Search

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária A conjuntivite alérgica canina (CAc) é a causa mais comum de conjuntivite em cães, e integra frequentemente a sintomatologia da dermatite atópica canina (DAc). Com este estudo pretende-se contribuir para uma melhor caracterização clínica e imunológica da CAc através da avaliação da expressão da IL-6, TNF-alfa e IL-12 nesta doença. Para este fim recorreu-se a um grupo de animais diagnosticados concomitantemente com CAc e DAc no HEV-FMV (n=20) e a um grupo controlo (n=21). Os pacientes foram caracterizados clinicamente recorrendo a um score de CAc e ao sistema de classificação Canine Atopic Dermatitis Extent and Severity Index – fourth version (CADESI-04) e foram realizadas biópsias conjuntivais. A partir destas amostras fez-se a quantificação relativa da expressão génica das três interleucinas por qRT-PCR. Os resultados foram calculados através do método 2-DeltaCt. Para comparar a expressão génica das interleucinas entre o grupo atópico e o grupo controlo utilizou-se o Welch Two Sample t-test. De seguida, aplicou-se a correlação de Spearman para avaliar a correlação entre a expressão das interleucinas e o score de CAc, e procedeu-se da mesma forma para os valores relativos ao CADESI-04. Os resultados obtidos pela técnica de qRT-PCR permitiram verificar uma sobrexpressão génica de IL-6 e IL-12, de 291.48 (p=1.306e-09) e 4.85 (p=0.00033) folds, respetivamente, nos animais com conjuntivite alérgica. Apesar de a expressão média de TNF- Alfa estar aparentemente aumentada no grupo experimental (7.33 folds), não foi possível demonstrar uma diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos (p=0.18). Os resultados sugerem que quanto maior o score de CAc maior a expressão génica de TNF-Alfa (Rho=-0.57; p=0.02) e IL-12 (Rho=-0.50; p=0.049). Não se verificou nenhuma correlação entre os níveis de expressão génica das interleucinas e os valores de CADESI-04. Com este estudo verificou-se um aumento das citoquinas pró-inflamatórias na CAc, importantes na resposta imunitária inata, e uma ativação de uma resposta Th1, apontando assim a IL-6 e IL-12 como potenciais alvos de imunoterapia nos animais com esta doença. Os resultados sugerem ainda que a expressão génica destas três interleucinas possa ser uma ferramenta útil no diagnóstico e classificação da CAc, mas não da DAc. ABSTRACT - CONTRIBUTION TO IMMUNOLOGICAL AND CLINICAL CHARACTERIZATION OF CANINE ALLERGIC CONJUNCTIVITIS - Canine allergic conjunctivitis (cAC) is the most common type of conjunctivitis in dogs and is often included in the symptoms of canine atopic dermatitis (cAD). With this study we aimed to contribute to improve the clinical and immunological characterization of cAC through the evaluation of IL-6, TNF-Alfa and IL-12 expression in this disease. For this purpose, conjunctival biopsies were performed on a group of 20 animals diagnosed with both cAC and cAD and a control group (n=21). From those samples, a relative quantification of the interleukin’mRNA expression was performed by qRT-PCR. The results were obtained through the 2-DeltaCt method. To compare interleukin gene expression between the atopic group and the control group Welch Two Sample t-test was used. Then Spearman correlation was applied to evaluate the correlation between interleukin gene expression and cAC clinical score, the same procedure was used for the CADESI-04 values. The results provided by qRT-PCR showed a significant gene overexpression of respectively 291.48 (p=1.306e-09) and 4.85 (p=0.00033) folds on IL-6 and IL-12 in dogs with allergic conjunctivitis. Even though the average expression of TNF-Alfa seems apparently higher in the experimental group (7.33 folds), there were no statistical significant differences between the atopic and the healthy group (p=0.18). The results suggest that the higher the cAC score, the greater the TNF-Alfa (Rho=-0.57; p=0.02) and IL-12 (Rho=-0.50; p=0.049) gene expression. There was no correlation between the interleukin gene expression levels and the CADESI-04 values. The results indicate an increase of pro-inflammatory cytokines in cAC, which are strongly involved on the innate immune response, and a Th1 subset activation, identifying IL-6 and IL-12 as potential targets for immunotherapy. This study suggests that the gene expression of those three interleukins may be an useful tool for cAC diagnose and classification, but not for cAD. N/A

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária A conjuntivite alérgica canina (CAc) é uma doença cuja manifestação clínica ocorre nas pálpebras, na conjuntiva e/ou na córnea. Caracteriza-se por reações de hipersensibilidade do tipo I e integra frequentemente a sintomatologia da dermatite atópica canina (DAc). Através do estudo realizado no âmbito da presente dissertação de mestrado, pretende-se contribuir para a caracterização da resposta imunitária da CAc. Nesse sentido, um grupo controlo formado por animais saudáveis (n=10) e um grupo de animais atópicos com conjuntivite alérgica (CA) (n=10) integraram a presente experiência. Ambos foram submetidos a um exame dermatológico e oftalmológico completos, em que se procedeu, apenas para o grupo atópico, à classificação da gravidade das lesões com o Canine Atopic Dermatitis Extent and Severity Index – fourth version (CADESI-4), bem como à avaliação quantitativa dos sinais clínicos de CAc (corrimento ocular, epífora, hiperémia conjuntival, prurido, quemose e queratite concomitante) através da atribuição de um valor entre 0 (ausente) e 3 (grave). Subsequentemente, após a aplicação tópica ocular de anestésico, uma amostra de conjuntiva palpebral medindo cerca de 2x2 mm foi colhida e submetida a quantificação, por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR), dos níveis de expressão de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) do gene da interleucina (IL) -10. A análise estatística foi realizada recorrendo ao teste Mann-Whitney-Wilcoxon e ao teste de correlação de Spearman, sendo que os resultados a seguir apresentados surgem sob a forma de média±desvio-padrão. O score de CADESI-4 nos cães atópicos foi de 22,1±15,72. O score de CA do olho esquerdo foi de 8,9±15,72 e no olho direito 9,1±2,51. A média do score de CA de ambos os olhos foi 9,0±2,30. Os níveis de expressão do gene da IL-10 para o grupo atópico e controlo foram, respetivamente, 0,005±0,0029 e 0,004±0,0024. Verificou-se existir um coeficiente de correlação positivo entre os valores de CADESI-4 e os níveis de expressão do gene da IL-10 (p=0,25), bem como um coeficiente de correlação negativo entre a média do score de CA de ambos os olhos e a expressão do mesmo gene (p=0,35). Desta forma, concluímos que aparentemente o grupo atópico apresenta maiores níveis de expressão do gene da IL-10, o que poderá ser útil para o estudo da fisiopatologia e tratamento de atopia canina e respetiva CA. É necessária a realização de mais estudos para confirmar esta hipótese. ABSTRACT - INTERLEUKIN-10 GENE EXPRESSION IN CANINE ALLERGIC CONJUNCTIVITIS - Canine allergic conjunctivitis (cAC) is a disease whose clinical manifestation occurs in the eyelids, in the conjunctiva and/or in the cornea. It is characterized by type I hypersensitivity reactions and is often included in the symptoms of canine atopic dermatitis (cAD). Through the study under this master thesis we aim to contribute to the characterization of cAC immune response. Therefore, a control group consisting of healthy animals (n=10) and a group of atopic animals with allergic conjunctivitis (AC) (n=10) were enrolled in the present experiment. Both underwent complete dermatological and ophthalmic examinations, which included, only for the atopic group, Canine Atopic Dermatitis Extent and Severity Index – fourth version (CADESI-4) classification of the severity of injuries, as well as the quantitative evaluation of clinical signs of AC (ocular discharge, epiphora, conjunctival hyperemia, pruritus, chemosis and concurrent keratitis) by rating them from 0 (absent) to 3 (severe). Subsequently, after ocular topical anesthesia, a sample of palpebral conjunctiva measuring approximately 2x2 mm was collected and subjected to quantification, by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), of the messenger ribonucleic acid (mRNA) expression levels of interleukin (IL) -10 gene. Statistical analysis was performed using the Mann-Whitney-Wilcoxon test and the Spearman correlation test, results being presented as mean±standard deviation. CADESI-4 score for the atopic group was 22,1±15,72. AC score in the left eye was 8,9±15,72 and in the right eye 9,1±2,51. The average AC score for both eyes corresponded to 9,0±2,30. IL-10 gene expression levels for the atopic and control group were, respectively, 0,005±0,0029 and 0,004±0,0024. There was a positive correlation coefficient between CADESI-4 values and IL-10 gene expression levels (p=0,25), as well as a negative correlation coefficient between the average of the AC score for both eyes and the expression of the same gene (p=0,35). Thus, we concluded that apparently the atopic group has higher IL-10 gene expression levels which may be useful for the study of the physiopathology and treatment of canine atopy and its respective AC. Further studies are required to confirm this hypothesis.