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Orientador : Leonardo Magalhães Cruz, dr Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 30/07/2015 Inclui referências : f. 150-163 Resumo: Estirpes de Herbaspirillum spp. foram isoladas de diversos tipos de ambientes e localizações geográficas, e apresentam grande diversidade metabólica. O gênero Herbaspirillum inclui organismos diazotróficos, endofíticos e espécies capazes de degradar compostos fenólicos ou até crescer autotroficamente. Neste trabalho foram sequenciados e anotados os genomas de três espécies de Herbaspirillum: H. autotrophicum IAM 14942 (bactéria oxidante de hidrogênio), H. chlorophenolicum CPW301 (bactéria capaz de degradar 4-clorofenol) e H. rhizosphaerae UMS-37 (bactéria isolada da rizosfera de Allium victorialis), que foram comparados com os genomas disponíveis das seguintes estirpes de Herbaspirillum spp.: H. seropedicae SmR1, BR11335, BR11417, AU14040, Os34 and Os45; H. rubrisubalbicans M1, BR11504; H. huttiense subsp. putei IAM 15032; H. frisingense GSF30; H. lusitanum P6-12; H. hiltneri N3; H. massiliense JC206; e Herbaspirillum sp. GW103, CF444 e YR522. A comparação genômica foi realizada com BLAST todos contra todos, a homologia entre proteínas foi determinada por 50% de cobertura de alinhamento e 50% de identidade. A média de genes dos 19 genomas analisados foi de 4.897, com cerca de 760 genes únicos por genoma (15%). H. massiliense parece ser a espécie mais distante das demais, enquanto H. rubrisubalbicans, H. seropedicae, H. huttiense e H. frisingense formam um grupo estritamente relacionado (filogrupo 1), e H. hiltneri, H. lusitanum e H. rhizosphaerae formam outro grupo relacionado (filogrupo 2). Essas relações foram confirmadas por análises filogenéticas que utilizaram informações do pangenoma. O core e o pangenoma do gênero consistem em aproximadamente 1.400 e 20.000 famílias de genes, respectivamente. A distribuição funcional dos genes do pangenoma, em comparação aos genes do core-genoma, mostrou maior número de genes envolvidos no metabolismo de carboidratos e íons inorgânicos, além de genes envolvidos com transcrição. O agrupamento de genes nif está presente somente em estirpes de H. seropedicae (com exceção da estirpe AU14040), H. rubrisubalbicans e H. frisingense. Já o agrupamento de genes do sistema de secreção do tipo III é amplamente distribuido dentro do gênero Herbaspirillum, e é proposto que esses genes estivessem presentes no ancestral do gênero. Análises taxonômicas baseadas na sequência genômica mostraram que as estirpes de Herbaspirillum GW103, CF444 e YR522 podem ser classificadas em novas espécies. Palavras-chave: Herbaspirillum, Comparação Genômica, Pangenoma, Core-genoma. Abstract: Strains of Herbaspirillum spp. have been isolated from a multitude of environments and geographic locations, presenting a metabolically diverse genus. It includes diazotrophs, plant endophytes, and also species capable of degrading phenolic compounds or growing autotrophically. We have sequenced and annotated the genome of three species of Herbaspirillum, namely: H. autotrophicum IAM 14942 (hydrogen-oxidizing bacteria), H. chlorophenolicum CPW301 (4-chlorophenol degrading bacteria) and H. rhizosphaerae UMS-37 (isolated from rhizosphere of Allium victorialis). We compared these genomes with the following available genome sequences of Herbaspirillum spp. strains: H. seropedicae strains SmR1, BR11335, BR11417, AU14040, Os34 and Os45; H. rubrisubalbicans strains M1 and BR11504; H. huttiense subsp. putei IAM 15032; H. frisingense GSF30; H. lusitanum P6-12; H. hiltneri N3; H. massiliense JC206; and Herbaspirillum sp. strains GW103, CF444 and YR522. The genome comparison was performed with all-against-all BLAST, the protein homology settled as 50% of align coverage and 50% of protein identity. The average gene content of the 19 analyzed organisms was 4,897, and about 762 unique genes per genome (15%). H. massiliense JC206 seems to be the most distant related species, while H. rubrisubalbicans, H. seropedicae and H. huttiense compose a closely related group (phylogroup 1), and H. hiltneri, H. lusitanum and H. rhizosphaerae compose another closely group (phylogroup 2). These relationships were confirmed by phylogenetic analysis using pan-genome tree. The core- and pan-genome of this genus consist of approximately 1,400 and 20,000 groups of genes, respectively. Functional distribution of the pan-genome genes, in comparison to core-genome genes, showed a high number of genes involved in carbohydrate metabolism, inorganic ions metabolism and transcription. The nif gene cluster is present only in H. seropedicae, H. rubrisubalbicans and H. frisingense strains. Type III secretion system gene cluster is largely distributed among Herbaspirillum genus, and it is hypothesized that this cluster of genes was present in the common ancestor of all Herbaspirillum species. Taxonomic analysis, performed with genome sequence, suggest that Herbaspirillum spp. strains GW103, CF444 and YR522 are new Herbaspirillum species. Keywords: Herbaspirillum, Genome comparison, Pan-genome, Core-genome.

Resumo: Herbaspirillum rubrisubalbicans M1 é uma bactéria endofítica diazotrófica que causa a doença da estria mosqueada em algumas variedades suscetíveis de cana-deaçúcar. Nesse estudo, um total de 560.138 reads provenientes do GS-FLX 454 pyrosequencer (cobertura de 39x) e 22.985 reads Sanger (cobertura de 3,8x) foram obtidos e usados para montagem do genoma de Herbaspirillum rubrisubalbicans. A montagem de novo com os reads GS-FLX 454 produziu nove scaffolds, contendo 70 gaps, e 393 contigs que ficaram fora da montagem. Os scaffolds foram ordenados usando o genoma de Herbaspirillum seropedicae SmR1 como referência e o programa MUMmer 3.0. Sete scaffolds foram mapeados, um dos quais corresponde ao operon rRNA, e que está presente em número de três cópias no genoma de H. rubrisubalbicans, e um outro representa um cluster de genes de transporte de am noácidos que aparece duas vezes nesse genoma. Para o fechamento de gaps, os reads Sanger, scaffolds não mapeados, e contigs fora da montagem foram submetidos em conjunto ao visualizador de montagens Consed. Foram encontrados três tipos diferentes de integrase/transposase, as quais são responsáveis por 31 repetições no genoma de H. rubrisubalbicans, além de quarto genes relacionados à proteína VGR. Essas 35 regiões repetitivas foram resolvidas usando informação de reads pareados. O número de contigs foi reduzido para cinco, com tamanho médio de ~1,12Mb, montados num único scaffold of ~5,6 Mb com conteúdo G+C de 60,5%.