Relatório de projecto final de Doutoramento em Farmácia (Química Farmacêutica e Terapêutica), apresentado à Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, 2019. This work was developed under scientific supervision of Professor Rui Moreira and cosupervision of Dr.ª Susana Lucas, from iMed.ULisboa (Instituto de Investigação do Medicamento), Faculty of Pharmacy, University of Lisbon, and Dr.ª Deborah Penque from the Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, Portugal. The work was partially performed in The Scripps Research Institute in La Jolla, California, under the supervision of Professor Ben Cravatt. Activity-based protein profiling (ABPP) is a technique that analyzes the dynamics in enzymatic activity in complex proteomes by using small molecular probes, deemed activity-based probes (ABPs), containing a reactive group to covalently bind enzyme catalytic residues, a tag for detection of labeled targets and a linker as a spacer and also specificity-enhancing. Different warheads have been developed to engage a wide range of enzymatic families but there is a constant need to create new chemical tools to expand the pool of engageable targets. In this work we evaluated two 4-membered ring warheads as new warheads for ABPP of serine hydrolases. The 3-Oxo-β-Sultam warhead was revealed to be a highly reactive chemotype which labels a wide range of proteins with limited target occupancy. A crystallographic analysis of the reaction of 3-Oxo-β-Sultams with elastase enzymes revealed a previously unknown mechanism of inhibition of these enzymes by sulfonylation, suggesting 3-Oxo-β-Sultam compounds could be used to expand the pool of available sulfonylating tools in chemical biology. 4-Oxo-β-Lactams were shown to potently hit a selected group of serine hydrolase with high target occupancy, including human neutrophil elastase (HNE) and members of the ABHD and DPP families of enzymes. A competitive-ABPP approach revealed high potency of a library of 4-Oxo-β-Lactams to target these enzymes. 4-Oxo-β-Lactams were identified used as a new chemotype for DPP8 and DPP9 inhibition. Crystallography experiments revealed a new binding mode of these enzymes with 4-Oxo-β-Lactams, highlighting that these compounds could be used to pursue selective DPP8 or DPP9 inhibitors, a highly pursued field in current medicinal chemistry. A análise de proteínas baseada na actividade (ABPP) é uma técnica que possibilita o estudo da actividade de proteínas em proteomas complexos. A principal vantagem desta técnica em relação a outras técnicas de quantificação é que o resultado reportado corresponde somente à fracção activa da enzima em estudo, permitindo associar padrões complexos de actividade enzimática a fenótipos da amostra em estudo. O conceito de ABPP depende das sondas baseadas na actividade (ABPs), que contém um grupo reactivo, responsável pela reacção com formação de ligação covalente com uma proteína alvo ou um grupo de proteínas, e um elemento marcador, que produz um sinal mensurável que permite reportar a actividade da proteína alvo ou facilitar a sua purificação. Estes dois elementos são normalmente separados por um elemento de espaçamento, diminuindo possíveis impedimentos estéreos e podendo contribuir para o aumento da especificidade da sonda. Uma experiência de ABPP envolve a incubação das ABPs com proteomas complexos, onde as sondas se vão ligar apenas à forma activa das suas enzimas alvo. As enzimas que reagiram com a ABP podem ser identificadas por ensaios de gel de electroforese de proteínas, caso o elemento marcador da ABP seja um fluoróforo, através da leitura directa de fluorescência no gel. Alternativamente, se o elemento sinalizador da ABP é a biotina, as proteínas alvo são enriquecidas através de incubação com streptavidina e analisadas por espectrometria de massa para identificação exacta da identidade das proteínas atingidas. A análise simultânea de várias amostras permite comparar padrões de actividade enzimática e potencialmente definir novos biomarcadores associados a um fenótipo específico. Existe uma procura contínua de novos grupos reactivos de modo a aumentar a variabilidade de ferramentas disponíveis e conseguir cobrir o maior número possível de famílias enzimáticas. Hidrolases de serina são uma das maiores famílias de enzimas, tendo papéis relevantes em inúmeros processos biológicos e patológicos e existindo um interesse contínuo no seu estudo para desenvolvimento de inibidores e sondas. Análises ABPP de hidrolases de serina são normalmente realizadas com o grupo reactivo fluorofosfonato. Neste trabalho estudámoss dois potenciais grupos reactivos baseados em anéis de 4 membros, as 3-Oxo-β-Sultamas e as 4-Oxo-β-Lactamas para análise de hidrolases de serina. As 3-Oxo-β-Sultamas são anéis de 4 membros que contém um grupo acil sulfonamida. Uma biblioteca de compostos baseada neste group reactivo foi sintetizada via química click. Ensaios bioqímicos de inibição enzimática utilizando a elastase neutrofílica humana como modelo revelaram valores de inibição submicromolares para os compostos com substituição 3-dietilo, com as ABPs a evidenciar que a adição de um elemento sinalizador volumoso não compromete a actividade dos compostos. A análise da reatividade destes compostos num proteoma complexo revelou que estes são dotados de alta reactividade, reagindo com uma elevada percentagem das proteinas identificadas nos ensaios de ABPP. As análises de espectrometria de massa revelaram que, apesar de identificarem várias enzimas da família das hidrolases de serina, as 3-Oxo-β-Sultamas fazem-no com baixa percetagem de ocupação de alvo, o que limita a sua aplicação como ABPs. O mecanismo de inibição de hidrolases de serina pelas 3-Oxo-β-Sultamas não se encontra bem definido. Estudos anteriores com a elastase porcina humana (PPE) levaram autores a sugerir que o mecanismo é a acilação, mas estes resultados basearam-se apenas em análise cinética da reacção e verificação da sua reversibilidade com o tempo. Utilizando técnicas de cristalografia demonstrámos, pela primeira vez, através de análise de raios X de complexos entre a PPE e a HNE, que o mecanismo de acção é a sulfonilação da serina catalítica das enzimas. Estes resultados são bastante promisores para a expansão da biblioteca de ferramentas de sulfonilação disponíveis na química biológica, um mecanismo sub-explorado de inibição enzimática. As 4-Oxo-β-Lactamas são derivados de β-Lactamas que contém um grupo carbonilo adicional na posição 4 do anel de 4 membros. A análise ABPP revelou um perfil selectivo de inibição de enzimas num proteoma complexo, que incluem a HNE, um alvo previamente conhecido, mas também novas proteínas anteriormente não identificadas como alvos deste grupo reactivo, que incluem enzimas das famílias domínio αβ-hidrolase (ABHD) e dipeptidil peptidase (DPP). Ao contrário do que acontece com as 3-Oxo-βSultamas, estes alvos são inibidos com alta ocupação de alvo, o que sugere que a 4-Oxoβ-Lactama é um bom grupo reactivo para aplicações ABPP. Uma biblioteca de inibidores baseados na 4-Oxo-β-Lactamas com substituinte N-arilo foi sintetizada de modo a estudar as características estruturais que definem a preferência de inibição para as enzimas identificadas nos ensaios ABPP. Uma análise por ABPP competitivo revelou que a posição dos substituintes no grupo N-arilo parece influenciar a especificidade dos compostos, com compostos com substuintes em para a apresentar, em geral, maior afinidade para a HNE e ABHD6, e compostos com substituintes em meta a apresentar maior especificidade para as DPPs. Compostos com substituintes em orto não apresentaram alvos relevantes dos ensaios em gel e não foram testados em espectrometria de massa. A validação dos alvos utilizando sobreexpressão de hidrolases de serina de interesse revelou que a maioria dos compostos inibe alguns destes alvos com IC50 submicromolar. Estes resultados enfatizam o potencial da 4-Oxo-β-Lactamas como grupo reactivo para aplicações ABPP e para o desenvolvimento de novos inibidores de hidrolases de serina. Uma ABP com um alcino terminal foi sintetizada para aplicações bioortogonais, demostrando alta selectividade para a HNE em ensaios ABPP em gel, tendo potencial para estudos futuros da HNE na doença pulmonar obstrutiva crónica. De entre os novos alvos identificados para as 4-Oxo-β-Lactamas são de salientar a DPP8 e a DPP9. A procura de inibidores da DPP8 e da DPP9 é uma grande área de interesse actual na química medicinal. Estas duas enzimas possuem alta similaridade estrutural entre si e não possuem inibidores específicos, sendo frequentemente inibidas em conjunto. Os inibidores que apresentaram melhores resultados para estas duas enzimas foram estudados mais aprofundadamente com as DPP8 e DPP9. Os compostos revelaram ter um efeito modesto na indução da piroptose, uma consequência da inibição destas enzimas e estudos de similaridade confirmaram que este grupo reactivo é completamente diferente dos grupos reactivos previamente utilizados para a inibição destas enzimas. Análise de complexos de raio X entre um inibidor 4-Oxo-β-Lactama e a DPP8 revelou a formação de uma ligação covalente entre o composto e a serina catalítica da DPP8. A parte distal da molécula apresenta interacções com aminoácios vizinhos ao sítio activo e um mecanismo de inibição que nunca tinham sido reportados anteriormente para os inibidores conhecidos da DPP8. Esta informação será vital para o futuro desenho de inhibidores destas enzimas e a exploração desta nova interacção poderá ser a chave para a descoberta de inibidores específicos para as mesmas. Adicionalmente, reportamos a síntese de sondas contendo vinil sulfonas como grupo reactivo para a análise de proteases de serina, sondas sintetizadas por modificação da estrutura de ácidos biliares e a síntese de sondas e inibidores baseados em modificações da 4-Oxo-β-Lactama como actividades complementares ao projeto princial aqui descrito. Em resumo, a utilização de ABPP e técnicas cristalográficas revelou o potencial de grupos reactivos com anéis de 4-membos, com as 3-Oxo-β-Sultamas comportando uma alta reactividade associada a baixa ocupação de alvo, mas com um mecanismo de acção inesperado via sulfonilação do centro activo de enzimas como a HNE. Os resultados revelaram também o enorme potencial das 4-Oxo-β-Lactamas como ABPs e como grupo reactivo para o desenvolvimento de inibidores, incluindo enzimas como a DPP8 e DPP9, para as quais a procura de inibidores é uma área de grande interesse actual. A descoberta de que os inibidores contendo 4-Oxo-β-Lactamas ibibem a DPP8 através de interacções previamente não conhecidas poderá resultar na descoberta dos primeiros inibidores específicos da DPP8 ou DPP9. The work was financially supported by Fundação para a Ciência e Tecnologia, through the doctoral grant SFRH/BD/100400/2014. N/A