No manejo de pacientes com síndrome de Cushing (SC), o diagnóstico diferencial entre Doença de Cushing (DC) e síndrome da secreção ectópica de ACTH (EAS) é complexo e desafiador. O cateterismo bilateral de seios petrosos inferiores (CBSPI) com dosagens de ACTH é considerado padrão-ouro no diagnóstico diferencial da etiologia. O CBSPI é feito preferencialmente com estímulo de CRH, indisponível em muitos países, incluindo o Brasil. O estímulo do ACTH com desmopressina, ainda que menos estudado, é uma alternativa nesta situação. Os objetivos deste estudo são avaliar a acurácia do gradiente central/periferia das dosagens de ACTH (SPI:P) no CBSPI antes e após estímulo de desmopressina para este diagnóstico diferencial em uma coorte de pacientes de um centro de referência no Brasil, aplicando diferentes pontos de corte e definindo critérios específicos da instituição. Cinquenta pacientes (48 com DC e 2 com EAS) com diagnóstico confirmado foram submetidos ao CBSPI com coletas de ACTH basal e estimulado com desmopressina, sendo 44% microadenomas, 38% imagem negativa e 18% macroadenomas. Aplicando o ponto de corte tradicional do SPI:P, a sensibilidade foi 85.1% no basal e 89.6% após estímulo, e a sensibilidade combinada foi 91.7%. Utilizando como critério o SPI:P >1.4 no basal e >2.8 após estímulo, a sensibilidade foi 87.2 e 89.6%, respectivamente, e a sensibilidade combinada foi 91.7%. Realizando uma curva ROC encontramos como melhores valores os pontos de corte de 1.2 no basal e 1.57 após estímulo. Com esses valores, a sensibilidade foi 93.6% e 93.8%, respectivamente, e a sensibilidade combinada foi 97.9%. A especificidade se manteve 100% em todas as análises. Entre os 43 pacientes que positivaram após o estímulo, 42 (97.7%) o fizeram até o terceiro minuto e 43 (100%) após o quinto minuto. Dos 50 pacientes avaliados, 43 realizaram o teste da desmopressina periférico previamente ao CBSPI, que não foi capaz de predizer a resposta ao estímulo do ACTH no CBSPI (p>0.9999). Além disso, nenhuma das variáveis clínicas avaliadas foram capazes de predizer a resposta do ACTH ao estímulo no CBSPI de forma estatisticamente significativa. Dificuldades técnicas ou variações anatômicas foram encontradas em 6 pacientes submetidos ao CBSPI. Nenhum paciente apresentou complicações tromboembólicas. Em conclusão, o emprego de estímulo do ACTH com desmopressina para avaliar o SPI:P no CBSPI aumenta a sensibilidade de 85.1% para 89.6%. Este aumento, embora pequeno, torna-se útil no cenário da investigação da SC ACTH-dependente. Considerando adicionalmente o baixo risco de complicações e a possibilidade demonstrada neste estudo de que podemos interromper o teste com 5 minutos de duração, nossos dados recomendam a utilização do estímulo com desmopressina no CBSPI para o diagnóstico diferencial da SC ACTH-dependente. In the management of Cushing’s syndrome (CS), the differential diagnosis between Cushing’s Disease (CD) and ectopic ACTH syndrome (EAS) is complex and challenging. Bilateral inferior petrosal sinus sampling (BIPSS) with ACTH sampling is considered the gold-standard in the differential diagnosis of the etiology. BIPSS is preferably performed with CRH stimulation, unavailable in many countries including Brazil. ACTH stimulation with desmopressin, although less studied, is an alternative in this setting. The objectives of this study are to assess the accuracy of inferior petrosal sinus to peripheral ACTH gradient (IPS:P) in BIPSS before and after desmopressin stimulation for this differential diagnosis in a cohort of patients of a referral center in Brazil, applying different cutoffs and to define institution-specific criteria. Fifty patients (48 with CD and 2 with EAS) with confirmed diagnosis underwent BIPSS with basal and desmopressin-stimulated samplings, being 44% microadenomas, 38% negative imaging and 18% macroadenomas. Applying the traditional IPS:P cutoff, sensitivity was 85.1% before and 89.6% after stimulation, and the combined sensitivity was 91.7%. Using the cutoff of IPS:P >1.4 before and >2.8 after stimulation, the sensitivity was 87.2 and 89.6%, respectively, and the combined sensitivity was 91.7%. Performing a ROC curve, we found that the optimal cutoffs were 1.2 before and 1.57 after stimulation. With these values, sensitivity was 93.6% and 93.8%, respectively, and the combined sensitivity was 97.9%. Specificity remained 100% during all analyses. Among the 43 patients who turned positive after stimulation, 42 (97.7%) did so until the third minute and 43 (100%) until the fifth minute. Of the 50 assessed patients, 43 underwent peripheral desmopressin test before BIPSS, which was unable to predict the ACTH response to stimulation in BIPSS (p>0.9999). Furthermore, none of the clinical variables assessed were able to predict the ACTH response to stimulation in BIPSS with statistical significance. Technical difficulties or anatomical variations were found in 6 patients who underwent BIPSS. No patient had thromboembolic complications. In conclusion, the use of ACTH stimulation with desmopressin to assess IPS:P in BIPSS increases sensitivity from 85.1% to 89.6%. This increase, although small, becomes useful in the setting of ACTH-dependent CS investigation. Additionally, considering the low risk of complications and the possibility shown in this study that we can interrupt the test within 5 minutes, our data recommend the use of desmopressin stimulation during BIPSS for the differential diagnosis of ACTH-dependent CS.