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Objective. Systemic sclerosis (SSc) is a complex autoimmune disease in which interferons (IFNs) may play an essential role. We hypothesized that type I and III IFNs may be found in increased levels in patients and be responsible for SSc autoimmune status. Methods. Type I and III IFN and ISG basal expression profiles were measured by qPCR using RNA from PBMCs of patients and controls . Results. Type I IFNs are increased in SSc patients, while no induction of type III IFNs was detected. This induction cannot be related to IRF7, since no upregulation of this gene was seen on patients. Of the ISGs tested, 2′5′OAS levels were increased in patients, while 6–16 and MxA levels were not. Conclusions. While there is no indication of type III IFN induction, increased levels of type I IFNs may lead to abnormal regulation of ISGs that can be responsible for immune system alterations described for SSc.

Seven MboI fragments spanning the mitochondrial apocytochrome b gene in Saccharomyces cerevisiae strain D273-10B were cloned in the BamHI site of the integrative yeast vector YIp5 and the capacity for autonomous replication was subsequently assayed in yeast. The positive correlation found between the ars-like activity in four fragments and the presence of regions common to multiple ethidium bromide-induced petite (rho-) genomes suggests that the mitochondrial sequences possibly active as origins of replication in low-complexity neutral or weakly suppressive rho- mutants could be functionally related to the yeast nuclear replicator 11 nucleotide motif defined by Broach et al. (1983).

Após o isolamento do mimivírus, vários outros vírus tão ou mais complexos foram identificados, apresentando diferenças notáveis em relação a estrutura, genoma, ciclos de multiplicação e, consequentemente, interação com seus hospedeiros. Recentemente, um amplo trabalho de prospecção viral, a partir de amostras de diversos ambientes, foi realizado pelo nosso grupo de pesquisa, possibilitando o isolamento de dois novos vírus, tupanvirus soda lake e cedratvirus getuliensis. A caracterização inicial do tupanvírus evidenciou uma curiosa interação determinada pelo shutdown do RNA ribossomal em células hospedeiras e não hospedeiras, quando inoculadas com tupanvírus. Já a descoberta do cedratvirus getuliensis representou o isolamento do terceiro cedratvírus no mundo, revelando a ascensão de um novo grupo viral e evidenciando o nosso ainda limitado conhecimento acerca da biologia desses vírus. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo analisar as interações entre esses vírus e protozoários a partir da caracterização do shutdown e da presença de sequências ribossomais em tupanvirus soda lake, assim como da descrição do ciclo de multiplicação do cedratvirus getuliensis. Com o intuito de elucidar se o canônico processo de ribofagia/autofagia estaria relacionado à degradação ribossomal promovida pelo tupanvírus, alguns experimentos foram conduzidos. O tratamento de A. castellanii com cloroquina e bafilomicina A, assim como o silenciamento do gene Atg8, não preveniram a ocorrência do shutdown. Ademais, foi possível observar que a infecção por tupanvírus induz uma notável acidificação do citoplasma de amebas, assim como uma progressiva degradação do núcleo/nucléolo temporalmente associada ao shutdown. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão também revelaram a presença de pequenas vesículas, em sua maioria com uma única membrana, contendo ribossomos, próximas ao núcleo. Essas vesículas, posteriormente, se agregam formando grandes estruturas que são depletadas do citoplasma no mesmo tempo que o shutdown pode ser detectado. Em conjunto, esses dados sugerem que o shutdown não é diretamente relacionado ao processo de ribofagia. Além disso, embora a formação de vesículas contendo ribossomos e a degradação do nucléolo possam estar relacionadas a ocorrência desse fenômeno, os mecanismos envolvidos no shutdown ainda precisam ser melhor investigado. Em paralelo aos experimentos da caracterização do shutdown, investigações sobre a presença de sequências ribossomais presentes no genoma do tupanvírus também foram conduzidas. Nossas análises revelaram a presença de duas cópias similares a partes de regiões intrônicas de 18S, mais especificamente a íntrons self-splicing do grupo I, no genoma de tupanvírus. Sequências similares também foram encontradas nos genomas de outros mimivírus, embora nunca antes descritas. A análise filogenética dessas duas cópias evidenciou que elas apresentam origens separadas, e, apesar de estarem localizadas em regiões intergênicas, são altamente expressas durante o ciclo de multiplicação. No entanto, a real função dessas cópias nos genomas virais ainda é obscura. A outra seção dessa tese foi destinada ao estudo aprofundado do ciclo de multiplicação do cedratvirus getuliensis. Inicialmente, o uso de diferentes inibidores de endocitose demonstraram que a penetração desses vírus em A. castellanii ocorre principalmente por fagocitose. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão evidenciaram que, em seguida, ocorre a formação de uma fábrica viral elétron-lucente perinuclear, no interior da qual ocorre a morfogênese de cedratvirus getuliensis envolvendo estruturas subsequentes, complexas e elétron-densas. Além disso, alterações celulares, como recrutamento de mitocôndrias, polarização de lisossomos e intenso tráfego de membranas também foram observadas ao longo da multiplicação de cedratvirus getuliensis. O final do ciclo de multiplicação foi marcado pela liberação da progênie viral principalmente pela lise celular, mas também por exocitose. Os dados aqui apresentados revelaram características peculiares de ambos os isolados virais e contribuíram para um melhor entendimento das relações entre esse vírus e seus hospedeiros Following the isolation of mimivirus, many other viruses as or more complex than APMV were identified, revealing notable differences related to structure, genome, replication cycle, and, consequently, host interactions. Recently, a extensive work of viral prospection using samples from diverse environments was performed by our research team, enabling the isolation of two new viruses, tupanvirus soda lake and Cedratvirus getuliensis. The initial characterization of tupanvirus showed a curious relationship determined by the ribosomal shutdown of host and non-host cells when inoculated with tupanvirus. Also remarkably, the discovery of cedratvirus getuliensis has represented the isolation of the third cedratvirus in the whole world, revealing the ascension of a new viral group and evidencing our limited knowledge about the biology of these viruses. Faced with this, the main goal of this thesis was to analyze the protozoan-viruses interactions based on the ribosomal RNA shutdown characterization and the presence of ribosomal sequences in tupanvirus soda lake, as well as the description of cedratvirus getuliensis replication cycle. Initially, to elucidate whether the canonical process of ribophagy/autophagy would be related with the observed ribosomal degradation promoted by tupanvirus, some experiments were conducted. The obtained results showed that the A. castellanii treatment with chloroquine and bafilomycin A, as well as the Atg8 gene silencing do not prevent the occurrence of tupanvirus induced shutdown in A. castellanii cells. Moreover, it was possible observe that the tupanvirus soda lake infection induces a remarkable acidification of amoebas cytoplasm and as a progressive degradation of the nucleus/nucleoli that was temporally associated with shutdown. Transmission electron microscopy also revealed the presence of small vesicles, in majority composed of just one membrane, containing ribosomes next to nuclear membrane. These vesicles, posteriorly, suffer aggregation and constitute growing structures that were depleted from the cytoplasm at the same time that shutdown could be detected. Taken together, these data suggest that the shutdown is not directly related to the ribophagy. Moreover, although the formation of vesicles containing ribosomes and the degradation of the nucleolus may be related to the occurrence of this phenomenon, the mechanism involved in the ribosomal degradation still need to be further investigated. In parallel to the experiments developed on the characterization of the ribosomal RNA shutdown, the presence of ribosomal sequences in tupanvirus were also investigated. Our analyzes revealed the presence of two copies that presented similarity with parts of 18S intronic regions, more specifically to group I self-splicing introns, in the genome of tupanvirus. Similar copies were also found in genomes of other mimiviruses, although never reported before. The phylogenetic analyzes of these two copies present evidenced that they had separated origins and, although they are located in intergenic regions, they are highly expressed during the replication cycle. However, the possible role of these copies in viral genomes still unclear. The other section of this thesis was devoted to the in-depth study of cedratvirus getuliensis replication cycle. Initially, the use of different endocytosis inhibitors evidenced that the entry of these viruses into A. castellanii occurs mainly by phagocytosis. Transmission electron microscopy images showed the formation of a perinuclear electronlucent viral factory. Inside and on the periphery of this structure occurs the morphogenesis that involved subsequent, complex and electron-dense structures. In addition, cellular alterations, such as mitochondria recruitment, lysosomes polarization, and intense membrane traffic were also observed along the replication of cedratvirus getuliensis. The end of the replication cycle was marked by the release of viral progeny mainly by cells lysis, but also by exocytosis. These data presented here revealed peculiar characteristics of both viral isolates and contribute to a better understanding about the host-virus interactions

O vírus Ebola (EBOV) é um vírus envelopado, filamentoso, e que contém um genoma de RNA de fita negativa. O EBOV pertence à família Filoviridae, e é causador de uma doença devastadora, com uma taxa de mortalidade de cerca de 50-90%. Os primeiros sintomas desenvolvidos por pacientes infectados são febre, mal-estar e dor muscular e podem ser seguidos por sangramento e falha de órgãos e tecidos. Os alvos iniciais do Ebola são macrófagos e células dendríticas, mas sua capacidade de infecção abrange todos os tipos de células, com exceção de linfócitos. O Ebola conecta-se através da membrana plasmática e, depois disso, a glicoproteína viral induz a absorção por endocitose. O processo é dependente da ação das proteínas da superfície celular. Após a absorção, as partículas viajam em compartimentos onde a glicoproteína viral é clivada e fundida na membrana endossomal, o que resulta na liberação dos compartimentos virais no citoplasma do hospedeiro. Foi feito o estudo do mecanismo de infecção do EBOV e a coleta das proteínas hospedeiras conhecidas até o momento, por participar diretamente ou indiretamente na infecção. Esta abordagem de mineração recrutou 133 proteínas hospedeiras. Com elas, foi construído uma via completa do interatoma para representar o ciclo de infecção do Ebola nos hospedeiros. Foi feita a análise também dos homólogos de cada proteína humana coletada ao longo da árvore taxonômica, para inferir seu clado/época de origem. Os resultados da análise de origem evolutiva permitiram inferir que o vírus poderia infectar desde Euleostomi, sugerindo que animais como peixes e pets poderiam ser infectados e retransmitir o vírus para outros hospedeiros, como o homem. Além disso, analisamos duas séries de dados GEO para expressão gênica após a infecção pelo Ebola, através do enriquecimento pelo KEGG, criando um perfil de infecção viral. Inicialmente, processos envolvendo controle celular e metabolismo foram enriquecidos, seguidos de vários outros processos de imortalização e supressão do sistema imune. Em conclusão, a infecção pelo Ebola ocorre com a interação com proteínas antigas na membrana e internas, algumas porém são mais novas. A construção da via possibilita a criação de um estudo sistemático a infecção do vírus e quais seriam os possíveis alvos terapêuticos. Ebola virus (EBOV) is an enveloped, filamentous virus that contains a negativestranded RNA genome. EBOV belongs to the Filoviridae family, and causes a devastating disease, with a mortality rate of about 50-90%. The first symptoms developed by infected patients are fever, malaise and muscle pain and can be followed by bleeding and failure of organs and tissues. The initial targets of Ebola are macrophages and dendritic cells, but their ability to infect all types of cells, with the exception of lymphocytes. Ebola connects through the plasma membrane and, thereafter, a viral glycoprotein induces uptake by endocytosis. The process is dependent on the action of the proteins of the cell life. After absorption, as particles travel in compartments where a viral glycoprotein is cleaved and fused to the endosomal membrane, which results in the release of viral compartments without host cytoplasm. The study of the mechanism of infection of the EBOV and a collection of the hosted proteins was carried out, by participating directly or indirectly in the infection. This mining approach recruited 133 host proteins. With them, a complete interactive route was constructed to represent the Ebola infection cycle in hosts. An analysis was also made of the homologues of each human protein collected along the taxonomic tree to infer its clade/epoch the origin. The results of the analysis of evolutionary origin have allowed inferring that the virus can infect from Euleostomi, suggesting that animals such as fish and pets might be infected and retransmit the virus to other hosts, such as man. In addition, we analyzed two datasets, through KEGG enrichment, creating a profile of viral infection. Initially, processes involving cellular control and metabolism were enriched, followed by several other processes of immortalization and suppression of the immune system. In conclusion, an Ebola infection occurs with an interaction with old membrane and internal proteins, some still are younger. The construction of the pathway allows the creation of a systematic study of virus infection and what the possible therapeutic targets might be.

A multiplicação viral eficiente resulta de uma complexa rede de interações vírus - célula hospedeira, que gera um ambiente intracelular propício a geração e disseminação da progênie viral. Interferir em vias de sinalização relacionadas à dinâmica do citoesqueleto é uma estratégia comum empregada pelos vírus para atingir esse propósito. O Orthopoxvirus Vaccinia (VACV), membro protótipo da família Poxviridae, interage de forma complexa com o citoesqueleto de actina e de microtúbulos de suas células hospedeiras durante seu ciclo de multiplicação viral, sendo esta manipulação essencial para garantir a eficiência da penetração, montagem, transporte e disseminação viral. Neste trabalho tivemos como objetivo investigar o papel desempenhado pela serina/treonina cinase PAK1 (p21-activated kinase 1) na infecção pelo VACV. Para isso, fibroblastos embrionários murinos (MEFs) derivados de camundongos selvagens (WT) ou nocautes (PAK1-/-) para PAK1, foram infectados com VACV por diferentes períodos de tempo. Verificou-se, através de ensaios de transferência de Western e microscopia de fluorescência, que PAK1 não está criticamente envolvida em etapas precoces do ciclo de multiplicação do VACV, sendo que a necessidade de PAK1 para a penetração do VACV por macropinocitose, previamente descrita (Science, 320:531, 2008), não interfere com a produção viral. Apesar disso, observamos que a ausência de PAK1 provoca uma grande redução no tamanho da placa viral, e que infecções a baixa MOI resultam em uma produção significativamente menor (~ 90%), tanto de IMVs, quanto de EEVs, indicando que a disseminação viral está sendo de alguma forma prejudicada. Marcação fluorescente do citoesqueleto de actina e microscopia eletrônica de varredura mostraram uma redução no número de caudas de actina induzidas pelo VACV em MEFs PAK1-/- sem haver, no entanto, alteração da quantidade de CEVs expostos na superfície celular. Além disso, experimentos de microscopia confocal revelaram que a ausência de PAK1 não impede o recrutamento do complexo ARP2/3 para os sítios de polimerização de actina subjacentes aos CEVs, e que em células WT, a forma ativa de PAK1 (P-PAK1 Thr 423) colocaliza com CEVs e caudas de actina. Assim, os resultados obtidos permitem concluir que PAK1 desempenha um papel na disseminação viral, sendo um constituinte celular importante para garantir a eficiência desse processo. An efficient virus multiplication cycle results from a complex network of virus-host interactions culminating with a propitious intracellular environment for the generation and spread of virus progeny. Interfering with signaling pathways related to cytoskeleton dynamics is a common strategy employed by viruses to achieve this purpose. The Orthopoxvirus Vaccinia (VACV), the prototypic member of Poxviridae family, interacts in a complex way with both actin and microtubules cytoskeleton of their host cells during the whole replication cycle, and this manipulation is essential to assure the efficiency of viral entry, assembly, transport and dissemination. In the present study we investigated the possible involvement of serine/threonine kinase PAK1 (p21-activated kinase 1) upon VACV infection. To that end, mouse embryo fibroblasts (MEFs) derived from wild-type (WT) and PAK1-null (PAK1-/-) mice were infected with VACV at different times. We showed, through Western blotting assay and fluorescence microscopy, that PAK1 is not critically involved in the early steps of VACV cycle, and the need of PAK1 to VACV entry by macropinocytosis, previously described (Science, 320:531, 2008), does not affect the production of intracellular mature virus (IMVs). Although, we found that the absence of PAK1 led to a severe reduction in plaque phenotype and infections of MEFs PAK1-/- carried out at low-multiplicity were followed by a greatly reduced production (~90%) of both IMV and extracellular enveloped virus (EEV), indicating that virus spread was drastically impaired. Immunofluorescent staining of actin cytoskeleton and scanning electron microscopy showed a reduction in the number of VACV-induced actin tails in MEFs PAK1-/-, without alteration in the amount of cell-associated enveloped virus (CEVs). Furthermore, confocal microscopy of MEFs PAK1+/+ infected with VACV reveled a colocalization of P-PAK1 with actin tails tips as well as CEVs (B5R) particles. Indeed, these results show that PAK1 plays a role in actin-based motility of VACV, being an important cellular constituent to assure the efficiency of viral dissemination.

Os Orthopoxvirus Vaccinia (VACV) e Cowpox (CPXV) pertencem à família Poxviridae, que compreende os maiores e mais complexos vírus animais de DNA, que se replicam exclusivamente no citoplasma de células hospedeiras. Apesar do gênero Orthopoxvirus ser o mais estudado da família, pouco ainda se sabe sobre as interações CPXV-células do hospedeiro. Uma vez que essas interações desempenham importante papel na biologia viral, o Grupo de Transdução de Sinal do Laboratório de Vírus (ICB-UFMG) vem estudando, ao longo dos últimos anos, a ativação de proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPKs) em resposta à infecção pelos Orthopoxvirus. Nosso grupo demonstrou previamente que estes Orthopoxvirus ativam as proteínas quinases ERK e JNK culminando com a fosforilação e conseqüente ativação do fator de transcricional c-Jun, um substrato comum de ambas as vias. Entretanto, as MAPKs JNK1/2 não são necessárias para a multiplicação desses vírus, apesar de serem importantes da disseminação do VACV. Sabendo que a produção de citocinas pode ser regulada pela via de JNK durante a infecção por diversos vírus, nós decidimos investigar o papel das MAPKs JNK1/2 na expressão de citocinas pró-inflamatórias após a infecção pelos vírus VACV e CPXV. Primeiramente, através de PCR em tempo real e ELISA, nós demonstramos que a infecção pelo CPXV leva a uma maior indução da expressão e secreção da citocina IL-6, em comparação com o VACV, em células selvagens e nocautes para JNK1/2. Também mostramos que há um aumento significativo da expressão do mRNA de IL-6 nas células KO em relação às WT após a infecção pelo CPXV, principalmente no tempo de 12 hpi. Esse resultado também foi observado em macrófagos de camundongos, através do tratamento com o inibidor farmacológico JNK inh. VIII. Utilizando células dominante negativa para o fator transcricional c-Jun (DNc-Jun), também foi observado uma maior expressão do mRNA de IL-6 nas células DN em relação às células controle. Resultados preliminares também mostraram que a inibição de JNK1/2 leva a redução da expressão de transcritos da citocina TNF-, tanto em fibroblastos quanto em macrófagos de camundongo. Em suma, esse trabalho sugere a participação da via JNK/c-Jun na regulação da expressão do mRNA de IL-6 após a infecção pelo CPXV, contribuindo, assim, para um melhor entendimento da complexa relação vírus-hospedeiro. The Orthopoxviruses Vaccinia (VACV) and Cowpox (CPXV) belong to the Poxviridae family, the largest and more complex animal DNA viruses, whose replication occurs in the cytoplasmic compartment of the infected cells. Even though Orthopoxvirus genus is the most studied, little is known about Orthopoxvirus Cowpox (CPXV)-host cell interactions. As virus-host cell interaction plays a decisive role in viral biology, the Grupo de Transdução de Sinal of the Laboratório de Vírus (ICB-UFMG) have been studying the activation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) in response to Orthopoxviruses infections. Previously, we demonstrated that these Orthopoxviruses activates the protein kinases ERK and JNK leading to the phosphorylation of the transcription factor c-Jun, a common substract on both signaling pathways. However, JNK 1/2 was not required for proper VACV and CPXV replication, although they are important in VACV dissemination. Since it has been shown that production of cytokine is regulated by JNK 1/2 during the infection with diverse viruses, we sought to investigate the expression of pro-inflammatory cytokines upon VACV and CPXV infection. By means of quantitative reverse transcription-PCR and ELISA, we demonstrated that CPXV infection of wild-type (WT) or JNK 1/2 knock-out (KO) mouse embryonic fibroblasts (MEFs) leads to a higher induction and secretion of IL-6 cytokine than VACV infection. We also showed a significant increase in IL-6 mRNA expression in KO cells when compared to WT MEFs, mainly at 12 hpi. This result was also confirmed with murine macrophages, by using the JNK inhibitor VIII. We also demonstrated an increase in IL-6 mRNA expression in cells infected with CPXV and expressing dominant-negative c-Jun mutation (DNc-Jun), when compared to infected control cells. Preliminary results also showed that JNK1/2 inhibition results in a reduction of the transcriptional expression of TNF- in MEFs as well as in murine macrophages. Taken together, our data suggest that the JNK/c-Jun pathway exerts a negative regulation of IL-6 mRNA expression upon CPXV infection, leading, thus, to a better understanding of the complex relationship between virus and their host cells.

Durante o processo de coevolução com seus hospedeiros os vírus adquiriram a capacidade de interceptar, mimetizar e usurpar as várias vias sinalizadoras celulares de modo a gerar condições favoráveis a sua replicação e disseminação. Os flavivírus são vírus envelopados, de forma esférica, com aproximadamente 50 nm e capsídeo de simetria icosaédrica que possuem como material genético uma molécula de RNA fita simples e senso positivo. Dentro desse grupo encontramos o Vírus da febre amarela (YFV), um arbovírus causador da doença que leva o mesmo nome e que se encontra disseminada pelas regiões tropicais da África a da América do Sul criando uma zona de risco para aproximadamente 900 milhões de pessoas e tendo chegado, no passado, a se espalhar por diversas outras regiões do mundo. Ainda hoje não existe um tratamento específico para os seres humanos infectados, e a manutenção desse vírus em ciclos silvestres associada a campanhas intermitentes de combate ao vetor nas áreas urbanas leva ao surgimento periódico de surtos dessa doença que pode levar à morte. O objetivo desse trabalho foi de efetuar análise da utilização de vias celulares MEK/ERK, JNK e PI3K/AKT, relacionadas com eventos de crescimento, sobrevivência, diferenciação celular, evasão da apoptose e migração por esse vírus. O estudo demonstrou que as vias de JNK e PI3K/AKT, quando inibidas por seus inibidores farmacológicos específicos, não afetam de forma negativa a multiplicação do YFV em células Vero, chegando, por outro lado, a inibição de PI3K/AKT a aumentar sutilmente a multiplicação. Já a inibição da via de MEK/ERK, por seu inibidor UO126, afetou significativamente a capacidade de multiplicação do vírus. Posteriormente, análises de cinética de ativação de MEK/ERK, associadas a análises por microscopia eletrônica de varredura e visualização do processo de morfogênese viral, levaram à conclusão de que a etapa de replicação do material genético é uma das etapas críticas sendo fortemente afetada. Esse fato pôde ser concluído devido à ausência ou má formação dos complexos de replicação viral. Em conclusão, os dados encontrados apontam que a via MEK/ERK não só é ativada pela infecção por YFV, como sua inativação leva à diminuição acentuada da capacidade de replicação do vírus. During the process of co-evolution with their hosts, the viruses acquired the capacity of intercept, mimic and usurp several cellular signaling pathways in a way to generate favorable conditions to the replication and dissemination. The flaviviruses are enveloped, with spherical form, and approximately 50 nm in size. Their capsid has icosahedral symmetry and their genetic material is composed by a molecule of single stranded, positive sense RNA. Inside this group we found the Yellow fever virus (YFV), an arbovirus causer of the disease that has the same name and is disseminated in the tropical regions of Africa and South America creating an zone of risk to approximate ly 900 million people and, in the past having being able to spread throughout several other regions in the world. In spite of the advances in the medicine, there is not an specific treatment to infected humans, and the maintenance of this virus in sylvatic cycles associated with intermittent campaigns of combat to the vector in the urban areas leads to the periodic outbreaks of his disease that can leads to death. The objective of this work is to effectuate analysis of the utilization of cellular pathways MEK/ERK, JNK and PI3K/AKT related to events of growth, survival, cellular differentiation, evasion of apoptosis and migration by this virus. The study demonstrated that the JNK and PI3K/AKT pathways, when inhibited by their specific pharmacological inhibitors, do not affect in a negative way the YFV multiplication in Vero cells and that the inhibition of PI3K/AKT leads to an subtle augment in the multiplication. On the other hand, the inhibition of the MEK/ERK pathway, by its inhibitor UO126, affected significantly the capacity of multiplication of the virus. Later, analyses of kinetic of activation of the last pathway, associated to analysis of scanning electron microscopy and visualization of the process of viral morphogenesis, leaded to the conclusio n that the period of replication of the genetic material is one of the critical period being strongly affected. This was concluded by the absence or the malformation of the viral replication complexes. In conclusion, the data encountered points that the ME K/ERK pathway not only is activated by the YFV, but this activation also leads to an accentuated diminution in the capacity of the replication of the virus.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Durannte a infecção, os vírus usurpam a maquinaria celular em seu benefício e, ao mesmo tempo, evadem às respostas antivirais do hospedeiro, com vistas à eficiente geração e disseminação da sua progênie. Os poxvírus codificam uma miríade de proteínas envolvidas na evasão imune e também manipulam a ativação de vias sinalizadoras, a fim de tornar o ambiente intracelular mais propício à sua multiplicação. No Brasil, diferentes amostras de Vaccinia virus (VACV) têm sido isoladas a partir de infecções que acometem roedores, bovinos e humanos, caracterizando-as como zoonoses emergentes. Estas amostras de VACV isoladas a partir de infecções naturais constituem uma ferramenta muito útil ao estudo da interação poxvírus-hospedeiro. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi analisar a ativação e o envolvimento de vias sinalizadoras celulares durante a infecção pelo VACV Belo Horizonte (VBH), isolado durante um surto de varíola murina no Centro de Bioterismo da UFMG, em comparação ao VACV Western Reserve (VACV-WR). Neste estudo, mostrou-se que durante a infecção de células A31 (fibroblastos 3T3 de camundongos Balb/C), a ativação das MAPK MEK/ERK, JNK e p38, e de PI3K/Akt foi temporalmente regulada de modo semelhante por ambos os vírus. Entretanto, a inibição farmacológica de MEK/ERK (UO126), PI3K/Akt (LY294002) e JNK (JNK inhibitor VIII) não afetou significativamente a multiplicação do VBH (inibição ≤ 50%), ao contrário do observado para VACV-WR. Já a inibição de p38 (SB202190) reduziu a progênie do VBH em 90%, mas não afetou o VACV-WR. Genisteína (inibidor de proteínas tirosina quinases) e dois inibidores sabidamente inespecíficos (SP600125 e Akt inhibitor IV) inibiram igualmente a multiplicação do VBH e do VACV-WR, ressaltando suas potenciais atividades antivirais. Em presença de LY294002, a multiplicação do VBH, assim como a síntese de proteínas virais precoces e tardias foram apenas retardadas mas não inibidas, como para o VACV-WR. A morfogênese do VBH também se procedeu normalmente em presença de LY294002. Entretanto, diferente do VACV-WR, apoptose foi desencadeada durante a infecção pelo VBH, independentemente da inibição de PI3K/Akt. Apesar disso, quatro genes virais (B13R, E3L, F1L e N1L) diretamente envolvidos na inibição da apoptose não apresentaram polimorfismos no VBH. Ambos os vírus multiplicaram em macrófagos de camundongo, mas o VBH induziu 2 log10 menos a expressão de citocinas inflamatórias que o VACV-WR. Em conclusão, estes dados indicam que, a despeito da grande similaridade genética entre VBH e VACV-WR, estas duas amostras de VACV apresentam diferenças biológicas que certamente refletem na patogênese destes vírus in vivo. During infection, viruses rely on cell metabolism and, at the same time, evade from host antiviral responses, to guarantee their efficient replication and dissemination. In spite of poxviruses encoding a plethora of immune evasion proteins, they also manipulate intracellular signaling pathways to create an environment propitious to virus replication. In Brazil, several strains of Vaccinia virus (VACV) have been isolated from outbreaks involving rodents, cows and humans, characterizing them as emerging zoonoses. As these Brazilian VACV strains, isolated from natural infections, constitute a useful tool to investigate virus-host interaction, the aim of this work was to analyze activation and functional relevance of cellular signaling pathways during VACV Belo Horizonte (VBH) infection, in comparison to VACV Western Reserve (WR). VBH was isolated during a mousepox outbreak in UFMG’s animal facility. During infection of A31 cells (3T3 fibroblasts derived from Balb/C mice), VBH and VACV-WR temporally regulate the activation of MAPK MEK/ERK, JNK and p38, and of PI3K/Akt in similar fashion. However, pharmacological inhibition of MEK/ERK (UO126), PI3K/Akt (LY294002) and JNK (JNK inhibitor VIII) did not affect significantly VBH replication (inhibition ≤ 50%), in contrast to VACV-WR. Inhibition of p38 (SB202190) reduced VBH progeny in 90%, but did not for VACV-WR. Genistein (protein tyrosine kinase inhibitor) and two known unspecific drugs (SP600125 e Akt inhibitor IV) inhibited equally VBH and VACV-WR replication, indicating their potential antiviral activities. In presence of LY294002, VBH replication and early/late protein synthesis were delayed, but not inhibited like VACV-WR. VBH morphogenesis also proceeded normally in presence of LY294002. Therefore, in contrast to VACV-WR, VBH infected cells underwent apoptosis even in the absence of PI3K/Akt inhibition. In spite of that, four viral genes (B13R, E3L, F1L e N1L) directly involved in apoptosis inhibition did not present polymorphisms in VBH. Both viruses replicated in murine macrophages, but VBH induced cytokine gene expression 2 log10 lesser than VACV-WR. In conclusion, these data indicate that VBH and VACV-WR, though closely related genetically, display biologic differences that certainly influence pathogenesis of these VACV strains in vivo.

O látex de Caricaceae é uma fonte tradicional de enzimas proteolíticas as quais são amplamente utilizadas na indústria e como preparações farmacológicas. Relatos etnofarmacológicos indicam que Carica candamarcensis, membro da família Caricaceae e comum a algumas áreas na América do Sul, é usada no tratamento de disfunções gástricas. É creditado às cisteíno proteases de Caricaceae funções defensivas na planta. Após injúria no epicarpo do fruto, essas enzimas iniciam um processo de coagulação semelhante ao que ocorre em mamíferos. Uma fração contendo proteases de C. candamarcensis estimulou a proliferação de células de mamíferos, sugerindo um papel na regeneração do tecido lesado. Também existem evidências que algumas enzimas auxiliam na cicatrização de úlceras gástricas e abrasões cutâneas realizadas em modelos murinos. Neste trabalho, nosso primeiro objetivo foi isolar e caracterizar proteases com atividade mitogênica presentes no látex de C. candamarcensis. Em seguida, visamos determinar a estrutura primária e terciária de uma dessas enzimas assim como analisar possíveis mecanismos de ação dessa substância. Após três processos cromatográficos foram isoladas duas cisteíno proteases (CMS2MS2 e CMS2MS3) com aproximadamente 23 kDa. CMS2MS2 estimulou a proliferação celular acima de 50% quando comparado ao controle em fibroblastos, osteoblastos e insulinoma. O efeito mitogênico foi observado com aproximadamente 1 nM de enzima e foi independente da atividade proteolítica quando avaliado em fibroblasto. Além disso, o inibidor específico de MEK (PD98059), que bloqueia a via das MAP-quinases, aboliu a atividade mitogênica de CMS2MS2. O efeito inibitório desse composto também foi observado quando CMS2MS2 esteve inibido por E-64. Entretanto, a proliferação celular foi apenas moderadamente diminuída (10%) quando fibroblastos foram pré-incubados com o inibidor do receptor de EGF (AG1478). Esse dado foi correlacionado com a liberação de fatores de crescimento das células com posterior atuação autócrina destas substâncias. CMS2MS2 possui 214 resíduos de aminoácidos incluindo os que formam a tríade catalítica (Cys25, His159 e Asn175). Análises filogenéticas revelaram que CMS2MS2 está mais próxima evolutivamente da quimopapaína do que da papaína, ambas isoladas do látex de Carica papaya. A estrutura tridimensional predita mostrou que essa enzima mitogênica possui características típicas das proteases da família da papaína. Estes dados sugerem que mínimas diferenças estruturais podem determinar seu efeito proliferativo, o qual é independente da atividade proteolítica; mas é dependente da ativação da via das MAP-quinases. A propriedade de agir como mitógeno atribuída às cisteína proteases isoladas de Caricaceae pode explicar algumas das aplicações farmacológicas destas proteases. Latex from Caricaceae contains proteolytic enzymes localized in the fruit, which are widely used industrially as well as in pharmaceutical preparations. Ethnopharmacologically, Carica candamarcensis, a member of Caricaceae family common to many areas of South America, is used to treat digestive disorders. Cysteine proteinases from Caricaceae latex are believed to be part of a plant defense mechanism. Upon injury, these enzymes promote the formation of a protein clot around the wounded area, as it occurs with mammalian systems. Some of these proteins display proliferative properties when probed with mammalian cells suggesting a role in reconstruction of wounded tissue. There are evidences that some of these enzymes are able to protect and enhance healing of chemically induced gastric ulcers in rats. In addition, it was demonstrated that these proteinases enhance the healing rate of induced dermal abrasions. In this study, we first aimed the isolation and characterization of proteinases displaying mitogenic activity. Subsequently, our goals were to determine the structure of the mitogenic protein and analyze a possible mechanism of action of this molecule. After three chromatography steps we isolated two mitogenic cysteine proteinases (CMS2MS2 and CMS2MS3) displaying a relative mass of 23 kDa. CMS2MS2 at approximately 1 nM stimulates proliferation above 50% of the control levels on insulinoma, fibroblastic, and osteoblastic cells. The mitogenic activity of CMS2MS2 in fibroblast was not affected by its inhibition with E-64, a specific inhibitor of cysteine protease. Furthermore, a specific MEK inhibitor (PD98059), that blocks the MAP-kinases pathway, abolishes the mitogenic activity of CMS2MS2. This inhibitory effect was also observed when CMS2MS2 was inhibited with E-64. In addition, the mitogenic effect was slightly suppressed (10%) when fibroblasts were pre-incubated with AG1478, a specific inhibitor of the EGF-receptor kinase. This phenomenon was correlated with growth factors released from cells acting in an autocrine way. CMS2MS2 contains 214 residues including the catalytic triad composed by Cys25, His159, Asn175. A phylogenetic tree analysis demonstrated that CMS2MS2 ranks closer to chymopapain than to papain, both isolated from Carica papaya latex. The overall predicted three-dimensional structure is similar to proteases from the papain family. These results suggest that minor structural differences within CMS2MS2 must account for its proliferative action that is independent of its proteolytic activity; but it is mediated by activation of MAP-kinases. This mitogenic property attributed to a purified cysteine proteinase may explain some of the therapeutical actions attributed to these enzymes.