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En esta Tesis se abordó el estudio de los mecanismos bioquímicos involucrados en lainteracción entre algunas bacterias promotoras del crecimiento y dos plantas de interésagronómico, arroz (Oryza sativa) y tomate (Solanum lycopersicum). La bacteria Azospirillum brasilense promovió el crecimiento de plantas de arroz,especialmente de su sistema radicular; la inoculación indujo un aumento en la producciónde etileno en la planta y en la actividad y expresión de la ácido 1-amino-ciclopropano-1-carboxílico sintasa (ACS). Se observó también un aumento en la actividad de quinasa deproteínas dependiente de Ca⁺² cuyas características bioquímicas indican que se trata deuna CDPK que estaría relacionada con el crecimiento de las raíces laterales. La inoculación con A. brasilense promovió el crecimiento de plantas de tomate, aumentólos niveles de ácido indol acético (AIA) y etileno y la actividad y expresión de ACS. Elsuplemento exógeno de etileno y el uso de un inhibidor de su percepción permiten asignar amodo de hipótesis un rol intermediario del etileno en la promoción del crecimiento delsistema radicular en plantas de tomate inoculadas con A. brasilense. El análisis global del perfil de expresión génica asociado a la inoculación de plantas detomate con A. brasilense indicó que la inoculación estimuló la expresión de una variedad degenes, muchos de los cuales se inducen por etileno y que se han encontrado sobreexpresados en otras especies en respuesta a la infección con patógenos o afectadas poragentes generadores de estrés. Los niveles de expresión de los genes implicados en elestablecimiento de la respuesta hipersensible aparecen sub expresados lo cual podríafavorecer el establecimiento de la interacción endofítica entre A. brasilense y tomate. Utilizando la técnica de 2D-DIGE se comenzó el análisis de los perfiles de proteínasexpresadas en plantas de tomate inoculadas con A. brasilense. Con esta técnica se logróevidenciar diferencias en los patrones de expresión que dependen del tratamiento al que sesometió a las plantas. This thesis is focused on the study of biochemical mechanisms involved in the interactionamong some growth-promoting bacteria and two plants of interest for agronomy: rice (Oryza sativa) and tomato (Solanum Iycopersicum). The bacterium Azospirillum brasilense promoted growth in rice plants, especially in theirroot system; inoculation induced an increase in ethylene production in the plant and in 1-aminocyclopropane-1-carboxilic acid synthase (ACS) activity and expression. A rise wasalso noticed in a Ca⁺²-dependent protein kinase activity with the biochemical features of a CDPK that could be related to lateral roots’ growth. A. brasilense inoculation also promoted tomato plants growth, raised indole acetic acid (IAA) and ethylene levels and the activity and expression of ACS. Exogenous supplementof ethylene and the use of an inhibitor of their perception have allowed for the hypothesisfor an intermediary role of ethylene in A. brasilense-inoculated tomato plants’ root systemgrowth. The overall analysis of the genetic expression profile of tomato plants associated to theinoculation with A. brasilense has indicated that inoculation stimulated expression of avariety of genes which are also induced by ethylene and have been found overexpressedin other species as a result of pathogenic infection or affected by stress-generating agents. The genes involved in the hypersensitive response appeared as underexpressed; this factcould favour the stablishment of the endophitic interaction between A. brasilense andtomato. 2D-DIGE technique was used to start the analysis of protein profiles expressed in A.brasilense-inoculated tomato plants. Fil: Ribaudo, Claudia Mónica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El objetivo principal de esta Tesis fue profundizar el estudio de losmecanismos bioquímicos involucrados en la transición dimórfica de Candidaalbicans. Este trabajo está basado en resultados previos de nuestro laboratorio en losque se había demostrado que la vía de señalización del AMPc está involucradaen la respuesta del hongo a algunos de los factores ambientales que controlan sumorfología. En consecuencia, continuamos nuestra investigación enfocando elestudio en la participación de la enzima blanco del AMPc, la quinasa de proteínadependiente de AMPc (PKA), en Ia transición levadura —>micelio. Los resultados de los experimentos realizados in vivo con la cepa salvaje 1001 demostraron que: - La inhibición in vivo de la actividad de PKA utilizando inhibidoresespecíficos resultó en un bloqueo completo de la transición dimórfica enmedio mínimo cuando la inducción se llevó a cabo con NAcGlc. Cuando elinductor usado fue suero, la inhibición de la PKA no tuvo un efecto tandrástico. - La inhibición de la PKA no promovió efectos deletéreos en la célula ya queel agregado de suero pudo reiniciar la diferenciación en célulasbloqueadas ni produce efectos generalizados sobre el crecimiento ya quela gemación de las células levaduriformes no fue afectada. - La inhibición de la PKA resultó en un bloqueo generalizado de lafosforilación total de proteínas in vivo. EI agregado de dbAMPc al medioaumentó globalmente la fosforilación de proteínas y aún en su presencia lainhibición de la PKA promueve una desaparición completa de las proteínasfosforiladas. Estos experimentos permiten concluir que la PKA es un elemento crucial enla transducción de señales desencadenadas por NAcGlc y que su ubicación en lacascada de fosforilaciones es tal que controla otras quinasas, algunas de lascuales podrian estar involucradas en el dimorfismo. Los experimentos de germinación realizados con una mutante que carece delgen para la única subunidad catalítica (subunidad C) conocida hasta esemomento (gen TPK2), y los datos aportados por el Proyecto genoma de Candida ,permitieron demostrar la existencia y expresión de un segundo gen para C noconocido. Es más, esta nueva C tiene también un rol positivo en la diferenciación. Demostramos también que la subunidad R es una fosfoproteína in vivo. Laautofosforilación de la subunidad R resultó en una marcada disminución de suafinidad por C Io que hizo a la holoenzima mas sensible a disociación por AMPc. In vivo esta situación permitiría a la holoenzima ser disociada con pequeñasfluctuaciones de AMPc. The main objective of this Thesis was to go deep into studies on thebiochemical mechanisms involved in the dimorphic transition of Candida albicans. This work is based on previous results from our laboratory that demonstratedthat the CAMP signaling pathway is involved the fungus response to someenvironmental factors which control its morphology. Consequently, to go on withour investigations we focussed our interest on the participation of the cAMP targetenzyme, the cAMP-dependent protein kinase (PKA) on the yeast-to-hyphatransition. The results of the in vivo experiments performed with the C. albicans wild typestrain 1001, demonstrated that: - The inhibition of the PKA activity with specific inhibitors resulted in acomplete blockade of the dimorphic transition in minima medium when theprocess was induced with GlcNAc. When the inducer was serum, theinhibition of PKA was not so drastic. - The inhibiton of PKA did not promote deleterious effects on the cells sincethe addition of serum allowed blocked cells to resume differentiation, norproduced generalized effects on growth since duplication of yeast cells wasnot affected. - The inhibition of PKA resulted in a generalized blockade of the total proteinphosphorylation in vivo. The addition of dbcAMP to the medium raisedprotein phosphorylation as a whole, but even in its presence PKA inhibitionpromoted the disappearance of phosphorylated proteins. These experiments allow us to conclude that PKA is a crucial element in thesignal transduction triggered by GlcNAc and that its location in thephosphorylation cascade is such that it control other kinases , some of whichcould be involved in dimorphism. Germination experiments performed using a mutant strain lacking the gene forthe sole catalytic subunit (C) known up this moment (TPK2 gene), and dataarising from the Candida genome Project, allowed us to demonstrate theexistence of a second gene for C still unknown. What is more, this new C isoformalso have a positive role on differentiation of C. albicans. We also found out that R subunit is a phosphoprotein in vivo. Autophosphorylation of R resulted in an important decrease in its affinity for Cmaking the holoenzyme more sensitive to dissociation by cAMP. In vivo thissituation could allow the holoenzyme to be dissociated by small fluctuations incAMP levels. Fil: Castilla Lozano, María del Rocío. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Se investigó el rol del AMPc en la morfogénesis de Candida albicans. El agregado exógeno del nucleótido o de agentes que elevan sus niveles intracelulares estimuló la germinación inducida por N-acetil-glucosamina; el glucagon mostró el mismo efecto estimulatorio, el cual fue bloqueado por su antagonista específico des His1 [Glu9] glucagon amida, indicando una probable interacción de la hormona con un receptor de membrana simil receptor de glucagon. Por imnunofluorescencia indirecta se comprobó la unión de la hormona a la superficie celular de levaduras. Cuando se usó suero como inductor de la germinación el efecto estimulatorio del glucagon aumentó. Anticuerpos anti-glucagon bloquearon el efecto de la hormona. Estos resultados proveen evidencias para la participación del AMPc en el dimorfismo; sabiendo que el principal receptor de AMPc en células eucariotas es la subunidad regulatoria (R) de la quinasa de proteínas dependiente de AMPc (PKA), podemos esperar que esta enzima tenga un importante rol la transición levadura-micelio. La PKA de C. albicans fue caracterizada y sus subunidades puficadas. Es una proteína tetramérica de 287 kDa compuesta por un dímero regulatorio (R) de 128 kDa y dos subunidades catalíticas de 78 kDa. La holoenzima exhibió una cooperatividad positiva en la activación por AMPc y se demostró la existencia de dos sitios de unión a AMPc en la subunidad R. La subunidad R fue fosforilada por la subunidad C a través de una reacción intramolecular, permitiendo clasificar a la PKA como de tipo II. La extrema sensibilidad de la subunidad C a la proteólisis impidió la purificación de la proteína nativa de alto peso molecular. Se caracterizó la fosforilación in vitro de R por CK2 y se investigó el efecto de dicha modificación sobre la funcionalidad de R. Se realizó el estudio de la fosforilación in vivo de la subunidad R. Fil: Zelada, Alicia M.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.