Search

During regeneration, lost structures are rebuilt and perfectly integrated within the remaining non-injured tissues. This fascinating process captured the attention of one of the founders of modern genetics, T. H. Morgan. He was particularly interested in understanding regeneration in freshwater planarians, which can regenerate a whole animal from a small piece of their bodies. He performed numerous experiments to understand how polarity is re-established such that an anterior-facing wound regenerates a head whereas a posterior-facing wound regenerates a tail. However, it has not been until more than 100 years later that the molecules required to determine axial polarity have been identified. Several studies have now shown that the Wnt/β-catenin and Hedgehog pathways are required for anteroposterior axis specification, whereas the establishment of the planarian dorsoventral (DV) axis relies on the Bone Morphogenetic Protein (BMP) pathway. Two recent papers have now uncovered additional conserved (anti-dorsalizing morphogenetic protein) and novel (noggin-like genes) elements that regulate planarian DV axis regeneration. Here, we summarize those results and present new data and hypotheses to explain the role that noggin-like genes might play.

La regeneració és la capacitat d'un organisme de reemplaçar fragments perduts a causa d'una amputació traumàtica o degeneració. La regeneració de les noves estructures té lloc bé a partir de proliferació cel·lular i formació de novo, bé per remodelació dels teixits preexistents. Les planàries poden regenerar un nou organisme sencer a partir de petits fragments del seu cos. Aquest fet ha atret l'interès dels científics al llarg de la història. El 1814, Dalyell conclou que les planàries «es poden considerar immortals sota la fulla d'una navalla ». La regeneració en les planàries requereix la generació de teixit nou en el lloc de la ferida mitjançant proliferació cel·lular, que produeix un teixit nou indiferenciat, el blastema, i el remodelatge dels teixits preexistents per recuperar les proporcions del nou organisme regenerat. Una altra propietat espectacular de les planàries és la capacitat de créixer i decréixer segons la ingesta d'aliment. En tot moment, però, al llarg d'aquest creixement/decreixement es mantenen les proporcions corporals i funcions correctes, gràcies al control homeostàtic. Tota aquesta plasticitat és deguda, a escala cel·lular, a la presència de cèl·lules mare totipotents en un alt percentatge (entre el 20-30 % del total cel·lular en un organisme adult). Una altra propietat fonamental és la contínua activitat dels mecanismes morfogenètics, que normalment apareixen una sola vegada en el desenvolupament de la resta dels altres organismes. L'aplicació de noves metodologies a escala cellular, molecular i genètica en l'era postgenòmica ens ha permès estudiar funcionalment vies i gens del desenvolupament en un nou escenari, la regeneració de planàries., Planarian regeneration and homeostasis, a classic developmental biology model. Regeneration is the ability of the fully developed organism to replace fragments lost by traumatic amputation or degeneration. Regeneration of the new structures is achieved either by cell proliferation and de novo formation, or by remodelling of the pre-existing tissues. Planarians, which can regenerate a whole new organism from a small piece of their body, have attracted the interest of scientists throughout history. In 1814, Dalyell concluded that planarians could “almost be called immortal under the edge of the knife”. Planarian regeneration involves the generation of new tissue at the wound site via cell proliferation, producing a new undifferentiated tissue or blastema, and the remodelling of pre-existing tissues to restore proportions. Another astonishing property of planarians is their capacity to grow and shrink depending on food availability and temperature. Remarkably, during the whole growth/degrowth process planarians keep normal body proportions and functions, thanks to a homeostatic control. All that plasticity is based, at the cellular level, upon the presence of totipotent stem cells in a high proportion (20-30% of total cell number in an adult organism). Another basic property is the continuous activity of the morphogenetic mechanisms that usually appear only once during the development of other model systems. The application of new methodologies at the cellular, molecular and genetic level in the postgenomics era allows us to functionally analyse the universal developmental pathways and genes in a new scenario, planarian regeneration.

Background Freshwater planarians are an attractive model for regeneration and stem cell research and have become a promising tool in the field of regenerative medicine. With the availability of a sequenced planarian genome, the recent application of modern genetic and high-throughput tools has resulted in revitalized interest in these animals, long known for their amazing regenerative capabilities, which enable them to regrow even a new head after decapitation. However, a detailed description of the planarian transcriptome is essential for future investigation into regenerative processes using planarians as a model system. Results In order to complement and improve existing gene annotations, we used a 454 pyrosequencing approach to analyze the transcriptome of the planarian species Schmidtea mediterranea Altogether, 598,435 454-sequencing reads, with an average length of 327 bp, were assembled together with the ~10,000 sequences of the S. mediterranea UniGene set using different similarity cutoffs. The assembly was then mapped onto the current genome data. Remarkably, our Smed454 dataset contains more than 3 million novel transcribed nucleotides sequenced for the first time. A descriptive analysis of planarian splice sites was conducted on those Smed454 contigs that mapped univocally to the current genome assembly. Sequence analysis allowed us to identify genes encoding putative proteins with defined structural properties, such as transmembrane domains. Moreover, we annotated the Smed454 dataset using Gene Ontology, and identified putative homologues of several gene families that may play a key role during regeneration, such as neurotransmitter and hormone receptors, homeobox-containing genes, and genes related to eye function. Conclusions We report the first planarian transcript dataset, Smed454, as an open resource tool that can be accessed via a web interface. Smed454 contains significant novel sequence information about most expressed genes of S. mediterranea. Analysis of the annotated data promises to contribute to identification of gene families poorly characterized at a functional level. The Smed454 transcriptome data will assist in the molecular characterization of S. mediterranea as a model organism, which will be useful to a broad scientific community.

Tesis llevada a cabo para conseguir el grado de Doctor por la Universidad de Barcelona.--2017-09-14, [EN] During early development of bilaterian animals, specific body structures are formed and body axes are established. The establishment of body axes requires the precise and coordinated function of signalling pathways and transcription factors that induce changes at the level of genetic material. The formation of the dorsoventral (DV) axis in the early embryo of Drosophila melanogaster is controlled mainly by the nuclear factor Dorsal (Dl), which forms a ventral to dorsal gradient and both activates and represses genes along the presumptive DV axis. In this thesis we have focused on the transcriptional repression occuring during DV axis establishment. Through genetic and biochemical analysis we have dissected the function of an additional nuclear factor, Capicua (Cic) in the repression of Dl target genes. Cic had been previously suggested to be involved in the repression of Dl targets, however this possible function was obscured by its function in DV patterning during oogenesis. During oogenesis, Cic acts as a member of the signalling pathway that establishes the formation of the Dl gradient in the embryo, thus affects both Dl-dependent activation and repression. We have found that, independently of its function in the ovary, Cic is involved in repression occuring DV patterning of the embryo, and that these two functions are carried by distinct isoforms of the protein. The main embryonic isoform, which was previously characterized, participates in DV patterning of the embryo, while the function of oogenesis is exerted by a different, yet uncharacterized isoform. Repression of genes in the DV axis depends on short enhancer elements (VRE elements), that contain Dl binding sites and AT-rich sequences that highly resemble the consensus binding site for Cic in its other targets in the early embryo. We have detected a direct interaction between the embryonic Cic protein and the AT-rich sequences adjacent to the Dl binding sites in the VRE elements of two genes repressed by Dl: zerknüllt (zen) and tolloid (tld). This interaction is of low affinity and, as a consequence, depends on the presence of Dl in the nuclei. Therefore, repression occurs only in ventral regions, where both Cic and Dl are active, distinguishing repression of DV genes from other Cic targets. Furthermore, we have shown that Cic is the key factor for the recruitment of the Groucho (Gro) corepressor to the regulatory sequences of zen. Finally, we have shown that Cic acts as a sensor of the Torso RTK pathway during repression of genes along the DV axis., [ES] Durante el desarrollo temprano de los animales bilaterales se forman estructuras específicas y se establecen ejes corporales. El establecimiento de los ejes corporales requiere el funcionamiento preciso y coordinado de vías de señalización y factores de transcripción que producen cambios a nivel genético. En esta tesis, nos hemos centrado en la formación del eje dorsoventral (DV) en el embrión temprano de Drosophila melanogaster, que esta regulado mayoritariamente por el factor nuclear Dorsal (Dl). Nos hemos enfocado en la represión transcripcional que ocurre durante dicho proceso. Mediante análisis genéticos y bioquímicos hemos descrito el papel de otro factor nuclear, el represor Capicua (Cic) en la represión de genes dianas de Dl. Nuestro estudio demuestra una implicación directa de Cic en la represión de los genes diana de Dl. Hemos visto una unión directa de Cic en cis-elementos que están adjuntos a los sitios de unión de Dl en los promotores de los genes diana. La unión de Cic a estos sitios ocurre con baja afinidad y, como consecuencia, depende de la presencia de Dl en el núcleo. Además, hemos demostrado que Cic es el elemento clave para el reclutamiento del corepresor Groucho (Gro) a las secuencias reguladoras de los genes reprimidos en el eje DV. Por último, hemos visto que la regulación de Cic por la vía de señalización RTK Torso es el mecanismo principal de modulación de la represión de los genes diana de Dl en las extremidades del embrión

[spa] Esta tesis doctoral estudia la evolución de la vía de señalización de los receptores de los factores de crecimiento epidérmicos (EGFR) en animales, y la identificación y caracterización de sus componentes principales –los receptores EGFR y los ligandos EGF—en la planaria Schmidtea mediterranea. Los resultados obtenidos sugieren que esta vía de señalización apareció muy temprano durante la evolución animal, ya que el ancestro común a todos los metazoos probablemente presentaba un receptor EGFR y un ligando EGF. Posteriormente, este complemento básico ha experimentando modificaciones independientes –pérdida o ganancia de elementos— en algunos grupos y/o especies. La planaria S. mediterranea es un claro ejemplo de expansión de la vía EGFR, puesto que tiene seis receptores EGFR y nueve ligandos EGF, uno de los cuales es de tipo neuregulina, subclase presente exclusivamente en Bilaterales. El estudio detallado de cada uno de estos elementos nos ha permitido demostrar que tanto los receptores como los ligandos se encuentran expresados en una gran variedad de tejidos en planarias y realizan una gran diversidad de funciones, tales como el mantenimiento y regeneración de la faringe, del sistema digestivo, del sistema excretor y de las células pigmentarias de los ojos. La activación del receptor EGFR, Smed-egfr-1, a través de la unión de su posible ligando Smed-nrg-1 es esencial para la diferenciación de las células madre de estos animales –los neoblastos—a células gastrodérmicas maduras. Nuestros resultados apoyan que la función de la vía EGFR en el mantenimiento y diferenciación de las células madre de animales está conservada en planarias. En conclusión, esta tesis doctoral avanza el conocimiento que tenemos de la vía EGFR en la evolución animal y en un modelo regenerativo como la planaria S. mediterranea, así como de los mecanismos que regulan las células madre adultas de estos organismos., [eng] This thesis studies the evolution of the epidermal growth factor receptor signaling pathway (EGFR) in animals, and the identification and characterization of its main components –the EGFR receptors and the EGF ligands– in the planarian Schmidtea mediterranea. The results obtained suggest that this signaling pathway appeared very early in animal evolution, since the common ancestor of all metazoans probably had one EGFR and one EGF ligand. Subsequently, this basic complement has undergone independent modifications -–gain or loss of elements– in some groups and / or species. The planarian S. mediterranea is a clear example of expansion of the EGFR pathway, since it has six EGFR and nine EGF ligands, one of which is a neuregulin type, subclass present exclusively in Bilateria. The detailed study of each of these elements has allowed us to demonstrate that both, receptors and ligands, are expressed in a wide variety of tissues in these animals and perform multiple functions, such as the maintenance and regeneration of the pharynx, the digestive system, the excretory system and the eye pigment cells. Specifically, the activation of the receptor Smed-egfr-1 through the binding of its possible ligand Smed-nrg-1, is essential for the differentiation of the stem cells of these animals –the neoblasts– to mature gastrodermal cells. Our results support that the known function of the EGFR signaling pathway in the maintenance and differentiation of the stem cells of other animals, is conserved in planarians. In conclusion, this thesis advances the knowledge we have of the EGFR pathway in animal evolution and in a regenerative model such as the planarian S. mediterranea, as well as in the mechanisms that regulate the adult stem cells of these organisms.

Les planàries d'aigua dolça s’han convertit en un bon model per estudiar la regeneració a nivell genètic i molecular, gràcies a la seva capacitat de reconstruir qualsevol fragment danyat a conseqüència d’una amputació, des de qualsevol eix corporal i formar un nou organisme adult en un termini de temps molt curt. Al mateix temps, durant l’estadi adult en l’absència d’una ferida, les planàries són capaces de reemplaçar les cèl•lules diferenciades dels teixits vells mitjançant una proliferació i diferenciació constant de les cèl•lules mare o neoblasts. Tenim al nostre abast un ampli coneixement sobre diverses rutes de senyalització que controlen l’estricte procés de la regeneració en les planàries. D’altra banda, avui dia encara es desconeix la funció d’algunes de les vies principals i queden molts elements desconeguts per entendre el fenomen de la regeneració. En aquesta tesi doctoral, hem pogut analitzar la funció concreta de la via dels EGFR, sobretot durant la formació del blastema i la regulació del creixement i la diferenciació de les noves estructures anteriors. Mitjançant estudis funcionals a través de la tècnica d’interferència de l’ARN (ARNi) dels tres EGFR identificats, hem observat la participació d’aquesta via en múltiples processos biològics durant la regeneració de les planàries i la homeòstasi. Smed-egfr-1 és necessari per a la regeneració de les cèl•lules pigmentàries dels ulls i la faringe. A més a més, el seu silenciament ocasiona una clara hiperproliferació i la formació d’uns bonys dorsals característics, tant en animals intactes com regenerants. D’altra banda, no es manifesta cap efecte evident després de silenciar Smed-egfr-2. Finalment, podem concloure que Smed-egfr-3 és necessari per la formació del blastema i per la diferenciació de determinats tipus cel•lulars, generalment neuronals. En aquesta tesi ens hem centrat sobretot amb l’estudi del Smed-egfr-3. Amb l’objectiu d’identificar possibles gens diana d’aquest gen i caracteritzar la funció de la via dels EGFR en més detall durant la regeneració de les planàries, hem utilitzat l’eina DGE (“Digital Gene Expression”), que ens permet comparar el transcriptoma dels animals on s’ha silenciat un gen d’interès (en el nostre cas, Smed-egfr-3) amb el dels controls. Així, a partir d’anàlisis del DGE hem pogut conèixer i quantificar l’expressió de possibles gens diana regulats (tant “up” com “down-regulated”) per la via dels EGFR; un d’aquests gens “downregulated” després d’inhibir Smed-egfr-3 és l’egr-4, un membre de la família gènica dels “early growth response”. egr-4 s’expressa majoritàriament en el sistema nerviós central i s’indueix ràpidament després de qualsevol tipus de ferida. El seu silenciament inhibeix la regeneració anterior, mostrant defectes durant la formació dels blastemes anteriors, però sense afectar la regeneració posterior. Aquests organismes tractats exhibeixen uns ganglis cefàlics més petits o fins I tot en alguns casos absents. La diferenciació d’altres tipus cel•lulars presents en la regió anterior també es mostren alterats després de silenciar egr-4. Tot i així, l’expressió primerenca dels determinants de la polaritat que intervenen en el restabliment de la polaritat anterior es mostren inalterats. Experiments simultanis del silenciament d’egr-4 i elements de la via Wnt/beta-cat revelen que egr-4 és necessari per la diferenciació del primordi del cervell. A més a més, els resultats d’aquests experiments suggereixen que egr-4 promou la regeneració cefàlica inhibint l’activitat de beta-catenin en condicions normals. A partir dels resultats obtinguts en aquesta tesi suggerim que egr-4 és un dels primers gens coneguts necessaris per la diferenciació del primordi del cervell durant la regeneració de la planària. En resum, suggerim una relació entre la diferenciació primerenca del cervell i la correcta progressió de la regeneració del cap en les planàries, que podria estar regulada gràcies a l’activació del gen egr-4 a través de la via EGFR, concretament Smed-egfr-3., During freshwater planarians regeneration, polarity and patterning programs play essential roles in determining whether a head or a tail regenerates at anterior or posterior-facing wounds. This decision is made very soon after amputation. The pivotal role of the Wnt/beta-•catenin and Hh signaling pathways in re-establishing anterior4 posterior polarity has been well documented. However, the mechanisms that control the growth and differentiation of the blastema in accordance with its anteriorposterior identity are less well understood. Conserved signa ling pathways play important roles in morphogenesis in all animals. One such pathway is the epidermal growth factor receptor (EGFR) pathway, which regulates multiple biological processes including cell proliferation, differentiation, apoptosis and cell survival. In this thesis, we show that silencing of Smed-egfr4 3, a planarian homologue of epidermal growth factor receptors, impairs regeneration and blastema growth in these organisms, probably by disrupting cellular differentiation. In order to better characterize the function of the EGFR signaling pathway during planarian regeneration, we conducted "Digital Gene Expression" analyses to identify putative target genes of Smed-egfr-3. One of the isolated candidate genes that is downregulated after silencing Smed-egfr-3 is egr-4, a member of the early growth response gene family. egr-4 is mainly expressed in the central nervous system and rapidly induced after different types of injury. While early egr-4 expression after injury is independent of EGFR signa ling, it becomes Smed-egfr4 34 dependent from the second day of regeneration. Functional analyses based on RNA interference (RNAi) reveals that egr-4 is required for head regeneration but not for posterior regeneration; egr-4 silencing impairs the formation of anterior blastemas; these animals exhibit either small cephalic ganglia or a total absence of new brain tissue. Single and combinatorial RNAi to target different elements of the Wnt/beta-•catenin pathway, together with expression analysis of brain4 and anterior4 specific markers, reveal that egr-4 is necessary for the brain primordia differentiation in the early stages of regeneration and it appears to antagonize the activity of the Wnt/~-catenin pathway to allow head regeneration. Our results suggest that a conserved EGFRjegr pathway plays an important role in cell differentiation during planarian regeneration and indicate an association between early brain differentiation and the progression of head regeneration.