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Canine hypothyroidism is one of the most often diagnosed endocrine disease in dogs characterized by a deficiency of the active thyroid hormones that have a negative impact on dog’s quality of life. The study of metabolic implications related to thyroid hormones can lead to the development of new biomarkers with clinical utility. In this study, we have analyzed 20 serum samples of dogs with hypothyroidism and compared them with 20 healthy dogs using non-target metabolomic techniques. With this approach, two new metabolites that change in serum of dogs with hypothyroidism have been detected. These metabolites are D-gluconic and L-isoleucine, both closely related to the development of complications and could be promising biomarkers of this disease.

Tesis-Universidad de Murcia., Consulte la tesis en: BCA. GENERAL. MEDIATECA. MF-TD 1608., Consulte la tesis en: BCA. GENERAL. MEDIATECA. MF-TD 1607., NEBRIJA. MEDIATECA. MF-23 1030.

Este trabajo es una revisión de los estudios realizados en la especie porcina sobre el comportamiento de la insulina, leptina y grelina, y su implicación en la regulación de la ingestión de alimentos. Desde el punto de vista productivo es de gran interés por constituir una fuente de información importante para conocer el estado metabólico y energético del animal. Los animales, durante su crecimiento y a lo largo de su vida productiva, pasan por diferentes etapas con necesidades específicas que deben ser cubiertas mediante el aporte de nutrientes a través de la alimentación. La salud de los animales dependen de la habilidad del cuerpo para regular de forma adecuada el equilibrio entre las necesidades y los aportes, y este equilibrio está regulado por del sistema nervioso central mediante señales neuronales o la liberación de hormonas. Las hormonas implicadas en la ingestión de alimentos, es decir, aquellas que ejercen un papel regulador sobre el apetito o la saciedad, pueden clasificarse en orexigénica o anorexigénicas según su capacidad de estimular o inhibir, respectivamente, el consumo de alimentos. La grelina, también llamada hormona del hambre, es la principal hormona orexigénica, es producida principalmente en el estómago en respuesta al hambre y la inanición. Durante el ayuno, o en estados energéticos insuficientes eleva sus niveles en sangre y tras la alimentación recupera los niveles basales. Entre las hormonas anorexigénicas destaca la leptina secretada principalmente por las células del tejido adiposo, cuya función primordial es la regulación de la ingestión de alimentos y del gasto energético, a largo plazo, para mantener las reservas corporales, de manera que, cuando un individuo está en balance energético positivo los niveles de leptina aumentan presentando un estado de saciedad que provoca la disminución en el consumo alimentos y/o apetito. Además, tras la ingestión de alimento, se secreta insulina, que es la principal hormona encargada de regular la glucemia y esta implicada en la regulación del apetito por interactuar con otras hormonas. Aunque estas hormonas han sido ampliamente estudiadas en la especie humana y roedores, es de esperar que en las próximas décadas su estudio se extienda a todos las especies domésticas. ABSTRACT This paper is a review about research of insulin, leptin and ghrelin in pigs and their implications in regulation of appetite. Their study could be very important in animal production as they are a source of important information to know metabolic and energetic states of animals. The animals during their growth have different states with their own needs which should be covered with the nutrients intake. The balance between needs and feed nutrient inputs are regulated by central neuronal system through hormones. The hormones involved in feed intake are orexigenic or anorexigenic according their capacity to activate or inhibit feed intake. The most important orexigenic hormone is the ghrelin, which is a «hunger hormone» is high in the fasting state and decreases in serum after feed intake. Leptin, anorexigenic hormone, is thought to be a satiety factor that regulates body weight through modulation of feeding behaviour and energy expenditure and it is directly related to the animals’ adiposity degree. Insulin, besides regulating blood glucose levels, is involved in food intake by interacting with other hormones. However, these actions are affected by many factors as the feeding pattern, the diet composition or the productive stage of swine.

In order to clarify the origin of the haptoglobin (Hp) quantified in saliva and meat juice samples, the extrahepatic localization of Hp in salivary gland and in diaphragmatic muscle, as part of the systemic acute phase response in pigs, was studied by immunohistochemistry. For this purpose a specific monoclonal antibody (mAb) produced by immunising mice with purified porcine Hp was used. Reactivity of the mAb was assessed by direct ELISA and by western blot, which showed the ability and specificity of the mAb to identify porcine haptoglobin as a purified antigen or in porcine serum in a native or denatured but non-reduced state. Five healthy and five diseased pigs were sampled at slaughter for serum and tissue procurement. Hepatic immunohistochemical analysis was used as control of the acute phase reaction status. In the liver, cell immunostaining revealed a perinuclear, cytoplasmic localization of Hp within hepatocytes, following mainly a periacinar pattern. Extrahepatic immunohistochemical analysis revealed positive cells in the glandular acini and duct epithelial cells of the salivary gland and intrasarcoplasmic immunolabelling of random diaphragmatic myofibers. A possible role of both salivary gland and diaphragmatic muscle on local Hp production could be postulated based on the present immunohistochemical study, which supports the concept that other cells besides hepatocytes may have the potential to produce Hp in the pig

En este estudio se han utilizado 15 bóvidos de la raza de lidia (Bos taurus), divididos en tres grupos, con diferentes edades, características del transporte y condiciones de lidia (machos de 3-4 años lidiados en la plaza de tientas y en plaza portátil y animales de 4 años lidiados en plaza fija), para estudiar el posible efecto de diferentes situaciones de estrés y ejercicio en la liberación de diferentes enzimas musculares. Se tomaron muestras de sangre de todos los animales. En las analíticas sanguíneas se obtuvieron los valores de cortisol y de las enzimas CPK, LDH y AST. En relación con estas enzimas, hubo una mayor liberación de CPK y LDH en los novillos lidiados en plaza de toros portátil, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas. El comportamiento de la enzima AST no fue el mismo que el de la CPK y la LDH, lo que indicaría según los datos obtenidos en este estudio, que esta enzima no sería un buen indicador del daño o fatiga muscular. Este mayor daño o fatiga muscular se detectó en los animales que se lidiaron en plazas de toros portátiles, sin descanso previo en los corrales. En estos mismos animales, hubo una correlación entre la liberación de cortisol y la de enzimas musculares.

Two fast and simple methods for porcine haptoglobin (Hp) and ceruloplasmin (Cp) purification are described in this paper. Hp was purified by ammonium sulphate fractionation and a FPLC Superdex-200 gel chromatography. The protein obtained showed two bands with a Mr (molecular mass) of about 44 kDa and 12.9 kDa corresponding to heavy (ß) and light (a) chains of Hp respectively, on sodium dodecyl sulphate-polyacrilamide gel electrophoresis, under reducing conditions. Ceruloplasmin (Cp) was isolated by one step of chromatography on amino-ethyl-derivatized Sepharose followed by gel filtration on a Superdex-200 column. The Mr of the protein, as estimated by SDS-PAGE was approximately 150 kDa. In conclusion, two new protocols have been developed for porcine Hp and Cp purification, being less time-consuming and technically demanding than those previously reported. This paper could represent an interesting guideline and be of help to obtain pure protein to use as specie-specific standard material and to produce specific antibodies.

La haptoglobina es una de las principales proteínas de fase aguda en rumiantes. Tiene un gran potencial como indicador precoz de condiciones infl amatorias, traumas y trastornos metabólicos, y además es útil para determinar el pronóstico y monitorizar tratamientos de enfermedades específi cas. Una de las aplicaciones clínicas más interesantes de la haptoglobina es como indicador de mastitis subclínicas, mediante su determinación en muestras de leche, ya que puede considerarse una medida más sensible que los indicadores tradicionalmente usados, como el recuento de células somáticas. En este trabajo se describen las relaciones entre haptoglobina con algunos estados infl amatorios, mastitis y trastornos metabólicos, como cetosis, acidosis ó lipidosis hepática y se indican nuevos campos de investigación que pueden ser desarrollados en el futuro.

Se ha estudiado la influencia del estrés físico y psicológico sobre las concentraciones plasmáticas de la proteína de fase aguda haptoglobina (Hp) en 20 vacas de raza bovina de lidia de 3 a 6 años de edad. Los animales se dividieron en 4 grupos, el primero, utilizado como control, corresponde a vacas en la ganadería sin estimulación aparente, los tres grupos restantes corresponden a vacas que se utilizaron en encierros tradicionales y que fueron sacrifi cados a las 30, 54 y 78 horas de la celebración del espectáculo. Las concentraciones medias de Hp en suero para las vacas control fueron 0,093 g/l y 0,13 g/l a las 30h, 0,19 g/l a las 54 h y 0,5 g/l a las 78 h de la celebración del encierro. Estos resultados indican que en los encierros tradicionales se estimula la producción de Hp en vacas de lidia, presentando valores estadísticamente signifi cativos a partir de las 54 horas de la realización del mismo y situándose los valores máximos a las 78 horas. Como conclusión, hemos de considerar que en situaciones de estrés en vacas de lidia los niveles de Hp en plasma son superiores a los normales y estos parámetros podrían ser utilizados como un indicador del nivel de estrés sufrido por el animal.

Este artículo lleva una fe de erratas, en donde indica todos los autores y que son los que aquí están recogidos.

Programa de doctorado: Clínica e investigación terapéutica [ES]El objetivo de esta tesis fue, por un lado, evaluar las PF A en perros con Dirofi/aria immitis. Y, por otro, evaluar las concentraciones de diferentes PF A durante el tratamiento adulticida., empleando el protocolo recomendado por la American Heartworm Society. Los resultados obtenidos demuestran la existencia de una respuesta de fase aguda (con aumentos en la CRP y disminución de la albúmina y PON-l) en perros con D. immitis. Los aumentos de CRP fueron mas evidentes en los perros con signos clínicos. La evaluación de las concentraciones de PF A después del tratamiento contra la Wolbachia y microfilarias, se caracteriza por una disminución de la CRP y Hp...

Introducción: la toxoplasmosis y la neosporosis son dos enfermedades causadas por los parásitos apicomplejos Toxoplasma gondii y Neospora caninum, respectivamente, que están distribuidos globalmente. La toxoplasmosis es una zoonosis y una de las principales causas de fallo reproductivo en pequeños rumiantes, con el consiguiente elevado impacto económico. Neospora caninum no es un patógeno zoonótico, pero es una de las principales causas de aborto en bovinos y también se asocia a fallos reproductivos en rumiantes. En la actualidad, el diagnóstico de estas parasitosis se basa con frecuencia en métodos serológicos, que podrían mejorar mediante la aplicación de una técnica más sensible como la fluorometría en tiempo retardado (TRFIA). Material y métodos: esta tesis se compone de tres actividades: (1) una revisión sistemática y meta-análisis sobre el desarrollo de nuevos métodos serológicos para diagnosticar toxoplasmosis en humanos y animales, enfocada a la perspectiva One Health y a analizar críticamente el proceso de validación; (2) un estudio de la seroprevalencia y factores de riesgo asociados a la infección por T. gondii en perros y gatos de un área antropizada (Bangkok, Tailandia); y (3) el desarrollo y validación de nuevas TRFIAs para detectar anticuerpos anti-T. gondii en suero de gatos y cabras, y anti-N. caninum en suero y leche de ovejas. En gatos, se evaluaron varios antígenos recombinantes y quiméricos mediante esta técnica. La validación analítica se basó en la estimación de la precisión intra- e inter-ensayo, sensibilidad (Se) analítica, exactitud y la reactividad cruzada con patógenos filogenéticamente relacionados. La validación diagnóstica se realizó mediante la evaluación del potencial discriminatorio entre positivos y negativos de la técnica (test de Mann Whitney), un análisis ROC (para la determinación del punto de corte óptimo, sensibilidad, especificidad -Sp- y área bajo la curva), la concordancia (usando el valor kappa) y el coeficiente de correlación de Spearman. Resultados: hay una falta de aplicación del enfoque One Health en los estudios sobre diagnóstico serológico de toxoplasmosis, especialmente en aquellos realizados en humanos y por investigadores médicos. El proceso de validación de nuevos métodos es muy heterogéneo y con frecuencia solo se realiza una validación diagnóstica y no analítica. La seroprevalencia de T. gondii en gatos y perros de Bangkok fue de 18,7% y 7,9%, respectivamente. Se desarrolló una TRFIA para detectar anticuerpos anti-T. gondii en gatos, en la que el antígeno quimérico TgSAG1-GRA8 obtuvo un mejor rendimiento diagnóstico en comparación con otros antígenos. Además, se desarrolló una TRFIA basada en el mismo antígeno quimérico para detectar anticuerpos anti-T. gondii en cabras con excelentes resultados en la Se analítica, y Se y Sp en el análisis ROC. Sin embargo, la reactividad cruzada con anticuerpos anti-N. caninum limita el uso de esta técnica. Finalmente, se desarrolló y validó una TRFIA basada en el antígeno recombinante NcGRA7 para detectar anticuerpos anti-N. caninum en suero sanguíneo y leche entera de ovejas, con alto rendimiento analítico y diagnóstico. Discusión y conclusiones: esta tesis doctoral aporta información nueva y actualizada sobre el desarrollo de métodos serológicos para diagnosticar infección por T. gondii en animales y humanos, destacando la necesidad de aplicación del enfoque One Health y del seguimiento del proceso de validación recomendado por la OIE. La elevada seroprevalencia de T. gondii en gatos y perros de Bangkok debería ser considerada como un riesgo para la salud pública en esta área antropizada. La nueva TRFIA desarrollada en esta tesis mejora la Se de las técnicas actuales de detección de infecciones por T. gondii y N. caninum y ha sido adaptada a muestras no invasivas, aunque se deberían evaluar mediante TRFIA nuevos antígenos de T. gondii para evitar la reactividad cruzada con N. caninum. Introduction: toxoplasmosis and neosporosis are two parasitic diseases caused by the Apicomplexan parasites Toxoplasma gondii and Neospora caninum, respectively, which are globally distributed. Toxoplasmosis is a zoonosis and a main cause of reproductive failure in small ruminants with the subsequent high economic impact. Neospora caninum is not a zoonotic pathogen, but it is a major cause of abortion in cattle and is also associated to reproductive failures in sheep. Currently, diagnosis of these diseases is commonly based on serological methods, but it could be improved by the application of a more sensitive technique such as Time-resolved fluorescence immunoassays (TRFIA). Material and methods: this PhD thesis comprises three main activities: (1) a systematic review and a meta-analysis on the development of new serological methods to diagnose toxoplasmosis in humans and animals, focused on their One Health approach followed and the critical analysis of the validation process; (2) a study of the seroprevalences rates and risk factors associated to T. gondii infection in dogs and cats from an anthropized area (Bangkok, Thailand); and (3) the development and validation of new TRFIAs for detection of anti-T. gondii antibodies in cat and goat sera, and anti-N. caninum antibodies in sheep serum and milk samples. In cats, several recombinant and a recombinant chimeric antigens were evaluated by this technique. Analytical validation consisted of estimating of the inter- and intra-assay precision, analytical sensitivity (Se), accuracy and cross-reactivity with closely related pathogens. Diagnostic validation was assessed by the evaluation of the positive/negative discriminative potential of the technique (Mann Whitney U test), a ROC analysis (for determination of the optimal cut- off, Se, specificity -Sp- and area under the curve), the agreement (using the kappa value) and the Spearman’s correlation coefficient. Results: there is a lack of implementation of the One Health approach in the studies on serological diagnosis of toxoplasmosis, especially in those conducted in humans and by physician-based research teams. The validation process of the newly developed methods is widely heterogeneous and the exclusive evaluation of the diagnostic performance of the assays, without considering the analytical characteristics, is frequent. The seroprevalence rates of T. gondii infection in cats and dogs from Bangkok were 18.7% and 7.9%, respectively. A TRFIA was developed to detect anti-T. gondii antibodies in cats, with the chimeric antigen TgSAG1-GRA8 providing a better diagnostic performance in comparison with other antigens. In addition, a TRFIA based on the same T. gondii chimeric antigen was developed to diagnose T. gondii infection in goats with excellent results in the analytical Se, and high Se and Sp in the ROC analysis. However, the cross-reactivity detected with specific anti-N. caninum antibodies limits the use of this technique. Finally, a TRFIAs based on recombinant NcGRA7 antigen was successfully developed and validated to detect anti-N. caninum antibodies in ovine blood sera and full-cream milk samples, with high analytical and diagnostic performances. Discussion and conclusions: this thesis provides new and up-to-dated knowledge on the development of serological methods to diagnose T. gondii infection in animals and humans, highlighting the need of implementation of the One Health approach and of a close following of the different steps of the validation process recommended by the OIE. The high seroprevalence of T. gondii found in dogs and cats from Bangkok should be considered a public health concern in this anthropized area. In addition, the new TRFIA developed in this thesis increase the Se of the current diagnostic methods for the detection of T. gondii and N. caninum infections and was adapted to non-invasive samples, although future research should include the evaluation by TRFIA of new T. gondii antigens avoiding the cross-reactivity with N. caninum.

El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue avanzar en el desarrollo de nuevos ensayos para determinar de forma precisa las concentraciones de oxitocina en saliva, pelo, y otras muestras de varias especies, como la porcina, bovina, canina y humana, así como de métodos que puedan evaluar la concentración de cortisol, cortisona y la actividad de la isoenzima 11β- hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2 en pelo de la especie porcina. Todo ello con el objetivo global de proporcionar nuevas herramientas analíticas que permitan evaluar el estrés y bienestar en estas especies de forma no invasiva. Los objetivos específicos fueron: (1) Desarrollar y validar inmunoensayos para la determinación de oxitocina en saliva de la especie porcina y aplicarlos en diferentes situaciones de estrés y experiencias positivas, y desarrollar un inmunoensayo para la medición de oxitocina en plasma seminal de la especie porcina, así como una revisión bibliográfica sobre los ensayos para la medición de oxitocina. (2) Desarrollar y validar inmunoensayos para la determinación de oxitocina en saliva de las especies canina, bovina, y humana, y aplicarlos en diferentes situaciones de estrés o positivas. (3) Desarrollar y validar un inmunoensayo para la determinación de oxitocina en pelo de la especie porcina. (4) Desarrollar y validar inmunoensayos para la determinación de cortisol y cortisona como biomarcadores de estrés en pelo de la especie porcina. Para el primer objetivo, se desarrollaron y validaron dos nuevos inmunoensayos basados en la tecnología de AlphaLISA para la determinación de oxitocina en saliva de cerdo y su evaluación en diferentes situaciones como el parto y la lactación, extracción de semen, y el transporte y estancia en matadero. También se evaluó la influencia del procedimiento de extracción y el tratamiento de reducción y alquilación sobre las muestras de saliva. Además, se desarrolló un método para determinación de oxitocina en plasma seminal de la especie porcina y se evaluó su relación con parámetros reproductivos. Para el segundo objetivo, se desarrollaron y validaron dos nuevos inmunoensayos basados en la tecnología de AlphaLISA, para la determinación de oxitocina en saliva de las especies bovina, canina, y humana para evaluar los cambios después de situaciones de estrés o positivas, así como la evaluación del tratamiento de reducción y alquilación sobre las muestras. Para el tercer objetivo, se desarrolló y validó un inmunoensayo basado en la tecnología de AlphaLISA para determinar oxitocina en pelo de la especie porcina y evaluar los cambios durante el ciclo reproductivo. Para el cuarto objetivo, se desarrollaron y validaron dos inmunoensayos basados en la tecnología de AlphaLISA, uno de ellos para determinar cortisona y el otro para cortisol en pelo de la especie porcina y evaluar los cambios durante el ciclo reproductivo, y así evaluar la actividad de la isoenzima 11β- hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2. En conclusión y de forma global, todos los métodos desarrollados en esta Tesis demostraron ser adecuados desde el punto analítico y permitieron detectar (1) oxitocina en saliva de las especies porcina, canina, bovina, y humana sin necesidad de tratamiento previo de las muestras, y en el plasma seminal y pelo del cerdo y (2) cortisol, cortisona y actividad de la isoenzima 11β- hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2 en pelo de la especie porcina, mediante el ratio cortisona/cortisol. Además, todos los métodos pudieron detectar las variaciones de los analitos en diferentes situationes de estrés y bienestar The main objective of this Doctoral Thesis was to provide an advance in the development of new assays to accurately determine oxytocin concentrations in saliva, hair, and other samples from various species, such as porcine, bovine, canine, and human, as well as methods that can evaluate the cortisol and cortisone concentrations, and the 11β-hydroxysteroid dehydrogenase isoenzyme type 2 activity in the hair of pigs. All this with the overall objective of providing new analytical tools to assess stress and welfare in these species in a non-invasive way. The specific objectives were: (1) To develop and validate immunoassays for oxytocin measurement in the saliva of porcine species and apply them in different stress and positive situations, and to develop an immunoassay for oxytocin measurement in seminal plasma of porcine species, as well as a review on assays for oxytocin measurement. (2) Develop and validate immunoassays for oxytocin measurement in the saliva of canine, bovine, and human species, and apply them in different stress or positive situations. (3) Develop and validate an immunoassay for the determination of oxytocin in the hair of pigs. (4) To develop and validate immunoassays for the determination of cortisol and cortisone as biomarkers of stress in hair of pigs. For the first objective, two new immunoassays based on AlphaLISA technology were developed and validated for oxytocin measurement in the saliva of pigs and its evaluation in different situations, such as farrowing and lactation, ejaculate collection, and transport and lairage at the slaughterhouse. The influence of the extraction procedure and the reduction and alkylation treatment on the saliva samples was also evaluated. In addition, a method for oxytocin measurement in the seminal plasma of pigs was developed, and its relationship with reproductive parameters was evaluated. For the second objective, two new immunoassays based on AlphaLISA technology were developed and validated for oxytocin measurement in the saliva of bovine, canine, and human species to evaluate the changes after stress or positive situations, as well as the evaluation of the reduction and alkylation treatment on the samples. For the third objective, an immunoassay based on AlphaLISA technology was developed and validated for oxytocin measurement in the hair of pigs and to evaluate changes during the reproductive cycle. For the fourth objective, two immunoassays based on AlphaLISA technology were developed and validated, one of them cortisone measurement and the other one for cortisol measurement in the hair of pigs, and the evaluation of the changes during the reproductive cycle, and the evaluation of the 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 isoenzyme activity. In conclusion, and globally, all the methods developed in this thesis proved to be adequate from the analytical point of view and allowed the detection of (1) oxytocin in the saliva of porcine, canine, bovine, and human species without the need for prior treatment of the samples, and in seminal plasma and hair of pigs and (2) cortisol, cortisone, and the 11β-hydroxysteroid dehydrogenase isoenzyme type 2 activity in the hair of pigs using the cortisone/cortisol ratio. In addition, all methods were able to detect the variations of the analytes in different stress and welfare situations.

Esta tesis como compendio de publicaciones fue concebida para profundizar en el estudio del desarrollo de ensayos que permitieran el uso de muestras de saliva para diagnosticar leishmaniosis en perros. Los objetivos fueron: (1) desarrollar y validar un ensayo ultrasensible para la cuantificación de anticuerpos anti-Leishmania que permitiera su medición en suero y saliva de perro; (2) evaluar la utilidad del nuevo ensayo con muestras de suero y saliva para monitorizar el tratamiento frente a leishmaniosis canina (LCan); (3) evaluar la relación entre los niveles de anticuerpos anti-Leishmania en suero de perro medidos con el nuevo ensayo y por un ELISA comercial y la concentración de proteínas de fase aguda; (4) evaluar, mediante el nuevo ensayo, la cinética de los niveles de IgG2 e IgA anti-Leishmania en suero y saliva de perros infectados experimentalmente con L. infantum durante un año de seguimiento; (5) estudiar el posible ritmo circadiano en los niveles de IgG2 e IgA anti-Leishmania en suero y saliva de perros infectados experimentalmente; (6) y desarrollar y validar una PCR a tiempo real para la cuantificación de ADN de Leishmania spp. en saliva canina. La precisión, la exactitud y la sensibilidad analítica de cada ensayo fueron evaluadas mediante los coeficientes de variación intra- e inter-ensayo, la linealidad bajo dilución, el porcentaje de recuperación y el estudio de correlación, y los límites de detección y cuantificación. Para ello, se recogieron muestras de suero y saliva de perros seronegativos y seropositivos a Leishmania spp. Para evaluar la utilidad de los TR-IFMAs en suero en la monitorización del tratamiento se obtuvieron muestras de suero de 16 perros seropositivos a Leishmania spp. en el momento del diagnóstico y tras 30 y 180 días de tratamiento. Del mismo modo, para evaluar la utilidad de los TR-IFMAs en la monitorización del tratamiento con muestras de saliva, se recogieron muestras de suero y saliva de 20 perros con signos clínicos compatibles con LCan en el momento del diagnóstico y después de 30 días de tratamiento. También se usaron 205 muestras de suero para evaluar la correlación entre TR-IFMA y un ELISA comercial y la concentración de proteínas de fase aguda en el momento del diagnóstico de LCan y durante la monitorización del tratamiento. Para estudiar la cinética de los niveles de anticuerpos anti-Leishmania se tomaron mensualmente durante 1 año muestras de suero y saliva de 11 perros infectados experimentalmente con Leishmania infantum y se analizaron por TR-IFMA. Para evaluar el posible ritmo circadiano en los niveles de anticuerpos anti-Leishmania, muestras de suero y saliva de 6 perros infectados experimentalmente que presentaban signos clínicos compatibles con LCan se recogieron a intervalos de 4 horas durante un periodo de 16 horas en dos días consecutivos. Finalmente, para el desarrollo y validación de una PCR a tiempo real para la detección de ADN de Leishmania spp. en saliva de perro se recogieron salivas de 16 perros infectados experimentalmente pre-infección y 16 semanas post-infección. Las conclusiones de esta tesis doctoral son: 1. Los ensayos inmunofluorométricos desarrollados en esta tesis doctoral permiten la cuantificación de anticuerpos IgG2 e IgA anti-Leishmania en suero y saliva de perro, siendo los niveles más elevados en perros seropositivos. Se observó solapamiento en los niveles de IgA anti-Leishmania entre seropositivos y seronegativos. 2. Los ensayos desarrollados detectan disminuciones en los niveles de IgG2 e IgA anti-Leishmania en suero y saliva de perros después del tratamiento, asociado con mejoría clínica. 3. El ensayo desarrollado para detectar IgG2 anti-Leishmania mostró mayor correlación con los resultados de CRP y ferritina en perros tratados que el ELISA. 4. Los niveles de IgG2 e IgA anti-Leishmania en suero y saliva de perros aumentan por encima del punto de corte del ensayo TR-IFMA tras la infección experimental. Además, el TR-IFMA desarrollado para la detección de IgG2 anti-Leishmania ofrece mejor valor diagnóstico que el desarrollado para IgA anti-Leishmania. 5. No se ha observado ritmo circadiano en los niveles de IgG2 e IgA anti-Leishmania tanto en suero como en saliva de perros con LCan en un periodo de 16 horas en dos días consecutivos. Además, se han observado mayores variaciones en los niveles de estos anticuerpos en saliva que en suero. 6. La PCR a tiempo real desarrollada permite la cuantificación de ADN del cinetoplasto de Leishmania spp. en saliva de perros infectados experimentalmente con L. infantum. No obstante, hay que tener en cuenta que la sensibilidad del ensayo en saliva es menor que en médula ósea. This PhD thesis as a compendium of publications was conceived to go in-depth on the study of the development of assays that could allow the use of saliva samples to diagnose leishmaniosis in dogs. The objectives were: (1) to develop and validate an ultrasensitive assay for anti-Leishmania antibodies quantification that could allow their measurement in serum and saliva of dogs; (2) to evaluate the usefulness of the assay for anti-Leishmania antibodies measurement in both serum and saliva samples as a tool for monitoring the treatment of canine leishmaniosis (CanL); (3) to assess the possible relationship between serum anti-Leishmania antibody levels measured by the new assay and by a commercially-available ELISA kit and the concentration of acute phase proteins; (4) to evaluate and compare the kinetics of anti-Leishmania IgG2 and IgA by the new assay in serum and saliva from experimentally infected dogs with L. infantum during one-year follow-up; (5) to assess the possible circadian rhythm of anti-Leishmania IgG2 and IgA levels in serum and saliva from experimentally infected dogs; and (6) to develop and validate a qPCR for quantification of Leishmania spp. DNA in canine saliva. Precision, accuracy and analytical sensitivity were evaluated by the coefficients of variation intra- and inter-assay, linearity under dilution, percentage of recovery and correlation study, and limits of detection and limits of quantification to validate the new assays. For that, serum and saliva samples from Leishmania-seronegative and Leishmania-seropositive dogs were collected. To evaluate the usefulness of the TR-IFMAs for treatment monitoring, serum samples were obtained from 16 Leishmania-seropositive dogs at the time of diagnosis and after 30 and 180 days of treatment. As well as, to evaluate the utility of the TR-IFMAs for treatment monitoring using saliva samples, serum and saliva samples were collected from 20 dogs with clinical signs compatible with CanL at the time of diagnosis and after 30 days of treatment. Also, 205 serum samples were evaluated to study the correlation between the TR-IFMA, a commercial ELISA and the concentration of acute phase proteins in dogs at the time of diagnosis and during treatment monitoring. To study the kinetics of anti-Leishmania antibody levels, 11 dogs were infected with Leishmania infantum. After, serum and saliva samples were monthly collected during 1-year and analyzed by TR-IFMAs. To assess the possible circadian rhythm in the levels of anti-Leishmania antibodies serum and saliva of 6 dogs experimentally infected presenting clinical signs of CanL were collected during a 16-h period at 4-h intervals on two consecutive days. Finally, to develop and validate a qPCR for the detection of Leishmania spp. DNA in saliva of dogs, saliva samples from 16 dogs experimentally infected were collected pre-infection and at 16-weeks post-infection. The conclusions of this PhD thesis are: 1. The immunofluorometric assays developed in this PhD thesis allow the quantification of anti-Leishmania IgG2 and IgA in canine serum and saliva samples in a reliable way. An overlap between seropositive and seronegative dogs was observed for IgA. 2. The assays developed detect decreases in anti-Leishmania IgG2 and IgA levels in serum and saliva from dogs with clinical leishmaniosis after treatment, which is associated with clinical improvement. 3. The assay developed for anti-Leishmania IgG2 is more correlated with CRP and ferritin concentrations than the ELISA results in treated dogs. 4. Levels of anti-Leishmania IgG2 and IgA in canine serum and saliva increase after experimental infection, surpassing the cut-off approximately one month earlier in serum than in saliva. Anti-Leishmania IgG2 shows better diagnostic value than IgA. 5. No circadian rhythm is observed for anti-Leishmania IgG2 and IgA levels in both serum and saliva samples of dogs with CanL during a 16 h-period. Additionally, higher intra-individual variations in the specific antibody levels are observed in saliva than in serum. 6. The qPCR assay developed allows the quantification of Leishmania kDNA in saliva samples of experimentally infected dogs with L. infantum. However, the sensitivity of this assay in the saliva is lower than in bone marrow.

Los objetivos de esta tesis fueron aumentar el conocimiento en biomarcadores de obesidad en perros tales como proteína C-reactiva (CRP), adiponectina (ADP), glucosa, fructosamina e insulina. Además, se evaluó la relación con la obesidad humana en los países europeos. Para llevar a cabo el estudio de CRP, se realizó una validación analítica de un inmunoensayo heterólogo disponible comercialmente para mediciones automáticas de CRP canina y compararlo con tres inmunoensayos homólogos diferentes. Además, se evaluó su capacidad para detectar inflamación en suero canino y la variación de las mediciones de CRP utilizando muestras individuales o agrupadas para fines de validación. La ADP se investigó mediante el desarrollo de un ensayo de alta sensibilidad para medir esta proteína en la saliva y el suero de perros con obesidad y leishmaniosis. Además, se realizó una técnica específica de digestión de proteasas para el aislamiento de isómeros ADP en suero de perro. Los biomarcadores de la homeostasis de la glucosa en la saliva del perro se estudiaron mediante la validación de ensayos automatizados para mediciones de glucosa y fructosamina y un ensayo ELISA para la determinación de insulina. Los ensayos se emplearon para evaluar los cambios en la saliva de los perros después de una administración experimental de glucosa. Finalmente, para investigar las percepciones de los dueños de perros sobre la obesidad entre ellos mismos y sus perros, e identificar factores comunes y posibles factores sociales, ambientales y económicos que podrían relacionarse con la obesidad en estos, se realizó un estudio transversal basado en un cuestionario llevado a cabo en varios países europeos. Los resultados de los artículos que componen esta tesis evidenciaron que el ensayo heterólogo para la determinación de PCR mostró resultados similares a los ensayos homólogos en la evaluación analítica y que por lo tanto indican que el ensayo fue preciso y exacto. Además, fue capaz de detectar valores más altos de CRP en perros con afecciones inflamatorias en comparación con perros sanos. Además, por su parte el nuevo método ultrasensible desarrollado en esta tesis fue capaz de medir ADP en suero y saliva de perros con alta repetitividad y sensibilidad, con un límite de cuantificación más bajo que los ELISA disponibles comercialmente. Las concentraciones de ADP determinadas por este ensayo disminuyeron en perros obesos en comparación con perros delgados y se observó correlación entre suero y saliva. Además, los perros con leishmaniosis presentaron niveles disminuidos de ADP. El uso de digestión selectiva de proteasas detectó los diferentes isómeros de ADP en suero canino y las formas HMW y LMW se incrementaron en perros Beagle después de un programa experimental de pérdida de peso. Finalmente, los factores comunes asociados con la obesidad en los propietarios y sus perros identificados por el estudio de caso de obesidad fueron la edad, el sexo y las actitudes de los propietarios hacia la dieta y la actividad física. Observando que los dueños de perros que no consideraban la obesidad como una enfermedad tenían más probabilidades de tener perros obesos. ABSTRACT The objectives of this thesis were to increase the knowledge in biomarkers of obesity in dogs such as C-reactive protein (CRP), adiponectin (ADP), glucose, fructosamine and insulin. In addition, the relationship with human obesity around European countries was assessed. To carry out the CRP study, an analytical validation of a commercially available heterologous immunoassay for automated measurements of canine CRP and compare it with three different homologous immunoassays were performed. In addition, its capability to detect inflammation in canine serum and the variation of CRP measurements using individual or pooled samples for validation purposes was assessed. ADP was investigate by developing a high-sensitive assay to measure this protein in saliva and serum of dogs with obesity and leishmaniosis. In addition, a specific protease digestion technique for ADP isomers isolation in dog serum was accomplished. The glucose homeostasis biomarkers in dog saliva were studied through the validation of automated assays for glucose and fructosamine measurements and an ELISA assay for insulin determination. The assays were employed to assess the changes in saliva of dogs after an experimental glucose administration. Finally, to investigate dog owner perceptions about obesity among themselves and their dogs, and identify common factors and possible social, environmental and economic drivers that could relate to obesity in dog-owners and their dogs, a cross-sectional questionnaire-based study was performed across multiple European countries. The results of the articles compounding this thesis indicate that the heterologous assay for CRP determination showed similar results to the homologous assays in the analytical evaluation that indicated that the assay was precise and accurate. In addition, it was able to detect higher CRP values in dogs with inflammatory conditions compared to healthy dogs. Moreover, the new ultrasensitive method was able of measure ADP in serum and saliva of dogs with high repeatability and sensitivity, adding a limit of quantification lower than commercially available ELISAs. ADP concentrations determined by this assay were decreased in obese dogs compared with lean dogs and correlation between serum and saliva were observed. In addition, dogs with leishmaniosis presented decrease levels of ADP. The use of selective protease digestion detected the different ADP isomers in canine serum and the HMW and LMW forms were increased in Beagles dogs after an experimental weight loss program. Finally, the common factors associated with obesity in owners and their dogs identified by the obesity-case study were age, gender and owners’ attitudes to diet and physical activity. Remarking that dog-owners who did not consider obesity to be a disease were more likely to have obese dogs

Tesis - Universidad CEU Cardenal Herrera (Valencia), Facultad de Veterinaria, Departamento de Medicina y Cirugía Animal, leída el 09-06-2017. El uso de la saliva como medio diagnóstico es cada vez más frecuente. De hecho, se ha podido constatar dicha utilidad en la detección de diversas sustancias, así como en el diagnóstico de algunas enfermedades. Por su parte, el daño muscular conlleva el incremento en sangre de ciertas enzimas, como CK, AST y LDH. El objetivo de la presente tesis doctoral es comprobar que la saliva puede usarse para detectar el daño muscular. Y de forma paralela evaluar cómo afectan diferentes condiciones de colección, procesado y almacenamiento de muestras de saliva sobre las enzimas de daño muscular. Para llevar a cabo tal objetivo se plantearon 4 estudios relacionados entre sí. En el primero de ellos se analizaron las variaciones enzimáticas que había entre las muestras de saliva sin tratar, las centrifugadas y las centrifugadas con algodón; a su vez se estudiaron diferentes métodos de centrifugación, con diferentes tiempos y fuerzas. En el segundo estudio, se analizaron las variaciones enzimáticas que había en las muestras de saliva al someterlas a diferentes condiciones de almacenamiento en el tiempo: a temperatura ambiente, refrigeración, a -20°C y a -80°C. Por otro lado, también se evaluó la estabilidad enzimática tras varios ciclos de congelación y descongelación a -20°C y a -80°C. En el tercer lugar, se recurrió a un modelo animal de daño muscular, ovariohisterectomía por el flanco en perro, en el que se midieron los valores de las enzimas CK y AST en suero y saliva, antes y después de la cirugía. Por último, el cuarto estudio midió los valores enzimáticos de CK, AST y LDH en jugadores de futbol sala, antes y después (varios tiempos) del partido, en suero y en saliva. Tras el análisis de los resultados se llegó a las siguientes conclusiones. En el primer estudio se llegó a la conclusión de que la centrifugación de las muestras de saliva mejora altamente la precisión de los análisis. En el segundo a que el método de conservación más apropiado es a -80°C. Finalmente, el tercer y cuarto estudios ponen de manifiesto que las enzimas estudiadas se incrementan tras un evento que implica un daño muscular. En definitiva, la saliva se configura como un buen medio diagnóstico para el daño muscular, con gran potencial clínico a desarrollar. / The use of saliva as a diagnostic medium is increasing during last years. In fact it has been possible to verify this utility in the detection of various substances and in the diagnosis of some diseases. On the other hand, muscle damage increases blood levels of certain enzymes such as CK, AST and LDH. The aim of this Thesis was to know if saliva could be used to detect muscle damage. And also, evaluate how the different conditions of collection, processing and storage of saliva samples affect to the studied enzymes. To achieve this objective 4 studies were performed in saliva. In the first study the enzymatic variations between the saliva untreated samples, the centrifuged samples and the centrifuged samples with cotton were analyzed and, also different methods of centrifugation were studied with different times and forces. In the second study the stability of the studied enzymes under different storage conditions were analyzed. Concretely at room temperature, under refrigeration, at -20°C and -80°C. On the other hand the enzymatic stability was evaluated after several cycles of freezing and thawing at -20°C and at -80°C. In the third study CK and AST enzymes were measured in serum and saliva before and after an ovariohysterectomy. Finally, in the fourth study CK AST and LDH were measured in serum and in saliva in soccer players before and after the match. After the analysis of the results the following conclusions were (1) the centrifugation of the saliva samples improves highly the precision of the analysis, (2) the best conservation method is at -80°C. Finally, the third and the fourth studies shown that the enzymes studied increased after an event involving muscle damage. In conclusion saliva is configured as a good diagnostic medium for muscle damage with great clinical potential to be developed.

OBJETIVOS 1. Evaluar el uso de la alfa amilasa salivar como marcador de estrés usando técnicas tradicionales (ensayos enzimáticos) en humana, usando como modelo experimental a estudiantes de veterinaria que tenían que realizar una presentación oral de un trabajo en lengua extranjera. 2. Evaluar el uso de la alfa amilasa salivar como marcador de estrés usando técnicas tradicionales (ensayos enzimáticos) en cerdos. 3. Implementar nuevos enfoques para la medición de la alfa-amilasa en muestras de saliva de varias especies (incluidos los seres humanos) mediante la cuantificación directa de la cantidad de la alfa-amilasa salival en lugar de mediante la medición de su actividad 4. Detectar e identificar nuevos biomarcadores de estrés en la saliva mediante técnicas de proteómica. Una técnica avanzada que permite la separación e identificación de múltiples proteínas. METODOLOGÍA Esta tesis doctoral es un compendio de los siguientes artículos publicados: 1) Assessment of Stress Associated with an Oral Public Speech in Veterinary Students by Salivary Biomarkers. Tecles F, Fuentes-Rubio M, Tvarijonaviciute A, Martínez-Subiela S, Fatjó J, Cerón JJ. (2014) J Vet Med Educ. Jan 21:1-7. [Epub ahead of print]. 2) Validation of an automated method for salivary alpha-amylase measurements in pigs (Sus scrofa domesticus) and its application as a stress biomarker. Fuentes M, Tecles F, Gutiérrez A, Otal J, Martínez-Subiela S, Cerón JJ. (2011) J Vet Diagn Invest. Mar;23(2):282-7. 3) Porcine salivary analysis by two-dimensional gel electrophoresis in three acute stress models: a pilot study. Fuentes-Rubio M, Cerón J, de Torre C, Escribano D, Gutiérrez AM, Tecles F. (2014) Can J Vet Res. Apr;78(2):127-32. En el primer artículo, se midió el cortisol salival y la actividad alfa-amilasa para evaluar el estrés asociado con una presentación oral pública de los estudiantes de Patología Clínica Veterinaria. Se recogieron muestras de saliva antes y directamente después de la presentación oral de 5 minutos y a los 20 y 35 minutos después del comienzo de la misma. El cortisol alcanzó su punto máximo 20 minutos después del comienzo de la presentación, mientras que la alfa-amilasa salival alcanzó su máximo justo al final del discurso. No existió relación entre estos cambios y el nivel de estrés que se indica por el estudiante en un cuestionario, ni con el sexo del estudiante, o la calidad de la presentación. El objetivo del segundo estudio fue validar un método espectrofotométrico automatizado para la medición de alfa-amilasa salival en cerdos y evaluar su posible aplicación como biomarcador de estrés no invasivo . La validación analítica incluyó la precisión intra- e inter- ensayo, linealidad bajo dilución, y límite de detección. Además, para estudiar el posible uso de alfa- amilasa salival como marcador de estrés, 12 cerdos en crecimiento de 3-4 meses de edad fueron sometidos a estrés por inmovilización durante al menos 1 min, obteniéndose muestras de saliva en diferentes puntos de tiempo. Los resultados de la validación analítica indicaron que el método era preciso y capaz de medir la alfa-amilasa de una manera lineal. Los resultados obtenidos en la prueba de esfuerzo mostraron un aumento significativo en la actividad salival alfa amilasa. El propósito del artículo 3 fue estudiar los cambios en el proteoma salival de cerdos sanos en situaciones de estrés para identificar cualquier posible nuevo biomarcador salival de estrés. Tres grupos de animales fueron sometidos a 3 modelos de estrés: restricción seguido de muestreo simulado de sangre de la vena cava; transporte breve por carretera; restricción de movimiento en una jaula digestibilidad. La saliva se obtuvo de cada animal antes, 15 y 30 min después de la inducción de estrés. Las muestras de los animales que mostraron el mayor incremento en la concentración de cortisol salivar se agruparon y se realizó una electroforesis en geles bidimensionales. Se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue R-250 para la detección de spots y seleccionarlos para su identificación mediante espectrometría de masas. Los análisis estadísticos demostraron que 2 proteínas tenían diferencias significativas en la expresión antes y después de la inducción de estrés y fueron identificadas como fragmentos de albúmina y proteína de unión odorizante. CONCLUSIONES 1. La actividad enzimática de la alfa amilasa salivar puede ser usada como biomarcador de estrés en estudiantes de Veterinaria tras someter a los individuos a una presentación pública oral. 2. La actividad enzimática de la alfa amilasa salivar puede ser usada como biomarcador de estrés en cerdos tras someter a los individuos a un protocolo de restricción de movimientos. 3. La concentración de alfa amilasa en saliva de humanos, cerdos, caballos y ovejas puede ser cuantificada mediante un ensayo de inmunofluorometría a tiempo resuelto. Este ensayo tiene una variación inter-individual baja y es más sensible que los ensayos enzimáticos para detectar estrés. 4. El proteoma salivar de los cerdos ha revelado diferencias entre animales en condiciones basales y bajo condiciones de estrés. Esto se reveló como una herramienta útil para buscar posibles nuevos biomarcadores de estrés in estos animales tales como la proteína de unión odorizante., OBJECTIVES 1. To evaluate the use of salivary alpha-amylase as a marker of stress using traditional techniques (enzymatic assays) in human using a model in which veterinary students had to make an oral presentation in a foreing language. 2. To evaluate the use of salivary alpha-amylase as a marker of stress using traditional techniques (enzymatic assays) in pigs. 3. To implement new approaches for measuring alpha-amylase in saliva samples of several species (including human beings) by direct quantification of the amount of the salivary alpha-amylase instead of by measuring its activity (Article 3, Article 4, Article 5, Article 6). 4. To detect and identify new biomarkers of stress in saliva by proteomics. An advanced technique that allows separation and identification of multiple proteins. METHODOLOGY This PhD thesis is a compilation of the following published papers: 1) Assessment of Stress Associated with an Oral Public Speech in Veterinary Students by Salivary Biomarkers. Tecles F, Fuentes-Rubio M, Tvarijonaviciute A, Martínez-Subiela S, Fatjó J, Cerón JJ. (2014) J Vet Med Educ. Jan 21:1-7. [Epub ahead of print]. 2) Validation of an automated method for salivary alpha-amylase measurements in pigs (Sus scrofa domesticus) and its application as a stress biomarker. Fuentes M, Tecles F, Gutiérrez A, Otal J, Martínez-Subiela S, Cerón JJ. (2011) J Vet Diagn Invest. Mar;23(2):282-7. 3) Porcine salivary analysis by two-dimensional gel electrophoresis in three acute stress models: a pilot study. Fuentes-Rubio M, Cerón J, de Torre C, Escribano D, Gutiérrez AM, Tecles F. (2014) Can J Vet Res. Apr;78(2):127-32. In the first article, salivary cortisol and alpha-amylase activity were measured to assess stress associated with a public oral presentation in Veterinary Clinical Pathology students. Stimulated saliva samples were collected before and directly after a 5-minute oral presentation and at 20 and 35 minutes after the beginning of the presentation. Cortisol peaked 20 minutes after the beginning of the presentation, whereas salivary alpha-amylase (sAA) peaked at 5 minutes, just at the end of the speech. These changes were not related to the level of stress that was indicated by the student in a questionnaire, the student’s sex, or the quality of the presentation. The aim of the second study was to validate an automated spectrophotometric method for salivary alpha-amylase measurement in pigs and evaluate its possible application as a noninvasive stress biomarker. The analytical validation included intra- and interassay precision, linearity under dilution, and limit of detection. In addition, to study the possible use of salivary alpha-amylase as a possible stress marker, 12 crossbred growing pigs of 3-4 months of age were subjected to restraint stress by a nasal snare for at least 1 min, and saliva samples were obtained at different time points. The results of analytical validation indicated that the method was precise and able to measure alpha-amylase in a linear manner. The results obtained in the stress test showed a significant increase in salivary alpha-amylase activity. The purpose of the research of article 3 was to study changes in the salivary proteome of healthy pigs in stressful situations to identify any potential new salivary biomarker of stress. Three groups of animals were subjected to 3 stress models: snaring restraint followed by simulated sampling of vena cava blood; brief transport by road; and restriction of movement in a digestibility cage. Saliva was obtained from each animal before and 15 and 30 min after the induction of stress. The samples from the animals that showed the greatest increase in salivary cortisol concentration were pooled and run on 2-dimensional gels. Coomassie Brilliant Blue R-250 was used for spot detection and mass spectrometry for spot identification. Statistical analyses showed that 2 proteins had significant differences in expression before and after the induction of stress. These proteins were identified as odorant-binding protein and fragments of albumin. CONCLUSIONS 1. The enzymatic activity of salivary alpha-amylase can be used as biomarker of stress in Veterinary students after subjecting the individuals to a public oral presentation. 2. The enzymatic activity of salivary alpha-amylase can be used as biomarker of stress in pigs after subjecting the individuals to restraint of movement protocol. 3. Alpha-amylase concentration in saliva of humans, pigs, horses and sheep can be quantified by TR-IFMA This assay has a lower inter-individual variation and is more sensitive than enzymatic assays to detect stress. 4. Salivary proteome of pigs has revealed differences between animals in basal status and under stress conditions. It was shown as a useful tool to search possible new salivary biomarkers of stress in these animals such as odorant-binding protein.

Se realizaron cuatro experiencias con el fin desarrollar métodos simples y sensibles para la determinación de las proteínas de fase aguda en muestras de saliva y jugo cárnico de cerdo, y contribuir a un mayor conocimiento sus posibles usos y aplicaciones. En la primera experiencia se desarrolló y optimizó un inmunoensayo para la determinación de la haptoglobina porcina en muestras de saliva y jugo cárnico basado en la fluorometría a tiempo resuelto. En la segunda experiencia se adaptó un inmunoensayo, previamente desarrollado para la determinación de la proteína C reactiva en muestras de sangre entera porcina, para la cuantificación de los niveles de dicha proteína en muestras de saliva y jugo cárnico. La tercera experiencia se centró en estudiar la utilidad práctica de los fluoroinmunoensayos desarrollados para evaluar la respuesta de fase aguda en enfermedades producidas en condiciones de campo. Además se valoró si la saliva y el jugo cárnico podrían utilizarse como muestras alternativas al suero sanguíneo para la determinación de Hp y CRP porcina. Finalmente, la cuarta experiencia consistió en un estudio proteómico en muestras de saliva porcina. Se utilizaron técnicas electroforéticas de alta resolución para realizar la separación de las proteínas salivares en una y dos dimensiones y permitir la identificación de dichas proteínas mediante inmunoblot y espectrofotometría de masas., The objectives of the present study were:1. To develop and validate a time resolved immunofluorometric assay (TR-IFMA) for Hp quantification in saliva and meat juice of pigs, including the study of the stability of Hp in those body fluids. A monoclonal antibody against porcine Hp was produced for this purpose allowing the development of a fast one-step assay that give results of a 95 wells plate in only 20 minutes.2. To develop and validate a TR-IFMA for CRP quantification in saliva and meat juice of pigs, including the study of the stability of CRP in those body fluids.3. To perform a clinical evaluation of the two TR-IFMAs developed in field conditions. For this purpose Hp and CRP were quantified in serum, saliva and meat juice of animals with PRRS at different ages and the results were compared in order to assess the usefulness of APP determinations in saliva and meat juice as an alternative to serum.4. To perform a preliminary evaluation of whole saliva by proteomics for possible identifications of new biomarkers of disease in pigs.