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Los cambios económicos, sociales y demográficos en los últimos años en todo el mundo han provocado una presión en la calidad del medio ambiente, el cual ha sido impactado principalmente por actividades humanas como la agricultura, industria y estilo de vida urbano [1, 2]. El desarrollo de estas actividades ha sido un motor para la producción de distintos compuestos orgánicos que han mejorado su rendimiento, pero a su vez se han transformado en contaminantes que impactan los diferentes ecosistemas acuáticos, terrestres y atmosféricos [3, 4]. En este contexto, los contaminantes emergentes se definen como compuestos que no están incluidos actualmente en las regulaciones existentes de calidad del agua o no se han estudiado previamente, y se piensa que son amenazas potenciales para la salud humana y los ecosistemas. Plaguicidas, fármacos, productos de cuidado personal (PCP), esteroides y hormonas, surfactantes, sustancias perfluoroalquilicas (PFASs), retardantes de llama, aditivos y agentes industriales, así como sus productos de transformación (TPs) conforman los principales grupos de contaminantes emergentes que se están investigando en la actualidad [2, 5-9]. Uno de los más importantes grupos de estos contaminantes que está en constante crecimiento son los plaguicidas [4, 10]. Estos compuestos incluyen un amplio rango de sustancias químicas utilizadas para limitar, inhibir y prevenir el crecimiento de animales nocivos, insectos, plantas invasoras, malas hierbas y hongos en la agricultura, ganadería y el hogar[11]. El área mediterránea de Europa se caracteriza por desarrollar una agricultura intensiva y a gran escala, siendo España uno de los principales productores agrícolas y el primer consumidor de plaguicidas (78 toneladas, 2013) según Eurostat (Oficina de Estadística de la Unión Europea) [12]. Los últimos estudios vinculados al análisis de plaguicidas ponen de manifiesto que, aunque principalmente están enfocados a su evaluación en alimentos, en el caso de matrices ambientales hay tres vertientes de enorme importancia: (i) desarrollo de métodos analíticos, (ii) seguimiento de la presencia de estos y otros contaminantes emergentes en las cuencas hidrográficas y (iii) evaluación del riesgo ecotoxicológico. Sin embargo, existen pocas referencias de estudios que aglutinen un análisis integral de las tres vertientes descritas y que posibiliten una comprensión global de la distribución, degradación y acumulación de los plaguicidas en los diferentes compartimentos ambientales, así como un análisis comparativo de este problema en las cuencas mediterráneas. El río Turia está situado en el sureste de España y es uno de los más importantes que drena sus aguas al Mar Mediterráneo. Pertenece a la Demarcación Hidrográfica del Júcar, la cual se caracteriza por una alta presión demográfica (5.162.163 habitantes, 2009) y una importante agricultura de regadío-secano, que ocupa alrededor de la mitad del territorio (350.000 ha), concentrada principalmente en la zona baja de la cuenca [13-15]. Estas características hacen de esta cuenca un espacio importante para el análisis y estudio del comportamiento integral de los contaminantes emergentes. En este contexto, el objetivo principal del presente estudio es evaluar la contaminación por plaguicidas y otros contaminantes emergentes en la Cuenca del Río Turia y está basado (I) en el análisis de diferentes familias de plaguicidas aplicando cromatografía de líquidos con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) y en la determinación del perfil de contaminación global mediante cromatografía de líquidos con espectrometría de masas de alta resolución (LC-HRMS), que nos permitirá comprender la (II) distribución espacial a lo largo de la cuenca como las diferentes vías de (III) transporte, y en relación a las concentraciones encontradas evaluar el (IV) riesgo derivado de la presencia de contaminantes emergentes (plaguicidas) en la fauna y flora acuática a través del coeficiente de riesgo (RQ) y las unidades toxicas (TUs). Complementariamente y con objeto de llegar a conclusiones extrapolables a un ámbito más amplio, se realiza (V) un análisis comparativo con otras cuencas del mediterráneo. Así pues, los Objetivos Específicos planteados para la presente investigación son: 1. Desarrollar métodos analíticos para determinar estos compuestos en diferentes matrices (aguas y sedimentos) hasta niveles traza. 2. Establecer el perfil de los contaminantes emergentes en la cuenca del río Turia. 3. Caracterizar las fuentes que determinan que el contaminante sea liberado al medio y averiguar sus rutas de distribución. 4. Definir y cuantificar los procesos que determinan su transporte y acumulación en el medioambiente. 5. Identificar los efectos ecológicos potenciales debido a la exposición a estos compuestos. 6. Realizar un estudio comparativo con otras cuencas del mediterráneo que nos permita establecer patrones de comportamiento. El desarrollo de estos objetivos permitirá: 1. Comprobar la presencia de contaminantes emergentes en el medioambiente, su dinámica, distribución y destino en la cuenca, como un factor clave para establecer la huella antrópica en la zona de estudio. 2. Evaluar la capacidad de respuesta de la cuenca frente a los diferentes tipos de presiones de origen antrópico (desarrollo urbano, industrial, agrícola, etc.) o natural (erosión, incendios forestales), de cara a su conservación y/o posible recuperación bajo la perspectiva del cambio climático. 3. Desarrollar una base metodológica para la aplicación de la forensía ambiental de modo global y multidisciplinar, para determinar las fuentes puntuales de degradación, química y/o física, que se aplicará a la cuenca del Turia para establecer sus zonas frágiles y su estado de degradación. La presente tesis doctoral está estructurada en dos partes: La primera parte consiste en una profunda revisión bibliográfica que incluye (I) introducción, consumo de plaguicidas (estadísticas), legislación, (II) plaguicidas tradicionales, (III) plaguicidas de nueva generación y (IV) problemática de las cuencas mediterráneas y los contaminantes emergentes. La segunda parte estructura el desarrollo experimental la tesis e incluye la optimización de los métodos analíticos (extracción, identificación y cuantificación de contaminantes emergentes) y su seguimiento en las cuencas a través del análisis dirigido (LC-MS/MS – secciones de V - VII) y no dirigido (LC-HRMS – sección VIII) de contaminantes emergentes. (V). Finalmente, (IX) se presenta el resumen de los resultados y las conclusiones del proyecto de investigación. Al final de la memoria se detalla la bibliografía utilizada, anexos, lista de abreviaturas, tablas y figuras. La estructura de ambas partes en mayor detalle implica: PRIMERA PARTE I) Introducción: Esta sección presenta una visión general de los plaguicidas, su desarrollo a lo largo de la historia, las estadísticas de producción y consumo a nivel mundial, en el área mediterránea y España (Comunidad Valenciana). Se explora la legislación actual de la Unión Europea en relación a los contaminantes emergentes (principalmente plaguicidas) en materia de Límites Máximos Permisibles en alimentos y matrices ambientales. Este apartado nos permite situarnos en el contexto actual de la problemática de los contaminantes emergentes y su impacto en los diferentes compartimentos ambientales. II) Plaguicidas Tradicionales: Se desarrolla una remembranza de la primera, segunda y tercera generación de plaguicidas y sus modos de acción como su toxicidad. Se realiza un especial énfasis en plaguicidas organoclorados, organofosforados, carbamatos y piretroides. Los plaguicidas pertenecientes a estos últimas tres familias han sido incluidas en la lista de búsqueda dirigida para el análisis de los ríos Turia, Júcar y Ebro. III) Plaguicidas de Nueva Generación: Se presenta una perspectiva profunda de los nuevos tipos de plaguicidas introducidos en el mercado: lactonas macrocíclicas, cloronicotinils, tetranortriterpenos, sales de amonio cuaternario, dinitroanilinas, acetamidas y oximas, Se presenta sus propiedades físico-química, toxicidad, regulación, métodos de extracción, métodos analíticos y referencias de estudios que han abordado el análisis de estos compuestos en matrices ambientales, de alimentos y biológicas. Esta revisión bibliográfica se publicará en un capítulo de libro “Pesticides (New Generation) and Related Compounds, Analysis of Pesticides” en la Encyclopedia of Analytical Chemistry, editada on-line por wiley. IV) Problemática de los contaminantes Emergentes en las Cuencas Mediterráneas: acerca de los estudios previos sobre la presencia de los contaminantes emergentes y sus productos de transformación en las principales cuencas mediterráneas de la Union Europea como: Ebro, Llobregat y Turia en España; Po y Tiber en Italia; Guadiana en Portugal; Rhône en Francia y Aliakmon, Axios en Grecia. Se aborda la problemática de los contaminantes emergentes teniendo como factores importantes las condiciones climáticas del área mediterránea y el actual contexto del cambio climático. SEGUNDA PARTE V) Desarrollo de un Método Analítico y de Extracción para Piretrinas y Piretroides (PUBLICACIÓN # 1: Simultaneous determination of pyrethroids and pyrethrins by dispersive liquid-liquid microextraction and liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry in environmental samples. Anal. Bioanal. Chem. (2017) Aceptada (DOI: 10.1007/s00216-017-0422-7): Debido a su creciente utilización en los últimos años, se presenta el desarrollo de un método para el análisis simultaneo de piretrinas naturales y sintéticas basado en la microextracción líquido-líquido dispersiva (DLLME) y cromatografía liquida y espectrometría de masas optimizado para su aplicación en aguas y sedimentos. Se demuestra la eficacia de estos métodos basados en la DLLME para la extracción de piretrinas naturales y sintéticas mediante la aplicación del mismo a muestras de aguas del humedal La Albufera y sedimentos del río Turia. VI) Análisis de Patrón Espacio Temporal de Residuos de Plaguicidas en las Cuencas de Turia y Júcar (2010-2013) (PUBLICACIÓN # 2 Spatio-temporal patterns of pesticide residues in the Turia and Júcar Rivers (Spain)” Sci. Total Environ. 540 (2016) 200-210: presenta el seguimiento de 50 plaguicidas agrupados en las siguientes familias: Anilidas, azol, benzimedazoles, carbamatos, cloroacetanilides, hormonas juvelines mimics, neonicotinoides, organofosforados, tiocarbamatos, triazinas, triazoles, ureas y otros plaguicidas en los ríos Júcar (2010-2011) y Turia (2012-2013). Además, se evaluaron los parámetros físico-químicos de las muestras ambientales y su relación con las concentraciones de plaguicidas encontrados. Asimismo, se procedio a la evaluación de riesgo a través del Coeficiente de Riesgo (RQ) para dafnias, algas y peces en ambos ríos. VII) Presencia y valoración de Riesgos de Plaguicidas en la Cuenca del Ebro (PUBLICACIÓN # 3 Pesticides in the Ebro River basin: Occurrence and risk assessment” en la revista científica Environ. Pollut. 211 (2016) 414-424: Se realizó el mismo seguimiento de plaguicidas en la cuenca del Ebro como estudio comparativo y complementario. En este estudio se evalúo de riesgo para la biota por medio de las Unidades Toxicas (TU), un concepto más integral de la toxicidad de los contaminantes debido a que considera el “cocktail” de concentraciones y su impacto en los distintos niveles tróficos como las dafnias, algas y peces. También se analizó el coeficiente de riesgo (RQ) en los mismos bioindicadores ambientales. VIII) Análisis Dirigido, de Amplio Espectro y no Dirigido en el Río Turia (PUBLICACIÓN # 4: Suspect, non-target and target screening of emerging pollutants using Data Independent Acquisition: Assessment of a Mediterranean River basin. Environ. Sci. Technol. (enviada): Aguas y sedimentos del Turia se analizaron en 2016 utilizando un método analítico (UPLC-QqQ-TOF) de análisis dirigido, de amplio espectro, y no dirigido para identificar emergentes utilizando. El análisis de amplio espectro se basó en la utilización de una librería teórica de 2.200 componentes de Water Corporation (plaguicidas, fármacos, drogas de abuso, productos de cuidado personal y toxinas) y el modo de adquisición de datos “Data Independent Acquisition” (DIA). El análisis no dirigido se realizó con la ayuda de bases de datos como el Chem. Spider. Finalmente, se desarrolló un método de análisis dirigido a 170 plaguicidas y 33 fármacos, incluyendo los encontrados en el análisis de amplio espectro y no dirigido. IX) Resumen de Resultados y Conclusiones: En este apartado se presenta un resumen detallado de los resultados obtenidos a lo largo de la investigación de la presente tesis doctoral. Finalmente, se presentan las conclusiones generales de esta tesis doctoral. De acuerdo a los objetivos planteados en la presente investigación se llegaron a las siguientes conclusiones: Primera: Los métodos analíticos basados en la cromatografía líquida de ultra alta resolución y espectrometría de masas en tándem (triple cuadrupolo) utilizando electrospray en modo de ionización positiva y trabajando en modo de monitorización de reacciones seleccionadas son selectivos, sensibles, fiables y eficaces para la separación, detección y cuantificación de plaguicidas en extractos de aguas y sedimentos. Segunda: Complementariamente, la búsqueda no dirigida de contaminantes a través de un espectrómetro de masas de alta resolución (cuádruplo tiempo de vuelo) permitió identificar contaminantes emergentes no seleccionados “a priori” configurándose como una herramienta indispensable para análisis integral de los patrones de contaminación que presentan las cuencas hidrográficas. Tercera: La optimización de la microextracción líquido-líquido dispersiva para la extracción simultánea de piretrinas naturales y sintéticas en aguas proporcionó buenas recuperaciones y altos factores de enriquecimiento. Esta técnica es ecológica debido la baja cantidad del disolvente utilizado (200 µL). Sin embargo, su aplicación se restringe a compuestos apolares (Kow>3) a diferencia de la extracción en fase sólida que es capaz de separar y concentrar más de 50 plaguicidas en aguas abarcando un amplio rango de polaridades. Cuarta: Los métodos de extracción de plaguicidas para sedimentos implican una extracción sólido-líquido con acetonitrilo incluyendo QuEChERS y otros sistemas. La microextracción líquido-líquido dispersiva puede combinarse como una etapa de purificación a estos métodos de extracción proporcionando un incremento de la sensibilidad debido al elevado factor de concentración para piretrinas y piretroides. Quinta: En las campañas de muestreo que se desarrollaron en el Turia analizando 50 plaguicidas se detectaron 33 en agua en 2012 y 44 en 2013 a concentraciones superiores a los límites de detección. Comparativamente, en 2010-2011 se detectaron 22 y 18 plaguicidas en el Júcar y 29 y 32 en el Ebro, respectivamente. Las principales familias de plaguicidas fueron organofosforados, triazinas, azoles y carbamatos. Algunos plaguicidas encontrados sobrepasaron los límites (> 100 ng mL-1) permisibles establecidos por la normativa de calidad de aguas potables. También se detectaron plaguicidas prohibidos en la UE, su presencia puede justificarse por su capacidad de persistencia y formar depósitos. Sexta: De los 50 compuestos analizados en los años 2012 y 2013 en los sedimentos del río Turia se detectaron 10 y 5 plaguicidas, respectivamente. En el río Júcar, en la campaña 2010-2011 se encontraron 8 y 12 plaguicidas y en las muestras del Ebro 6 y 7 respectivamente. Los plaguicidas son más frecuentes en aguas que en sedimentos. Esto se debe probablemente a la polaridad de los contaminantes identificados. Séptima: En 2016, se amplió el número de compuestos analizados a 171 plaguicidas y 33 fármacos. Se detectaron 33 y 7, respectivamente en aguas y 34 y 6, respectivamente en sedimentos. Las principales familias de plaguicidas detectadas en ambas matrices son carbamatos, ureas, organofosforados y los principales fármacos fueron antibióticos y analgésicos. Los fármacos se presentaron en muestras de aguas y sedimentos con similar frecuencia. Octava: La caracterización de las diferentes unidades de paisaje en la demarcación del Júcar permitió evaluar las fuentes de los contaminantes. El estudio de distribución espacial a lo largo de las tres cuencas confirmó el vínculo entre las actividades antrópicas y el tipo e intensidad de la contaminación, configurando un patrón de contaminación elevada en puntos específicos en la cabeceras y las desembocaduras de las cuencas y baja polución en los paisajes abruptos centrales, debido a la complicada accesibilidad, baja densidad poblacional y escasa área cultivable. Novena: Combinando la concentración de cada contaminante emergente con el caudal del río, se obtienen las cargas de plaguicidas que llegan al Mar Mediterráneo. La carga total de plaguicidas liberados al río Turia se estimó en 156 y 98 kg por año en la campaña 2012-2013. Los niveles más altos de contaminación se relacionan con los peores valores de los parámetros de la calidad del agua, que a su vez están vinculados a las zonas de mayor presión antrópica y a la creciente intrusión salina en las cuencas del área. Décima: La evaluación de riesgo a través de los coeficientes de riesgo (RQ) y unidades toxicas (TU) establece el impacto ecotoxicológico de los contaminantes emergentes en tres niveles tróficos: algas, dafnias y peces. Los insecticidas mostraron alto riesgo RQ (>1) para dafnias y peces, los herbicidas para algas y los fungicidas para los tres niveles tróficos. Las mezclas de plaguicidas hallados en la cuenca del rio Turia suponen un mayor riesgo para peces y dafnias. Undécima: El estudio comparativo a nivel de tres cuencas mediterráneas (Turia, Júcar y Ebro) da a conocer un patrón similar de comportamiento de los contaminantes emergentes. Organofosforados, azoles, carbamatos y triazinas se detectaron con frecuencia y a altas concentraciones. Las cargas de plaguicidas vertidas al mar Mediterráneo se estima que superan los 100 kg por año. La distribución espacial de los plaguicidas a lo largo de los tres ríos, demostró que las desembocaduras de cuencas son las más impactadas por los contaminantes emergentes. References 1. Babut, M., et al., Pesticide risk assessment and management in a globally changing world-report from a European interdisciplinary workshop. Environmental Science and Pollution Research, 2013. 20(11): p. 8298-8312. 2. Moreno-González, R., J.A. Campillo, and V.M. León, Influence of an intensive agricultural drainage basin on the seasonal distribution of organic pollutants in seawater from a Mediterranean coastal lagoon (Mar Menor, SE Spain). Marine Pollution Bulletin, 2013. 77(1-2): p. 400-411. 3. Zhang, W., F. Jiang, and J. Ou, Global pesticide consumption and pollution: with China as a focus. Proceedings of the International Academy of Ecology and Environmental Sciences, 2011. 1(2): p. 125. 4. Alavanja, M.C.R., Pesticides Use and Exposure Extensive Worldwide. 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