomyocytes' death. Regarding the cause, β-ARs are chronically activated to maintain cardiac function after MI. Considering the key role of GJ and β-ARs signaling in AP conduction, we investigated Cx43 spatio-temporal regulation by PKA in physiological and pathophysiological (MI) conditions.Experiments in which PKA was specifically inhibited or displaced from its anchoring to A Kinase Anchoring Proteins (AKAPs) with peptides showed an anchored-PKA phosphorylates Cx43 and regulates intercellular communication in ventricular cardiomyocytes. High resolution microscopy and biochemical approaches allowed us to identify for the time in cardiomyocytes a proteic macrocomplex composed of Cx43, the AKAP : ezrin and PKA. Finally, we observed in an acute MI model of LAD during 7 days a decreased proximity between Cx43 and ezrin at ID associated with a decreased Cx43 phosphorylation and an increased susceptibility to ventricular arrhythmias. We identified for the first in heart Cx43 and intercellular communication regulated by an anchored-PKA. Interestingly, a Cx43-ezrin-PKA complex localized at ID is disrupted after MI which could partially explain could explain the decrease in Cx43 phosphorylation, GJ uncoupling and ventricular arrhythmias., La stimulation des récepteurs beta-adrenergiques (β-ARs) par les catécholamines active la voie de signalisation AMPc-Protéine kinase A (PKA) et est responsable de l'effet dromotrope positif, i.e. l'accélération de la vitesse de propagation du potentiel d'action (PA). La propagation du PA est médiée par les jonctions communicantes (JC) localisées aux disques intercalaires (DI) des cardiomyocytes, qui sont composées de connexine 43 (Cx43). Ces structures assurent la conduction anisotrope du PA et ainsi la contraction synchrone et homogène du cœur. Des altérations de l'expression et/ou de la localisation de la Cx43 cardiaque sont connues pour affecter la propagation du PA et favoriser la survenue des arythmies ventriculaires après un infarctus du myocarde (IDM). L'IDM est un problème de santé publique majeur qui se caractérise par une lésion ischémique provoquant la mort irréversible des cardiomyocytes et une altération de la fonction cardiaque. Il est connu dans la littérature qu'après un IDM, les β-ARs sont activés de manière chronique pour maintenir la fonction cardiaque. Considérant le rôle clé des JC et de la signalisation des β-ARs dans la propagation du PA, nous avons étudié la régulation spatiale et temporelle de la Cx43 cardiaque par la PKA en condition physiologique et lors d'un IDM. Des expériences dans lesquelles la PKA a été spécifiquement inhibée ou déplacée de son ancrage aux AKAPs (Protéines d'Ancrage à la PKA) par des peptides nous ont permis de mettre en évidence qu'une PKA ancrée assure la phosphorylation constitutive de la Cx43 et régule la communication intercellulaire des JC (CIJC) dans des cardiomyocytes ventriculaires. Des approches d'imagerie confocale à haute résolution et de biochimie nous ont permis d'identifier pour la première fois dans les cardiomyocytes la présence d'un macrocomplexe protéique composé de la Cx43, de l'AKAP : ezrine et de la PKA. Enfin, nous avons observé dans un modèle d'IDM aigu chez le rat ayant subi une ligature permanente pendant 7 jours de l'artère coronaire descendante gauche, une diminution de la proximité entre l'ezrine et la Cx43 aux DI associée à une diminution de phosphorylation de la Cx43 et une susceptibilité accrue aux arythmies. Ainsi, nous avons montré pour la première fois dans le cœur que la phosphorylation de la Cx43 et la CIJC sont régulées par une PKA ancrée. De manière intéressante, un complexe Cx43-ezrine-PKA exprimé aux DI en condition physiologique est interrompu dans l'IDM ce qui pourrait expliquer la diminution de phosphorylation de la Cx43, la dérégulation de la communication intercellulaire et la survenue des arythmies ventriculaires.

Renal and cardiac diseases are both major issues of public health. Therefore, my thesis project was articulated in 2 axes, one cardiac and the other renal. Notch3 plays a role in vascular physiopathology: by controlling proliferation and vascular smooth muscle cell (VSMC) maturation and this receptor is necessary for cardiac adaptation during a pressure overload. The objectives of my project were to study the effects of the Notch3 signaling pathway in mouse overexpressing this protein specifically in VSMCs (TgN3ICDSM) during hypertension (HTA), and its role during a physiological cardiac remodeling induced by a program of moderate physical training (PT). We showed that TgN3ICDSM mice develop HTA but show less cardiac hypertrophy and fibrosis in response to AngII-dependent HTA. Furthermore, heart disease regresses in Notch3-/- mice after 5 weeks of PT. Consequently, physical training may be able to counteract some defects related to the absence of Notch3. We have previously reported that the expression of the gap junction protein connexin 43 (Cx43) is abnormally induced in different models of chronic renal disease and its reduction protected against kidney disease. Thus, the aim was to evaluate Cx43 implication in acute kidney injury (AKI). We observed improved renal function and structure in Cx43+/- mice, compared with WT, after renal IR. This protective effect may be due to a limited inflammatory response. However, this protective phenotype was not observed when Cx43 was specifically deleted in endothelial or renal tubular cells. Therefore, simultaneous reduction of Cx43 in several cell types seems necessary against the progression of AKI., Les insuffisances rénales et cardiaques demeurent des problèmes majeurs de santé publique. Ainsi, mes recherches sont articulées sur 2 axes, l’un cardiaque et l’autre rénal. Notch3 joue un rôle majeur dans la physiopathologie vasculaire: en contrôlant la prolifération et la maturation des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), ce récepteur est nécessaire à l’adaptation cardiaque lors d’une hypertension artérielle (HTA). Mes objectifs étaient d’étudier les effets de la suractivation de la signalisation de Notch3 dans les CMLV lors d’une HTA et son implication lors d’un remodelage cardiaque physiologique induit par un entrainement physique modéré (EP). Les souris surexprimant Notch3 dans les CMLV développent une HTA, mais présentent une hypertrophie cardiaque et une fibrose moindres en réponse à l’AngII. De plus, l’EP permet de contrecarrer les défauts liés à l’absence de Notch3 car la cardiopathie des souris Notch3-/- régresse après 5 semaines d’EP. La connexine 43 (Cx43), protéine constitutive des jonctions gap, est anormalement exprimée dans la néphropathie chronique et sa réduction génétique protège contre la maladie. Ainsi, nous avons évalué son rôle dans la l’insuffisance rénale aigüe (IRA). Nous avons montré que les souris Cx43+/- avaient une fonction et une structure rénales améliorées par rapport aux WT après IRA. Cette protection semble liée à une réponse inflammatoire modérée. Cependant, la délétion ciblée de Cx43 dans les cellules endothéliales ou les tubules rénaux ne semble pas reproduire le phénotype observé chez des Cx43+/-. Ainsi, la réduction simultanée de Cx43 dans plusieurs types cellulaires est indispensable contre la progression de l’IRA.

Glial cells including astrocytes - as much abundant as neurons in the brain - may play an important role in anxiety, depression and possibly antidepressant drugs response. Previous studies in humans and animals are consistent with this hypothesis since they report an association between changes in astroglial markers expression and the severity of psychiatric disorders. Among those markers, the connexnis-43 (Cx43) are particularly interesting. Those transmembrane proteins are involved in the formation of two functional units of communications: the gap-junctions (GJs) which facilitate the communication between two neighboring astrocytes, and the hemichannels (HCs) which are able to release neuroactive molecules (gliotransmitters i.e. glutamate, ATP, D-serine) in the synaptic cleft. Decreased levels of Cx43 were unveiled in different brain regions of depressed patients but also in relevant mouse models of depression. Functionally, the induction of an anxio/depressive-like phenotype has been associated with a decreased activity of GJ and an increased HC activity. In light of these data, the aim of this thesis was to better characterize the role of Cx43 in anxio/depressive-like behaviors and antidepressant drugs response using genetic and pharmacological approaches. Our results show that hippocampal genetic inactivation of Cx43 has no effect on neuro-behaviors. However, in a mouse model of depression based on chronic corticosterone treatment exposure (CORT model), the genetic inactivation of Cx43 induces anxiolytic-/antidepressant-like effects. Mechanistically, these behavioral responses would be linked to an attenuation of hippocampal glutamate release through HCs and a lower hypothalamic pituitary adrenal (HPA) axis reactivity. Regarding the pharmacological approach, our work provides experimental evidence that systemic administration of the connexins blocker carbenoxolone, enhances the acute effects of a serotonin reuptake inhibitor in basal conditions while hindering its chronic beneficial effects in a mouse model of depression. Together, those results suggest the importance of the cellular microenvironment in the way Cx43 may influence treatment response. This work points out the importance of astroglial Cx43 in mood through the modulation of neuronal network associated with HPA. It also emphasizes the importance to develop Cx43 modulators to strengthen the therapeutic activity of antidepressant drugs. Further studies are warranted to define the modalities of such innovative strategies combining pharmacological agents with astroglial and neuronal tropisms., Les cellules gliales dont les astrocytes - au moins aussi nombreux que les neurones dans le cerveau - joueraient un rôle important dans l'anxiété, la dépression et probablement dans la réponse aux antidépresseurs. Plusieurs études menées chez l'Homme et l'animal vont dans ce sens puisqu'elles mettent en évidence une association entre des changements d'expression de différents marqueurs astrocytaires et la sévérité de ces troubles psychiatriques. C'est notamment le cas de la connexine 43 (Cx43), une protéine transmembranaire impliquée dans la formation de deux unités fonctionnelles distinctes : les jonctions communicantes (JCs) qui assurent la communication entre deux astrocytes voisins et les hémicanaux (HCs) dont le rôle est de libérer de molécules neuro-actives (gliotransmetteurs i.e. glutamate, ATP, D-sérine) dans la fente synaptique. En effet, une diminution de l'expression des Cx43 a été rapportée dans différentes régions cérébrales de patients dépressifs et dans des modèles murins de dépression. En revanche, d'un point de vue fonctionnel, l'induction d'un phénotype "anxio-dépressif" serait associée à une diminution de l'activité des JCs et à une augmentation de l'activité des HCs. Face à ces effets opposés, l'objectif de cette thèse était de caractériser plus finement le rôle des Cx43 dans les comportements "anxio-dépressifs" et la réponse aux psychotropes en utilisant des approches d'inactivation génétiques et pharmacologiques de ces protéines. Nos résultats montrent que l'inactivation génétique des Cx43 dans l'hippocampe n'entraine aucun effet neuro-comportemental. En revanche, dans un modèle de dépression basé sur l'exposition chronique des souris à la corticostérone (modèle CORT), l'inactivation génétique des Cx43 exerce des effets de type anxiolytiques-antidépresseurs. D'un point de vue mécanistique, ces effets seraient liés à une diminution de la libération hippocampique de glutamate par les HCs et à une atténuation de la réactivité de l'axe hypothalamo-hypophysaire (HPA). Concernant l'inactivation pharmacologique des Cx43, nos travaux apportent des évidences expérimentales sur le fait que l'administration systémique de carbenoxolone, un bloqueur des connexines, potentialise la réponse aiguë d'un inhibiteur de recapture de la sérotonine en conditions basales, mais s'oppose à ses effets bénéfiques chroniques dans un modèle de dépression. Le microenvironnement cellulaire semble donc essentiel dans la manière dont les Cx43 influencent la réponse aux antidépresseurs. L'ensemble de ces résultats de thèse laissent entrevoir un rôle des Cx43 astrocytaires dans la régulation de l'humeur via la modulation de circuits neuronaux convergeant vers l'axe HPA. Ils soulignent également l'intérêt de moduler les Cx43 pour renforcer l'activité thérapeutiques des antidépresseurs actuellement disponibles. Les futures recherches devront préciser les modalités de ces nouvelles stratégies combinant des agents pharmacologiques à tropisme astrocytaire et neuronal.

Glial cells including astrocytes - as much abundant as neurons in the brain - may play an important role in anxiety, depression and possibly antidepressant drugs response. Previous studies in humans and animals are consistent with this hypothesis since they report an association between changes in astroglial markers expression and the severity of psychiatric disorders. Among those markers, the connexnis-43 (Cx43) are particularly interesting. Those transmembrane proteins are involved in the formation of two functional units of communications: the gap-junctions (GJs) which facilitate the communication between two neighboring astrocytes, and the hemichannels (HCs) which are able to release neuroactive molecules (gliotransmitters i.e. glutamate, ATP, D-serine) in the synaptic cleft. Decreased levels of Cx43 were unveiled in different brain regions of depressed patients but also in relevant mouse models of depression. Functionally, the induction of an anxio/depressive-like phenotype has been associated with a decreased activity of GJ and an increased HC activity. In light of these data, the aim of this thesis was to better characterize the role of Cx43 in anxio/depressive-like behaviors and antidepressant drugs response using genetic and pharmacological approaches. Our results show that hippocampal genetic inactivation of Cx43 has no effect on neuro-behaviors. However, in a mouse model of depression based on chronic corticosterone treatment exposure (CORT model), the genetic inactivation of Cx43 induces anxiolytic-/antidepressant-like effects. Mechanistically, these behavioral responses would be linked to an attenuation of hippocampal glutamate release through HCs and a lower hypothalamic pituitary adrenal (HPA) axis reactivity. Regarding the pharmacological approach, our work provides experimental evidence that systemic administration of the connexins blocker carbenoxolone, enhances the acute effects of a serotonin reuptake inhibitor in basal conditions while hindering its chronic beneficial effects in a mouse model of depression. Together, those results suggest the importance of the cellular microenvironment in the way Cx43 may influence treatment response. This work points out the importance of astroglial Cx43 in mood through the modulation of neuronal network associated with HPA. It also emphasizes the importance to develop Cx43 modulators to strengthen the therapeutic activity of antidepressant drugs. Further studies are warranted to define the modalities of such innovative strategies combining pharmacological agents with astroglial and neuronal tropisms., Les cellules gliales dont les astrocytes - au moins aussi nombreux que les neurones dans le cerveau - joueraient un rôle important dans l'anxiété, la dépression et probablement dans la réponse aux antidépresseurs. Plusieurs études menées chez l'Homme et l'animal vont dans ce sens puisqu'elles mettent en évidence une association entre des changements d'expression de différents marqueurs astrocytaires et la sévérité de ces troubles psychiatriques. C'est notamment le cas de la connexine 43 (Cx43), une protéine transmembranaire impliquée dans la formation de deux unités fonctionnelles distinctes : les jonctions communicantes (JCs) qui assurent la communication entre deux astrocytes voisins et les hémicanaux (HCs) dont le rôle est de libérer de molécules neuro-actives (gliotransmetteurs i.e. glutamate, ATP, D-sérine) dans la fente synaptique. En effet, une diminution de l'expression des Cx43 a été rapportée dans différentes régions cérébrales de patients dépressifs et dans des modèles murins de dépression. En revanche, d'un point de vue fonctionnel, l'induction d'un phénotype "anxio-dépressif" serait associée à une diminution de l'activité des JCs et à une augmentation de l'activité des HCs. Face à ces effets opposés, l'objectif de cette thèse était de caractériser plus finement le rôle des Cx43 dans les comportements "anxio-dépressifs" et la réponse aux psychotropes en utilisant des approches d'inactivation génétiques et pharmacologiques de ces protéines. Nos résultats montrent que l'inactivation génétique des Cx43 dans l'hippocampe n'entraine aucun effet neuro-comportemental. En revanche, dans un modèle de dépression basé sur l'exposition chronique des souris à la corticostérone (modèle CORT), l'inactivation génétique des Cx43 exerce des effets de type anxiolytiques-antidépresseurs. D'un point de vue mécanistique, ces effets seraient liés à une diminution de la libération hippocampique de glutamate par les HCs et à une atténuation de la réactivité de l'axe hypothalamo-hypophysaire (HPA). Concernant l'inactivation pharmacologique des Cx43, nos travaux apportent des évidences expérimentales sur le fait que l'administration systémique de carbenoxolone, un bloqueur des connexines, potentialise la réponse aiguë d'un inhibiteur de recapture de la sérotonine en conditions basales, mais s'oppose à ses effets bénéfiques chroniques dans un modèle de dépression. Le microenvironnement cellulaire semble donc essentiel dans la manière dont les Cx43 influencent la réponse aux antidépresseurs. L'ensemble de ces résultats de thèse laissent entrevoir un rôle des Cx43 astrocytaires dans la régulation de l'humeur via la modulation de circuits neuronaux convergeant vers l'axe HPA. Ils soulignent également l'intérêt de moduler les Cx43 pour renforcer l'activité thérapeutiques des antidépresseurs actuellement disponibles. Les futures recherches devront préciser les modalités de ces nouvelles stratégies combinant des agents pharmacologiques à tropisme astrocytaire et neuronal.

Traumatic brain injury (TBI) is the first cause for emergency department visits in the pediatric population. Regardless of the severity of TBI, pediatric patients suffer long-term cognitive and emotional impairments but the underlying cellular and molecular mechanisms are still poorly understood and there are no effective treatments available. The neurovascular unit is composed by blood vessels, neurons and astrocytes. Astrocytes are crucial for various physiological functions of this unit such as brain homeostasis and neurovascular coupling. In injuries astrocytes become “reactive”, and this “astrocytopathy” can impact their physiological roles and worsen the outcome after injury.We investigated astrocytopathy in juvenile TBI and hypothesized that: (1) reactive astrocytes contribute to spread of edema through connexin gap junctions after juvenile moderate TBI; and that (2) astrocytopathy also develops after juvenile mild TBI with calcium changes that could contribute to (3) impaired vascular reactivity, all of which impacts the behavioral outcome after injury.We have shown that:(1)Reducing astrocytopathy by downregulating the gap junction protein connexin 43 improved the behavioral outcome after juvenile moderate TBI, but did not impact the spread of edema.(2)Astrocytes became reactive and underwent morphological changes after juvenile mild TBI with disturbances in purinergic-calcium signaling related to expression changes of the water channel aquaporin 4 (AQP4).(3)Major vascular dysfunction developed after juvenile mild TBI with functional and morphological changes of the intraparenchymal vessels that paralleled behavioral impairments and preceded axonal damage after injury.This work brings new insights in the pathophysiology of juvenile TBI and opens prospects for developing therapeutics targeting astrocytopathy after injury., Le traumatisme crânien (TC) est la première cause de visite aux urgences pour la population pédiatrique. Indépendamment du niveau de sévérité du TC, les patients pédiatriques souffrent sur le long-terme de troubles cognitifs et émotionnels, cependant les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents sont encore peu connus, et il n’existe pas de traitement efficace disponible à ce jour. L’unité neurovasculaire est composée de vaisseaux sanguins, neurones et astrocytes. Les astrocytes sont essentiels à une variété de fonctions physiologiques assurées par cette unité tels que l’homéostasie cérébrale et le couplage neurovasculaire. Suite à une lésion, les astrocytes deviennent « réactifs », et cette « astrocytopatie » peut impacter leur rôle physiologique et empirer les conséquences de la lésion.Nous avons étudié le rôle de l’astrocytopatie dans le TC juvénile et fait l’hypothèse que : (1) les astrocytes réactifs contribuent à la propagation de l’œdème via les jonctions serrées connexines après un TC juvénile modéré ; (2) l’astrocytopatie se développe également après un TC juvénile léger avec des changements calciques qui pourraient contribuer à (3) une altération de la réactivité vasculaire, tout cela impactant sur les conséquences comportementales qui font suite à la lésion.Nous avons montré que :(1)Réduire l’astrocythopatie en sous-régulant la connexine 43 permettait d’améliorer les conséquences comportementales après un TC modéré juvénile, mais n’impactait pas la propagation de l’œdème.(2)Les astrocytes devenaient réactifs et subissaient des changements morphologiques après un TC juvénile léger avec des perturbations dans les signaux purinergiques-calciques liés à des changements dans l’expression du canal aqueux aquaporine 4 (AQP4).(3)Une dysfonction vasculaire majeure s’était développée après le TC juvénile léger avec des changements fonctionnels et morphologiques des vaisseaux intraparenchymaux parallèles aux altérations comportementales et précédant les dommages axonaux après la lésion.Ce travail apporte un nouvel aperçu de la pathophysiologie du TC juvénile et ouvre des possibilités pour développer des thérapies ciblant l’astrocytopatie après une lésion.

Exposure to pollutants can affect for long human health. Some of these pollutants act as endocrine disruptors (ED) and are known to be at the origin of several chronic human diseases. Even if their role in cancer origin is difficult to estimate, some of them as Bisphenol A (BPA) have been classified as carcinogens.Tumor growth is often the consequence of complex mechanisms and interactions with their close microenvironment. And some of these interactions between cancer cells and their microenvironment can impact the tumor evolution. Among such interactions, gap junctions are the only ones able to establish a direct intercellular communication and they have been often associated with tumor growth either by their absence of the aberrant expression of their protein subunits, the connexins. And, indeed, in the case of cerebral tumors such as glioblastoma, the presence of a particular connexin, connexin43 (Cx43), seems to increase their invasive capacity.Taking into account this particular context, effects of the tumor microenvironment (astrocytes), exposure to BPA and its chlorinated derivatives as well as the role of Cx43 in invasive capacity of human glioblastoma cells have been studied by using in utero and in vitro approaches. To do so, for the in utero approach, the effects of BPA exposure and its chlorinated derivatives have been evaluated by daily injections in female mice (20μg/kg/jour) during gestation (E0 à E21) and lactation (J0 à J6) in different contexts of Cx43 expression by using WT or Cx43+/- mice. The in vitro effects of BPA and its chlorinated derivatives have been tested on human glioblastoma cells (U251 cell line) expressing different levels of Cx43 by shRNA.The results show that BPA and its chlorinated derivatives affect the expression of Cx43 and gap junctional intercellular communication (GJIC) but also the migration of U251 cells depending on the level of Cx43 expression. The in utero treatments also affect the expression of Cx43 in astrocytes and increase GJIC without acting on their migration. However, the treatments do not seem to act globally on the hemichannel activity of Cx43. Moreover, if BPA treatment increases migration, invasion and the number of invadopodia of U251 cells, the effect if more heterogeneous on cells whose Cx43 is diminished. For instance, on these cells, the 3D migration is decreased by the chlorinated derivatives whereas the 3D invasion is increased by BPA when the number of invadopodia is increased whatever the treatment is. Moreover, it is interesting to note that the medium from WT or Cx43+/- astrocytes seems to increase migration and invasion of U251 cells associated with a high number of invadopodia whatever the level of Cx43 expression is except for migration which is not modified when Cx43 expression is diminished. In conclusion, BPA and its chlorinated derivatives are able to affect expression and communicating function of Cx43. Moreover, those treatments as well as astrocytes seem to favor the migration and invasion capacities of U251 cells by augmenting the number of invadopodia depending on the level of Cx43 expression., L’exposition aux polluants peut durablement affecter la santé humaine. Parmi ces polluants, certains agissent comme perturbateurs endocriniens (PE) connus pour être à l’origine de diverses maladies chroniques. Bien que leur impact sur la survenue de cancers soit difficile à évaluer, certains d’entre eux, comme le Bisphénol A (BPA) sont classés parmi les cancérigènes.Le développement des tumeurs cancéreuses est souvent la conséquence de mécanismes et d’interactions complexes avec leur microenvironnement. Et certaines interactions potentielles entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement peuvent ainsi orienter l’évolution de la tumeur. Parmi celles-ci, les jonctions communicantes sont les seules permettant une communication directe entre les cellules et ont été souvent associées par leur absence ou par la présence aberrante de leur protéine de structure, les connexines, dans le développement des tumeurs solides. Ainsi, dans le cas des tumeurs cérébrales que sont les glioblastomes, la présence d’une connexine particulière, la connexine 43 (Cx43), semble favoriser leur forte capacité invasive.Prenant en compte ce contexte particulier, les effets du microenvironnement tumoral (astrocytes), de l’exposition au BPA et de ses dérivés chlorés ainsi que le rôle de la Cx43 dans la capacité invasive des cellules de glioblastome humains ont été étudiés par des approches in utero et in vitro. A cette fin, pour l’approche in utero, les effets d’une exposition au BPA et ses dérivés chlorés ont été évalués par injections quotidiennes dans des souris femelles (20μg/kg/jour) durant la gestation (E0 à E21) et la lactation (J0 à J6), et ce, dans des contextes différents d’expression de Cx43 par l’utilisation de souris WT ou Cx43+/-. Les effets in vitro du BPA et ses dérivés chlorés ont été testés sur des cellules de glioblastome humain (lignée U251) exprimant différents niveaux de Cx43 par shRNA. Les résultats montrent que le BPA et ses dérivés chlorés affectent l’expression de la Cx43 et la communication jonctionnelle mais aussi la migration des cellules U251 selon le niveau d’expression de la Cx43. Les traitements in utero affectent également l’expression de la Cx43 des astrocytes et augmentent la communication jonctionnelle sans effet notable sur la migration. Cependant, d’une manière générale, les traitements ne semblent pas agir sur la fonction hémicanal de la Cx43. Par ailleurs, si le BPA augmente la migration, l’invasion 3D et le nombre d’invadopodes des cellules U251, les effets sont plus hétérogènes sur les cellules dont l’expression de Cx43 est diminuée. Ainsi, sur ces cellules, la migration 3D est diminuée après traitement à des dérivés chlorés alors que l’invasion 3D augmente après traitement au BPA et que le nombre d’invadopodes est augmenté quelles que soient les conditions de traitement. De plus, l’ajout de milieu d’astrocytes WT ou Cx43+/- semble augmenter la capacité migratoire et invasive des cellules U251 avec une forte augmentation du nombre des invadopodes quelle que soit le niveau d’expression de la Cx43 sauf pour la migration, inchangée, lorsque l’expression de la Cx43 est diminuée.En conclusion, le BPA et ses dérivés chlorés sont capables d’affecter l’expression et la fonction communicante de la Cx43. De plus, ces traitements ainsi que les astrocytes semblent favoriser les capacités migratoire et invasive des cellules U251 en augmentant le nombre des invadopodes selon le niveau d’expression de la Cx43.

The Atypical Chemokine Receptor 3 (ACKR3) and CXCR4 are two G protein-coupled receptors (GPCR) belonging to the CXC chemokine receptor family. Both receptors are activated upon CXCL12 binding and are over-expressed in various tumours, including glioma, where they have been found to promote proliferation and invasive behaviours. Upon CXCL12 binding, CXCR4 activates canonical GPCR signalling pathways involving Gαi protein and β-arrestins. In addition, CXCR4 was found to interact with several proteins able to modify its signalling, trafficking and localization. In contrast, the cellular pathways underlying ACKR3-dependent effects remain poorly characterized. Several reports show that ACKR3 engages β-arrestin-dependent signalling pathways, but its coupling to G proteins is restricted to either specific cellular populations, including astrocytes, or occurs indirectly via its interaction with CXCR4. ACKR3 also associates with the epidermal growth factor receptor to promote proliferation of tumour cells in an agonist-independent manner. These examples suggest that the extensive characterization of ACKR3 and CXCR4 interactomes might be a key step in understanding or clarifying their roles in physiological and pathological contexts. This thesis addressed this issue employing an affinity purification coupled to high-resolution mass spectrometry proteomic strategy that identified 19 and 151 potential protein partners of CXCR4 and ACKR3 transiently expressed in HEK-293T cells, respectively. Amongst ACKR3 interacting proteins identified, we paid particular attention on the gap junction protein Connexin-43 (Cx43), in line with its overlapping roles with the receptor in the control of leukocyte entry into the brain, interneuron migration and glioma progression. Western blotting and BRET confirmed the specific association of Cx43 with ACKR3 compared to CXCR4. Likewise, Cx43 is co-localized with ACKR3 but not CXCR4 in glioma initiating cell lines, and ACKR3 and Cx43 are co-expressed in astrocytes of the sub-ventricular zone and surrounding blood vessels in adult mouse brain, suggesting that both proteins form a complex in authentic cell or tissue contexts. Further functional studies showed that ACKR3 influences Cx43 trafficking and functionality at multiple levels. Transient expression of ACKR3 in HEK-293T cells to mimic ACKR3 overexpression detected in several cancer types, induces Gap Junctional Intercellular Communication (GJIC) inhibition in an agonist-independent manner. In addition, agonist stimulation of endogenously expressed ACKR3 in primary cultured astrocytes inhibits Cx43-mediated GJIC through a mechanism that requires activation of Gαi protein, and dynamin- and β-arrestin2-dependent Cx43 internalisation. Therefore, this thesis work provides the first functional link between the CXCL11/CXCL12/ACKR3 axis and gap junctions that might underlie their critical role in glioma progression.; Le récepteur atypique ACKR3 et le récepteur CXCR4 sont des récepteurs couplés aux protéines G appartenant à la famille des récepteurs CXC des chimiokines. Ces deux récepteurs sont activés par la chimiokine CXCL12 et sont surexprimés dans de nombreux cancers comme les gliomes, dont ils favorisent la prolifération et le caractère invasif. Le récepteur CXCR4 active des voies de signalisation qui dépendent de la protéine Gi et des β-arrestines et s’associe à plusieurs protéines impliquées dans la transduction du signal, le trafic et la localisation cellulaire du récepteur. Par contre, les mécanismes de signalisation impliqués dans les effets d’ACKR3 restent mal connus. Le récepteur déclenche une signalisation dépendant des β-arrestines, mais son couplage aux protéines G dépend du type cellulaire ou se fait par un mécanisme indirect via son association au récepteur CXCR4. Le récepteur ACKR3 s’associe également au récepteur de l’EGF pour induire la prolifération cellulaire par un mécanisme indépendant de sa stimulation par un agoniste. Ces données illustrent l’intérêt de caractériser de façon systématique l’interactome de ces récepteurs pour comprendre leurs rôles physiologiques et pathologiques. Cette thèse a poursuivi cet objectif grâce à la mise en œuvre d’une approche protéomique combinant la purification des partenaires des deux récepteurs par affinité suivie de leur identification par spectrométrie de masse. J’ai ainsi identifié respectivement 19 et 151 partenaires protéiques potentiels des récepteurs CXCR4 et ACKR3 exprimés dans les cellules HEK-293T. Parmi les protéines recrutées par ACKR3, nous nous sommes focalisés sur la connexine 43 (Cx43, une des protéines constituant les jonctions Gap) du fait de la similitude des effets du récepteur et de la Cx43 dans la pénétration des leucocytes dans le parenchyme cérébral, la migration des interneurones et la progression des gliomes. J’ai confirmé par Western blot et par BRET l’association spécifique de la Cx43 à l’ACKR3 et non pas au CXCR4. De la même façon, j’ai montré une co-localisation de la Cx43 et de l’ACKR3 dans des cellules de gliome humain, ainsi que dans les astrocytes de la zone sous-ventriculaire et les pieds astrocytaires entourant les capillaires cérébraux chez la souris, suggérant que les deux protéines forment un complexe protéique dans un contexte biologique authentique. Des études fonctionnelles ont révélé que l’ACKR3 module les fonctions de la Cx43 par différents mécanismes. L’expression de l’ACKR3 dans les cellules HEK-293T (mimant la surexpression du récepteur dans les tumeurs), induit par elle-même une inhibition de l’activité jonctionnelle de la Cx43. De même, la stimulation du récepteur par un agoniste réduit l’activité jonctionnelle de la Cx43 par un mécanisme impliquant l’activation d’une protéine Gi, la β-arrestine2 et l’internalisation de la Cx43. Cette thèse établit donc pour la première fois un lien fonctionnel entre le système constitué par les chimiokines CXCL11, CXCL12 et leur récepteur ACKR3 d’une part et les jonctions Gap d’autre part qui pourrait jouer un rôle critique dans la progression des gliomes.

The Atypical Chemokine Receptor 3 (ACKR3) and CXCR4 are two G protein-coupled receptors (GPCR) belonging to the CXC chemokine receptor family. Both receptors are activated upon CXCL12 binding and are over-expressed in various tumours, including glioma, where they have been found to promote proliferation and invasive behaviours. Upon CXCL12 binding, CXCR4 activates canonical GPCR signalling pathways involving Gαi protein and β-arrestins. In addition, CXCR4 was found to interact with several proteins able to modify its signalling, trafficking and localization. In contrast, the cellular pathways underlying ACKR3-dependent effects remain poorly characterized. Several reports show that ACKR3 engages β-arrestin-dependent signalling pathways, but its coupling to G proteins is restricted to either specific cellular populations, including astrocytes, or occurs indirectly via its interaction with CXCR4. ACKR3 also associates with the epidermal growth factor receptor to promote proliferation of tumour cells in an agonist-independent manner. These examples suggest that the extensive characterization of ACKR3 and CXCR4 interactomes might be a key step in understanding or clarifying their roles in physiological and pathological contexts. This thesis addressed this issue employing an affinity purification coupled to high-resolution mass spectrometry proteomic strategy that identified 19 and 151 potential protein partners of CXCR4 and ACKR3 transiently expressed in HEK-293T cells, respectively. Amongst ACKR3 interacting proteins identified, we paid particular attention on the gap junction protein Connexin-43 (Cx43), in line with its overlapping roles with the receptor in the control of leukocyte entry into the brain, interneuron migration and glioma progression. Western blotting and BRET confirmed the specific association of Cx43 with ACKR3 compared to CXCR4. Likewise, Cx43 is co-localized with ACKR3 but not CXCR4 in glioma initiating cell lines, and ACKR3 and Cx43 are co-expressed in astrocytes of the sub-ventricular zone and surrounding blood vessels in adult mouse brain, suggesting that both proteins form a complex in authentic cell or tissue contexts. Further functional studies showed that ACKR3 influences Cx43 trafficking and functionality at multiple levels. Transient expression of ACKR3 in HEK-293T cells to mimic ACKR3 overexpression detected in several cancer types, induces Gap Junctional Intercellular Communication (GJIC) inhibition in an agonist-independent manner. In addition, agonist stimulation of endogenously expressed ACKR3 in primary cultured astrocytes inhibits Cx43-mediated GJIC through a mechanism that requires activation of Gαi protein, and dynamin- and β-arrestin2-dependent Cx43 internalisation. Therefore, this thesis work provides the first functional link between the CXCL11/CXCL12/ACKR3 axis and gap junctions that might underlie their critical role in glioma progression.; Le récepteur atypique ACKR3 et le récepteur CXCR4 sont des récepteurs couplés aux protéines G appartenant à la famille des récepteurs CXC des chimiokines. Ces deux récepteurs sont activés par la chimiokine CXCL12 et sont surexprimés dans de nombreux cancers comme les gliomes, dont ils favorisent la prolifération et le caractère invasif. Le récepteur CXCR4 active des voies de signalisation qui dépendent de la protéine Gi et des β-arrestines et s’associe à plusieurs protéines impliquées dans la transduction du signal, le trafic et la localisation cellulaire du récepteur. Par contre, les mécanismes de signalisation impliqués dans les effets d’ACKR3 restent mal connus. Le récepteur déclenche une signalisation dépendant des β-arrestines, mais son couplage aux protéines G dépend du type cellulaire ou se fait par un mécanisme indirect via son association au récepteur CXCR4. Le récepteur ACKR3 s’associe également au récepteur de l’EGF pour induire la prolifération cellulaire par un mécanisme indépendant de sa stimulation par un agoniste. Ces données illustrent l’intérêt de caractériser de façon systématique l’interactome de ces récepteurs pour comprendre leurs rôles physiologiques et pathologiques. Cette thèse a poursuivi cet objectif grâce à la mise en œuvre d’une approche protéomique combinant la purification des partenaires des deux récepteurs par affinité suivie de leur identification par spectrométrie de masse. J’ai ainsi identifié respectivement 19 et 151 partenaires protéiques potentiels des récepteurs CXCR4 et ACKR3 exprimés dans les cellules HEK-293T. Parmi les protéines recrutées par ACKR3, nous nous sommes focalisés sur la connexine 43 (Cx43, une des protéines constituant les jonctions Gap) du fait de la similitude des effets du récepteur et de la Cx43 dans la pénétration des leucocytes dans le parenchyme cérébral, la migration des interneurones et la progression des gliomes. J’ai confirmé par Western blot et par BRET l’association spécifique de la Cx43 à l’ACKR3 et non pas au CXCR4. De la même façon, j’ai montré une co-localisation de la Cx43 et de l’ACKR3 dans des cellules de gliome humain, ainsi que dans les astrocytes de la zone sous-ventriculaire et les pieds astrocytaires entourant les capillaires cérébraux chez la souris, suggérant que les deux protéines forment un complexe protéique dans un contexte biologique authentique. Des études fonctionnelles ont révélé que l’ACKR3 module les fonctions de la Cx43 par différents mécanismes. L’expression de l’ACKR3 dans les cellules HEK-293T (mimant la surexpression du récepteur dans les tumeurs), induit par elle-même une inhibition de l’activité jonctionnelle de la Cx43. De même, la stimulation du récepteur par un agoniste réduit l’activité jonctionnelle de la Cx43 par un mécanisme impliquant l’activation d’une protéine Gi, la β-arrestine2 et l’internalisation de la Cx43. Cette thèse établit donc pour la première fois un lien fonctionnel entre le système constitué par les chimiokines CXCL11, CXCL12 et leur récepteur ACKR3 d’une part et les jonctions Gap d’autre part qui pourrait jouer un rôle critique dans la progression des gliomes.

Neuropathic pain, characterised by a marked prevalence, is the consequence of nerve compression or lesion. Antidepressants represent the main treatments of this disease, however, medical needs remain mostly unsatisfied by these molecules. In order to improve this therapeutical approach, my thesis work has focussed on astroglial connexin 43 (Cx43) that has recently been involved in the mechanism of action of antidepressant as well as in neuropathic pain. The first part of my work, performed in primary cultures of mouse cortical astrocytes, has allowed to reinforce the link between antidepressants and Cx43 in astrocytes. Whereas its expression was unchanged in our model, an heterogeneous effect of antidepressants was observed on the intercellular communication of astrocytes. Furthermore, all tested molecules led to the inhibition of Cx43 hemichannel activity in an inflammatory context, our study is the first to report such effect. Interestingly, antidepressants prescribed in neuropathic pain induced inhibition of coupling and/or hemichannels. The second part of my work concerned the combination between amitriptyline and mefloquine. This is based on combinatorial approaches proposed by Theranexus, a start-up partner in this project. The association of the two molecules presented a synergy on astroglial coupling reduction in vitro correlated to a potentiation of the anti-hyperalgesic effect of amitriptyline in vivo, in rats with injured sciatic nerve. These results confirm the implication of the astroglial Cx43 in the antinociceptive response to antidepressants., Les douleurs neuropathiques, caractérisées par une prévalence élevée, résultent de la compression ou lésion de nerfs. Les antidépresseurs figurent parmi les traitements de première intention de cette pathologie, toutefois des besoins médicaux restent insatisfaits par ces molécules. Mon travail de thèse s'est intéressé à la connexine 43 (Cx43) astrocytaire impliquée dans le mécanisme d'action des antidépresseurs ainsi que dans les douleurs neuropathiques. La première partie des travaux, réalisée avec des cultures d'astrocytes corticaux de souris, a permis de préciser le lien entre les antidépresseurs et la Cx43 astrocytaire. Alors que son expression s'est avérée inchangée dans notre modèle, un effet hétérogène des antidépresseurs a été observé sur le couplage intercellulaire des astrocytes. L'ensemble des molécules testées a conduit à l'inhibition de l'ouverture des hémicanaux de Cx43 étudiée dans un contexte inflammatoire, notre étude est la première à rapporter cet effet. De plus, les antidépresseurs prescrits dans les douleurs neuropathiques ont induit l'inhibition du couplage et/ou des hémicanaux. La seconde partie de mes travaux a porté sur la combinaison entre l'amitriptyline et la méfloquine. Ceci repose sur les approches combinatoires proposées par Theranexus, start-up avec qui la thèse a été réalisée. Les deux molécules ont présenté une synergie d'effet sur la réduction du couplage astrocytaire in vitro corrélée a une potentialisation de l'action anti-hyperalgésique de l'amitriptyline in vivo, chez le rat lésé au niveau du nerf sciatique. Ces résultats valident l'implication de la Cx43 astrocytaire dans la réponse antinociceptive des antidépresseurs.

Le récepteur nucléaire Nr5a2 est exprimé dans l’ovaire, plus spécifiquement dans les cellules de granulosa et lutéales. Une déplétion conditionnelle de Nr5a2 dans les cellules de granulosa au stade de follicule primaire par croisement de souris Nr5a2-flox et Amhr2-Cre (Nr5a2f/fAmhr2Cre/+) génère des problèmes au niveau de l’expansion du cumulus, de l’ovulation et de la lutéinisation. Ainsi, nous estimons que Nr5a2 régule les connexions intercellulaires dans le follicule ovarien via la connexine 43 (Cx43), une protéine de jonction impliquée dans l’expansion du cumulus. Le premier objectif de l’étude était de déterminer si l’absence d’expansion du cumulus chez les souris Amhr2Cre-cKO est liée à l’absence de communication intercellulaire adéquate entre les cellules de granulosa et de cumulus dans les follicules préovulatoires. À cette fin, des ovaires de souris immatures Amhr2Cre-cKO et non transgéniques ont été prélevés (n=3) après un traitement de superstimulation utilisant les gonadotropines eCG suivie de hCG afin d’induire l’ovulation. Nous avons ainsi démontré, par RT-PCR, une sous-expression de Cx43 avant et au moment du stimulus ovulatoire (0 h et 2 h) chez le groupe Amhr2Cre-cKO (P, The nuclear receptor Nr5a2 is expressed in the ovary, exclusively in granulosa and luteal cells. Conditional disruption of Nr5a2 in granulosa cells beginning with primary follicles by means of Nr5a2-floxed and Amhr2-Cre mice (Nr5a2f/fAmhr2Cre/+) results in failure in cumulus expansion, ovulation and luteinization. We hypothesize that Nr5a2 regulates intercellular connections in ovarian follicles through connexin 43 (Cx43), a gap-junctional protein related to cumulus expansion. The first objective of this study was to determine whether the lack of cumulus expansion in Amhr2Cre-cKO mice is related to the absence of normal cell-to-cell communication in cumulus/granulosa cells of preovulatory follicles. To address this, immature ovaries of Amhr2Cre-cKO and non-transgenic littermates mice were collected (n=3) after superstimulation to induce follicle development and ovulation. Using RT-PCR, the Cx43 mRNA levels were shown to be downregulated prior to and at the time of the ovulatory stimulus (0 h and 2 h) in the Amhr2Cre-cKO group (P

Under physiological conditions, in rat intrapulmonary arteries (IPA), connexin 43 (Cx43) localised at the myoendothelial junctions is involved in the reactivity to serotonin (5-HT). 5-HT increases superoxide anion (O2•) in the smooth muscle and nitric oxide (a vasodilator) in the endothelium. O2• will then rapidly pass through Cx43 to scavenge endothelial NO to decrease the bioavailability of the latter and hence maintain IPA contraction in physiological conditions. However, to date, the increase in O2• level by other contractile agonists such as endothelin-1 (ET-1) and phenylephrine (PHE) and the mechanism involved in this increase are still unknown in the pulmonary circulation. The goal of this present work is to identify the contractile agonists involved in the increase of O2• and to highlight the signaling pathways involved in the agonists-induced increase of O2•. As Cx43 plays an important role in IPA contractile reactivity to 5-HT in healthy rats, the role of Cx43 under pathological conditions of the pulmonary circulation has been studied with a mice model heterozygous for Cx43 (Cx43+/-) suffering from hypoxic pulmonary hypertension (HPH). We have shown that O2• increase in rat IPA is exclusive to 5-HT. 5-HT-induced O2• increase in rat IPA is only from an increase in production by the mitochondria and NADPH oxydase via a ROS-induced ROS release mechanism dependent on PKC. Upon binding to 5-HT2A receptors, 5-HT induces an extracellular calcium influx which is responsible for an increase in mitochondrial calcium level and causes an upregulation in O2• production by the complex I of the mitochondrial respiratory chain. Moreover, this signaling pathway takes place in specialized microdomains, namely caveolae. On the other hand, interestingly, in Cx43+/- HPH mice, IPA remodeling is inhibited and right ventricular hypertrophy is less intense. IPA vasoreactivity to 5-HT, ET-1 and PHE is modified in Cx43+/- healthy and HPH mice as compared to wild type mice. These data bring (1) new elements of comprehension in the signaling pathways involved in 5-HT-induced O2• production in healthy rat pulmonary circulation and (2) new insights on the role of Cx43 in mice IPA under physiological and HPH conditions., Au niveau des artères intrapulmonaires (AIP) de rats sains, la connexine 43 (Cx43) située au niveau de la jonction myoendothéliale (JME) intervient dans la réactivité à la 5-HT. La 5-HT produit de l’anion superoxyde (O2•) au niveau du muscle lisse et du monoxyde d’azote (NO) au niveau de l’endothélium des AIP. La Cx43 permet alors le passage de l’O2• du muscle lisse vers l’endothélium de façon à diminuer la biodisponibilité du NO et maintenir une contraction physiologique de l’artère pulmonaire. Cependant, l’augmentation d’O2• par d’autres agonistes vasoconstricteurs tels que l’endothéline-1 (ET-1) et la phényléphrine (PHE) et les mécanismes impliqués dans cette augmentation restent encore méconnus dans la circulation pulmonaire. Ainsi, ce travail vise à identifier les agonistes qui provoquent une augmentation de la quantité d’O2• et à mettre en évidence les voies de signalisation mises en jeu au niveau des AIP de rats. Par ailleurs, la Cx43 étant impliquée dans la réactivité des AIP de rats sains à la 5-HT, le rôle de la Cx43 dans la circulation pulmonaire pathologique a été étudié à l’aide d’un modèle de souris hétérozygote pour la Cx43 (souris Cx43+/-) souffrant d’hypertension pulmonaire (HTP) hypoxique chronique (HC). Nous avons montré que l’augmentation d’O2•au niveau des AIP est un mécanisme exclusif de la 5-HT. Cette augmentation provient uniquement d’une augmentation de production par la mitochondrie et les NADPH oxydases via un mécanisme de « ROS-induced ROS release » dépendant de la PKC. La 5-HT agit par le biais des récepteurs 5-HT2A, induit un influx calcique extracellulaire qui augmente la concentration calcique mitochondriale provoquant une augmentation de production d’O2• par le complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale. De plus, cette voie s’exerce au sein des microdomaines de signalisation, notamment les cavéoles. D’autre part, chez les souris Cx43+/- HTP HC le remodelage des AIPest inhibé et l’hypertrophie ventriculaire droite est freinée. La vasoréactivité des AIP à la 5-HT, à l’ET-1 et à la PHE est modifiée chez les souris Cx43+/- saines et HTP HC par rapport aux souris sauvages. Ces données apportent (1) des éléments de compréhension sur les voies de signalisation mises en jeu dans la production d’O2• en réponse à la 5-HT dans la circulation pulmonaire de rats sains et (2) de connaissances nouvelles sur le rôle de la Cx43 dans les AIP de souris saines et souffrant d’HTP HC.

La connexine 43 (Cx43) est l’unité protéique de base dans la formation des canaux des jonctions gap (JG) responsables des échanges intercellulaires. Toutefois, elle forme aussi des canaux non-jonctionnels à large conductance, nommés hémicanaux (Hc), qui fournissent un accès entre l’intérieure des cellules et le milieu extracellulaire. Bien qu’ils soient beaucoup moins étudiés que les JG, on estime que les Hc restent normalement à l’état fermé, et ce, grâce à la phosphorylation des connexines qui les forment. Suite à un stress ischémique, les Cx43 se déphosphorylent et entraînent ainsi l’ouverture des Hc de Cx43 (HcCx43), un effet qui compromet la survie des cellules. La protéine kinase C (PKC) est l’enzyme de phosphorylation qui possède le plus grand nombre de sites de phosphorylation sur la Cx43 en comparaison avec les autres kinases. Ses fonctions dépendent de la mise en jeu d’un répertoire d’au moins 12 isoformes distinctes. Dans les cardiomyocytes, les isoformes de PKC participent au développement des réponses adaptées ou mésadaptées au stress ischémique. Malgré que la régulation des canaux de Cx43 par la PKC lors d’une ischémie soit bien documentée, il n’existe pas à l’heure actuelle de connaissances sur les effets fonctionnels spécifiques qu’exercent des différentes isoformes de PKC sur les HcCx43, ni sur la valeur thérapeutique de la modulation de ses derniers. Dans ce contexte, nous avons proposé que les HcCx43 sont régulés sélectivement et différentiellement par les différentes isoformes de PKC et que l’inhibition spécifique de ces hémicanaux peut protéger le coeur lors d’un événement ischémique. Le présent travail comporte trois études qui ont été entreprises spécialement dans le but de valider ces hypothèses. Dans la première étude, nous avons profité de l’expertise du laboratoire du Dr Baroudi dans la dissection des isoformes de PKC pour étudier le rôle fonctionnel de chacune d’elles dans la régulation des HcCx43 en utilisant une gamme unique de peptides synthétiques inhibiteurs et activateurs spécifiques des isoformes de PKC, en combinaison avec la technique du patch-clamp. Nous avons démontré, entre autre, que les HcCx43 sont particulièrement inhibés par l’isoforme PKC epsilon, connue pour son effet cardioprotecteur contre les dommages ischémiques lors d’un préconditionnement ischémique. Dans la deuxième étude, nous avons caractérisé l’effet d’un peptide synthétique mimétique structural de la Cx43 sur la fonction des HcCx43. En plus d’avoir élucidé ces effets sur les propriétés fonctionnelles du canal, nous avons démontré d’une manière directe et indéniable que le peptide Gap26 inhibe et spécifiquement les HcCx43 et que son administration in vitro (cardiomyocytes isolés) et ex vivo (coeur intact) confère à ces modèles expérimentaux une résistance importante contre le stress ischémique. Dans la troisième étude, nous avons investigué pour la première fois in vivo le potentiel de deux peptides uniques mimétiques structuraux de la Cx43, Gap26 et Gap27, dans la cardioprotection contre les lésions ischémiques lorsqu’ils sont administrés à basse dose sous forme d’un bolus intraveineux unique. Nous avons démontré que l’injection de ces peptides avant ou après la survenue de l’ischémie réduit significativement la taille de l’infarctus qui en résulte.En conclusion, l’ensemble de ces résultats révèlent le rôle bénéfique de l’inhibition des HcCx43 lors d’une ischémie et dévoilent un potentiel thérapeutique prometteux des mimétiques structuraux de Cx43 dans la prévention et le traitement de l’infarctus du myocarde., Connexin 43 (Cx43) is the basic unit in the composition of Gap junction channels but also of the non-junctional unapposed hemichannels (Hc). Gap junction channels play key roles in cardiac function by allowing conduction of electrical impulses and exchange of biologically important molecules between cells. The unapposed Hc, however, perform functions different from those achieved by Gap junction channels mainly by providing pathways between the cytosol and the extracellular space allowing movement of ions and other small metabolites. Although they are much less studied than Gap junction channels, Hc are believed to remain normally in a closed state and that phosphorylation is an important factor promoting their closure. Under ischemic stress,the amount of non-phosphorylated Cx43 increases resulting in increasing hemichannels opening, an effect that can lead to irreversible tissue injury and cell death. Protein kinase C (PKC) possesses the largest number of phosphorylation sites on Cx43 and exerts significant control on Cx43 channels. Its function depends on the involvement of at least 12 distinct isoformes. Various PKC isoforms exert specific cellular and cardiovascular functions, nonetheless the functional role of PKC isoforms in the modulation of the unapposed Cx43 hemichannels has never been assessed, neither has the therapeutic potential of Cx43Hc modulation in the protection of ischemic heart. In this context, three studies have been performed, they form the body of this thesis. In the first study, a unique set of synthetic PKC isoform-selective activator and inhibitor peptides was utilised. In combination with the patch clamp technique, we have demonstrated that Cx43Hc conductance is strongly inhibited by, among many isoforms, epsilon PKC isoforme, known for its cardioprotective effect against ischemic injury. In the second study, we characterized the effect of a synthetic structural mimetic peptide of Cx43. Using patch clamp technique, we have demonstrated that the peptide Gap26 inhibits directly and specifically Cx43Hc, we also showed that Gap26 can confer resistance to cardiomyocytes (in vitro) and intact heart (ex vivo) against ischemia. In the third study, we investigated for the first time in vivo the capability of a unique pair of structural Cx43 mimetic peptides, Gap26 and Gap27, to protect heart from ischemic injury when administered in single low-dose intravenous boluses. We demonstrated that administration of either one or both peptides, before or after the onset of ischemia renders heart more resistant to ischemia and reduces significantly the size of myocardial infarct. Altogether, our results revealed salvatory effect of Cx43Hc inhibition during ischemia and uncovered therapeutique potentials of the synthetic structural mimetic peptides of Cx43 in ischemic heart disease.

National audience