Search

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias. Especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas African swine fever virus (ASFV) is a nucleo-cytoplasmic large DNA arbovirus and the single member of the family Asfarviridae. It infects soft ticks of the genus Ornithodoros as well as all members of the family Suidae, representing a global threat for pig husbandry for which there is currently no effective vaccine or treatment. Since the ASFV viral cycle is mainly cytoplasmic, it has been found/predicted to code for many components of the replicative and transcriptional machineries. Of these, and based in sequence homologies, a putative type II DNA topoisomerase-coding ORF (P1192R) was identified in the ASFV genome. DNA topoisomerases are enzymes that modulate the topological state of DNA molecules. They are ubiquitous and essential, participating in processes such as DNA replication, recombination and repair and also in transcription. Since ASFV has a large linear genome, with 170 to 190 kbp depending on the isolate, containing terminal inverted repeats and covalently closed ends, a type II topoisomerase may be indispensable for viral replication and/or transcriptional events. The main objectives of this work were to deepen the study on ORF P1192R and determine if it indeed codes for a type II DNA topoisomerase and, if so, to characterize its activity. Bioinformatics and phylogenetic analyses showed that ORF P1192R is highly conserved among the fourteen ASFV isolates analyzed and, although its amino acid sequence clearly diverges from other type II topoisomerases, the structural organization is preserved and conserved motifs and domains essential for activity are present. Transient expression of GFP-pP1192R in COS-7 cells revealed an exclusively cytoplasmic distribution of the protein, which remained unaltered by treatment with leptomycin B. Using Vero cells or swine macrophages infected with ASFV isolate Ba71V or L60, respectively, expression of pP1192R was observed in the late phase of infection, co-localizing with the viral factories, where the bulk of viral replication and transcription occurs. Heterologous expression of pP1192R in Saccharomyces cerevisiae demonstrated that it functionally complements a top2 thermo-sensitive mutation and that it exhibits ATP-dependent decatenation activity. The purified recombinant pP1192R was found to efficiently decatenate kDNA and to processively relax supercoiled plasmid DNA, which are characteristics of a type II topoisomerase. The optimal requirements in terms of pH, temperature and salt, divalent ions and ATP concentrations for pP1192R activity in vitro were determined and its sensitivity to a panel of topoisomerase poisons and inhibitors was tested. Our results indicate that P1192R may be a target for studying, and possibly controlling, ASFV transcription and replication. RESUMO - O vírus da peste suína africana (VPSA) é um arbovírus icosaédrico núcleo-citoplasmático de DNA de cadeia dupla, classificado no género Asfivirus da família Asfarviridae, da qual é o único membro conhecido. Este vírus infecta carraças do género Ornithodoros assim como todos os membros da família Suidae, constituindo uma ameaça global para a suinicultura para a qual não existe actualmente qualquer vacina ou tratamento. A prevenção da peste suína africana é feita através de medidas que visam reduzir o risco de introdução de animais ou produtos de origem animal infectados em regiões livres da doença, enquanto o controlo de um surto se baseia exclusivamente em medidas que incluem o abate sanitário de todos os animais susceptíveis na área do foco e a proibição de movimentos e comercialização de animais. Embora o VPSA tenha sido inicialmente descrito como um vírus com replicação exclusivamente citoplasmática, actualmente sabe-se que o núcleo da célula hospedeira é indispensável na fase inicial da infecção. Contudo, a grande maioria do ciclo infeccioso ocorre no citoplasma da célula infectada, não sendo por isso surpreendente que, das 150 a 167 grelhas de leitura aberta (ORF, do inglês “open reading frame”) identificadas no genoma do VPSA, algumas codifiquem para componentes das maquinarias de replicação e de transcrição. Dentre estas, prevê-se, com base em homologia de sequências aminoacídicas, que a ORF P1192R codifique para uma topoisomerase de DNA do tipo II. As topoisomerases de DNA estão presentes em todas as células e são responsáveis pela modulação do estado topológico do DNA, estado esse que se altera durante processos como a replicação, a recombinação e a reparação do DNA, assim como a transcrição, e dos quais resultam torções das moléculas de DNA que, não sendo resolvidas, podem comprometer a integridade genómica e consequentemente a viabilidade celular. Todas as topoisomerases exercem a sua actividade através da criação de quebras no DNA devido ao ataque nucleofílico de um resíduo de tirosina catalítico ao esqueleto fosfodiéster da molécula de DNA, gerandose assim uma ligação fosfotirosina covalente. As topoisomerases são classificadas em dois tipos, tendo por base a forma como quebram a molécula de DNA: as topoisomerases do tipo I, cuja actividade é independente de ATP e que geram quebras em cadeia única no DNA, facilitando assim o desenrolamento; e as topoisomerases do tipo II, que necessitam de ATP para gerar uma quebra nas duas cadeias do DNA, através da qual fazem passar uma dupla cadeia intacta. Considerando que o VPSA tem um genoma linear de grandes dimensões, com 170 a 190 quilopares de bases dependendo do isolado, e que contém repetições terminais invertidas fechadas covalentemente, uma topoisomerase do tipo II pode efectivamente ser essencial para eventos de replicação e/ou transcrição virais. Os objectivos centrais deste trabalho foram os seguintes: (i) realização de um estudo bioinformático e filogenético aprofundado da ORF P1192R do VPSA; (ii) estudo da proteína codificada por esta ORF (pP1192R), através da sua clonagem, expressão em sistema heterólogo, purificação da proteína recombinante e caracterização in vitro da sua actividade; (iii) determinação do efeito sobre a actividade da proteína recombinante dum painel de compostos químicos descritos como sendo inibidores de topoisomerases; (iv) identificação dos níveis de expressão e da localização intracelular da pP1192R em células infectadas pelo VPSA, a diferentes tempos de infecção; (v) avaliação do efeito de mutações dirigidas em resíduos ou motivos identificados como reguladores da actividade enzimática ou localização subcelular da pP1192R, tendo por base a informação gerada nos estudos bioinformáticos acima mencionados. A ORF P1192R do isolado L60 do VPSA foi amplificada por PCR e clonada e a sua sequência nucleotídica foi determinada e utilizada em análises bioinformáticas e filogenéticas. Verificou-se que esta ORF é altamente conservada entre os catorze isolados do VPSA cujo genoma se encontrava disponível nas bases de dados e, embora a sua sequência aminoacídica seja claramente divergente das de outras topoisomerases do tipo II incluídas neste estudo, quer sejam elas de origem procariota, eucariota ou viral, a organização estrutural da proteína está preservada e estão presentes motivos e domínios conservados que são essenciais para a actividade enzimática. O estudo da localização celular da pP1192R iniciou-se com a construção de plasmídeos quiméricos para a expressão da pP1192R em fusão com a proteína verde fluorescente (GFP) ou com uma variante vermelha (RFP). Transfectaram-se transientemente células de linha COS-7 com estas construções tendo-se observado que a proteína de fusão se distribuía exclusivamente pelo citoplasma. Esta distribuição não foi alterada após tratamento com leptomicina B que bloqueia uma das vias de exportação de proteínas do núcleo. Já a infecção das células a expressarem GFP-pP1192R com um isolado do VPSA adaptado a células Vero (Ba71V) induziu uma redistribuição da proteína de fusão, deixando de estar homogeneamente distribuída pelo citoplasma para estar principalmente concentrada nas fábricas virais a partir das 8 horas pós-infecção. Utilizando células de linha Vero infectadas com o isolado Ba71V, utilizado como modelo de infecção, ou macrófagos derivados de monócitos de sangue periférico de suíno (células alvo do vírus na infecção natural) infectados com o isolado virulento L60, e utilizando um soro anti-pP1192R produzido no decurso destes trabalhos, foi possível constatar que a pP1192R viral é produzida na fase intermédia/tardia da infecção (observável a partir das 6/8 horas pós-infecção) e que acumula nas fábricas virais ao longo da infecção. A expressão em sistema heterólogo da pP1192R iniciou-se num sistema procariota, baseado em Escherichia coli, mas embora tenha sido possível obter proteína recombinante em grandes quantidades, a sua purificação só foi conseguida recorrendo a agentes desnaturantes, impedindo a obtenção de proteína activa. Assim, avançou-se para um novo sistema de expressão baseado na levedura Pichia pastoris que apresenta diversas vantagens sobre o anterior, nomeadamente o facto de ser um sistema eucariota e por isso mais semelhante ao contexto em que a pP1192R é expressa em condições naturais. Contudo, neste sistema não foi possível obter proteína recombinante e o sistema foi abandonado. Tentou-se por fim a expressão heteróloga na levedura Saccharomyces cerevisiae. Neste organismo, a utilização das estirpes JCW26 e SD117 que contêm uma mutação termo-sensível no gene que codifica para a topoisomerase do tipo II endógena, permitiu demonstrar, quer in vivo através da complementação da mutação termo-sensível, quer in vitro recorrendo a ensaios funcionais de decatenação, que a pP1192R é efectivamente uma topoisomerase do tipo II funcional. Utilizando ainda S. cerevisiae como sistema de expressão, foi possível obter e purificar pP1192R recombinante para caracterização da sua actividade em ensaios funcionais in vitro. Observou-se que a pP1192R é capaz de relaxar DNA superenrolado, de decatenar DNA catenado e, quando em elevadas concentrações, de catenar DNA plasmídico, não tendo sido detectada actividade de superenrolamento de DNA relaxado. Determinaram-se também as condições óptimas de funcionamento em termos de temperatura, pH e concentrações de sal (NaCl ou KCl), ATP ou iões divalentes (Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+ e Ca2+), que foram posteriormente utilizadas para avaliar a sensibilidade da pP1192R recombinante a um painel de inibidores de topoisomerases, entre os quais se incluem drogas frequentemente utilizadas como agentes antimicrobianos ou antitumorais. Dos compostos testados, aqueles para os quais foram obtidos resultados mais promissores, i.e., os que revelaram níveis de inibição mais elevados, foram a coumermicina A1, a doxorubicina, a amsacrina e a genisteína. Pelo contrário, as quinolonas, normalmente utilizadas como antibióticos visando infecções provocadas por organismos procariotas, foram dos compostos com menor eficácia. Em suma, os resultados deste trabalho indicam que a ORF P1192R é um alvo promissor para o estudo e, eventualmente, o controlo dos processos replicativos e transcricionais do vírus da peste suína africana.

A temática deste trabalho consiste na Concepção de uma Central Logística de Distribuição de Hortícolas Refrigerados, pelo que se optou por fazer o projecto de uma Central de Produção e Distribuição de Saladas. Este trabalho começará com uma introdução onde se fará a apresentação do projecto bem como os seus principais objectivos. Posteriormente, será feita uma pequena abordagem sobre a microbiologia dos produtos, onde se fará referência às alterações que podem ocorrer nos mesmos, à origem dessas alterações e à influência da temperatura, da humidade e do oxigénio nos produtos perecíveis. De seguida, apresenta-se a memória descritiva do projecto propriamente dito. Nesta descreve-se todo o projecto, começando pelo objectivo do mesmo, pela descrição do edifício e pela explicação do processo tecnológico. Posteriormente referem-se as matérias-primas, a capacidade de produção e as características dos produtos acabados, passando de seguida para o dimensionamento das instalações. Após o dimensionamento das instalações serão realizados os balanços térmicos, a partir dos quais as instalações frigoríficas e de climatização serão dimensionadas. De seguida, far-se-á a caracterização da instalação relativamente à produção de efluentes (gasosos, líquidos ou sólidos), ao abastecimento de água, à rede de esgotos, entre outros. Na parte final da memória descritiva, irá, ainda ser feita, referência às regras higio–sanitárias e técnico–funcionais a que a unidade industrial está sujeita.

O futebol é, sem dúvida, um fenómeno omnipresente na vida portuguesa. Pode mesmo falar-se de «futebolização» da sociedade portuguesa, mas, paradoxalmente, a profunda centralidade social do futebol em Portugal coexiste com uma realidade oposta: os níveis de assistência aos jogos «ao vivo» surpreendentemente baixos. Neste artigo destacam-se e analisam-se algumas das particularidades da formação social do futebol em Portugal, exactamente a partir daquelas realidades aparentemente paradoxais. Debruçando-se sobre dados acerca das assistências nos estádios desde os anos 1980, os autores desenvolvem seis factores/argumentos que poderão ajudar a explicar este paradoxo do jogo português, concluindo que as duas realidades em questão não são completamente contraditórias e que, em certa medida, acabam por se determinar mutuamente. Le football est, sans nul doute, un phénomène omniprésent dans la dimension publique (mais aussi privée) de la vie portugaise. On peut même parler de la «footballisation» de la société portugaise, et nombreux sont les critiques de l’hégémonie culturelle du football et de ses rapports étroits avec la politique. Paradoxalement, cette profonde popularité et cette centralité sociale du football au Portugal coexistent avec une réalité contraire: les niveaux d’assistance au jeux «sur place» sont étonnamment faibles. L’article souligne et analyse quelques particularités de la formation sociale du football au Portugal, justement à partir de ces réalités apparemment paradoxales. Se penchant sur les données disponibles en matière d’assistance dans les stades portugais au cours des trois dernières décennies, mais en se référant toujours aux contextes historiques respectifs, les auteurs indiquent et développent six facteurs/arguments qui pourraient aider à expliquer ce paradoxe du jeu portugais. Ils concluent que les deux réalités concernées ne sont pas entièrement contradictoires et que, dans une certaine mesure, elles finissent par se déterminer mutuellement. Without doubt, football is omnipresent in the Portuguese public (and private) sphere. Some speak about the «footballizaton» of Portuguese society, 658 and criticise the hegemony of football in Portuguese culture, along with it the close (and sometimes dangerous) connections between football and politics. What is so interesting about this phenomenon is that it is juxtaposed with other facts, such as stadium attendance, being surprisingly low. The article brings to the forefront the particularities of the Portuguese football social formation case by taking these two current realities as a point of departure. In analysing stadium attendance over three decades against specific historical backgrounds, the authors present six different factors which explain the paradox and come to the conclusion that both realities are not contradictory - but partly determining each other.