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International audience; Cross-contamination of animal feed with antibiotics may occur during manufacturing in feed mills, because shared production lines can be used for medicated and non-medicated feed, but may also occur during transport, storage and at the farm level. This is a major issue in the current context where antimicrobial usage must be controlled in order to maintain their effectiveness. A LC-MS/MS method was developed for the determination of colistin, bacitracin A and virginiamycin M1 in feed for pigs, poultry and rabbits at concentrations similar to those encountered in cross-contamination. After investigating various issues related to colistin behaviour and matrix effects, we successfully validated this method according to the requirements of European regulations in terms of linearity, trueness, precision, limit of quantification and limit of decision. Trueness ranged 88.6–107.8% and precision ranged 12.6–21.2%. We then applied this method to the analysis of medicated pig feed to check the performance of the method on “real” samples of medicated feed. We subsequently analysed non-medicated pig, and rabbit feed samples, collected directly on farms, to check the rate of cross-contamination. No samples were contaminated by colistin, bacitracin, or virginiamycin.

Due to the lack of new antibiotics facing the increasing emergence of resistances, it is important to understand the mechanism and dynamics of these phenomenon. Lipopolysaccharide (LPS) is the polymyxin main target and the most contributing component to polymyxin resistance. Plasmid-mediated colistin resistance MCR-1 (Mobile Colistin Resistance) carrying by Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae encodes a phosphoethanolamine transferase leads to the addition of phosphoethanolamine to lipid A of LPS, whereas LPS modification by phosphoethanolamine and loss of LPS are the two primary mechanisms that have been described in colistin-resistant Acinetobacter baumannii to date. Polymyxin-resistance occurred during polymyxin treatment, but the mechanism and dynamics how these strains acquired resistance is poorly understood. Sequential time-kill (TK) were developed as an alternative approach to discriminate heterogenous subpopulations (S/R) versus adaptive resistance (AR) during colistin and polymyxin B exposure.In this thesis we:1.Confirm that sequential TK could discriminate between stable heterogenous subpopulation (S/R) and unstable homogenous population (AR) demonstrated by pharmacokinetics/pharmacodynamics (PK/PD) modelling.2.Determine the molecular impact of MCR-1 in the progressive adaptation of E. coli and K. pneumoniae over chromosomal genes involved to LPS modification by using the sequential TK approach. 3.Use two A. baumannii clinical isolates, a colistin-susceptible and a colistin acquired-resistant after colistin treatment, to disqualify the presence of heterogenous subpopulation or adaptive resistance. The genes involved in LPS modification and Lipid A biosynthesis were subsequently characterized after sequential TK performance.These studies not only provide a simple approach to discriminate between two PK/PD models, but also an indication that the MCR-1 presence favor another resistance mechanism leading to high-level resistance to polymyxin. By the similar approach, we determine how colistin-susceptible and resistant A. baumannii isolates respond under polymyxin pressure, including the genes involved. Furthermore, polymyxin B showed a lower capacity to induce high-level of resistance than colistin for all bacterial species., Du fait du manque de nouveaux antibiotiques et de l’augmentation des résistances, il est important de comprendre les mécanismes et la dynamique de ces phénomènes. La modification du lipopolysaccharide (LPS) est le principal mécanisme contribuant à la résistance des bactéries aux polymyxines. Le plasmide portant le gène MCR-1 (Mobile Colistin Resistance) retrouvé chez Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae code une phosphoethanolamine transférase capable de modifier le LPS par une addition de phosphoethanolamine sur le lipide A du LPS alors que chez Acinetobacter baumannii résistant aux polymyxines il a été décrit à la fois des modifications du LPS par une phosphoethanolamine et une perte du LPS. Cependant, les interactions entre les différents mécanismes exprimés par ces bactéries à Gram-négatif pour devenir résistantes à la colistine et à la polymyxine B sont encore peu décrit. Les courbes de bactéricidies séquentielles ont étés utilisées comme une approche alternative pour discriminer l’héterorésistance de la population bactérienne (2 sous populations S/R) d’une résistance adaptative (AR) durant le traitement par la colistine ou la polymyxine B.Au cours de ce travail de thèse, nous avons:1.Confirmé que l’approche des courbes de bactéricidies séquentielles peut discriminer deux modèles pharmacocinétique/pharmacodynamique (PK/PD) semi-mécanistiques décrivant soit une population stable héterorésitante (S/R) soit une population bactérienne instable et homogène dont la résistance s’adapte au cours du temps (AR).2.Déterminé l’impact de la présence du plasmide MCR-1 sur les mécanismes de résistance chromosomique impliqués dans la résistance adaptative de E. coli and K. pneumoniae aux polymyxines. 3.Déterminé les mécanismes impliqués dans la résistance aux polymyxines dans deux souches cliniques d’A. baumannii, isolées avant et après traitement d’un patient à la colistine.Dans ce travail, une nouvelle approche de courbes de bactéricidies séquentielles a été utilisée et validée afin de pouvoir différencier différents modèles PK/PD semi-mécanistiques. De plus, ce travail a montré que la présence du plasmide MCR-1 favorisait l’activation d’autres mécanismes chromosomiques conduisant à de hauts niveaux de résistances aux polymyxines. Enfin, la polymyxine B montrait une plus faible capacité à induire ces mécanismes chromosomiques conduisant à de hauts niveaux de résistance.

Pseudomonas aeruginosa (PA) and Acinetobacter baumannii (AB) are responsible for chronic lung infections often associated with the development of biofilms, i.e. bacterial aggregates trapped in a self-produced matrix of anionic polymers such as alginate or DNA. Within these biofilms, bacteria are protected from cationic antibiotics (ATB) such as tobramycin (TOB) and colistin (COL), in part through their interaction with matrix polymers, which reduce their diffusion. The main objectives of this thesis were first to develop a lung biofilm model that mimics those found in chronic lung infections of patients with cystic fibrosis (CF), one of the main lung diseases for which biofilms develop. Then use this model to evaluate a new ATB delivery system made of lipid nanoparticles developed to treat lung biofilms.In CF patients, PA forms biofilms consisting of aggregates (50-100 μm) enclosed in their pulmonary mucus. An in vitro lung biofilm model composed of polymers present in vivo (alginate, mucins, DNA) and consisting of PA trapped in alginate beads has been developed and evaluated using COL and TOB. This model was refined by evaluating the effect of the size of the beads and the growth medium in which they were dispersed. Changing the size of the beads from 60 to 1200 µm and using a dispersion medium simulating the composition of mucus further decreased the effectiveness of TOB in this model. For high TOB concentrations, small-colony variants (SCV) of PA, also found in the CF patient, were observed in the model, suggesting a good mimicry of the conditions in vivo. In this model, COL efficacy was less impacted than that of TOB, and prevented the appearance of SCV. Pegylated lipid nanoparticles loaded with COL and containing a lipophilic adjuvant to COL such as farnesol have been developed to increase its effectiveness against biofilms. Encapsulation of COL improved its efficiency by two in the lung biofilm model PA developed, but also restored the sensitivity to COL of a resistant AB and improved its efficiency in an abiotic adherent biofilm model with AB., Pseudomonas aeruginosa (PA) et Acinetobacter baumannii (AB) sont responsables d'infections pulmonaires chroniques souvent associées à la formation de biofilms, i.e. des agrégats bactériens piégés dans une matrice riche en polymères anioniques tels que l'alginate ou l’ADN. Au sein de ces biofilms, la diffusion des antibiotiques cationiques (ATB), tels que la tobramycine (TOB) et la colistine (COL), est en partie réduite due aux interactions avec les polymères de la matrice. Les principaux objectifs de cette thèse ont été dans un premier temps de développer un modèle de biofilm pulmonaire mimant ceux retrouvés dans les infections pulmonaires chroniques des patients atteints de mucoviscidose (CF), l'une des principales maladies pulmonaires dans laquelle ces biofilms se développent. Un nouveau système d’administration d'ATB, composé de nanoparticules lipidiques chargées de COL, a été par la suite développé et testé grâce à ce modèle de biofilms pulmonaires.Chez les patients atteints de CF, PA forme des biofilms constitués d'agrégats (50-100 μm) incorporés dans leur mucus pulmonaire. Un modèle de biofilm pulmonaire in vitro composé des polymères présents in vivo (alginate, mucines, ADN) et constitué de PA piégés dans des billes d'alginate, a été développé et évalué à l'aide de la COL et de la TOB. Ce modèle a été optimisé en évaluant l'effet de la taille des billes et du milieu de croissance dans lequel elles ont été dispersées. La modification de la taille des billes de 60 à 1200 µm et l'utilisation d'un milieu de dispersion simulant la composition du mucus pulmonaire ont permis de réduire davantage l'efficacité de la TOB dans ce modèle. Pour des concentrations élevées en TOB, des variants de PA formant de très petite colonies (SCV), également trouvés chez les patients atteints de CF, ont été observés dans le modèle, ce qui suggère une bonne imitation des conditions in vivo. Dans ce modèle, l'efficacité de la COL a été moins affectée que celle de la TOB, et aucune SCV a été observé. Des nanoparticules lipidiques PEGylées chargées de COL et contenant un adjuvant lipophile à la COL tel que le farnésol ont été développées pour augmenter son efficacité contre les biofilms. L'encapsulation de la COL a amélioré son efficacité par un facteur deux dans le modèle de biofilm pulmonaire à PA précédemment développée. Ces nanoparticules ont permis également de restaurer la sensibilité à la COL d'une souche résistant d’AB et ont amélioré son efficacité dans un modèle de biofilm d’AB formé sur une surface abiotique.

Introduction le diagnostic de la tuberculose par culture sur milieu solide demeure la methode de reference malgre le developpement de nouvelles methodes. Cependant, les performances de cette methode sont entravees par des taux eleves de contamination des cultures dues a des bacteries sporulantes. Ces bacteries sont en general sensibles a la vancomycine et par consequent a l´association vancomycine, colistine, nystatine et trimethoprime (VCNT). L´objectif de notre etude etait donc d´evaluer l´efficacite d´un milieu de culture selectif de Lowenstein-Jensen (LJ) a base de VCNT pour reduire les contaminations de culture. Methodes des expectorations collectees chez 120 patients tuberculeux et non tuberculeux inclus entre Octobre 2016 et Mai 2017 ont ete decontaminees par la methode modifiee de Petroff. Les culots de decontamination ont ete inocules sur les milieux LJ ordinaires (LJ-MO) et selectif LJ-VCNT a 10µg/ml de vancomycine. Quinze souches de bacteries sporulantes ont ete inoculees sur les memes types de milieux afin d´evaluer leur susceptibilite au VNCT. Resultats les contaminations des cultures sur le milieu LJ-VCNT a 10µg/ml de vancomycine et sur milieu LJ-MO etaient respectivement de 11,66% (14/120) et de 39,16% (47/120) avec p

L’émergence de bactéries à Gram négatif multirésistantes en milieu hospitalier a emmené à reconsidérer la place d’anciens antibiotiques tels que la colistine dans la stratégie thérapeutique. En réanimation, un regain d’intérêt de l’utilisation de la colistine a été observé ces dernières années. Lors de la prescription d’antibiotiques chez les patients de réanimation, il est nécessaire de tenir compte des nombreuses sources de variabilité pharmacocinétique et plus particulièrement lors de l’utilisation de médicaments à marge thérapeutique étroite. Chez ces patients, il est donc nécessaire d’optimiser les schémas posologiques afin d’atteindre l’objectif PK-PD : fAUC/CMI > 50 et prévenir l’émergence de résistances bactériennes. L’objectif de cette étude a été d’évaluer le bon usage de la colistine en analysant la pertinence des prescriptions, les résultats des concentrations plasmatiques en antibiotique, l’adaptation de posologie suite à ces dosages et à la documentation microbiologique ainsi que l’évolution clinico-biologique des patients. Notre étude a montré que près de deux tiers des patients étaient sous-dosés et une faible proportion avaient des concentrations comprises dans les valeurs thérapeutiques attendues. Une adaptation de posologie de posologie a été réalisée chez la moitié des patients et concernait surtout les patients surdosés par crainte des effets toxiques de la molécule. Par ailleurs, une forte proportion de patients sous-dosés en concentration résiduelle, présentait un ratio Cmin/CMI correct, en prenant en compte les CMI vraies. Un tiers des patients a présenté une augmentation de la créatinine durant le traitement, la majorité ayant un autre médicament néphrotoxique associé.

International audience; Colistin is a polypeptide antibiotic mainly used in porcine and poultry to treat gastrointestinal infections. It has been included by the World Health Organisation (WHO) in the list of critically important human antibiotics of high priority for antimicrobial resistance since 2017. Therefore, it is necessary to develop specific and sensitive screening methods for this molecule. Screening for colistin with immunoassays is an interesting alternative to LC-MS/MS screening methods. The performance of three commercially available ELISA kits was evaluated in poultry and porcine muscles for the detection of colistin in regards to its European maximum residue limit (MRL) (150 µg/kg). The applicability of the three ELISA kits to the detection of colistin at or below the MRL in porcine and poultry muscles was demonstrated. The detection capabilities (CCβ) of two kits were or lower than or equal to the MRL (150 µg/kg). The lowest detection capability (30 µg/kg) was achieved with the third ELISA kit. The specificity of the three kits was very satisfactory (false positive rates 0%). The three kits are very specific for the detection of colistin (colistin A and B) and polymyxin B.

Pseudomonas aeruginosa (PA) and Acinetobacter baumannii (AB) are responsible for chronic lung infections often associated with the development of biofilms, i.e. bacterial aggregates trapped in a self-produced matrix of anionic polymers such as alginate or DNA. Within these biofilms, bacteria are protected from cationic antibiotics (ATB) such as tobramycin (TOB) and colistin (COL), in part through their interaction with matrix polymers, which reduce their diffusion. The main objectives of this thesis were first to develop a lung biofilm model that mimics those found in chronic lung infections of patients with cystic fibrosis (CF), one of the main lung diseases for which biofilms develop. Then use this model to evaluate a new ATB delivery system made of lipid nanoparticles developed to treat lung biofilms.In CF patients, PA forms biofilms consisting of aggregates (50-100 μm) enclosed in their pulmonary mucus. An in vitro lung biofilm model composed of polymers present in vivo (alginate, mucins, DNA) and consisting of PA trapped in alginate beads has been developed and evaluated using COL and TOB. This model was refined by evaluating the effect of the size of the beads and the growth medium in which they were dispersed. Changing the size of the beads from 60 to 1200 µm and using a dispersion medium simulating the composition of mucus further decreased the effectiveness of TOB in this model. For high TOB concentrations, small-colony variants (SCV) of PA, also found in the CF patient, were observed in the model, suggesting a good mimicry of the conditions in vivo. In this model, COL efficacy was less impacted than that of TOB, and prevented the appearance of SCV. Pegylated lipid nanoparticles loaded with COL and containing a lipophilic adjuvant to COL such as farnesol have been developed to increase its effectiveness against biofilms. Encapsulation of COL improved its efficiency by two in the lung biofilm model PA developed, but also restored the sensitivity to COL of a resistant AB and improved its efficiency in an abiotic adherent biofilm model with AB., Pseudomonas aeruginosa (PA) et Acinetobacter baumannii (AB) sont responsables d'infections pulmonaires chroniques souvent associées à la formation de biofilms, i.e. des agrégats bactériens piégés dans une matrice riche en polymères anioniques tels que l'alginate ou l’ADN. Au sein de ces biofilms, la diffusion des antibiotiques cationiques (ATB), tels que la tobramycine (TOB) et la colistine (COL), est en partie réduite due aux interactions avec les polymères de la matrice. Les principaux objectifs de cette thèse ont été dans un premier temps de développer un modèle de biofilm pulmonaire mimant ceux retrouvés dans les infections pulmonaires chroniques des patients atteints de mucoviscidose (CF), l'une des principales maladies pulmonaires dans laquelle ces biofilms se développent. Un nouveau système d’administration d'ATB, composé de nanoparticules lipidiques chargées de COL, a été par la suite développé et testé grâce à ce modèle de biofilms pulmonaires.Chez les patients atteints de CF, PA forme des biofilms constitués d'agrégats (50-100 μm) incorporés dans leur mucus pulmonaire. Un modèle de biofilm pulmonaire in vitro composé des polymères présents in vivo (alginate, mucines, ADN) et constitué de PA piégés dans des billes d'alginate, a été développé et évalué à l'aide de la COL et de la TOB. Ce modèle a été optimisé en évaluant l'effet de la taille des billes et du milieu de croissance dans lequel elles ont été dispersées. La modification de la taille des billes de 60 à 1200 µm et l'utilisation d'un milieu de dispersion simulant la composition du mucus pulmonaire ont permis de réduire davantage l'efficacité de la TOB dans ce modèle. Pour des concentrations élevées en TOB, des variants de PA formant de très petite colonies (SCV), également trouvés chez les patients atteints de CF, ont été observés dans le modèle, ce qui suggère une bonne imitation des conditions in vivo. Dans ce modèle, l'efficacité de la COL a été moins affectée que celle de la TOB, et aucune SCV a été observé. Des nanoparticules lipidiques PEGylées chargées de COL et contenant un adjuvant lipophile à la COL tel que le farnésol ont été développées pour augmenter son efficacité contre les biofilms. L'encapsulation de la COL a amélioré son efficacité par un facteur deux dans le modèle de biofilm pulmonaire à PA précédemment développée. Ces nanoparticules ont permis également de restaurer la sensibilité à la COL d'une souche résistant d’AB et ont amélioré son efficacité dans un modèle de biofilm d’AB formé sur une surface abiotique.

For ethical, technical, regulatory, and cost reasons, in vitro methods are increasingly used as an alternative to in vivo experimentations. The aim of the present study was to validate, according to in vivo data in living animals, a new in vitro model of the piglet colon, the PigutIVM, under both control conditions and antibiotic disturbance by the widely used colistin. The PigutIVM reproduces the main biotic and abiotic parameters of the piglet colon: temperature, pH, retention time, supply of ileal effluents, complex, and metabolically active microbiota and self-maintained anaerobiosis. Under both control and antibiotic-treated conditions, qPCR analyses showed that the main bacterial populations of piglet gut microbiota were similar in vitro and in vivo, with Pearson correlation coefficient higher than 0.9. During colistin administration, both in piglets and in the in vitro model, a significant decrease in Escherichia coli populations was observed together with changes in microbial composition of subdominant populations. SCFA concentrations were similar in vitro and in vivo and were not modified by colistin. Interestingly, the administration of the probiotic Saccharomyces cerevisiae var. boulardii CNCM I-1079 led in vitro to a decrease in E. coli levels, as previously observed when the antibiotic treatment was applied. This new in vitro model of the piglet colon provides a flexible, reproducible, and cost-effective tool for the screening of drugs or new dietary compounds, such as pre- or probiotics. It will be helpful for researchers, feed producers, or veterinarians when developing innovative non-antibiotic strategies.

International audience; Objectif - Introduction : La colistine (COS), antibiotique longtemps délaissé, est devenue une alternative de dernier recours pour le traitement des infections à entérobactéries multirésistantes, notamment productrices de carbapénémases. Le complexe Enterobacter cloacae (CEC) comprend plusieurs clusters étroitement liés et non différenciables phénotypiquement, dont certains présentent un phénotype d’hétérorésistance (HR) à la COS. Même si plusieurs gènes ont été identifiés (ex. tolC, phoP et soxS-soxR) dans cette HR, les mécanismes restent en grande partie inconnus. En 2019, Huang et al. ont décrit le gène ecr qui serait également impliqué dans l’HR en régulant positivement l’expression de phoP et de l’opéron arnBCADTEF. Le but de ce travail a été de rechercher la présence du gène ecr par PCR en temps réel dans une collection de souches de CEC déjà caractérisées et par une approche in silico à partir des séquences génomiques disponibles.Matériels et méthodes : Une collection de 100 souches cliniques uniques représentatives des différents clusters du CEC (C-I à C-XIV) a été étudiée. Les souches identifiées par séquençage partiel du gène hsp60 ont été caractérisées pour l’HR à la COS par CMI par microdilution et analyse de population. Après le design d’amorces spécifiques, une technique de PCR en temps réel a été développée. Parallèlement, le gène ecr a été recherché par une analyse in silico sur 1560 souches du CEC.Résultats : Sur les 100 souches, 48 présentaient une HR à la COS et appartenaient aux clusters hsp60suivants : C-I (7/8), C-II (16/16), C-III (1/14), C-IV (8/9), CVII (2/4), C-IX (3/3), C-X (1/2), C-XI (8/9), C-XII (2/2). Le gène ecr a été retrouvé uniquement pour les clusters C-I (7/7, 100%), C-IV (7/8, 87,5%), C-VII (1/2) et C-X (1/1) par PCR. L’analyse in silico des 1560 génomes a montré la présence du gène ecr uniquement pour les clusters C-I (87/87, 100%) et C-IV (86/92, 93,5%). Conclusion : Dans cette étude, nous avons pu montrer que le gène ecr semble particulièrement présent chez les clusters C-I et C-IV. Ces résultats montrent l’importance de la détermination précise du cluster en matière d’interprétation de la sensibilité à la COS. L’analyse génomique doit être étendue aux 100 souches cliniques de ce panel pour confirmer cette association exclusive à certains clusters et redéfinir ainsi précisément le cluster des 2 souches ecr positif non C-I ou C-IV.

The increase of multidrug-resistant bacteria (BMR) to antibiotics is a major public health problem. The first objective of the thesis was to search for the presence of BMR, poorly documented in the community in Tunisia. For the first time, we isolate a Klebsiella pneumoniae belonging to the sequence type ST147 producing carbapenemase NDM-1 in this setting, at Sfax. Our data also indicate an unusually high proportion (47%) of Escherichia coli producing committally two extended-spectrum ß-lactamases. Four of them, with CTX-M-15 and CTX-M-27, are divided into 2 clonal strains of type A-ST617 (2 isolates) and B2-ST131 subclade C2 (2 isolates). All contain a plasmid with the same allelic combination, F31: A4: B1; suggesting a possible dissemination of this replicon. In another study (community-based, Djerba), a multiresistant clonal strain Eh22 of Enterobacter hormaechei, containing a 300 kbp conjugative plasmid of IncHI2, was isolated from 2 patients without apparent epidemiological relationship. The plasmid was sequenced and shows the presence of different resistance genes including 4 genes encoding β-lactamases (blaTEM-1, blaDHA-1, blaCTX-M-3 and blaSHV-12). In a second part, we studied in Eh22, the resistance to colistin (CS), antibiotic of last resort. After selection of an in vitro mutant, we showed for the first time, in Enterobacter spp, that this resistance can be due to a mutation in the gene encoding MgrB, a negative regulator of the 2-component PhoQP system that allows the synthesis of cationic residues on lipopolysaccharide, target of CS. In the last part, bacteriocins-like molecules active on BMR were searched in a collection of Bacillus thurengiensis. One of them, BUPM103, inhibits the growth of BMR. The gene for a potential bacthuricin F103 (11 kDa) was identified by an in silico analysis and it was produced in E. coli. The filtered supernatant secretion showed a growth inhibitory activity against a multiresistant K. pneumoniae, in contrast to control (without secretion). This recombinant bacthuricine could constitute a therapeutic alternative for the BMR treatment., L’augmentation des bactéries multirésistantes (BMR) aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique. Le premier objectif de la thèse a été de rechercher la présence, peu documentée, de BMR dans la communauté en Tunisie. Pour la première fois, nous isolons une Klebsiella pneumoniae de séquence type ST147 productrice de la carbapénèmase NDM-1 dans ce milieu, à Sfax. Nos données indiquent aussi une proportion inhabituellement élevée (47%) d’Escherichia coli produisant deux ß-lactamases à spectre élargi. Quatre d’entre eux, avec CTX-M-15 et CTX-M-27, se divisent en 2 souches clonales de type A-ST617 (2 isolats) et B2-ST131 subclade C2 (2 isolats). Toutes contiennent un plasmide avec la même combinaison allélique, F31:A4:B1 ; suggérant une possible dissémination de ce réplicon. Lors d’une autre étude (milieu communautaire, Djerba), une souche clonale Eh22 d’Enterobacter hormaechei multirésistante, contenant un plasmide conjugatif IncHI2 de 300 kpb, a été isolée chez 2 patients sans lien épidémiologique apparent. Le plasmide a été séquencé et montre la présence de différents gènes de résistance incluant 4 gènes codant pour des ß-lactamases (blaTEM-1, blaDHA-1, blaCTX-M-3 et blaSHV-12). Dans une seconde partie, nous avons étudié chez Eh22 la résistance à la colistine (CS), antibiotique de dernier recours. Après avoir sélectionné un mutant in vitro, nous avons montré pour la première fois, chez Enterobacter spp, que cette résistance pouvait être due à une mutation dans le gène codant pour MgrB, un régulateur négatif du système à 2 composants PhoQP qui permet la synthèse de groupements cationiques sur le lipopolysaccharide, cible de la CS. Dans une dernière partie, des molécules de type bactériocines actives sur les BMR ont été recherchées à partir d’une collection de Bacillus thurengiensis. L’une d’elle, BUPM103, inhibe la croissance de BMR. Une analyse in silico a permis d’identifier le gène d’une potentielle bacthuricine F103 (11 kDa) qui a été produite dans E. coli. Le surnageant de sécrétion filtré a montré une activité d’inhibition de la croissance de K. pneumoniae multirésistante, contrairement au contrôle (sans sécrétion). Cette bacthuricine recombinante pourrait constituer une alternative thérapeutique pour le traitement des BMR.

Use of chlorhexidine in clinical settings has led to concerns that repeated exposure of bacteria to sub-lethal doses of chlorhexidine might result in chlorhexidine resistance and cross resistance with other cationic antimicrobials including colistin, endogenous antimicrobial peptides (AMPs) and their mimics, ceragenins. We have previously shown that colistin-resistant Gram-negative bacteria remain susceptible to AMPs and ceragenins. Here, we investigated the potential for cross resistance between chlorhexidine, colistin, AMPs and ceragenins by serial exposure of standard strains of Gram-negative bacteria to chlorhexidine to generate resistant populations of organisms. Furthermore, we performed a proteomics study on the chlorhexidine-resistant strains and compared them to the wild-type strains to find the pathways by which bacteria develop resistance to chlorhexidine. Serial exposure of Gram-negative bacteria to chlorhexidine resulted in four- to eight-fold increases in minimum inhibitory concentrations (MICs). Chlorhexidine-resistant organisms showed decreased susceptibility to colistin (8- to 32-fold increases in MICs) despite not being exposed to colistin. In contrast, chlorhexidine-resistant organisms had the same MICs as the original strains when tested with representative AMPs (LL-37 and magainin I) and ceragenins (CSA-44 and CSA-131). These results imply that there may be a connection between the emergence of highly colistin-resistant Gram-negative pathogens and the prevalence of chlorhexidine usage. Yet, use of chlorhexidine may not impact innate immune defenses (e.g., AMPs) and their mimics (e.g., ceragenins). Here, we also show that chlorhexidine resistance is associated with upregulation of proteins involved in the assembly of LPS for outer membrane biogenesis and virulence factors in Pseudomonas aeruginosa. Additionally, resistance to chlorhexidine resulted in elevated expression levels of proteins associated with chaperones, efflux pumps, flagella and cell metabolism. This study provides a comprehensive overview of the evolutionary proteomic changes in P. aeruginosa following exposure to chlorhexidine and colistin. These results have important clinical implications considering the continuous application of chlorhexidine in hospitals that could influence the emergence of colistin-resistant strains.

National audience; La colistine est un vieil antibiotique qui est devenu la dernière option pour traiter des infections causées par bactéries gram – résistantes aux antibiotiques en médecine humaine. En 2015, un gène de résistance à la colistine, horizontalement transférable, a été découvert en Chine. Il s’agit du gène mcr-1 localisé sur un plasmide (1). Depuis cette date, le screening de collections d’Enterobacteriaceae a montré la dissémination mondiale de ce gène chez l’homme, les animaux et dans l’environnement, qui est passé inaperçu pendant des décennies. Plusieurs auteurs suggèrent que l’aquaculture est responsable de l’origine et la sélection du gène mcr-1(2,3). Dans cette étude rétrospective, nous avons évalué la sensibilité à la colistine d’une collection de Yersinia ruckeri responsable de cas cliniques en pisciculture en France. Nous avons testé 104 isolats cliniques et nonreliés épidémiologiquement de Y. ruckeri par la méthode de CMI (Concentration Minimale Inhibitoire) liquide selon le protocole de référence (CLSI). Il n’existe pas de seuil de résistance décrit pour le couple colistine/Y. ruckeri, nous avons donc utilisé la valeur reportée par le European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing pour Escherichia coli, une autre Enterobacteriaceae (CMI >2μg/ml). Un isolat montrait une résistance phénotypique à la colistine (CMI=128 μg/ml). Son ADN plasmidique a été testé par PCR pour la recherche du gène mcr-1, et le séquençage a montré une similarité de 100% avec la séquence de mcr-1 décrite initialement en Chine. Cet isolat correspondait à un cas de yersiniose sur un saumon atlantique isolé en 1985.Cette étude décrit pour la première fois la présence du gène mcr-1 chez Y. ruckeri, et présente l’isolat porteur de mcr-1 le plus ancien décrit en Europe. L’isolat antérieurement considéré le plus ancien date de 2004 (4). Nos résultats suggèrent que l’aquaculture peut avoir un rôle dans l’origine et la sélection de mcr-1, mais aussi que mcr-1 n’a pas persisté dans la population de Y. ruckeri associée à l’aquaculture en France. Le non-usage de la colistine en aquaculture en France peut avoir évité la dissémination de mcr-1. Au contraire, on considère qu’en Asie l’usage important de cet antibiotique en aquaculture ainsi que l’abondance des élevages piscicoles sont responsables de la distribution extensive de mcr-1.

International audience

Les pratiques agricoles peuvent participer à la propagation des gènes de résistances aux antimicrobiens (GRAs) dans l’environnement. En effet, les épandages de lisier de porc introduisent des microorganismes résistants aux antimicrobiens dans le sol. Cette étude a permis d’évaluer l'impact d’épandages répétés de lisier de porc et du travail du sol sur la présence de GRAs dans le sol et l'eau de drainage en grandes cultures. Les bactéries Escherichia coli et entérocoques ont été dénombrées. Après l’extraction d'ADN, les gènes de résistance tet(T), sul1 et blaCTX-M-1 ont été quantifiés par qPCR. La détection des gènes mcr-1 et mcr-2 a été réalisée par PCR conventionnelle. D’après les résultats obtenus, l’épandage du lisier de porc à une dose élevée (45m3/ha) a eu un impact à long terme sur l’abondances des gènes tet(T) et sul1 dans le sol. Une dose plus faible (20m3/ha) a eu un impact à court terme. L’abondance des gènes sul1 dans l’eau de drainage a significativement diminué 15 jours après l’épandage comparé à 169 jours pour les gènes tet(T). Le travail du sol n’a pas eu d’impact sur la présence et l’abondance des GRAs dans les échantillons. Les gènes blaCTX-M-1 ont été détectés dans le lisier et dans 7 échantillons d'eau, mais aucun lien n’a été établi avec les traitements. Les gènes mcr-1 et mcr-2 n'ont pas été détectés. Ce projet a permis de démontrer que le réservoir des gènes de résistance à la tétracycline et aux sulfamides dans le sol peut être augmenté après l’épandage répété de lisier à dose élevée., Agricultural practices represent potential pathways for the propagation of antimicrobial resistance genes (ARGs) in the environment. Hog manure applications introduce antimicrobial resistant microorganisms to the soil. This study evaluated the impact of hog manure spreading and tillage practices on the presence of ARGs in soil and drainage water in field crops. Escherichia coli and enterococci bacteria were counted. After DNA extraction, tet(T), sul1 and blaCTX-M-1 resistance genes were quantified by qPCR. The detection of mcr-1 and mcr-2 genes was performed by conventional PCR. The results showed that high-dose manure application (45 m3/ha) had a long-term impact on tet(T) and sul1 genes abundance in soil. A dose of 20 m3/ha had a short-term impact. Gene abundance in drainage water decreased significantly 15 days after manure application for sul1 and 169 days for tet(T). Tillage practices did not have an impact on the presence and abundance of ARGs in samples. The blaCTX-M-1 genes were detected in hog manure and in 7 water samples, but no link was established with the treatments. The mcr-1 and mcr-2 genes were not detected. This study demonstrated that tetracycline and sulfonamide resistance genes reservoir in soil can be increased after repeated high doses swine manure applications.

International audience; Since its introduction in the 1950s, colistin has been used mainly as a topical treatment in human medicine owing to its toxicity when given systemically. Sixty years later, colistin is being used as a last-resort drug to treat infections caused by multidrug-resistant (MDR) Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii and Enterobacteriaceae (e.g., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae), for which mortality can be high. In veterinary medicine, colistin has been used for decades for the treatment and prevention of infectious diseases. Colistin has been administered frequently as a group treatment for animal gastrointestinal infections caused by Gram-negative bacteria within intensive husbandry systems. Given the ever-growing need to retain the efficacy of antimicrobials used to treat MDR infections in humans, the use of colistin in veterinary medicine is being re-evaluated. Despite extensive use in veterinary medicine, there is limited evidence for the development of resistance to colistin and no evidence has been found for the transmission of resistance in bacteria that have been spread from animals to humans. Since surveillance for colistin resistance in animals is limited and the potential for such transmission exists, there is a clear need to reinforce systematic monitoring of bacteria from food-producing animals for resistance to colistin (polymyxins). Furthermore, colistin should only be used for treatment of clinically affected animals and no longer for prophylaxis of diseases, in line with current principles of responsible use of antibiotics.

The global spread of multidrug-resistant Gram-negative bacteria associated with a decrease in the number of new antibiotic therapies is a major public health issue. Colistin is often referred to as the "last-resort" antibiotic, used as the only therapeutic alternative for MDR Gram-negative bacteria infection, which explains the current renewal of interest in this antimicrobial agent. However, the appearance of colistin-resistant bacterial strains has been already observed. The main objective of this PhD work was to study the colistin resistance mechanism (s) in K. pneumoniae by looking at two aspects of the problem. Firstly, we sought to better understand this mechanism, associating a genotypic study with a phenotypic study. Next, we looked for therapeutic alternatives, by evaluating different antibiotic combinations, La diffusion des bactéries multirésistantes aux antibiotiques associée à une diminution du nombre de nouveaux antibiotiques représente un véritable enjeu de santé publique. De nos jours, un vieil antibiotique, la colistine, connait un récent regain d’intérêt, constituant parfois la seule alternative thérapeutique. La colistine est, alors, qualifiée d’antibiotique de « dernier recours ». Cependant, il a été constaté l’apparition de souches résistantes à la colistine. L’objectif principal de ce travail de thèse a été d’étudier le(s) mécanisme(s) de résistance à la colistine chez K. pneumoniae. Afin de mener à bien notre projet, nous nous sommes intéressés à deux aspects de la problématique. Dans un premier temps, nous avons cherché à mieux comprendre ce mécanisme, en associant une étude génotypique à une étude phénotypique. Et dans un second temps, nous avons cherché des alternatives thérapeutiques, en évaluant différentes associations antibiotiques

Background and aim Plasmid-mediated colistin resistance mechanisms have been identified worldwide in the past years. A multiplex polymerase chain reaction (PCR) protocol for detection of all currently known transferable colistin resistance genes (mcr-1 to mcr-5, and variants) in Enterobacteriaceae was developed for surveillance or research purposes. Methods: We designed four new primer pairs to amplify mcr-1, mcr-2, mcr-3 and mcr-4 gene products and used the originally described primers for mcr-5 to obtain a stepwise separation of ca 200 bp between amplicons. The primer pairs and amplification conditions allow for single or multiple detection of all currently described mcr genes and their variants present in Enterobacteriaceae. The protocol was validated testing 49 European Escherichia coli and Salmonella isolates of animal origin. Results: Multiplex PCR results in bovine and porcine isolates from Spain, Germany, France and Italy showed full concordance with whole genome sequence data. The method was able to detect mcr-1, mcr-3 and mcr-4 as singletons or in different combinations as they were present in the test isolates. One new mcr-4 variant, mcr-4.6**, was also identified. Conclusions: This method allows rapid identification of mcr-positive bacteria and overcomes the challenges of phenotypic detection of colistin resistance. The multiplex PCR should be particularly interesting in settings or laboratories with limited resources for performing genetic analysis as it provides information on the mechanism of colistin resistance without requiring genome sequencing.

International audience

L'auteur de la thèse a souhaité limiter l'accès aux membres de l'Enseignement supérieur français.; L'antibiorésistance est un phénomène complexe qui tend à devenir de plus en plus préoccupant. Elle est la conséquence de plusieurs facteurs : (i) la très forte augmentation de la multirésistance aux antibiotiques chez les bactéries, et en particulier chez les Bactéries à Gram Négatif (BGN) ; (ii) l'émergence et la dissémination de souches résistantes voire multirésistantes, comme les Entérobactéries résistantes aux carbapénèmes ; et (iii) l'absence de nouvelles molécules. Cette situation a contraint les cliniciens à se tourner vers d'anciennes molécules comme la colistine, pour le traitement d'infections causées par ces BGN multirésistantes. La colistine est un antibiotique polypeptidique de la famille des polymyxines. La famille des polymyxines comprend actuellement deux composés utilisés en thérapeutique : la polymyxine B et la polymyxine E (ou colistine). Ce très net regain d'intéret pour la colistine, qui a été alors qualifié de traitement de dernier recours, a eu plusieurs conséquences ; la principale étant la très forte augmentation du nombre de souches résistantes à la colistine chez les espèces normalement sensibles (Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli…), et leur dissémination à l'échelle de la planète… Cette thèse s'articulera en deux grandes parties. La première présentera les données les plus récentes sur l'état des lieux des connaissances sur la résistance à la colistine chez les Entérobactéries, tant d'un point de vue mécanistique (avec la présentation des mécanismes de résistance), qu'épidémiologique. La seconde portera quant à elle sur différents travaux qui ont été menés au laboratoire, sur la résistance à la colistine, à travers la présentation de trois publications internationales et qui illustreront les moyens qui peuvent être utilisés pour comprendre, caractériser, voire même lutter contre l'antibiorésistance.

Colistin represents one of the few available drugs for treating infections caused by carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. As such, the recent plasmid-mediated spread of the colistin resistance gene mcr-1 poses a significant public health threat, requiring global monitoring and surveillance. Here, we characterize the global distribution of mcr-1 using a data set of 457 mcr-1-positive sequenced isolates. We find mcr-1 in various plasmid types but identify an immediate background common to all mcr-1 sequences. Our analyses establish that all mcr-1 elements in circulation descend from the same initial mobilization of mcr-1 by an ISApl1 transposon in the mid 2000s (2002–2008; 95% highest posterior density), followed by a marked demographic expansion, which led to its current global distribution. Our results provide the first systematic phylogenetic analysis of the origin and spread of mcr-1, and emphasize the importance of understanding the movement of antibiotic resistance genes across multiple levels of genomic organization., The recent plasmid-mediated spread of the mobilized colistin resistance gene mcr-1 poses a significant public health threat, requiring worldwide monitoring and surveillance. Here, Wang et al. compile and analyze a data set of 457 mcr-1-positive sequenced isolates to investigate the origin and global distribution of mcr-1.

La découverte récente du premier gène de résistance plasmidique à la colistine, mcr-1, a mis en évidence le besoin urgent d'améliorer la détection des isolats résistant à la colistine dans les laboratoires de microbiologie clinique, afin de pouvoir rapidement isoler les patients porteurs. L’objectif de ma thèse a ainsi été de répondre à cette problématique par le développement et l’évaluation d’outils spécifiques. Une revue a été rédigée, visant à résumer les nouveaux outils développés pour détecter la résistance aux polymyxines, y compris la présentation des méthodes actuelles phénotypiques, antibiogrammes et génotypiques.Le milieu de culture LBJMR a été développé pour détecter toutes les bactéries à Gram négatif résistantes à la colistine et également les souches d’entérocoques résistants à la vancomycine, qui représentent un autre problème majeur de santé publique. LBJMR est polyvalent et a permis de dépister 3 bactéries d'intérêt clinique à partir d’un même échantillon: E. coli et K. pneumoniae résistantes à la colistine, et E. faecium résistant à la vancomycine. Un brevet a été déposé.Le kit UMIC Colistine est un dispositif commercial de détermination de la CMI basé sur la méthode de référence. Évalué conformément à la norme ISO 20776, sa sensibilité était excellente pour la détection des souches porteuses du gène mcr-1. Le kit UMIC Colistine constitue ainsi une méthode rapide et fiable pour évaluer la CMI des isolats cliniques dans les laboratoires de microbiologie clinique.Enfin, mes travaux de thèse ont compris l’analyse d’une souche de K. pneumoniae hétérorésistante à la colistine et la description d’une nouvelle espèce bactérienne : Pseudomonas massiliensis.

Du fait de l'émergence de bactéries à Gram négatif résistantes aux carbapénèmes, la colistine a été réutilisée pour traiter des infections liées à ces germes. Néanmoins, depuis sa réintroduction, la résistance acquise à la colistine chez ces bactéries a émergé et les mécanismes expliquant la résistance à la colistine au sein des entérobactéries sont encore incompris.L’objectif de cette thèse était d’identifier de nouveaux mécanismes de résistance à la colistine chez les entérobactéries, notamment chez celle qui y résistant naturellement. Nous avons réalisé une revue de la littérature des mécanismes de la résistance à la colistine identifiés à ce jours. Nous nous somme ensuite intéressés au mécanisme de la résistance à la colistine chez Proteus vulgaris en comparant une souche anormalement sensible à la colistine et une résistante. La mise en évidence d’une mutation sur le gène arnD a permis de montrer le rôle de l’aminoarabinose. Puis, nous avons étudié le rôle de l’efflux et à partir d’une collection de souches résistantes à la colistine, nous avons évalué l’effet d’un hinhibiteur de pompes à efflux sur la CMI de la colistine. Nous avons montré que les bactéries hétérorésistantes ainsi que les souches résistant naturellement à la colistine étaient beaucoup plus répondeuse à l'effect inhibiteur de pompe du CCP que les autres entérobactéries. Enfin, dans une troisième partie, nous avons cherché à identifier les facteurs de risque d’acquisition de K. pneumoniae résistantes à la colistine et à déterminer le support moléculaire de cette résistance chez des patients hospitalisés au sein de l’AP-HM. Trois nouvelles mutations sont rapportés pour la première fois ici.

Différents scénarii sont envisageables pour réduire la nécessité de recourir à la colistine : la vaccination contre certaines maladies, l’utilisation d’acides organiques ou encore de métaux pour la prévention des infections digestives… Dans ce contexte, l’Anses a été saisie par le ministère chargé de l’Agriculture pour évaluer les bénéfices et les risques liés à l’utilisation de l’oxyde de zinc dans l’alimentation des porcelets au sevrage pour diminuer le recours aux antibiotiques dans la lutte contre les troubles digestifs apparaissant à cette période. Il ressort que ce type d’alternative présente des risques préoccupants pour l’environnement mais aussi de développement de résistance croisée zinc/antibiotiques. De plus, si l’usage de la colistine était interdit en médecine vétérinaire, il est probable que l’on s’orienterait vers un usage renforcé d’autres familles d’antibiotiques, importants également pour la santé humaine et pour lesquelles la résistance serait augmentée. Il importe donc de poursuivre la caractérisation du danger et l’évaluation de risque lié à l’usage de la colistine en médecine vétérinaire, de renforcer le contrôle de la surveillance et de mettre en place un suivi étroit de la résistance pour détecter précocement tout signal d’alerte.

This is a post-peer-review, pre-copyedit version of an article published in 'Pharmaceutical Research'. The final authenticated version is available online at: https://doi.org/10.1007/s11095-018-2379-4. The following terms of use apply: https://www.springer.com/gp/open-access/publication-policies/aam-terms-of-use. Deposited by shareyourpaper.org and openaccessbutton.org. We've taken reasonable steps to ensure this content doesn't violate copyright. However, if you think it does you can request a takedown by emailing help@openaccessbutton.org.

Différents scénarii sont envisageables pour réduire la nécessité de recourir à la colistine : la vaccination contre certaines maladies, l’utilisation d’acides organiques ou encore de métaux pour la prévention des infections digestives… Dans ce contexte, l’Anses a été saisie par le ministère chargé de l’Agriculture pour évaluer les bénéfices et les risques liés à l’utilisation de l’oxyde de zinc dans l’alimentation des porcelets au sevrage pour diminuer le recours aux antibiotiques dans la lutte contre les troubles digestifs apparaissant à cette période. Il ressort que ce type d’alternative présente des risques préoccupants pour l’environnement mais aussi de développement de résistance croisée zinc/antibiotiques. De plus, si l’usage de la colistine était interdit en médecine vétérinaire, il est probable que l’on s’orienterait vers un usage renforcé d’autres familles d’antibiotiques, importants également pour la santé humaine et pour lesquelles la résistance serait augmentée. Il importe donc de poursuivre la caractérisation du danger et l’évaluation de risque lié à l’usage de la colistine en médecine vétérinaire, de renforcer le contrôle de la surveillance et de mettre en place un suivi étroit de la résistance pour détecter précocement tout signal d’alerte.

Colistin is an old antibiotic, used in both human and veterinary medicine. However, the antibiotic arsenal being more and more limited, colistin appears as one of the last ramparts in the fight against multidrug-resistant bacteria in humans. In order to preserve the efficacy of colistin, two issues were addressed in this thesis:(i) the risks of selecting colistin resistance related to the discovery in 2015 of a gene carried by a plasmid (mcr-1). Thus, the impact of the use of colistin by the oral route in pig production was evaluated in vivo and an absence of selection was observed in our experimental conditions. Similarly, the (minority) use of colistin in human medicine as a prophylaxis for selective digestive decontamination (SDD) was studied in rats harboring a human intestinal microbiota. Preliminary results also show no selection effect.(ii) the development of a physiology-based pharmacokinetic model (PBPK) in pigs for the systemic use of colistin and its prodrug, colistin methanesulfonate (CMS). This model allowed to explore the tissue distribution of CMS and colistin, especially in the kidneys where toxicity is most frequent. As an application of this model, the estimation of waiting times before slaughter when using CMS in pigs was carried out. Finally, the ability of PBPK models to perform intra and interspecies extrapolations was used to adapt this model in adults and children, in order to be able to predict plasma concentrations of colistin during treatment., La colistine est un vieil antibiotique, utilisé à la fois en médecine humaine et vétérinaire. Cependant, l’arsenal antibiotique étant de plus en plus limité, la colistine apparait comme un des derniers remparts dans la lutte contre les bactéries multi-résistantes chez l’Homme. Afin de préserver l’efficacité de la colistine, deux problématiques ont été abordées dans cette thèse :(i) les risques de sélection de résistance à la colistine en lien avec la découverte fin 2015 d’un gène porté par un plasmide (mcr-1). Ainsi, l’impact de l’usage de colistine par voie orale en production porcine a été évalué in vivo et une absence de sélection a été observée dans nos conditions expérimentales. De façon similaire, l’usage (minoritaire) de colistine en médecine humaine comme prophylaxie de décontamination digestive sélective (SDD) a été étudié chez des rats hébergeant un microbiote intestinal humain. Les résultats préliminaires ne montrent pas non plus d’effet de sélection.(ii) le développement d’un modèle pharmacocinétique basé sur la physiologie (PBPK) chez le porc pour l’usage par voie systémique de la colistine et de sa prodrogue, le colistine méthanesulfonate (CMS). Ce modèle a permis d’explorer la distribution tissulaire du CMS et de la colistine, notamment au niveau rénal où la toxicité est la plus fréquente. Comme application de ce modèle, l’estimation des temps d’attente avant abattage lors d’usage de CMS chez le porc a été effectué. Enfin, la capacité des modèles PBPK à réaliser des extrapolations intra et inter-espèces a été utilisé pour adapter ce modèle chez l’adulte et l’enfant, afin de pouvoir prédire les concentrations plasmatiques de colistine lors d’un traitement.

La méthanisation consiste en la transformation biologique de la matière organique sous l'action de microorganismes, en milieu anaérobie. Les produits obtenus sont le biogaz (en particulier du méthane) et des sous-produits liquides ou solides. Le méthane pourra être à l'origine de la production de chaleur et d'électricité. Il s'agit, associé à d'autres modes de production d'énergie, d'une réponse à la demande croissante énergétique au niveau mondial, et à la nécessité de remplacer les sources actuelles par de l'énergie« verte». Il existe de nombreux effluents envisageables pour ce processus. Un des plus courants est le lisier issu de l'élevage bovin. Cependant, la méthanisation peut être inhibée par les substances présentes dans le réacteur. Cette étude se concentrera particulièrement sur l'inhibition par les antibiotiques, administrés classiquement aux bovins durant l'élevage et retrouvés dans le lisier. Nous avons, par une série d'expérimentations, évalué l'effet de la colistine et de la streptomycine, deux antibiotiques couramment administrés aux bovins durant l'élevage, sur la méthanisation du lisier de ces animaux. Cette étude a été réalisée par mise en contact, dans des réacteurs batch le lisier, avec de la streptomycine (milieux concentrés à 0,8, 8 et 80 mg/L) ou de la colistine (milieux concentrés à 0,01, 0,1 et l mg/L), puis à la méthanisation de ces échantillons. Le volume de biogaz et de méthane produit a été suivi durant 90 jours. Nous avons pu observer une inhibition partielle de la méthanisation dans les milieux réactionnels contenant de la streptomycine : un ralentissement du processus pour des milieux concentrés à 0,8 et 8 mg/L en streptomycine, et une diminution du volume de biogaz produit au terme des 90 jours pour un milieu concentré à 80 mg/L. La première partie de cette thèse est consacrée à la description de la méthanisation, en particulier aux étapes de son déroulement, aux paramètres physico-chimiques et bactériologiques ayant un impact sur ce processus, ainsi qu'à ses effluents et produits. Ensuite, les différents antibiotiques sur le marché en France à l'usage des bovins et leur usage ont été étudiés, puis une revue de substances pouvant couramment inhiber la méthanisation a été réalisée. Enfin, l'étude expérimentale concernant la méthanisation en présence de streptomycine et de colistine est présentée.

International audience; Colistin resistance was investigated in 1,696 isolates collected from 2007 to 2014 within the frame of the French livestock antimicrobial resistance surveillance programme. The mcr-1 gene was detected in all com-mensal Escherichia coli isolates with a minimum inhibi-tory concentration to colistin above the 2 mg/L cutoff value (n=23). In poultry, mcr-1 prevalence was 5.9% in turkeys and 1.8% in broilers in 2014. In pigs, investigated in 2013, this prevalence did not exceed 0.5%. These findings support that mcr-1 has spread in French livestock. We report mcr-1 prevalence data in commensal Escherichia coli isolated from French livestock from 2007 to 2014.

The emergence and multiplication of infections involving resistant and multi-resistant antibiotic-resistant bacteria is currently a major challenge in the field of health. Indeed, the resistance of microorganisms to antibiotic molecules has become an increasingly worrying phenomenon, particularly in hospitals, hence the need for new therapies and new antimicrobial agents that are more effective. Many conventional antibiotic agents have been developed in recent years, but many of them still present risks of more or less toxic side effects on eukaryotic cells, and despite their high effectiveness against multi-resistant microorganisms. Thus, antimicrobial peptides are considered good candidates in the fight against multi-resistant microorganisms, mainly because of their low toxicity to eukaryotic cells and their different modes of action compared to conventional antibiotics. Indeed, the latter are generally non-specific and are less likely to lead to the observed resistance phenomena for conventional antibiotics.The aim of the work carried out in this thesis was to study the modes of action of the two different antimicrobial agents; (I) colistin, a cyclic polypeptide already used to treat infections caused by multi-resistant bacteria; and (ii) bovine catestatin (CAT), a recently discovered linear peptide belonging to the Host Defense Peptides Ie produced by the endocrine and immune system of mammals. This study was carried out mainly using different physico-chemical characterization methods such as Atomic Force Microscopy (AFM) and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (ATR-FTIR). The activity of colistin on pure and mixed phospholipid membranes (based on DPPC, DOPC and DPPE) was monitored in real time and in situ by these two techniques. The changes in the biochemical fingerprint of the membranes, in particular in the Amide II band and in the Amide II / C = O integrated intensity ratio allowed us to reinforce the hypothesis that the activity of the peptide was more intense On mixed membranes than on pure membranes. Similar changes in the biochemical footprint of these membranes were observed when they were exposed to catestatin. In addition, infrared spectroscopy has also demonstrated conformational changes in the structure of catestatin, in particular by the passage from a so-called random coil structure to an alpha-helix structure, and only in contact with the structure membrane. Such conformational changes could be implicated in the antimicrobial activity and mode of action of this peptide. In addition, we have also been interested in the action of the two peptides on more complex phospholipid membranes since they consist mainly of natural extracts of bacterial lipopolysaccharides (lipid A, LPS-s and LPS-re). Our results showed that the two antimicrobial agents were responsible for a reorganization of the structure of the membranes and in some cases the peptide was at the origin of the formation of the pores of different sizes. The influence of the elasticity of the membrane has also been studied using force spectroscopy (AFM). This study revealed a considerable impact of the peptides on the mechanical properties of the membranes and in particular on their elasticity. In order to approximate the actual conditions of antimicrobial treatment, we exhibited different bacterial E. coli biofilms from doses of two antimicrobial peptides. This latter study was carried out in real time and in situ using infrared spectroscopy and atomic force microscopy. Infrared spectroscopy allowed us to follow the modifications of the biochemical fingerprint of the biofilm on the course of the treatment. Also provided information on possible changes in bacterial metabolism. In parallel with these measurements, the AFM allowed us to observe the changes in the morphology and mechanical properties of the bacterial biofilm as a function of the antimicrobial treatment applied. [...], L’émergence et la multiplication des infections impliquant des bactéries résistantes et multi-résistantes aux traitements par voie antibiotique sont actuellement un défi majeur dans le domaine de la santé. En effet, la résistance des microorganismes aux molécules antibiotiques est devenue un phénomène de plus en plus préoccupant notamment en milieu hospitalier d’où la nécessité de faire appel à de nouvelles thérapies et à de nouveaux agents antimicrobiens plus efficaces. De nombreux agents antibiotiques classiques ont été développés ces dernières années, mais beaucoup d’entre eux présentent encore des risques d'effets secondaires plus ou moins toxiques sur les cellules eucaryotes, et en dépit de leur efficacité importante contre des microorganismes multi-résistants. Ainsi, les peptides antimicrobiens sont considéré comme de bons candidats dans la lutte contre multi-résistantes microorganismes, principalement en raison de leur faible toxicité sur les cellules eucaryotes et de leurs différents modes d'action par rapport aux antibiotiques classiques. En effet, ces derniers sont généralement non spécifiques et sont moins susceptibles de mener aux phénomènes de résistance observés pour les antibiotiques classiques. L'objectif des travaux menés dans ce mémoire était d'étudier les modes d'action des deux agents antimicrobiens différents; i) la colistine, un polypeptide cyclique déjà utilisé pour traiter les infections causées par des bactéries multi-résistantes et ii) la catestatine bovine (CAT), un peptide linéaire récemment découvert faisant partie de la famille des HDP (Host Defense Peptides), c’est-à-dire produite par le système endocrinien et immunitaire des mammifères. Cette étude a été réalisée principalement à l’aide de différentes méthodes de caractérisation physico-chimique telles que la microscopie à force atomique (AFM) et la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier en réflexion totale atténuée (ATR-FTIR). L'activité de la colistine sur des membranes phospholipidiques pures et mixtes (à base de DPPC, DOPC et DPPE) a été suivie en temps réel et in-situ par ces deux techniques. Les modifications de l'empreinte biochimique des membranes, en particulier au niveau de la bande Amide II et du rapport d'intensité intégré Amide II/C=O nous a permis de renforcer l'hypothèse selon laquelle l'activité du peptide était plus intense sur les membranes mixtes que sur les membranes purs. Des modifications similaires dans l'empreinte biochimique de ces membranes ont été observées quand elles avaient été exposées à la catestatine. En outre, la spectroscopie infrarouge a également mis en évidence des changements conformationnels dans la structure de la catestatine, notamment par le passage d’une structure en pelote dite « random coil » à une structure en hélice alpha, et ce uniquement au contact avec la membrane. De tels changements conformationnels pourraient être impliqués dans l'activité antimicrobienne et le mode d'action de ce peptide. En outre, nous nous sommes également intéressé à l’action des deux peptides sur des membranes phospholipidiques plus complexes puisque constituées principalement d’extraits naturels de lipopolysaccharides bactériens (lipide A, LPS-s et le LPS-re). Nos résultats ont mis en évidence que les deux agents antimicrobiens étaient à l’origine d’une réorganisation de la structure des membranes et dans certains cas, le peptide était à l’origine de la formation des pores de différentes tailles. L'influence de l'élasticité de la membrane a également été étudiée à l’aide de la spectroscopie de force (AFM). Cette étude a mis en évidence un impact considérable des peptides sur les propriétés mécaniques des membranes et en particulier sur leur élasticité. Afin de se rapprocher des conditions réelles d'un traitement antimicrobien, nous avons exposé des biofilms bactériens de E. coli différentes de doses de deux peptides antimicrobiens. [...]

International audience; Colistin is currently regarded as one of the `last-resort' antibiotics used for the treatment of critical infections caused by multidrug-resistant Gram-negative pathogens. There have been numerous reports of the emergence of colistin resistance in patients, most of whom had previously received colistin therapy or with acquisition via nosocomial transmission. However, there are also ample reports of colistin resistance in humans who have not received the drug previously or without nosocomial transmission. We have also observed a similar occurrence in our study involving colistin resistance from several countries along with a similar phenomenon being reported by researchers. The observation of colistin resistance in humans without prior colistin exposure is of particularly great clinical importance and concern because of the current importance of colistin in clinical medicine. Colistin use and colistin-resistant bacteria in animals have been recently reported, suggesting that animals could also be a source of transmission of colistin-resistant bacteria to humans. This is a real worry and calls for clinicians to be aware and vigilant of this phenomenon and of the possibility of independent resistance to colistin in some patients. (C) 2015 Elsevier B.V. and the International Society of Chemotherapy. All rights reserved.

Antibiotics are among the most commonly prescribed drugs, however optimal dosages are not yet well defined. The aim of this thesis was to develop pharmacokinetic (PK) and pharmacokinetic-pharmacodynamics (PK/PD) models that characterize the course of antimicrobial drug concentrations and effects over time, with an emphasis on the development of resistance. These models were applied to optimize dosing regimens of antimicrobial therapies.A population PK model for colistin and its prodrug, colistin methanesulfonate (CMS) was developed in critically ill patients receiving colistin by nebulization and/or undergoing an intermittent hemodialysis (HD). Results predicted clear benefits of using aerosol delivery of 2MIU CMS dose for the treatment of pulmonary infections. For patients with HD session dosing regimen of CMS should be 1.5 MIU twice daily with an additional dose of 1.5 MIU after each HD session.An assessment of the performances of different PK-PD models by using a simulation approach have shown the importance of longer study designs and of complementary microbiological data to predict accurately bacterial resistance development. A semi-mechanistic PK/PD model that incorporates mutation rate and adaptive resistance development of a bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa against colistin wasdeveloped based on in-vitro data. A high, quick and partially reversible resistance was described. These results confirm that the first 24 h of treatment are critical in the management of infections, that colistin alone cannot eradicate completely the mutants of Pseudomonas aeruginosa that were selected during the experiments and that combination therapies seem necessary.; Les antibiotiques sont actuellement parmi les médicaments les plus utilisés, mais les schémas thérapeutiques optimaux ne sont pas toujours bien définis. Le but de cette thèse était de développer des modèles pharmacocinétiques (PK) et pharmacodynamiques (PK/PD) décrivant les profils de concentrations des antibiotiques ainsi que leurs effets et le développement de résistances bactériennes afin d'optimiser les schémas thérapeutiques.Un modèle PK de population sur la colistine et sa prodrogue, le colistine methanesulfonate (CMS), a été développé chez les patients recevant la colistine par voie aérosol et/ou sous hémodialyse (HD). Les résultats ont montré un net avantage de la voie aérosol pour le traitement des infections pulmonaires avec une dose de 2 MUI de CMS. Pour les patients sous HD une dose de 1.5 MUI de CMS 2 fois par jour est recommandée avec une dose supplémentaire de 1.5 MUI de CMS après chaque séance de HD.L'évaluation des performances de différents modèles PK/PD via à une approche par simulation a montré l'importance d'effectuer des études suffisamment longues ainsi que d'obtenir des données microbiologiques complémentaires afin de décrire le développement de la résistance bactérienne.Un modèle PK/PD incluant taux de mutation et résistance adaptative à la colistine d'une souche bioluminescente de Pseudomonas aeruginosa a été développé à partir de données in-vitro. Une résistance rapide, importante et partiellement réversible a été décrite. Ces résultats confirment l'importance des 24 premières heures dans le traitement des infections, que la colistine seule ne peut pas complètement éliminer les mutants de Pseudomonas aeruginosa et que des associations semblent nécessaires.

Antibiotics are among the most commonly prescribed drugs, however optimal dosages are not yet well defined. The aim of this thesis was to develop pharmacokinetic (PK) and pharmacokinetic-pharmacodynamics (PK/PD) models that characterize the course of antimicrobial drug concentrations and effects over time, with an emphasis on the development of resistance. These models were applied to optimize dosing regimens of antimicrobial therapies.A population PK model for colistin and its prodrug, colistin methanesulfonate (CMS) was developed in critically ill patients receiving colistin by nebulization and/or undergoing an intermittent hemodialysis (HD). Results predicted clear benefits of using aerosol delivery of 2MIU CMS dose for the treatment of pulmonary infections. For patients with HD session dosing regimen of CMS should be 1.5 MIU twice daily with an additional dose of 1.5 MIU after each HD session.An assessment of the performances of different PK-PD models by using a simulation approach have shown the importance of longer study designs and of complementary microbiological data to predict accurately bacterial resistance development. A semi-mechanistic PK/PD model that incorporates mutation rate and adaptive resistance development of a bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa against colistin wasdeveloped based on in-vitro data. A high, quick and partially reversible resistance was described. These results confirm that the first 24 h of treatment are critical in the management of infections, that colistin alone cannot eradicate completely the mutants of Pseudomonas aeruginosa that were selected during the experiments and that combination therapies seem necessary., Les antibiotiques sont actuellement parmi les médicaments les plus utilisés, mais les schémas thérapeutiques optimaux ne sont pas toujours bien définis. Le but de cette thèse était de développer des modèles pharmacocinétiques (PK) et pharmacodynamiques (PK/PD) décrivant les profils de concentrations des antibiotiques ainsi que leurs effets et le développement de résistances bactériennes afin d'optimiser les schémas thérapeutiques.Un modèle PK de population sur la colistine et sa prodrogue, le colistine methanesulfonate (CMS), a été développé chez les patients recevant la colistine par voie aérosol et/ou sous hémodialyse (HD). Les résultats ont montré un net avantage de la voie aérosol pour le traitement des infections pulmonaires avec une dose de 2 MUI de CMS. Pour les patients sous HD une dose de 1.5 MUI de CMS 2 fois par jour est recommandée avec une dose supplémentaire de 1.5 MUI de CMS après chaque séance de HD.L'évaluation des performances de différents modèles PK/PD via à une approche par simulation a montré l'importance d'effectuer des études suffisamment longues ainsi que d'obtenir des données microbiologiques complémentaires afin de décrire le développement de la résistance bactérienne.Un modèle PK/PD incluant taux de mutation et résistance adaptative à la colistine d'une souche bioluminescente de Pseudomonas aeruginosa a été développé à partir de données in-vitro. Une résistance rapide, importante et partiellement réversible a été décrite. Ces résultats confirment l'importance des 24 premières heures dans le traitement des infections, que la colistine seule ne peut pas complètement éliminer les mutants de Pseudomonas aeruginosa et que des associations semblent nécessaires.

La diarrhée post-sevrage est une maladie d’importance dans l’industrie porcine et est principalement causée Escherichia coli O149. Le traitement habituellement utilisé est la néomycine. Cependant, en raison de l’antibiorésistance, les vétérinaires se tournent vers la colistine sulfate (CS). La CS lie les lipopolysaccharides (LPS) et provoque un déplacement des cations divalents causant la formation de pores entrainant la mort cellulaire. Le système à deux composantes PmrA/PmrB est le plus incriminé dans la résistance à la colistine en ajoutant un groupement 4-amino-4-déoxy-L-arabinose (L-Ara4N) au lipide A des LPS, augmentant ainsi la charge du LPS et diminuant son affinité pour la CS. L’objectif principal est d’évaluer l’acquisition de la résistance à la CS d’E. coli in vitro et dans un modèle in vivo. Nous avons utilisé des souches associées à des cas cliniques d’E. coli O149 et avons créé 22 mutants résistants à la CS. La concentration minimale inhibitrice (CMI) a été mesurée par une méthode de double dilution et comparée au seuil de résistance. Suite au séquençage des gènes pmrA/pmrB, nous avons identifié sept nouveaux polymorphismes, trois dans PmrA : A80V, N128I, S144G et quatre dans PmrB : V87E, D148Y, D148V et T156M. Pour l’essai in vivo, nous avons suivi une souche expérimentale ETEC:F4 (E. coli O149) et isolé des E. coli de la flore commensale. Le séquençage des gènes pmrA et pmrB de ces isolats a montré un polymorphisme spécifique, G15R et T156M respectivement. Cependant, plusieurs souches récoltées possédaient une résistance à la CS, mais sans polymorphisme de PmrA/PmrB, suggérant d’autre(s) mécanisme(s) de résistance., Post-weaning diarrhea is an important swine disease in Québec mainly caused by Escherichia coli O149. The most frequent treatment used is neomycin, but due to antimicrobial resistance to this antibiotic, veterinarians often use colistin sulfate (CS). CS binds the lipopolysaccharides (LPS) and causes a displacement of divalent cations causing pore formation in the membrane, leading to cellular death. The two component system PmrA/PmrB is the most frequently associated with CS resistance in E. coli by adding à L-Ara4N group to the LPS, increasing its charge, reducing affinity for CS. The main objective of this study was to investigate the genetic polymorphism in pmrA/pmrB genes in E. coli strains acquired in vitro and in an infectious model of post-weaning diarrhea in piglets. For the in vitro assay, we used swine clinical E. coli strains resistant to neomycin isolated from 2008 to 2011. We created 22 mutants resistant to CS. MIC was determined by standard double dilution method and compared to the EUCAST breakpoint. By sequencing the genes pmrA and pmrB, we identified seven new genetic polymorphisms, 3 were in PmrA: A80V, N128I, S144G and 4 in pmrB gene: V87E, D148Y, D148V, T156M. For the in vivo assay, we followed the experimental infection ETEC:F4 E. coli strain and commensal E. coli isolates through a post-weaning infectious model. Sequencing of pmrA and pmrB showed two polymorphisms G15R and T156M, respectively. Many E. coli strains acquired in vitro and in vivo resistance to colistin without mutation in pmrA/pmrB suggesting other(s) mechanism(s) of resistance to this antibiotic.

Résumé Les bacilles à Gram négatif non fermentants sont des pathogènes opportunistes responsables essentiellement d'infections nosocomiales. Le traitement de ces infections est souvent difficile, de par leur résistance naturelle et acquise à de nombreux antibiotiques. Un total de 44 souches de bacilles à Gram négatif non fermentants (27 Acinetobacter baumannii et 17 Pseudomonas aeruginosa) ont été isolés à partir du service de réanimation au niveau du CHU de Tlemcen. L'étude de la résistance in vitro de ces germes aux antibiotiques a révélé que les souches d'Acinetobacter baumannii présentent des taux élevés de résistance vis-à-vis de la plupart des molécules testées: ceftazidime et ceftriaxone (100%), imipenème (92.59%), amikacine (85.18%), gentamycine (70.73%), tobramycine (18.51%), ciprofloxacine (92.59%), alors que les taux de résistance chez Pseudomonas aeruginosa étaient les suivants: céfopérazone (100%), cefsulodine (1 00%),imipénème (76.47%), ceftazidime (11.76%), ciprofloxacine (29.41%), gentamicine (23.52%), amikacine (0%). aucune souche résistante à la colistine n'a été isolée. Mots clés: bacilles à Gram négatif non fermentants, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, résistance, antibiotiques, colistine, réanimation. Abstract Non-fermentative Gram negative rods are opportunistic pathogens mainly responsible for nosocomial infections. Treatment of these infections is often difficuit, because of their natural and acquired resistance to many antibiotics. A total of 44 strains of Non-fermentative Gram negative rods (27 Acinetobacter baumannii and 17 Pseudomonas aeruginosa) were isolated from the intensive care unit at the university hospital of Tlemcen. The study in vitro of resistance of these organisms to antibiotics revealed that strains of Acinetobacter baumannii - have a high level resistance to molecules tested: ceftazidim and ceftriaxon (100%), imipenem (92.59%), amikacin (85.18%) gentamycin (70.73%), tobramycin (18.51%), ciprofloxacin (92.59%), The antibiotic resistance rates of Pseudomonas aeruginosa were: cefoperazon (100%), cefsulodin (100%),imipenem (76.47%), ceftazidim (11.76%), ciprofloxacin (29.41%), gentamicin (23 .52%), amikacin (0%). No colistin-resistant strain was isolated. Keywords: Non-fermentative Gram negative rods, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, resistance, antibiotics, colistin, intensive care unit.

Colistin is a cationic cyclic polypeptide antibiotic belonging to the polymyxin family and targeting bacterial membranes. It is produced by Paenibacillus polymyxa through a Nonribosomal Peptide Synthetase (NRPS) mechanism. In the context of cystic fibrosis (CF), colistin is used for the treatment of lung infections caused by multiresistant Gram-negative bacteria including Pseudomonas aeruginosa. Unfortunately, this molecule is also known for its strong side effects. So far, genetic systems controlling the production of polymyxins were little known. In this study we characterized by High-resolution LC-MS the antimicrobial molecules, including colistins, of a new Paenibacillus. A genomic library of this strain was constructed and screened to identify genes involved in the production of these antibiotics. A degenerated PCR screening was performed and allowed to select four clones in the genomic library. In silico study allowed to identify a new NRPS gene cluster responsible for the biosynthesis of colistin variants. In the future, this work might allow the harnessing of the production of colistin derived structures, more active and/or showing fewer side effects. In parallel, a second investigation was performed in order to find new NRPS genes in a collection of one hundred intertidal mudflat bacterial isolates. This work has allowed the identification of new sequences and the characterization of a new antimicrobial producing strain.; La colistine, antibiotique appartenant à la famille des polymyxines, est un polypeptide cyclique, cationique, ciblant les membranes bactériennes. Elle est produite par Paenibacillus polymyxa via des complexes multi-enzymatiques appelés Non-Ribosomal Peptides Synthétases (NRPS). Dans le cas de la mucoviscidose, et malgré des effets secondaires importants, la colistine est utilisée comme ultime recours pour lutter contre les bactéries Gram-négatives multirésistantes responsables d’infections pulmonaires dont Pseudomonas aeruginosa. Jusqu’ici les systèmes génétiques à l’origine de la production de la colistine étaient peu connus. Au cours de cette étude, nous avons caractérisé par LC-MS haute résolution des molécules antimicrobiennes, dont des colistines, produites par un nouveau Paenibacillus. Afin d’identifier et de cloner le cluster de gène responsable de la production de ces antibiotiques, une banque d’ADN génomique a été construite et criblée par homologie de séquence avec des systèmes de production déjà connus. Ce criblage a permis de sélectionner quatre clones d’intérêt. L’étude in silico de leurs séquences a permis d’identifier les différents modules d’un nouveau cluster NRPS qui serait à l’origine de la synthèse de variants de la colistine. À terme, cette découverte pourrait permettre de mieux contrôler la production de la colistine et d’obtenir des composés plus actifs et/ou présentant des effets secondaires amoindris. En parallèle à ce premier travail, nous avons également recherché la présence de nouvelles NRPS chez une centaine de micro-organismes issus d’une station d’étude environnementale du laboratoire (vasière intertidale). Ce travail a permis de découvrir des nouvelles séquences et d’isoler un nouveau micro-organisme producteur d’antibiotique(s).

Anatomical barriers for antibiotic penetration can pose a particular challenge in the clinical setting. Stenotrophomonas maltophilia (SM) and Pseudomonas aeruginosa (PA) are two pathogens capable of developing multiple drug-resistance (MDR) mechanisms. We report the case of a 56-year-old female patient with a permanent percutaneous transhepatic biliary drainage (PTBD), who was admitted to our hospital with a cholangitis due to a MDR Escherichia coli strain. Upon admission, culture-guided antimicrobial therapy was conducted and the biliary catheter was replaced, with poor clinical response. Subsequently, SM and PA were detected. Treatment with fosfomycin and colistine was initiated, again without adequate response. Systemic colistine and tigecycline along with an intrabiliary infusion of colistine for 5 days was then used, followed by parenteral fosfomycin and tigecycline for 7 days. The patient was then successfully discharged. This is the first case report we are aware of on the use of intrabiliary colistine. It describes a new approach to treating cholangitis by MDR bacteria in patients with a PTBD.

Antibiotics are pollutants present in aquatic ecosystems ultimate receptacles of anthropogenic substances. These compounds are studied as their persistence in the environment or their effects on natural organisms. Numerous efforts have been made worldwide to assess the environmental quality of different water resources for the survival of aquatic species, but also for human consumption and health risk related. Towards goal, the optimization of analytical techniques for these compounds in aquatic systems remains a necessity. Our objective is to develop extraction and detection methods for 12 molecules of aminoglycosides and colistin in sewage treatment plants and hospitals waters. The lack of analytical methods for analysis of these compounds and the deficiency of studies for their detection in water is the reason for their study. Solid Phase Extraction (SPE) in classic mode (offline) or online followed by Liquid Chromatography analysis coupled with Mass Spectrometry (LC/MS/ MS) is the most method commonly used for this type of analysis. The parameters are optimized and validated to ensure the best conditions for the environmental analysis. This technique was applied to real samples of wastewater treatment plants in Bordeaux and Lebanon.; Les antibiotiques sont des polluants présents dans les écosystèmes aquatiques, réceptacles ultimes des substances anthropiques. L’étude de ces composés porte sur leur rémanence dans le milieu ou leurs effets sur des organismes naturels. De nombreux efforts ont été faits à l’échelle mondiale pour l’évaluation de la qualité environnementale des différentes ressources en eau pour la survie des espèces aquatiques mais aussi pour la consommation humaine et le risque sanitaire lié. Dans ce but, l’optimisation des techniques analytiques pour ces composés dans les systèmes aquatiques demeure une nécessité. Notre objectif est de développer des méthodes d’extraction et de détection pour 12 molécules appartenant à la famille des aminoglycosides et de la colistine dans les eaux des stations d’épuration et les eaux hospitalières. L’absence des méthodes d’analyse pour ces composés ainsi que le manque des études permettant leur détection dans l’eau sont les raisons de leur étude. L’Extraction sur Phase Solide (SPE) en mode classique (hors ligne) ou en ligne, suivie d’une analyse par la Chromatographie Liquide couplée à la Spectrométrie de Masse (LC/MS/MS) est la méthode la plus couramment employée pour ce type d’analyse. Les paramètres sont optimisés et validés afin d’assurer les meilleures conditions utilisées dans les analyses environnementales. Cette technique a été appliquée sur des échantillons réels des eaux des stations d’épuration à Bordeaux et au Liban.

We tested the susceptibility to colistin of Escherichia coli indicator strains isolated from the faecal content of pigs of various ages housed in commercial French farrow-to-finish herds. This antimicrobial had been administered to piglets during the lactating period and more frequently after weaning in most of the selected farms (13 out of 16). Twenty-three strains (22 from young pigs) out of the 4333 tested were classified as resistant by disk diffusion method and confirmed by MIC determination (4 to 16 μg/ml). Our results indicate that disk diffusion method can be a valuable method for the assessment of colistin resistance and illustrate the infrequent occurrence of resistance to this antimicrobial., Des souches d’Escherichia coli sentinelles ont été isolées de matières fécales de porcs présents dans des élevages naisseurs-engraisseurs conventionnés situés en France. Les souches ont été sélectionnées pour leur sensibilité à la colistine. Dans la plupart des élevages de l’étude (13 sur 16) la colistine était administrée aux porcelets en maternité et plus fréquemment en post-sevrage. Parmi les 4333 souches testées, 23 souches (dont 22 isolées de porcelets) ont été classées résistantes par la méthode de l’antibiogramme standard et leur résistance a été confirmée par détermination de la CMI (de 4 à 16 μg/ml). Ces résultats indiquent que la méthode de l’antibiogramme standard est utilisable pour l’évaluation de la résistance à la colistine. De plus, il apparaît que l’apparition de souches résistantes à la colistine en contexte d’utilisation est peu fréquente.