Search

Metabolic syndrome (MS) is a complex pathology characterized by visceral adiposity, insulin resistance, arterial hypertension, and dyslipidaemia. It has become a global epidemic associated with increased consumption of high-calorie, low-fibre food and sedentary habits. Some of its underlying mechanisms have been identified, with hypoadiponectinemia, inflammation and oxidative stress as important factors for MS establishment and progression. Alterations in adipokine levels may favour glucotoxicity and lipotoxicity which, in turn, contribute to inflammation and cellular stress responses within the adipose, pancreatic and liver tissues, in addition to hepatic steatosis. The multiple mechanisms of MS make its clinical management difficult, involving both non-pharmacological and pharmacological interventions. Transient receptor potential (TRP) channels are non-selective calcium channels involved in a plethora of physiological events, including energy balance, inflammation and oxidative stress. Evidence from animal models of disease has contributed to identify their specific contributions to MS and may help to tailor clinical trials for the disease. In this context, the oxidative stress sensors TRPV1, TRPA1 and TRPC5, play major roles in regulating inflammatory responses, thermogenesis and energy expenditure. Here, the interplay between these TRP channels and oxidative stress in MS is discussed in the light of novel therapies to treat this syndrome.

Orientador: Elaine Minatel Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Tratamentos com antioxidantes e bloqueadores de canais de cálcio têm apresentado resultados positivos na diminuição da mionecrose nas fibras musculares distróficas. O objetivo do presente projeto foi verificar se o tratamento com o bloqueador de cálcio Nifedipina (Ni) e o antioxidante Coenzima Q10 (CoQ10), administrados isoladamente ou em associação antes que se iniciem os ciclos de degeneração/regeneração muscular, pode apresentar efeito benéfico sobre as fibras musculares distróficas de camundongos mdx, modelo experimental da distrofia muscular de Duchenne. Camundongos mdx com 14 dias de vida pós-natal foram divididos em 4 grupos experimentais: (1) tratados com álcool 20% e solução aquosa 1% de Tween 80; (2) tratados com a associação de Ni e CoQ10; (3) tratados com Ni isoladamente; (4) e tratados com somente CoQ10. Camundongos da linhagem C57BL/10 foram usados como controle. Os músculos tibial anterior (TA), diafragma (DIA) e esternomastóideo (STN) foram retirados e utilizados para quantificar: (1) o número de fibras em degeneração, regeneradas e normais; (2) o nível de TNF-?, NF-?B e 4-HNE; (3) o conteúdo de cálcio total; e (4) a área de inflamação muscular. Amostras de sangue foram utilizadas para determinação dos níveis creatina quinase (CK). Os animais tratados com Ni apresentaram: redução significativa de fibras em degeneração no músculo TA, redução nos níveis de TNF-? em todos os músculos analisados e no conteúdo de NF-?B e cálcio no músculo DIA. Animais mdx tratados com Coenzima Q10 mostrou redução: CK, TNF-? no músculo TA, no conteúdo de NF-?B nos músculos DIA e STN, na área de inflamação no músculo DIA e determinação do cálcio nos músculos DIA e STN. A associação dos tratamentos demonstrou redução significativa na análise de CK, no TNF-? do músculo TA, na área de inflamação, conteúdo do NF-?B e cálcio no músculo DIA. O conjunto dos resultados sugere que a Ni e a CoQ10 possam ser potencialmente úteis para o tratamento farmacológico da distrofinopatias. Entretanto, estudos futuros da dosagem e do tempo de tratamento serão necessários para obtenção de efeitos benéficos mais significativos sobre os músculos distróficos Abstract: Treatment using antioxidant and calcium channel blockers have shown positive results for myonecrosis decrease in dystrophic muscle fibers. The aim of this study is to verify if treatment with Nifedipine (Ni) calcium channel blocker and Coenzyme Q10 (CoQ10) antioxidant, administered alone or in association before degeneration/regeneration cycles take place, may have a beneficial effect on dystrophic muscle fibers in mdx mice, which are the experimental model for Duchenne's dystrophy. Mdx mice at 14 days old were divided into 4 experimental groups: (1) treated with 20% alcohol and 1% Tween 80 water solution; (2) treated with an association of Ni and CoQ10; (3) treated with Ni alone; and (4) treated with CoQ10 alone. C57BL/10 mice were used as a control. The tibialis anterior (TA), diaphragm (DIA) and sternomastoid (STN) muscles were removed and used for quantification of: (1) number of degenerated, regenerated and wild-type fibers; (2) TNF-?, NF-?B and 4-HNE levels; (3) total amount of calcium; and (4) muscle inflammation area. Creatine kinase (CK) was analyzed from a blood sample. The animals treated with Ni showed: a significant decrease of degenerated muscle fibers in the TA muscle, a reduced TNF-? level in all muscles analyzed and lower levels of NF-?B and calcium in the DIA muscle. Mdx mice treated with Coenzyme Q10 presented a decrease of the following: CK expression, TNF-? level in the TA muscle, NF-?B level in the DIA and STN muscles, inflammation area in the DIA muscle and calcium content in the DIA and STN muscles. The association of both drugs showed a significant reduction of CK in the blood, TNF-? in the TA muscle, and also a reduction of the inflammation area, the NF-?B expression and the calcium content of the DIA muscle. Overall results suggest that Ni and CoQ10 may play a potential role as a pharmacological treatment for dystrophynopathies. However, further studies must be carried out for both dosage and treatment period to obtain more significant beneficial effects on dystrophic muscles Mestrado Anatomia Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Léa Rodrigues Simioni Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Neste trabalho, foi examinada a atividade neuromuscular do veneno da aranha acanthoscurria juruenicola (encontrada na região amazônica) em preparações biventer cervicis de pintainho (bc) e nervo frênico-diafragma de camundongo (nfd). Em preparações bc estimuladas indiretamente, o veneno (30 e 100 µg/ml) causou bloqueio neuromuscular tempo e concentração dependentes (73±7% e 89±0,6%, respectivamente). A preparação bc incubada com o veneno (100 µg/ml) reduziu significativamente a contratura após a adição de ach (100 µm; 80±9%) e kcl (40 mm; 49±17%) após 120 min. Em preparações nfd, o veneno também causou bloqueio neuromuscular concentração-tempo-dependente, sendo que a concentração de 30 µg/ml de veneno causou bloqueio máximo de 79±6%, após 120 min, enquanto que na concentração de 100 µg/ml, induziu completo bloqueio aos 13±4 min. A preparação nfd se tornou mais sensível a ação do veneno quando a concentração de cálcio na solução tyrode foi reduzida de 1.8 mm para 0.4 mm. Observou-se bloqueio total das contrações musculares (20±2 min; 3 µg/ml), enquanto com a concentração de 0.3 µg/ml ocorreu facilitação neuromuscular (73±6,5% de aumento até os 120 min). Em preparações curarizadas incubadas em solução de tyrode com cálcio 1.8 mm, o veneno (30 e 100 µg/ml) produziu 88±1% e 88.5±1.5%, respectivamente, de bloqueio neuromuscular. No entanto, usando-se baixo cálcio (0.4 mm), observou-se em preparaçãoes sob estímulo elétrico direto, apenas leve bloqueio (16±5% e 24±6% com 0.3 µg/ml e 3 µg/ml, respectivamente, após 120 min). O veneno (30 µg/ml) causou discreta despolarização da membrana (-74±2 mv para -58±3 mv após 120 min) e reduziu a frequência do potencial de placa terminal em miniatura (pptm; 17±3/min para 7±2/min após 60 min). Ainda na preparação nfd, mantida em solução com baixo cálcio (0.4mm) e exposta ao veneno (0.3 µg/ml), houve aumento significativo do valor do conteúdo quântico [6.7 ± 0.6 (t0) para 12 ± 0.3 (t120)]. Assim como visto nos resultados em que foi observada a facilitação da resposta contrátil; 3 µg de veneno/ml não causou alteração no valor do conteúdo quântico [6 ± 0.1 (t0) para 6.1 ± 2.3 (t120); n = 3; p > 0.05]. O veneno (30 µg/ml) não causou efeito significante na alteração da amplitude do potencial de ação composto (pac) registrado em preparações nervo ciático (nc) de camundongo durante 30 min de incubação [amplitude controle: 15.9 ± 4.8 mv (t0) vs. 15.1 ± 5.6 mv (t30)]; tetrodotoxina (ttx, 1 µm) adicionada após o tempo de exposição da preparação ao veneno, aboliu completamente o pac. A análise histológica das preparações bc e nfd não mostraram alterações significativas. A rianodina e o dantrolene impediram o bloqueio total provocado pelo veneno (3 µg/ml). Observou-se ainda, que as respostas contraturantes provocadas pela cafeína foram atenuadas pela ação do veneno. Juntos os resultados indicam que o veneno de a. Juruenicola pode afetar a transmissão neuromuscular em preparações in vitro Abstract: In this work, we examined the neuromuscular activity of venom from acanthoscurria juruenicola, a large theraphosid spider found in the brazilian amazon basin, in biventer cervicis of chicken (bc) e mouse phrenic nerve-diaphragm (pnd) preparations. In indirectly-stimulated bc preparations, the venom caused time-dependent neuromuscular blockade, with 30 µg of venom/ml producing a maximum blockade of 73±7 e 89±0.6, respectively. That blockade was not reversible after wash. Incubation with the venom (100 µg/ml) reduce significantly the contracture after addition of ach (100 µm; 80±9%) and kcl (40 mm; 49±17%) after 120 min. In indirectly-stimulated pnd preparations, the venom caused time-dependent neuromuscular blockade, with 30 µg of venom/ml producing a maximum blockade of 79±6% after 120 min, whereas 100 µg/ml produced complete neuromuscular blockade in 13±4 min. The sensitivity of pnd to venom was greater in low ca2+, with complete blockade occurring in 20 ± 2 min at 3 µg/ml, whereas a concentration of 0.3 µg/ml caused only marked facilitation (74±7% increase in twitch height after 120 min). In curarized, directily-stimulated pnd, a venom concentration of 30 and 100 µg/ml produced blockade of 88±1% and 88.5±1.5, after 120 min. Low extracellular ca2+ markedly attenuated the blockade in directly-stimulated pnd (16±5% and 24±6% blockade with 0.3 µg/ml and 3 µg/ml, respectively, after 120 min. A. Juruenicola venom (30 µg/ml) depolarized diaphragm muscle membrane (from -74±2 mv to -58±3 mv after 120 min; n = 4; p < 0.05) and reduced the frequency of miniature end-plate potentials (mepps; from 17±3/min to 7±2/min after 60 min; n = 4; p < 0.05). In pnd preparations maintained in low ca2+ bath solution and exposure to venom (0.3 µg/ml), there was significant increase in quantal content [from 6.7 ± 0.6 (t0) to 12 ± 0.3 (t120); p < 0.05] just like that neuromuscular facilitation seen in twitch-tension protocols; 3 µg of venom/ml did not cause alteration in quantal content [from 6 ± 0.1 (t0) to 6.1 ± 2.3 (t120); n = 3; p > 0.05]. A. Juruenicola venom (30 µg/ml) caused no significant effects on peripheral nerve conductance from evoked cap (compound action potential) during a 30 min incubation [control amplitude: 15.9 ± 4.8 mv (t0) vs. 15.1 ± 5.6 mv (t30)]; tetrodotoxin (ttx, 1 µm) added after venom exposure time, abolished completely the cap. Histological analysis of bc and pnd showed no myonecrosis after incubation with venom. The ryanodine and dantrolene prevented the blockade caused by the venom (3 mg/ml) and the contractures caused by caffeine were attenuated by venom action. Together, the results indicate that the venom of a. Juruenicola may affect the transmission neuromuscular in preparations in vitro Doutorado Farmacologia Doutora em Farmacologia CAPES 01-p-2162/2012

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os canais de cálcio voltagem-dependentes (CaV) são proteínas de membrana plasmática que conduzem cálcio, e são ativados pela despolarização da mesma promovendo influxo do íon, que serve como um segundo mensageiro intracelular, transformando sinais elétricos em químicos. Esse processo controla diversos eventos intracelulares, como exocitose, endocitose, contração muscular, transmissão sináptica e metabolismo. Em células beta (B), a secreção de insulina estimulada por glicose e/ou leucina ocorre por diversos sinais que levam à despolarização da membrana e influxo de cálcio, que age no processo de acoplamento estímulo/secreção dos grânulos contendo insulina. É possível a existência de efeitos sinérgicos entre o metabolismo da leucina e glicose, permitindo um controle fino da expressão gênica, produção e secreção de insulina em células B. Recentemente demonstramos que animais que sofreram um processo de restrição protéica modificam o mecanismo de secreção de insulina alterando a resposta secretória para diferentes secretagogos (glicose, aminoácidos, etc.). Nesse trabalho, buscamos elucidar o envolvimento dos íons cálcio nos processos de secreção de insulina, bem como avaliar a expressão gênica e protéica das subunidades alfa1 e beta2 do canal nos diferentes grupos estudados. Observamos uma redução na expressão gênica das duas subunidades do CaV em ilhotas de animais desnutridos e uma tendência de recuperação na expressão protéica da subunidade ?1 em animais desnutridos suplementados com leucina. As áreas abaixo das curvas (AUC) de cálcio das ilhotas não apresentaram diferença entre os grupos quando estimulados com alta (16,7 mM) glicose e 40 mM de K+, porém, há um aumento na área abaixo da curva quando estimuladas com tolbutamida no grupo desnutrido suplementado com leucina (LPL). As secreções de insulina frente a inibidores de canal de cálcio apresentaram resultados similares frente a alta glicose e tolbutamida, porém apresentando valores absolutos menores. Ilhotas provenientes de animais LPL apresentaram recuperação da taxa de liberação de insulina quando estimuladas com ácido ketoisocapróico, atingindo valores similares aos controles. Essa recuperação não foi observada quando estimulamos as ilhotas com cloreto de potássio. Observamos também uma redução na área das ilhotas de animais desnutridos, com recuperação a valores equivalentes aos controles quando há suplementação com leucina. Nossos dados sugerem que o manejo dos íons cálcio possa não estar diretamente envolvido na melhora da secreção de insulina por ilhotas de animais desnutridos suplementados com leucina, mesmo havendo uma melhora na expressão protéica da subunidade alpha1 do Cav em ilhotas de animais LPL, através de uma possível modulação pós-transcricional. Abstract: Voltage-dependent calcium channels (CaV) are plasma membrane proteins that lead calcium, and are activated by depolarization of the same by promoting the influx of this ion, which serves as an intracellular second messenger, turning electrical signals into chemical. This process controls several intracellular events such as exocytosis, endocytosis, muscle contraction, synaptic transmission and metabolism. In beta cells (B), insulin secretion stimulated by glucose and/or leucine occurs by several signs that lead to membrane depolarization and calcium influx, which acts on the coupling process stimulus/secretion of granules containing insulin. It is possible that there are synergistic effects between the metabolism of glucose and leucine, allowing fine control of gene expression, production and insulin secretion in B cells. We have shown that animals which have undergone a process of protein restriction alter the mechanism of insulin secretion by altering the secretory response to different secretagogues (glucose, amino acids, etc.). In this paper we elucidate the involvement of calcium ions in the process of insulin secretion, as well assess the gene and protein expression of alpha1 and beta2 subunits of the channel in different groups. Observed a decrease in gene expression of two subunits of CaV in islets of malnourished animals and a recovery trend in protein expression of ?1 subunit in malnourished animals supplemented with leucine. The areas under the curve (AUC) for calcium of islets did not differ between groups when stimulated with high (16.7 mM) glucose and 40 mM K +, however, there is an increase in area under the curve when stimulated with tolbutamide in undernourished group supplemented with leucine (LPL). The secretions of insulin compared to calcium channel inhibitors showed similar results compared to high glucose and tolbutadima, although a smaller absolute values. Islets from LPL animals showed recovery of the rate of insulin release when stimulated with ketoisocaproic acid (KIC), reaching values similar to controls. This recovery was not observed when we stimulate the islets with potassium chloride. We also observed a reduction in the area of the islets of malnourished animals, with recovery to similar values for controls when supplementation with leucine. Our data suggest that the management of calcium ions can not be directly involved the improvement of insulin secretion by islets of malnourished animals supplemented with leucine, even with an improvement in protein expression of the alpha1 subunit of the Cav in islets of animals LPL, through a possible post-transcriptional modulation. Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Several species of Convolvulaceae are popularly used to treat smooth muscle disorders and others have already shown spasmolytic effect. Among the species of this family, Evolvulus linarioides Meisn., stands out, a species commonly found in the states of Bahia, Minas Gerais, Pernambuco and Paraíba. Thus, this study aimed to investigate the spasmolytic activity of the crude methanolic extract obtained from the aerial parts (EL-MeOHAP) in rat aorta and trachea, rat uterus and guinea-pig ileum, in addition to characterizing its mechanism of action in the organ it presented greater relaxing power. All functional experimental protocols (n = 5) performed were approved by the UFPB Ethics Committee on the Use of Animals (certificate 3059100918). EL-MeOHAP showed non-selective spasmolytic activity in the tested organs, being more potent in rat trachea (EC50 = 139.4 ± 17.4 μg/mL) and guinea-pig ileum (IC50 = 124.8 ± 18.1 μg/mL). Following the study of the mechanism of action in guinea-pig ileum, it was observed that EL-MeOHAP relaxed the ileum pre-contracted with KCl 40 mM (EC50 = 53.5 ± 5.7 μg/mL), carbachol 10-6 M (EC50 = 49.6 ± 7.2 μg/mL) or histamine 10-6 M (EC50 = 36.0 ± 5.2 μg/mL) in an equipotent manner, suggesting that the extract should inhibit the Ca2+ influx through voltage-dependent Ca2+ channels (Cav). This hypothesis was confirmed, since the extract inhibited the cumulative contractions induced by CaCl2 in depolarizing medium (70 mM KCl) nominally without calcium. In addition, EL-MeOHAP relaxed the ileum pre-contracted with S-(-)-Bay K8644, a Cav1 agonist (EC50 = 83.2 ± 6.4 μg/mL), compared to the effect observed with KCl, demonstrating that the extract directly inhibits the influx of Ca2+ through Cav1. Other relaxation pathways were also investigated, however it was found that K+ channels, adrenergic, nitric oxide and cyclooxygenase pathway were not involved in the spasmolytic effect of this extract in guinea-pig ileum. Knowing that the mechanisms of Ca2+ mobilization in muscle cells of the circular and longitudinal layers are different, a possible blockage of Ca2+ mobilization from intracellular stores was also investigated. Therefore, the circular layer of guinea-pig ileum was used, and it was observed that the extract antagonized the phasic contractions induced by histamine 10-5 M (EC50 = 53.5 ± 5.7 μg/mL), thus modulating negatively the release of Ca2+ from intracellular stores. In view of this, it was possible to infer that EL-MeOHAP has non-selective activity in the tested organs and that its mechanism of action in isolated guinea-pig ileum involves blocking the Ca2+ influx by Cav1, in addition to a negative modulation of Ca2+ release mechanisms from intracellular stores, resulting in a reduction in [Ca2+]c, thus promoting muscle relaxation. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Várias espécies da família Convolvulaceae são utilizadas popularmente para o tratamento de desordens do músculo liso, e outras já apresentaram efeito espasmolítico. Entre as espécies dessa família, destaca-se Evolvulus linarioides Meisn., uma espécie comumente encontrada nos estados de Bahia, Minas Gerais, Pernambuco e Paraíba. Dessa forma, esse estudo teve como objetivo investigar a atividade espasmolítica do extrato metanólico bruto obtido das partes aéreas (EL-MeOHPA) em aorta e traqueia de rato, útero de rata e íleo de cobaia, além de caracterizar seu mecanismo de ação no órgão que apresentou maior potência relaxante. Todos os procedimentos experimentais funcionais (n = 5) realizados foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFPB (certidão 3059100918). O EL-MeOHPA apresentou atividade espasmolítica não seletiva em relação aos órgãos testados, sendo mais potente em traqueia de rato (CE50 = 139,4 ± 17,4 μg/mL) e íleo de cobaia (CI50 = 124,8 ± 18,1 μg/mL). Seguindo com o estudo do mecanismo de ação em íleo de cobaia, observou-se que o EL-MeOHPA relaxou de maneira equipotente o íleo pré-contraído com 40 mM de KCl (CE50 = 53,5 ± 5,7 μg/mL) ou com 10-6 M de carbacol (CE50 = 49,6 ± 7,2 μg/mL) ou com histamina (CE50 = 36,0 ± 5,2 μg/mL), sugerindo que o extrato deve inibir o influxo de Ca2+ através dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem (CaV). Essa hipótese foi confirmada, uma vez que o extrato inibiu as contrações cumulativas induzidas por CaCl2 em meio despolarizante (KCl 70 mM) nominalmente sem Ca2+. Além disso, o EL-MeOHPA relaxou de maneira equipotente o íleo pré-contraído com S-(-)-Bay K8644, um agonista dos CaV1 (CE50 = 83,2 ± 6,4 μg/mL), em comparação ao efeito observado com KCl, demonstrando que o extrato inibe de forma direta o influxo de Ca2+ através dos CaV1. Também foram investigadas outras vias de relaxamento, entretanto foi constatado a não participação dos canais de K+ e das vias adrenérgica, do óxido nítrico e das ciclo-oxigenases no efeito espasmolítico desse extrato em íleo de cobaia. Tendo em vista que os mecanismos de mobilização de Ca2+ nas células musculares das camadas circular e longitudinal se diferenciam, investigou-se também um possível bloqueio da mobilização de Ca2+ dos estoques intracelulares. Para isso, foi utilizada a camada circular do íleo de cobaia, e observou-se que o extrato antagonizou as contrações fásicas induzidas por 10-5 M de histamina (CE50 = 53,5 ± 5,7 μg/mL), modulando assim, negativamente, a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares. Diante do exposto, foi possível inferir que o EL-MeOHPA possui atividade não seletiva nos órgãos testados e que seu mecanismo de ação em íleo isolado de cobaia envolve bloqueio do influxo de Ca2+ via CaV1, além de uma modulação negativa dos mecanismos de liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, resultando na redução da [Ca2+]c, promovendo assim o relaxamento muscular.

Asthma is a chronic and multifactorial inflammatory disease of the respiratory system, characterized by bronchial remodeling and hyperresponsiveness, with treatment aimed to preventing symptoms and acute attacks. Thus, it is still necessary to improve molecules testing in animal models such as chronic allergic pulmonary inflammation (IPAC) induced by ovalbumin focusing a more effective treatment. For this, it was evaluated a possible relaxant effect of LASSBio-448 and 12 derivatives, as well as well it was investigated the mechanism of action of the most potent LASSBio in guinea pig trachea from control (GC) and IPAC (GIPAC) groups. The experimental procedures were approved by Ethic Comission on Animal Use of UFPB (protocol Nº 018/2015). LASSBio-448 relaxed trachea in both the presence and presence of epithelium of GIPAC. As showed by the prototype, the N-methylsulfonamide LASSBios (-1610, -1630, -1631, -1628, -1612 e -1623) and sulfonamidic LASSBios (-1622, -1613, -1722, -1629, -1625 e -1611) also relaxed trachea in both the presence and absence of epithelium, carbachol-contracted, from GC and GIPAC, being LASSBio-1611 the most potent of all when compared to LASSBio-448, in the absence of epithelium, in both GC (1,380-fold) and GIPAC (575-fold). Thus, it was decided to investigate its mechanism of relaxant action in trachea denuded of epithelium from GIPAC. Considering that the airway relaxation has the participation of nitric oxide (NO), it was decided to evaluate whether the NO synthase (NOS)/soluble guanylyl cyclase (sGC)/protein kinase G (PKG) would be activated by this derivative. The relaxant potency of LASSBio-1611 was reduced in the presence of L-NAME, ODQ and Rp-8-Br-PET-cGMPS, inhibitors of NOS, sGC and PKG, by approximately 170-, 155- and 195-fold, respectively. In addition, the inhibitory effect of L-NAME on the relaxing effect of LASSBio-1611 was reversed in the presence of L-arginine, the NOS substrate. These results provide strong evidence that this derivative activates this signaling pathway to relax denuded guinea pig trachea with IPAC. As the K+ and voltage-sensitive Ca2+ channels are targets of PKG, the inhibitory effect of LASSBio-1611 was tested on contractions induced by 18 or 60 mM KCl, observing an equipotency, suggesting a possible blockage of Ca2+ influx. This blockade was confirmed since the cumulative concentration-response curve to CaCl2 was paralleled shifted to the right with reduction of Emax in the presence of different concentrations of LASSBio-1611. There is evidence of an interconnection between the NOS and the ciclooxygenases (COXs) pathways, and it was observed that in the presence of indomethacin, an inhibitor of COXs, and indomentacin + L-NAME, the relaxing potency of LASSBio-1611 was considerably reduced 813- and 537-fold, respectively, indicating that there is modulation of COX, increasing the production of relaxant prostanoids in the airways. In addition, it was observed that, in silico, LASSBio-1611 has an enthalpy of formation of the ligand-macromolecule complex increased for the iNOS, nNOS, PKG, CaV1.2 and COX-2, compared to the enthalpy of standards activators and/or inhibitors. Besides, the LASSBio-1611 follows the Lipinski's rule as well as exhibits essential pharmacokinetic characteristics for a good drug candidate. Therefore, in general, all LASSBios relax guinea pig trachea of both GC and GIPAC, and that the relaxant mechanism of action of LASSBio-1611 in the GIPAC, denuded epithelium, is dependent on the NOS/sGC/PKG and COXs pathways. This increased relaxant potency of LASSBio-1611 is due to the insertion of the 1-naphthyl substituent into the sulfonamide function, increasing its lipophilicity. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES A asma é uma doença inflamatória crônica e multifatorial do sistema respiratório, caracterizada por remodelamento e hiper-responsividade brônquica, com tratamento voltado para prevenir sintomas e crises agudas. Nesse sentido, ainda faz-se necessário o aperfeiçoamento de moléculas e testes em modelos animais como o de inflamação pulmonar alérgica crônica (IPAC) induzida por ovalbumina para se chegar a um tratamento mais eficaz. Portanto, avaliou-se o possível efeito relaxante do LASSBio-448 e de 12 derivados, bem como investigou-se o mecanismo de ação relaxante do LASSBio mais potente em traqueia isolada de cobaia dos grupos controle (GC) e com IPAC (GIPAC). Os procedimentos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFPB (Certidão Nº 018/2015). O LASSBio-448 relaxou a traqueia com e sem epitélio do GIPAC. Assim como o protótipo, os LASSBios N-metilssulfonamídicos (-1610, -1630, -1631, -1628, -1612 e -1623) e sulfonamídicos (-1622, -1613, -1722, -1629, -1625 e -1611) também relaxaram, a traqueia com e sem epitélio funcional, pré-contraída com carbacol, do GC e do GIPAC, sendo o LASSBio-1611 o mais potente de todos quando comparado ao LASSBio-448, na ausência de epitélio, tanto no GC (1.380 vezes) como no GIPAC (575 vezes). Sendo assim, decidiu-se investigar seu mecanismo de ação relaxante em traqueia de cobaia na ausência de epitélio do GIPAC. Como uma das vias de relaxamento nas vias aéreas é a do óxido nítrico (NO), decidiu-se avaliar se a via da sintase do NO (NOS)/ciclase de guanilil solúvel (sGC)/proteína cinase G (PKG) seria ativada por esse derivado. A potência relaxante do LASSBio-1611 foi reduzida na presença de L-NAME, de ODQ e de Rp-8-Br-PET-cGMPS, inibidores da NOS, da sGC e da PKG em aproximadamente 170, 155 e 195 vezes, respectivamente. Além disso, a potência inibitória do L-NAME sobre o efeito relaxante do LASSBio-1611 foi revertida na presença do substrato de NOS, L-arginina. Esses resultados fornecem indícios de que esse derivado ativa essa via de sinalização para relaxar a traqueia de cobaia com IPAC, sem epitélio. Como os canais de K+ e os de Ca2+ dependentes de voltagem são alvos da PKG, avaliou-se o efeito do LASSBio-1611 sobre as contrações induzidas por 18 ou 60 mM de KCl, observando uma equipotência, sugerindo um possível bloqueio do influxo de Ca2+. Esse bloqueio foi confirmado pelo deslocamento da curva concetração-resposta cumulativa ao CaCl2 de maneira pararela para a direita com redução do Emax na presença de diferentes concentrações do LASSBio-1611. Além disso, há evidências de uma interligação entre as vias da NOS e das ciclo-oxigenases (COXs) e se demonstrou que na presença de indometacina, um inibidor de COXs, e de indomentacina + L-NAME, a potência relaxante do LASSBio-1611 foi reduzida bruscamente em 813 e 537 vezes, respectivamente, indicando que há uma modulação das COXs, que aumenta a produção de prostanoides relaxantes nas vias aéreas. Adicionalmente, observou-se, in silico, que o LASSBio-1611 tem uma entalpia de formação do complexo ligante-macromolécula aumentada para as iNOS e nNOS, a PKG, o CaV1.2 e a COX-2, comparada a entalpia de ativadores e/ou inibidores padrões. Além disso, o LASSBio-1611 segue a regra de Lipinski, assim como apresenta características farmacocinéticas essenciais para um bom candidato a fármaco. Portanto, de maneira geral, todos os LASSBios relaxam traqueia de cobaia, tanto do GC como do GIPAC e que o mecanismo de ação relaxante do LASSBio-1611 no GIPAC, sem epitélio, é dependente das vias NOS/sGC/PKG e COXs. Essa potência relaxante aumentada do LASSBio-1611 pode ser em decorrência da inserção do substituinte 1-naftila na função sulfonamida, aumentando sua lipofilicidade.

Alpinia zerumbet is a plant from Zingiberaceae family, popularly known in Brazil as “Colônia”, used for anxiety and systemic arterial hypertension treatment. Several studies have already demonstrated its anti-hypertensive, vasodilator and antioxidant activities, among others, but no research aimed to verify the vasodilator effect of essential oil from Alpinia zerumbet (EOAz) in resistance vessels. Thus, the aim of this study was to evaluate the vasorelaxant effect of EOAz and to assess its mechanism of action in mesenteric small arteries isolated from Wistar rats. Therefore, the effect of EOAz (03 to 3000 µg/mL) was verified by isometric tension, measured in rings of second-order branch of the mesenteric artery (SOBMA), with intact endothelium, pre-contracted by KCl (80 mM) and U-46619 (03 µM). To study the mechanism of action, it was evaluated the influence of endothelium presence, and the influence of several inhibitors (TEA, 4-AP, Glybenclamide, Atropine, L-NAME, ODQ and indomethacin) on vasodilator effect of EOAz in SOBMA pre-contracted by U-46619. Some protocols were also performed targeting to study Ca2+ influx, through CaCl2 contraction in high K+ medium, as well as Ca2+ release from intracellular storages by caffeine and phenylephrine induced contraction in Ca2+ free medium. Results showed an endothelium-independent vasorelaxant effect of EOAz on SOBMA pre-contracted by KCl, with an EC50 of 33.17 µg/mL (CI95%: 28.11 to 39.38), and U-46619, with an EC50 of 21.52 µg/mL (CI95%: 17.68 to 25.95). Significantly higher potency (P

A regulação do processo de maturação e manutenção do metabolismo das células de Sertoli é fundamental para a promoção adequada da fertilidade masculina. Além dos hormônios andrógenos, com a testosterona (T), os retinóides possuem papel fundamental na regulação e manutenção da espermatogênese. Sabe-se que além dos efeitos individuais, os retinóides interagem com outros hormônios, modulando suas ações. Este trabalho teve como objetivos estudar as possíveis interações nas vias de sinalização do retinol e da T em rápidas respostas mediadas pela membrana plasmática, verificando a influência destes hormônios sobre o influxo de cálcio, analisando a influência dos canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L (CCDV-L) e dos canais de potássio dependentes de voltagem (Kv) em testículos de ratos imaturos de 10 dias de idade. Também foi objetivo deste trabalho analisar a resposta eletrofisiológica destes hormônios em cultura primária de células de Sertoli. Na técnica de influxo de cálcio foi realizada curva de dose-resposta, onde os tecidos foram tratados com retinol ou testosterona, por 2 minutos, nas concentrações 10-12, 10-9 e 10-6 M e 10-9 e 10-6 M, respectivamente. Após definido a concentração para os demais experimentos, foi analisado a interação entre estes dois hormônios. Em seguida foi verificada a influência dos canais CCDV-L e Kv, através da utilização dos bloqueadores nifedipina e cloreto de tetraetilamônio (TEA), respectivamente. Também foi realizada a técnica de eletrofisiologia Patch Clamp em whole cell onde foi analisada a atividade das correntes de potássio através da ação não clássica destes hormônios. Concluímos que o retinol estimula o influxo de cálcio em testículos de ratos imaturos. Este efeito estimulatório ocorre através dos CCDV-L e em parte através dos canais Kv. A T também estimula o influxo de cálcio em testículos de ratos imaturos. Este efeito estimulatório ocorre através dos canais Kv e em parte através dos CCDV- L. Além disso, o retinol e a T estimulam as correntes do íon potássio através da abertura dos canais de Kv das células de Sertoli imaturas de cultura primária. O retinol e a T interagem entre si, agindo de forma sinérgica, estimulando ainda mais o influxo de cálcio quando aplicados simultaneamente, demonstrando que sua ação é 6 desencadeada pela abertura de diferentes tipos de canais iônicos.

A recent untargeted metabolomics investigation into the chemical profile of 10 organic extracts from cf. Symploca spp. revealed several interesting chemical leads for further natural product drug discovery. Subsequent target-directed isolation efforts with one of these, a Panamanian marine cyanobacterium cf. Symploca sp., yielded a phenethylamide metabolite that terminates in a relatively rare gem-dichlorovinylidene moiety, caracolamide A (1), along with a known isotactic polymethoxy-1-alkene (2). Detailed NMR and HRESIMS analyses were used to determine the structures of these molecules, and compound 1 was confirmed by a three-step synthesis. Pure compound 1 was shown to have in vitro calcium influx and calcium channel oscillation modulatory activity when tested as low as 10 pM using cultured murine cortical neurons, but was not cytotoxic to NCI-H460 human non-small-cell lung cancer cells in vitro (IC50 > 10 μM).

Resumo Introduction: Valvular deposits of calcium quantified by transthoracic echocardiography are associated with the occurrence of systemic atherosclerotic disease, but its prognostic value and influence of associated cardiovascular risk factors have not been defined yet. Objectives: To correlate the valvular cardiac calcium index by transthoracic echocardiography with cardiovascular risk factors and presence of coronary artery disease (CAD). Methods: We selected 203 patients (61.2 ± 14.3 years; 57.6% females) who underwent transthoracic echocardiography with cardiac calcium index quantification. The presence or absence of CAD, hypertension, diabetes mellitus (DM), dyslipidemia, and smoking was assessed. Results: Age above 65 years (p < 0.001) and the presence of hypertension (p < 0.001) showed a significant correlation with the presence of cardiac calcification, whereas DM (p = 0.056) and CAD (p = 0.08) showed only a trend toward a correlation with calcification. Mitral valve calcification alone correlated significantly with age above 65 years (p < 0.001), presence of CAD (p = 0.004), hypertension (p = 0.054), and DM (p = 0.07). On multivariate analysis, CAD (odds ratio [OR] 3.39, 95% confidence interval [95%CI] 1.58-7.29, p = 0.002) and age > 65 years (OR 1.05, 95%CI 1.02-1.08, p = 0.003) correlated significantly and independently with mitral valve calcification. Aortic valve calcification alone showed no correlation with the presence of CAD (p = 0.435), but correlated significantly with age above 65 years (p < 0.001) and hypertension (p < 0.001). On multivariate analysis, only age (OR 1.1, 95%CI 1.06-1.14, p < 0.001) remained independently and significantly correlated with aortic calcification. Conclusion: Age above 65 years and hypertension were independent risk factors for the presence of valvular cardiac calcification, with mitral valve calcification alone emerging as significantly and independently associated with the presence of CAD. Resumo Introdução: Depósitos valvares de cálcio quantificados por ecocardiografia transtorácica estão associados à presença de doença aterosclerótica sistêmica, embora seu valor prognóstico e a influência de fatores de risco cardiovascular associados ainda não estejam definidos. Objetivos: Correlacionar o índice de calcificação cardíaca valvar pela ecocardiografia transtorácica com fatores de risco cardiovascular e presença de doença arterial coronariana (DAC). Métodos: Foram selecionados 203 pacientes (61,2 ± 14,3 anos; 57,6% do sexo feminino) que realizaram ecocardiografia transtorácica com quantificação do índice de cálcio cardíaco. A presença ou não de DAC, hipertensão arterial sistêmica (HAS), diabetes mellitus (DM), dislipidemia e tabagismo foi avaliada. Resultados: Idade acima de 65 anos (p < 0,001) e presença de HAS (p < 0,001) mostraram correlação significativa com a presença de calcificação cardíaca, enquanto que o DM (p = 0,056) e a DAC (p = 0,08) apresentaram apenas uma tendência a se correlacionar com a mesma. A calcificação isolada da valva mitral mostrou correlação significativa com idade acima de 65 anos (p < 0,001), presença de DAC (p = 0,004), HAS (p = 0,054) e DM (p = 0,07), sendo que na análise multivariada a DAC (odds ratio [OR] 3,39, intervalo de confiança de 95% [IC95%] 1,58-7,29, p = 0,002) e idade > 65 anos (OR 1,05, IC95% 1,02-1,08, p = 0,003) mostraram correlação significativa e independente com calcificação mitral. A calcificação isolada da valva aórtica não mostrou correlação com a presença de DAC (p = 0,435), mas apresentou uma correlação significativa com idade acima de 65 anos (p < 0,001) e HAS (p < 0,001). Na análise multivariada, apenas a idade (OR 1,1, IC95% 1,06-1,14, p < 0,001) manteve uma correlação independente e significativa com calcificação aórtica. Conclusão: Idade acima de 65 anos e hipertensão arterial sistêmica foram fatores de risco independentes para a presença de calcificação cardíaca valvar, sendo que a calcificação isolada da valva mitral esteve associada de forma significativa e independente com a presença de DAC.

Phosphodiesterases (PDEs) are enzymes that promote hydrolysis of cAMP/cGMP. PDE inhibitors have been useful in the therapy of diseases which are intrinsically related to deregulations in vascular tone by increasing levels of these second messengers. Thus, PDE inhibitors may be important in the treatment of cardiovascular diseases. AAL 195 is a compound synthesized from structural modifications of the molecules of Zardaverina and Rolipram, two PDE4 inhibitors known. Binding assays and molecular modeling showed AAL 195 is a potent and selective inhibitor of these enzymes. Therefore, the aim of this study was to evaluate the vasorelaxant effect of AAL 195 in superior mesenteric artery of rats and elucidate the mechanisms involved in this it. Male Wistar rats (250 – 300g) were euthanized by exsanguination under anesthesia and superior mesenteric artery was removed, cut in rings (2-4 mm), which were mounted in organ baths containing Tyrode's solution at 37°C and gassed with 95% O2 - 5% CO2. For isometric tension recordings, each ring was fixed in a force transducer connected to an acquisition system. The values were expressed as mean ± S.E.M. Data were analyzed using Student's t test or one-way ANOVA, followed by Bonferroni (p

Despite the important biological effects of jabuticaba, its actions on the cardiovascular system have not been clarified.To determine the effects of jabuticaba hydroalcoholic extract (JHE) on vascular smooth muscle (VSM) of isolated arteries.Endothelium-denuded aortic rings of rats were mounted in isolated organ bath to record isometric tension. The relaxant effect of JHE and the influence of K+ channels and Ca2+ intra- and extracellular sources on JHE-stimulated response were assessed.Arteries pre-contracted with phenylephrine showed concentration-dependent relaxation (0.380 to 1.92 mg/mL). Treatment with K+ channel blockers (tetraethyl-ammonium, glibenclamide, 4-aminopyridine) hindered relaxation due to JHE. In addition, phenylephrine-stimulated contraction was hindered by previous treatment with JHE. Inhibition of sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase did not change relaxation due to JHE. In addition, JHE inhibited the contraction caused by Ca2+ influx stimulated by phenylephrine and KCl (75 mM).JHE induces endothelium-independent vasodilation. Activation of K+ channels and inhibition of Ca2+ influx through the membrane are involved in the JHE relaxant effect.Embora a jabuticaba apresente importantes efeitos biológicos, suas ações sobre o sistema cardiovascular ainda não foram esclarecidas.Determinar os efeitos do extrato de jabuticaba (EHJ) sobre o músculo liso vascular (MLV) em artérias isoladas.Aortas (sem endotélio) de ratos foram montadas em banho de órgãos isolados para registro de tensão isométrica. Foram verificados o efeito relaxante, a influência dos canais de K+ e das fontes de Ca2+ intra- e extracelular sob a resposta estimulada pelo EHJ.Artérias pré-contraídas com fenilefrina apresentaram relaxamento concentração-dependente (0,380 a 1,92 mg/mL). O tratamento com bloqueadores de canais de K+ (tetraetilamônio, glibenclamida, 4-aminopiridina) prejudicaram o relaxamento pelo EHJ. A contração estimulada com fenilefrina também foi prejudicada pelo tratamento prévio com EHJ. A inibição da Ca2+ATPase do reticulo sarcoplasmático não alterou o relaxamento pelo EHJ. Além disso, o EHJ inibiu a contração causada pelo influxo de Ca2+ estimulado por fenilefrina e KCl (75 mM).O EHJ induz vasodilatação independente do endotélio. Ativação dos canais de K+ e inibição do influxo de Ca2+ através da membrana estão envolvidas no efeito relaxante do EHJ.

Background: Despite the important biological effects of jabuticaba, its actions on the cardiovascular system have not been clarified. Objectives: To determine the effects of jabuticaba hydroalcoholic extract (JHE) on vascular smooth muscle (VSM) of isolated arteries. Methods: Endothelium-denuded aortic rings of rats were mounted in isolated organ bath to record isometric tension. The relaxant effect of JHE and the influence of K+ channels and Ca2+ intra- and extracellular sources on JHE-stimulated response were assessed. Results: Arteries pre-contracted with phenylephrine showed concentration-dependent relaxation (0.380 to 1.92 mg/mL). Treatment with K+ channel blockers (tetraethyl-ammonium, glibenclamide, 4-aminopyridine) hindered relaxation due to JHE. In addition, phenylephrine-stimulated contraction was hindered by previous treatment with JHE. Inhibition of sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase did not change relaxation due to JHE. In addition, JHE inhibited the contraction caused by Ca2+ influx stimulated by phenylephrine and KCl (75 mM). Conclusion: JHE induces endothelium-independent vasodilation. Activation of K+ channels and inhibition of Ca2+ influx through the membrane are involved in the JHE relaxant effect. Resumo Fundamentos: Embora a jabuticaba apresente importantes efeitos biológicos, suas ações sobre o sistema cardiovascular ainda não foram esclarecidas. Objetivos: Determinar os efeitos do extrato de jabuticaba (EHJ) sobre o músculo liso vascular (MLV) em artérias isoladas. Métodos: Aortas (sem endotélio) de ratos foram montadas em banho de órgãos isolados para registro de tensão isométrica. Foram verificados o efeito relaxante, a influência dos canais de K+ e das fontes de Ca2+ intra- e extracelular sob a resposta estimulada pelo EHJ. Resultados: Artérias pré-contraídas com fenilefrina apresentaram relaxamento concentração-dependente (0,380 a 1,92 mg/mL). O tratamento com bloqueadores de canais de K+ (tetraetilamônio, glibenclamida, 4-aminopiridina) prejudicaram o relaxamento pelo EHJ. A contração estimulada com fenilefrina também foi prejudicada pelo tratamento prévio com EHJ. A inibição da Ca2+ATPase do reticulo sarcoplasmático não alterou o relaxamento pelo EHJ. Além disso, o EHJ inibiu a contração causada pelo influxo de Ca2+ estimulado por fenilefrina e KCl (75 mM). Conclusão: O EHJ induz vasodilatação independente do endotélio. Ativação dos canais de K+ e inibição do influxo de Ca2+ através da membrana estão envolvidas no efeito relaxante do EHJ.

Vasorrelaxant effects of R(+)-pulegone were tested in normotensive rats using two different methodological approaches. In vivo, increasing doses (1, 3, 10, 20 and 30 mg / kg) were administered in the animals, i.v. bolus and selected randomly, then the parameters for mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR) were evaluated. In this situation the substance triggered a hypotensive effect and bradycardia. In the ex vivo approach, we used the thoracic aorta of these animals and isometric tension experiments, evaluated the vasorelaxant activity of the substance. The administration of R (+)-pulegone triggered vasorelaxant effect concentration-dependent in both rings with intact endothelium and with this removed, but the substance had the lowest pD2 value in the presence of the endothelium (-3.64 ± 0.06, n = -3.17 vs 5 ± 0.034, n = 6, respectively), no change in peak effect (98.2 ± 1.2%, n = 5 vs. 106.0 ± 8.1%, n = 6) indicating that the substance acts triggering vasodilation in aortic dependent manner and independent of the vascular endothelium. In rings with intact endothelium, the vasorelaxant activity of R(+)-pulegone was not altered in the presence of diclofenac and atropine, but was modified by L-NAME (-3.00 ± 0.016; n=5), HDX (-3.07 ± 0.021; n=5), ODQ (-3.17 ± 0.03; n = 5) and the red ruthenium (-3.14 ± 0.04; n=5) vs control: -3.64 ± 0.06; n = 5. These results suggest that the substance is probably stimulating NO production via the activation of TRP channels. In smooth muscle vascular, R(+)-pulegone inhibited curve calcium concentration-dependent manner (Emax: 10-4 M: 68 9 ± 3.81%; 3x10-4 M: 40.97 ± 8.05%; 10-3 M: 24.79 ± 5.04% and 3x10-3 M: 0.29 ± 0.33%) via calcium channels type L, as in the presence of nifedipine, there was a reduction of the maximum effect (Emax: 93.3 ± 1.7% ; n = 6 vs Emax control: 106.8 ± 8.1%; n = 6 ). Additionally, it was surveyed the participation of for potassium channels, using 4-aminiopiridine, it was seen that the substance has inhibited response by blocking the potassium channels sensitive to voltage (-2.93 ± 0.012 - n = 5 vs control - 3.17 ± 0.034 - n = 6) as well as sensitive to ATP, since, in the presence of glybenclamide, the relaxant response to R(+)-pulegone was also inhibited (-2.94 vs. -3.17 ± 0.012 ± 0.03). Thus, to cause vasorelaxation in normotensive rat thoracic aorta, R(+)-pulegone, stimulates the production of NO in endothelial cells, probably by activating calcium influx via TRP channels. The effect independent of the endothelium is mediated by inhibition of calcium influx, likely through the CaV and for opening potassium channels (KATP and Kv). O efeito vasorrelaxante de R(+)-pulegona foi estudado em ratos normotensos, utilizando duas abordagens metodológicas. Na avaliação in vivo, doses crescentes (1, 3, 10, 20 e 30 mg/Kg), foram administradas nos animais, via i.v. em bolus de maneira aleatória, posteriormente os parâmetros de pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) foram avaliados. Nesta situação a substância desencadeou um efeito hipotensor e bradicárdico dependente de dose. Na abordagem ex vivo, utilizou-se a aorta torácica destes animais e avaliou-se a atividade vasorrelaxante da substância. A administração de R(+)-pulegona desencadeou efeito vasorrelaxante, concentração dependente tanto em anéis com endotélio intacto quanto com este removido, porém a substância apresentou o valor do pD2 menor na presença do endotélio (-3,64 ± 0,06, n=5 vs -3,17 ± 0,034, n=6, respectivamente), sem nenhuma alteração no efeito máximo (98,2 ± 1,2%, n=5 vs 106,0 ± 8,1%, n=6), indicando que a substância atua desencadeando vasodilatação na aorta de maneira dependente e independente do endotélio vascular. Em anéis com endotélio intacto, a atividade vasorrelaxante de R(+)-pulegona não foi alterada na presença de diclofenaco e atropina, porém foi modificada por L-NAME (-3,00 ± 0,016, n=5), HDX (-3,07 ± 0,021, n=5), ODQ (-3,17 ± 0,03, n=5) e o vermelho de rutênio (-3,14 ± 0,04, n=5) todos vs controle: -3,64 ± 0,06, n=5. Estes resultados sugerem que a substância provavelmente está estimulando a produção de óxido nítrico (NO), via ativação dos canais TRP na célula endotelial. O efeito dependente do músculo liso vascular de R(+)-pulegona dá-se através da inibição da curva de cálcio de maneira dependente de concentração (Emáx: 10-4 M: 68,9 ± 3,81%; 3x10-4 M: 40,97 ± 8,05%; 10-3 M: 24,79 ± 5,04% e 3x10-3 M: 0,29 ± 0,33%), via canais para cálcio tipo L, pois na presença de NIF, ocorreu redução do efeito máximo (Emáx: 93,3 ± 1,7%, n= 6 vs controle Emáx: 106,8 ± 8,1%, n=6). Adicionalmente, pesquisou-se a participação dos canais para potássio e na presença de 4-AP ocorreu redução da resposta relaxante da substância indicando a participação dos canais para potássio sensíveis a voltagem (-2,93 ± 0,012, n=5 vs controle -3,17 ±0,034, n=6) e também sensíveis ao ATP, uma vez que, na presença de glibenclamida, a resposta relaxante para R(+)-pulegona também foi reduzida (-2,94 ± 0,012, n=5 vs -3,17 ± 0,03, n=6). Assim, para causar vasorrelaxamento em aorta torácica de ratos normotensos, R(+)-pulegona, estimula a produção de NO na célula endotelial, provavelmente por ativar o influxo de cálcio via canais TRP e o efeito independente do endotélio, é mediado pela inibição do influxo de cálcio, provavelmente através dos CaV e abertura dos canais para potássio (Kv e KATP).

β-Citronellol is an alcoholic monoterpene found in essential oils such Cymbopogon citratus (a plant with antihypertensive properties). β-Citronellol can act against pathogenic microorganisms that affect airways and, in virtue of the popular use of β-citronellol-enriched essential oils in aromatherapy, we assessed its pharmacologic effects on the contractility of rat trachea. Contractions of isolated tracheal rings were recorded isometrically through a force transducer connected to a data-acquisition device. β-Citronellol relaxed sustained contractions induced by acetylcholine or high extracellular potassium, but half-maximal inhibitory concentrations (IC50) for K(+)-elicited stimuli were smaller than those for cholinergic contractions. It also inhibited contractions induced by electrical field stimulation or sodium orthovanadate with pharmacologic potency equivalent to that seen against acetylcholine-induced contractions. When contractions were evoked by selective recruitment of Ca2+ from the extracellular medium, β-citronellol preferentially inhibited contractions that involved voltage-operated (but not receptor-operated) pathways. β-Citronellol (but not verapamil) inhibited contractions induced by restoration of external Ca2+ levels after depleting internal Ca2+ stores with the concomitant presence of thapsigargin and recurrent challenge with acetylcholine. Treatment of tracheal rings with L-NAME, indomethacin or tetraethylammonium did not change the relaxing effects of β-citronellol. Inhibition of transient receptor potential vanilloid subtype 1 (TRPV1) or transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) receptors with selective antagonists caused no change in the effects of β-citronellol. In conclusion, β-citronellol exerted inhibitory effects on rat tracheal rings, with predominant effects on contractions that recruit Ca2+ inflow towards the cytosol by voltage-gated pathways, whereas it appears less active against contractions elicited by receptor-operated Ca2+ channels.

Natural products are a rich source of compounds for the discovery of new drugs. The importance of these natural products in the discovery and inspiration drug is proven and their synthesis is of significant interest. The isoquinoline alkaloids are commonly found in a variety of natural products and biologically active compounds. The novel synthetic isoquinoline alkaloid, 1- (3-methoxy-4-hydroxyphenyl) -7-methoxy-1,2,3,4- tetrahydroisoquinoline (MTHP), showed relaxing activity on the superior mesenteric artery of normotensive rats by the NO-cGMP pathway. The aim of this study was to investigate the vasorelaxant action mechanism of MTHP in rat aorta. Isometric contractions were monitored, and relative potency and efficacy parameters were determined from cumulative concentration-response curves. The MTHP relaxed significantly and concentration-dependent manner the rings of aorta precontracted with phenylephrine in the presence (EC50 = 2.7 ± 0.2 x 10-6 M) and absence (EC50 = 5.7 ± 1.1 x 10-5 M) of a functional endothelium, being 21 times more potent in the presence of endothelium. In the presence of L-NAME, ODQ and indomethacin, the relaxing potency of MTHP was decreased at 17, 24 and 36 times, respectively. These results suggest the involvement of EDRF in alkaloid mechanism of action. However, in the presence of atropine, non-selective antagonist of muscarinic receptors, the relaxing potency of MTHP is not changed, discarding the involvement of these receptors. MTHP relaxed the aorta rings precontracted with 30 or 80 mM KCl, 3 times more potent for 30 KCl, suggesting upregulation of K + channels. However, on contractions induced by S-(-)-Bay K8644, an activator of CaV1, MTHP relaxed significantly and concentration-dependent manner, suggesting a blocking calcium influx through these channels and that locking takes place by antagonism of the non-competitive type. In the presence of glibenclamide and 4-AP, the relaxing potency of MTHP is not changed, discarding KATP and KV in MTHP mechanism. However, in the presence of 1 mM TEA+ , apamin and BaCl2, its potency was decreased about 12, 13 and 74 times, respectively, suggesting the involvement of BKCa, SKCa and Kir on the vasorelaxant action mechanism of MTHP. In the presence of Y-27632, an inhibitor of ROCK, the relaxing potency of MTHP not changed, discarding the participation of the RhoA/ROCK pathway. MTHP does not interfere with cell viability and apoptosis in rat aorta calls labeled annexin-V and propidium iodide. The MTHP decreased fluorescence induced by 300 mM KCl in myocytes loaded with Fluo-3 and inhibited Ba2+ currents through CaV. These results suggest that MTHP promotes vasorelaxation via EDRF by a upregulation of NOS and cyclooxygenase, as well as activation of soluble guanylyl cyclase (GCs). Furthermore, the alkaloid decreases calcium influx by blocking a direct CaV-L, as well as by positive modulation of SKCa, BKCa and Kir channels. All these events lead to a reduction of [Ca2+]i and consequent relaxation of vascular smooth muscle. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Os produtos naturais são uma fonte rica de compostos para a descoberta de novos medicamentos. A importância destes produtos naturais na descoberta e inspiração de drogas é comprovada e sua síntese é de interesse significativo. Os alcaloides isoquinolínicos são comumente encontrados em uma variedade de produtos naturais e em compostos biologicamente ativos. O alcaloide isoquinolínico sintético inédito, 1-(3- metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina (MTHP), demonstrou que o MTHP apresentou atividade relaxante em artéria mesentérica superior de ratos normotensos através da via NO-GMPc. Assim, o objetivo desse estudo foi investigar o mecanismo de ação vasorelaxante do MTHP em aorta isolada de rato. As contrações isométricas foram monitoradas e os parâmetros de potência e eficácia relativa foram determinados a partir de curvas concentrações-resposta cumulativas. O MTHP relaxou de maneira significante e dependente de concentração os anéis de aorta pré-contraídos com fenilefrina na presença (CE50 = 2,7 ± 0,2 x 10-6 M) e na ausência (CE50 = 5,7 ± 1,1 x 10-5 M) de endotélio funcional, sendo 21 vezes mais potente na presença do endotélio. Na presença de L-NAME, ODQ e Indometacina, a potência relaxante do MTHP foi atenuada em 17, 24 e 36 vezes, respectivamente. Esses resultados sugerem a participação de fatores relaxantes derivados do endotélio (FRDE) no mecanismo de ação do alcaloide. No entanto, na presença de atropina, um antagonista não seletivo dos receptores muscarínicos, a potência relaxante do MTHP não foi alterada, descartando a participação desses receptores. MTHP relaxou os anéis de artéria aorta pré-contraídos com 30 ou 80 mM de KCl, sendo 3 vezes mais potente para KCl 30, sugerindo uma modulação positiva de canais para K+. No entanto, em contrações induzidas por S-(-)-Bay K8644, um ativador dos CaV1, MTHP relaxou a aorta de maneira significante e dependente de concentração, sugerindo um bloqueio do influxo de cálcio por esses canais e esse bloqueio se dá por um antagonismo do tipo não competitivo. Na presença de 10 mM de TEA+, bloqueador não seletivos dos canais de K+, MTHP teve sua potência atenuada cerca de 14 vezes, confirmando a participação desses canais. Na presença de glibenclamida e de 4-AP, a potência relaxante do MTHP não foi alterada, descartando os KATP e KV. No entanto, na presença de 1 mM de TEA+, de Apamina e BaCl2, sua potência foi atenuada cerca de 12, 13 e 74 vezes respectivamente, sugerindo a participação dos BKCa, SKCa e Kir no mecanismo de ação vasorelaxante do MTHP. Na presença do Y-27632, um inibidor da ROCK, a potência relaxante do MTHP não foi alterada, descartando a participação da via RhoA/ROCK. MTHP não interfere com a viabilidade e apoptose celular em mióciotos de aorta de rato marcados com anexina-V e iodeto de propídeo. O MTHP diminuiu a fluorescência induzida por 300 mM de KCl em miócitos de aorta carregados com Fluo-3 e inibiu as correntes de Ba2+ através dos CaV. Estes resultados sugerem que o MTHP promove vasorelaxamento via FRDE, por uma modulação positiva da óxido nítrico sintase e das cicloxigenases, bem como a ativação da ciclase de guanilil solúvel. Além disso, o alcaloide diminui o influxo de cálcio por um bloqueio direto dos CaV-L, bem como por uma modulação positiva dos canais BKCa, SKCa e Kir. Todos esses eventos levam a uma redução da [Ca2+]i e consequente relaxamento do musculo liso vascular.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The monoterpene citral is the major constituent of the essential oil of Cymbopogon citratus, medicinal plant popularly known as capim-limão or capim-santo , widely used to treat hypertension. This study evaluated the cardiovascular effects induced by the citral in normotensive rats by using in vivo and in vitro approaches. In non-anaesthetized rats, citral (1, 5, 10, and 20 mg/kg, i.v.) induced transient hypotension and bradycardia. Both effects were significantly attenuated by the pre-treatment with atropine (2 mg/kg, i.v.), hexamethonium (20 mg/kg, i.v.), sodium thiopental (45 mg/kg; i.p.) or indomethacin (5 mg/kg, i.v.) after dose of 5 mg/kg of the citral. After pre-treatment with L-NAME (20 mg/kg, i.v.), hypotension was significantly attenuated, while bradycardia was not altered. Furthermore, electrocardiogram records demonstrated that citral (10 and 20 mg/kg) was also able to induce sinoatrial block, which was reverted by atropine (2 mg/kg). In rings of rat mesenteric artery pre-contracted with phenylephrine (10 μM), citral (10-5 - 10-2 M) was able to induce relaxations (pD2 = 2.52 ± 0.10; Emax = 103.4 ± 10.2%) that was not affected after removal of the endothelium (pD2 = 2.34 ± 0.15; Emax = 107.2 ± 4.3%) or in rings without endothelium pre-contacted with KCl 80 mM (pD2 = 2.04 ± 0.12; Emax = 101.3 ± 7.1%) or in rings without endothelium after tetraethylammonium (pD2 = 3.25 ± 0.05; Emax = 109.3 ± 9.8%). At concentrations of 3 x 10-4 and 10-3 M, citral was able significantly to inhibit the contractions induced by CaCl2 (from 10- 5 to 10-2 M) or sodium orthovanadate (from 3 x 10-4 to 3 x 10-2 M) up to 88.6 ± 3.1% and 93.3 ± 3.8%, respectively. These results demonstrate that citral induces hypotension, which appears to be caused by activation of muscarinic receptors, NO release and, in part, by PGI2 release, associated to bradycardia, which seems to be due to an activation of muscarinic and nicotinic receptors, involving compounds of central nervous system, and sinoatrial block. Furthermore, citral induces vasorelaxation of mesenteric artery possibly caused by the inhibition of the Ca2+ influx through voltage-operated Ca2+ channels associated to a decrease of calcium sensitivity. O monoterpeno citral é o composto majoritário do óleo essencial de Cymbopogon citratus, planta medicinal conhecida popularmente como capim-santo ou capim-limão , e é utilizada na medicina popular brasileira para o tratamento da hipertensão. Este estudo buscou investigar os efeitos cardiovasculares do citral em ratos normotensos através de experimentos in vivo e in vitro. Em animais não-anestesiados, a administração i.v. do citral (1, 5, 10 e 20 mg/kg) induziu uma resposta transiente caracterizada por hipotensão associada à bradicardia. Estes efeitos foram significativamente atenuados em animais pré-tratados com atropina (2 mg/kg, i.v.), hexametônio (20 mg/kg, i.v.), tiopental (45 mg/kg; i.p.) ou indometacina (5 mg/kg, i.v.) após dose de 5 mg/kg do citral. Em animais pré-tratados com L-NAME (20 mg/kg, i.v.), o efeito hipotensor foi significativamente atenuado, enquanto que a bradicardia não foi alterada. Além disso, registros de ECG mostraram que o citral (10 e 20 mg/kg) foi capaz de induzir bloqueio sinoatrial e que este efeito foi inibido totalmente com a administração de atropina (2 mg/kg; i.v.). Em anéis de artéria mesentérica de rato précontraídas com FEN (10 μM), o citral (10-5 - 10-2 M) induziu relaxamento (pD2 = 2,52 ± 0,10; Emáx = 103,4 ± 10,2%) que não foi alterado após a remoção do endotélio (pD2 = 2,34 ± 0,15; Emáx = 107,2 ± 4,3%), nem em preparações, sem endotélio, pré-contraídas com KCl 80 mM (pD2 = 2,04 ± 0,12; Emáx = 101,3 ± 7.1%) e nem em anéis, sem endotélio, após incubação com 100 μM de TEA (pD2 = 3,25 ± 0,05; Emáx= 109,3 ± 9,8%). Nas concentrações de 3 x 10-4 e 10-3 M, o citral foi capaz de inibir significativamente as contrações induzidas por CaCl2 (10-5 - 10-2 M) e por ortovanadato de sódio (3 x 10-4 - 3 x 10-2 M) em 88,6 ± 3,1% e 93,3 ± 3,8%, respectivamente. Estes resultados demonstram que o citral induz hipotensão, que parece ser causada por ativação de receptores muscarínicos, liberação de NO e em parte, por liberação de PGI2, associada à bradicardia, que parece ser causada pela ativação de receptores muscarínicos cardíacos, nicotínicos ganglionares, envolvendo componentes do sistema nervoso central, e bloqueio sinoatrial. Além disso, o citral induz vasorelaxamento que parece ser causado por bloqueio do influxo de Ca2+ através dos canais de Ca2+ operados por voltagem associado à diminuição da sensibilidade ao Ca2+.

Submitted by Joana Lopes Dias (jdias@ubi.pt) on 2015-04-14T10:35:58Z No. of bitstreams: 1 Histamine modulates dopaminergic neuronal survival by boosting microglial activity.pdf: 2847356 bytes, checksum: fdbd789ffbfd15973a5009da2db02bb2 (MD5) Made available in DSpace on 2015-04-14T10:35:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Histamine modulates dopaminergic neuronal survival by boosting microglial activity.pdf: 2847356 bytes, checksum: fdbd789ffbfd15973a5009da2db02bb2 (MD5) Previous issue date: 2013

O Aspidosperma subincanum Mart. é uma planta medicinal que é conhecida por ser utilizada para o tratamento de doenças relacionadas com o sistema cardiovascular. No entanto, seus efeitos e mecanismos de ação farmacológicos não estão muito bem elucidados. O objetivo do presente estudo foi determinar o efeito do Extrato Etanólico do Aspidosperma Subincanum Mart. (EEAS) sobre a pressão arterial (in vivo) em ratos anestesiados e da pressão arterial (in vitro) em artéria aorta torácicas de ratos. Para a realização do protocolos experimentais foram inseridos cateteres na veia e artéria femural direita de ratos anestesiados para que pudesse ser realizada a infusão do EEAS e a verificação da pressão arterial, frequência cardíaca e fluxo sanguíneo aórtico; foram inseridas sondas de fluxo e posicionadas em torno da aorta. Além da pressão foi verificado o efeito vasodilatador do EEAS em anéis de aortas isoladas de ratos pré-contraídas com vasoconstritor. A infusão intravenosa do EEAS resultou em significativa hipotensão, bradicardia e aumento do fluxo aórtico dose-dependente. Em artérias isoladas, o EEAS (0-27μg/mL) induziu relaxamento concentração-dependente em anéis de aorta pré-contraídas com agonista contrátil; foi potencializado o relaxamento nos anéis de aorta sem endotélio. O pré-tratamento dos anéis isoladas de aorta com ODQ, um inibidor da guanilato clicase solúvel (sGC), MDL – 12,330A um inibidor da adenilato ciclase (AC) e CPA um inibidor da bomba do retículo sarcoplasmático, reduziram o vasorelaxamento induzido pelo EEAS. O EEAS foi capaz de diminuir o efeito ocasionado pelo tratamento com fenilefrina (um agonista adrenérgico) e Bay K 8644 (ativador dos canais de Calcio do tipo L) de forma concentração-dependente. O bloqueio dos canais de K+ com tetraetilamonio, clotrimazol, glibenclamida ou 4-aminopiridina reduziu o relaxamento estimulado pelo EEAS. Estes achados sugerem que o EEAS induz hipotensão associada à bradicardia e o relaxamento independente do endotélio vascular. As vias do cGMP/sGC e cAMP/AC foram ativadas e a SERCA e os canais de K+ possivelmente estão envolvidos neste relaxamento. Aspidosperma subincanum Mart. is a medicinal herb that is known to be useful for the treatment of cardiovascular-related illnesses. However, its effects and pharmacological mechanisms of action have not been studied. The aim of the present study was to determine the effect of an ethanol extract of Aspidosperma subincanum Mart. (EEAS) on blood pressure (in vivo) and vascular tension (in vitro) in the rat thoracic aorta. Catheters were inserted into the right femoral vein and artery of anesthetized rats for EEAS infusion and the measurement of blood pressure, heart rate and aortic blood flow (flow probes were placed around the aorta). Moreover, the vasodilator effect of EEAS in isolated pre-contracted rat aortas was examined. Intravenous infusion of EEAS resulted in significant and dose-dependent hypotension, bradycardia and increased aortic blood flow. In isolated arteries, EEAS (0-27μg/mL) induced a concentration-dependent relaxation of pre-contracted aortic rings; endothelial denudation potentiated this effect. Pre-treatment of the aortic rings with ODQ, an inhibitor of soluble guanylyl cyclase (sGC); MDL-12,330A, an inhibitor of adenylyl cyclase (AC); or CPA, a SERCA inhibitor, reduced EEAS-induced vasorelaxation. Treatment with an EEAS impaired contractions induced by phenylephrine (an adrenergic agonist) and Bay K 8644 (an L-type Ca(2+) channel activator). The blockade of K(+) channels with tetraethylammonium, clotrimazole, glibenclamide or 4-aminopyridine reduced the relaxation stimulated by EEAS. These findings suggest that EEAS induces hypotension associated with bradycardia. EEAS induces endothelium-independent vascular relaxation. The sGC/cGMP and AC/cAMP pathways, SERCA activation and Ca(2+) and K(+) flux across the sarcolemma, are likely involved in this relaxation. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Submitted by Helena Fortuna (hfortuna@ubi.pt) on 2013-05-17T13:45:43Z No. of bitstreams: 1 Tese_Mestrado_Diogo_Maio.pdf: 3196175 bytes, checksum: a8d488a353105372e9242ef5e0d03b84 (MD5) Made available in DSpace on 2013-05-17T13:45:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Mestrado_Diogo_Maio.pdf: 3196175 bytes, checksum: a8d488a353105372e9242ef5e0d03b84 (MD5) Previous issue date: 2012-10

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-05-31T15:10:49Z No. of bitstreams: 1 Bruno Mendes Tenorio.pdf: 4101398 bytes, checksum: d81bf09fb306302eb9abbcd6d926a6a7 (MD5) Made available in DSpace on 2016-05-31T15:10:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruno Mendes Tenorio.pdf: 4101398 bytes, checksum: d81bf09fb306302eb9abbcd6d926a6a7 (MD5) Previous issue date: 2011-12-12 In recent decades, humans have been exposed to various exogenous physical agents, such as high temperatures emitted by industrial devices and electromagnetic fields emitted by the electricity distribution networks and electronic devices. Researches demonstrated that these agents can cause reproductive disorders. The chapter 1 of this study aimed to investigate the possible effects of low frequency EMF exposure of 60 Hz and 1 mT from day 13 of gestation up to puberty at 21 postnatal days. The results showed that exposure to EMF reduced parameters related to the lumen, epithelium and seminiferous tubules. It was also observed an increase in the volume of blood vessels and connective tissue cells in animals exposed to EMF. The plasma testosterone did not change due to EMF exposure. The exposure to EMF of 60 Hz and 1 mT from gestation to puberty can induce a delay in testicular development. In chapter 2, the aim was to evaluate the effects of exposure to low frequency EMF (60 Hz and 1 mT) from the 13th day of gestation up to 90 postnatal days (adult). The plasma testosterone concentration was not changed by EMF exposure. However, the histopathological and histomorphometrical analysis showed testicular degeneration in a subset of animals exposed to EMF. The degenerative process severity varied among affected animals, indicating an individual sensitivity to EMF. The electron microscopy analysis also showed testicular degeneration, the main change was high electrodense mitochondria with loss of normal organization and cristae. The exposure to EMF of 60 Hz and 1 mT seems to alter spermatogenesis and reduce the fertility. Chapter 3 aimed to analyze the effects of heat shock (43 °C / 15 min.) and Hsp90 inhibition on CaV3 T-type calcium channels and calciumactivated potassium channels (BKCa) in Leydig cells. The results showed that exposure to heat shock induced a reduction in BKCa channels steady-state current (49.8%), maximum conductance (68.9%) and activation time constant (31.9%). Heat shock slowed the BKCa channels activation and reduced its voltage dependence. Hsp90 inhibition did not change BKCa channels. The CaV3 channels current was not affected by heat shock or Hsp90 inhibition. The heat shock can inhibit BKCa channels, the Hsp90 does not seem to be involved in this process. Nas últimas décadas, os seres humanos vêm sendo expostos a vários agentes físicos exógenos, como temperaturas elevadas induzidas por equipamentos industriais e a exposição aos campos eletromagnéticos (CEM) emitidos por aparelhos eletrônicos. Pesquisas vêm demonstrando que estes agentes podem gerar distúrbios reprodutivos. O objetivo do capítulo 1 do presente trabalho foi investigar o possível efeito da exposição ao CEM de baixa frequência de 60 Hz e 1 mT desde o 13º dia de gestação até a puberdade aos 21 dias pós-natal. Os resultados demonstraram que a exposição ao CEM reduziu os parâmetros relacionados ao lúmen, epitélio e túbulos seminíferos. Também foi observado o aumento no volume dos vasos sanguíneos e das células do tecido conjuntivo nos animais expostos ao CEM. A testosterona plasmática não se alterou devido à exposição ao CEM. A exposição ao CEM de 60 Hz e 1 mT desde a gestação até a puberdade pode induzir o retardo no desenvolvimento testicular. No capítulo 2, o objetivo foi avaliar o efeito da exposição ao CEM de baixa frequência (60 Hz e 1 mT) desde o 13º dia de gestação até os 90 dias pós-natal (adulto). A concentração da testosterona plasmática não foi alterada devido à exposição ao CEM. Entretanto, as análises histopatológicas e histomorfométricas demonstraram degeneração testicular em um sub-grupo dos animais expostos ao CEM. A gravidade do processo degenerativo variou entre os indivíduos afetados, indicando uma sensibilidade individual ao CEM. A análise de microscopia eletrônica também demonstrou degeneração testicular, sendo a principal alteração observada a presença de mitocôndrias eletrodensas e com perda da sua organização e cristas. A exposição ao CEM de 60 Hz e 1 mT parece alterar a espermatogênese e reduzir a fertilidade. No capítulo 3, o presente trabalho objetivou analisar os efeitos do choque térmico (43ºC / 15 min.) e da inibição da Hsp90 nos canais de cálcio CaV3 tipo-T e potássio ativado por cálcio (BKCa) em células de Leydig. Os resultados obtidos revelaram que nos canais BKCa o choque térmico reduziu a corrente do estado estacionário em 49,8%, a condutância máxima em 68,9% e a constante de tempo de ativação em 31,9%. O choque térmico tornou mais lenta a ativação dos canais BKCa e reduziu sua dependência de voltagem. A inibição da Hsp90 não alterou os canais BKCa. A corrente dos canais CaV3 tipo-T não foi afetada pelo estresse térmico ou pela inibição da Hsp90. A exposição das células de Leydig à temperatura elevada pode inibir os canais BKCa, a Hsp90 parece não estar envolvida neste processo.

O veneno da aranha Phoneutria nigriventer contém vários peptídeos que atuam em diferentes canais e receptores do sistema nervoso de insetos e mamíferos. As toxinas Tx3-6 e Tx3-4 são bloqueadoras de canais de cálcio sensíveis a voltagem e possuem um grande potencial farmacológico no tratamento da dor e na neuroproteção. Como apenas pequenas quantidades de cada toxina podem ser isoladas do veneno, testes farmacológicos e estruturais ficam restritos à obtenção destes peptídeos. Neste trabalho, nós testamos diferentes sistemas de expressão e purificação na tentativa de obtermos as toxinas Tx3-6 e Tx3-4 recombinantes funcionais e em grandes quantidades. A toxina Tx3-6 recombinante expressa no vetor pBADmycHis em E. coli teve efeito analgésico comparável à toxina nativa no teste da formalina em ratos, porém, o rendimento da expressão foi de apenas 0,3 mg/L de cultura. Cerca de 2 mg da mesma toxina foram obtidos no sistema pE-SUMO (E. coli), mas a toxina não teve nenhum efeito no bloqueio de glutamato em sinaptosomas corticais de camundongos. A Tx3-4 também foi expressa no sistema SUMO, de onde foram obtidos cerca de 800 g/L da toxinarecombinante solúvel e funcional e cerca de 3 mg/L da toxina insolúvel que foram renaturados in vitro e renderam 2 mg funcionais. Expressões nos sistemas pPICZ (leveduras), pET (E. coli) e pBADHis (E. coli) foram insatisfatórias devido a baixos rendimentos, expressão em corpos de inclusão e obtenção das toxinas de forma inativa. A caracterização da estrutura secundária da toxina Tx3-4 por dicroísmo circular revelou que a maior parte da sua estrutura apresenta um enovelamento aleatório, mas que a toxina contém também estruturas em -hélice e, em menor quantidade, folhas . Este arranjo é semelhante ao observado para oxytoxinas do veneno da aranha Oxyopes lineatus, que também são bloqueadoras de canais de cálcio sensíveis a voltagem. Apesar da disponibilidade de inúmeros sistemas de expressão, a produção de proteínas recombinantes funcionais ainda é uma tarefa difícil. A expressão funcional das toxinas recombinantes Tx3-6 e Tx3-4 criaram novas expectativas para futuros testes farmacológicos e análises estruturais e os resultados obtidos com a renaturação da toxina Tx3-4 abrem novos caminhos para a obtenção de toxinas em larga escala The venom of the spider Phoneutria nigriventer contains several peptides that act on ion channels and receptors of the nervous system of insects and mammals. The toxins Tx3-6 and Tx3-4 are voltage-gated calcium channel blockers and have shown a pharmacological potential in the treatment of pain and in neuroprotection. Only small amounts of these toxins can be purified from the venom and pharmacological and structural tests depend on their availability. In this work, we tested different expression and purification systems in order to identify the best method of getting functional toxins Tx3-6 and Tx3-4 in large amounts. The recombinant toxin Tx3-6 expressed in the vector pBADmycHis in E. coli was functional, however, the expression yield was only 0,3 mg/L of culture. Two miligrams of Tx3-6 was obtained using the SUMO system (E. coli) but the recombinant toxin was not functional. The Tx3-4 was also expressed in the SUMO system and approximately 800 g/L of a soluble functional recombinant toxin was produced. Three miligrams of insoluble Tx3-4 was also purified by the SUMO system and after refolding in vitro, we got 2 mg/L of a functional toxin. Expressions carried in the systems pPICZ (yeast), pET (E. coli) and pBADHis (E. coli) were unsuccessful due to low yield, expression as inclusion bodies and production of inative toxins. The secondary structural caracterization of the recombinant toxin Tx3-4 by circular dichroism revealed that the peptide is mainly arranged in random coil but it has some -helices and, in a lower percentage, -sheet structures are also present. This structure is similar to that described for the oxytoxins from the venom of the spider Oxyopes lineatus, which are also voltage-gated calcium channel blockers. Despitethe availability of numerous gene fusion systems, recombinant protein expression in Escherichia coli remains difficult. The functional expression of the toxins Tx3-6 and Tx3-4 created new expectations for further pharmacological and structural analysis and the results obtained from the refolding of the Tx3-4 opened new pathways for the production of these toxins in large scale

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Lippia alba (Mill.) N.E. Brown (VERBENACEAE), popularly know as Erva Cidreira Brasileira, has been one of the most commonly herbs used in the Brazilian folk medicine to blood pressure control. This study aimed to investigate the cardiovascular effects of the essential oil of Lippia alba (EOLA) in rats. For the hemodynamic measurement, normotensive male Wistar rats had their abdominal aorta and lower vena cava cannulated. Initially, five chemotypes (geranial, limonene, linalool, mircene, and carvone) were tested in normotensive conscious rats. They were intravenously and in bolus administrated at the doses of 5, 10, 20, 40 and 60 mg/kg. The EOLAG showed the best results on blood pressure, being chosen for the following experiments. The administration of EOLAG (5, 10, 20, and 40 mg/kg, i.v.) induced transient hypotension and bradycardia. These responses were attenuated by atropine (2 mg/kg, i.v.), hexamethonium (20 mg/kg, i.v.) and NG-nitro-Larginine methyl ester hydrochloride (L-NAME - 20 mg/kg, i.v.), but not by indomethacin (5 mg/kg, i.v.). For in vitro approach, the rats were euthanized and the superior mesenteric artery was removed and cut in rings (1-2 mm), which were placed in organ baths containing Tyrode`s solution at 37o C and gassed with carbogen. In intact rings of rat mesenteric artery pre-contracted with phenilephrine (1 μM), EOLAG (1 - 1000 mg/mL) induced relaxation (pD2 = 1.89 ± 0.21; Emax = 110.8 ± 10.8 %) which was not modified after the removal of the endothelium (pD2 = 2.37 ± 0.16; Emax = 134.8 ± 16.5 %), after incubation with TEA (pD2 = 2.23 ± 0.04; Emax = 117.2 ± 4.96 %) or KCl (80 mM) (pD2 = 1.96 ± 0.06; Emax = 112.6 ± 6.70 %). In addition, the EOLAG was able to inhibit the contraction caused by CaCl2 and produced additional effect (34.82 %; n = 5) on maximal relaxation of nifedipine (10 μM). In conclusions, the results demonstrate that the EOLAG induces hypotensive effect, that seems to be caused by muscarinic activation and NO release, and bradycardia, that seems to be due to an activation of ganglion nicotinic and cardiac muscarinic receptors. Furthermore, EOLAG produces vasorelaxation primarily caused by blocking Ca2+ influx through voltage-operated Ca2+ channels. A Lippia alba (Mill.) N.E. Brown (VERBENACEAE), conhecida popularmente como Erva Cidreira Brasileira, é uma das plantas mais utilizadas na medicina popular brasileira, inclusive para o tratamento da hipertensão arterial. Este estudo buscou investigar os efeitos cardiovasculares do óleo essencial de Lippia alba (OELA) em ratos. Para registro dos parâmetros hemodinâmicos, ratos machos Wistar saudáveis foram canulados na aorta abdominal e na veia cava inferior. Inicialmente foram testados 5 quimiotipos deste óleo (geranial, limoneno, linalol, mirceno e carvona), administrados por via intravenosa e in bolus, nas doses de 5, 10, 20, 40 e 60 mg/kg. Após análise destes resultados, observou-se que o quimiotipo geranial (OELAG) foi o que apresentou o melhor efeito sobre a pressão arterial, tornando-se o quimiotipo de escolha. Em animais saudáveis e não-anestesiados, o OELAG (5, 10, 20 e 40 mg/kg, i.v.) induziu hipotensão e bradicardia transientes. Estes efeitos foram atenuados em animais pré-tratados com atropina (2 mg/kg, i.v.), hexametônio (20 mg/kg, i.v.) ou LNAME (20 mg/kg, i.v.), mas não com indometacina (5 mg/kg, i.v.). Para os experimentos in vitro, os ratos foram eutanasiados e a artéria mesentérica superior foi removida e seccionada em anéis (1-2 mm), os quais foram montados em cubas para órgão isolado contendo solução de Tyrode a 37o C e gaseificada com carbogênio. Em anéis intactos de artéria mesentérica superior de ratos, pré-contraídos com fenilefrina (10 μM), o OELAG (1 - 1000 mg/mL) induziu relaxamento (pD2 = 1,89 ± 0,21; Emax = 110,8 ± 10,8 %) cujo efeito não foi alterado após remoção do endotélio (pD2 = 2,37 ± 0,16; Emax = 134,8 ± 16,5 %), após a incubação com tetraetilamônio (TEA) (pD2 = 2,23 ± 0,04; Emax = 117,2 ± 4,96 %) ou KCl (80 mM) (pD2 = 1,96 ± 0,06; Emax = 112,6 ± 6,70 %). Além disso, o OELAG foi capaz de inibir as contrações induzidas por CaCl2 e produzir um efeito adicional (34,82 %; n = 5) sobre o relaxamento máximo causado pela nifedipina (10 μM) em anéis sem endotélio. Diante destes resultados, pode-se concluir que o OELAG produz efeito hipotensor, que parece ser causado por ativação de receptores muscarínicos e liberação de NO, e bradicardia, que parece ser causado pela ativação de receptores muscarínicos cardíacos e Efeitos cardiovasculares do óleo essencial de Lippia alba em ratos MAYNARD, L.G (2011) 9 nicotínicos ganglionares. Além disso, o OELAG induz vasorelaxamento que parece ser causado inicialmente por um bloqueio do influxo de Ca2+ através dos canais de Ca2+ operados por voltagem.

O hormônio folículo-estimulante (FSH) produz um efeito dual sobre o potencial de membrana das células de Sertoli, com uma fase inicial rápida, que compreende uma hiperpolarização, por um período de segundos e uma fase de despolarização, que ocorre mais lentamente, por um período de minutos. A fase de despolarização envolve um mecanismo relacionado à entrada de cálcio estimulada pelo FSH. O Isoproterenol, um agonista de receptores β-adrenérgicos, induz uma hiperpolarização imediata e prolongada na membrana de células de Sertoli de ratos imaturos. Este efeito é provavelmente resultante da queda de [ATP]i a qual libera a inibição exercida pelo nucleotídeo sobre o canal de K+ATP. Dessa forma, objetivou-se estudar a ação do Isoproterenol sobre o potencial de membrana das células de Sertoli para melhor avaliar o componente hiperpolarizante produzido por FSH nas células de Sertoli, além de estudar a captação de Ca2+ estimulada pelo FSH e pelo isoproterenol. O potencial de membrana foi registrado utilizando túbulos seminíferos isolados de testículos de ratos Wistar machos de 15 dias de idade. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares preenchidos com KCl 3mmol/L acoplados a um eletrômetro. Foi realizada a aplicação tópica isolada de FSH (4mU/mL) e Isoproterenol (2μM). Depois, em experimentos individuais, foram aplicados topicamente, FSH e isoproterenol, 5 minutos após a aplicação tópica da Tolbutamida (10μM) e Glibenclamida (10μM), sulfonilureias de ação hipoglicemiante, que exercem efeito de fechamento dos canais de K+ATP. A Tolbutamida (10μM), ainda, foi perfundida 15 minutos antes da aplicação do Isoproterenol, a fim de testar se esta sulfoniluréia impediria de forma mais significativa a ação deste. Na técnica de captação de Ca2+, utilizou-se FSH e isoproterenol com toxina pertussis (PTX), bloqueador da subunidade Gi da proteína G para avaliar o seu envolvimento na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Utilizou-se a toxina colérica, estimulador da proteína Gs, para avaliar o envolvimento do AMPc na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Fez-se uso de SQ22536, inibidor da enzima adenilato ciclase, para avaliar o envolvimento dessa enzima na ação estimulante do FSH nas células de Sertoli de ratos imaturos. Os resultados foram dados como média ± SEM. Os dados da variação do potencial de membrana foram analisados pelo teste ANOVA para medidas repetidas com o pós-teste de Bonferroni. O FSH teve sua hiperpolarização inibida quando foi aplicado tolbutamida (10μM) anteriormente. O SQ22536 também aboliu a hiperpolarização causada pelo FSH. O Isoproterenol, quando aplicado isoladamente produziu uma resposta hiperpolarizante sobre o potencial de membrana, alterando de – 32,4mV ± 1,32 mV para -40,0 ± 0,78 mv, aos 60 segundos após a sua aplicação (*p0,05) (n=6 células de Sertoli). A perfusão com Tolbutamida foi mais eficaz no bloqueio da resposta beta-adrenérgica, causando uma despolarização de -41,6 ±1,21 mV para -35,4 ± 0,98 mV, aos 120 segundos após a aplicação tópica do Isoproterenol (p>0,05) (n=9 células de Sertoli). A aplicação tópica de Glibenclamida (10μM), a qual é um inibidor do canal de k +ATP, bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando despolarização, demonstrando que a hiperpolarização do isoproterenol está relacionada com a abertura desses canais. A tolbutamida (10μM), quando aplicada topicamente, impediu a fase de hiperpolarização característica causada pelo FSH (4mU/mL), causando despolarização do potencial de membrana das células de Sertoli de ratos imaturos. O Isoproterenol apresentou uma resposta hiperpolarizante rápida sobre o potencial de membrana, causada, provavelmente, por uma abertura dos canais de K+ATP na membrana das células de Sertoli de testículos de ratos imaturos. PTX quando aplicada topicamente e anteriormente à aplicação de isoproterenol não impediu a hiperpolarização característica causada por isoproterenol. A ação hiperpolarizante de isoproterenol independe de proteína Gi. PTX não impede a captação de 45Ca2+ estimulada pelo isoproterenol. A toxina colérica, que estimula proteína Gs, não estimula a captação de 45Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Follicle-stimulating hormone (FSH) produces a dual effect on the membrane potential of Sertoli cells, with an initial rapid phase, which comprises a hyperpolarization for a period of seconds and a depolarization phase, wich occurs more slowly, within minutes. The depolarization phase involves calcium entry stimulated by FSH. Isoproterenol, an agonist of β-adrenergic receptors, induces an immediate and prolonged hyperpolarization on the membrane of Sertoli cells from immature rats. The aim of this work is to study the involvement of K+ATP channels in the hiperpolarization effect of isoproterenol on the membrane of Sertoli cells. This work also aimed to study the action of Isoproterenol on the membrane potential of Sertoli cells to better understanding the hyperpolarizing component produced by FSH in Sertoli cells, in addition to study the Ca2+ uptake stimulated by FSH and by isoproterenol. Membrane potential was recorded using isolated seminiferous tubules of testes of 15 days-old rats. The record of intracellular Sertoli cell was performed using microcapillary filled with KCl3 mmol/L coupled to an electrometer. We performed a single topical application of FSH(4mU/mL) and Isoproterenol (2μM). Then, inindividual experiments were applied topically, FSH and isoproterenol, 5 minutes after topical application of Tolbutamide (10μM) and glibenclamide(10μM), sulfonylurea a hypoglycemicaction, exercising effect closing of K+ channels ATP. The Tolbutamide (10μM) also was infused 15 minutes before application of Isoproterenol in order totest whether this would prevents ulfonylurea most significantly to the action of isoproterenol. In the technique of 45Ca2+ uptake, we used FSH and isoproterenol with pertussis toxin (PTX), blocking the G protein subunit Gi to evaluate its involvementon Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. We used the cholera toxin, a stimulator of Gs protein, to evaluate the involvement of AMPc on Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. SQ22536, an inhibitor of the enzyme adenylate cyclase, was used to evaluate the involvement this enzyme in the stimulatory action of FSH in Sertoli cells from immature rats. The results were given as mean ± SEM. The data of the change in membrane potential were analyzed by ANOVA for repeated measures with Bonferroni post-test. The hyperpolarization produced by FSH was inhibited when tolbutamide was applied (10μM). The SQ22536 also abolished the hyperpolarization caused by FSH. The Isoproterenol when used alone produced a hyperpolarizing response on the membrane potential , changing from -32.4mV±1.32 mV to -40.0±0.78 mV at 60 seconds after its application (*p0.05) (n=6Sertoli cells). The Tolbutamide infusion was more effective inblocking beta-adrenergic response, causing a depolarization of -41,6 ±1,21 mV to -35,4 ± 0,98 mV at 120seconds after the topical application of Isoproterenol (p>0.05) (n=9Sertoli cells). Isoproterenol produces a rapid hyperpolarization on membrane potential of Sertoli cells. This effect was blocked by tolbutamide, indicating that the activation of beta-adrenergic receptors involves opening of K+ATP channels in the membrane of Sertoli cells from immature rat testes. PTX,when applied topically prior to application of isoproterenol did not prevent the characteristic hyperpolarization caused by isoproterenol. The hyperpolarizing action of isoproterenol is independent of Gi protein. PTX does not prevent the uptake of 45Ca2+ stimulated by isoproterenol. The cholera toxin, which stimulates Gs protein, does not stimulate 45Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats.

Em homens, os níveis de testosterona e de testosterona biodisponível (livre e a ligada à albumina) declinam com a idade, apresentando elevado risco de desenvolver resistência à insulina e diabetes tipo II. Já foi demonstrada a ação clássica (efeito genômico) da testosterona sobre a síntese e a liberação de insulina em pâncreas de rato. Os objetivos do presente trabalho são determinar: 1) a ação não clássica específica da testosterona, da nandrolona e de outros esteróides sexuais sobre a secreção de insulina em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos machos adultos; 2) a influência de aminoácidos sobre esta ação; 3) a ação da testosterona sobre o transporte de aminoácidos; 4) a participação dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L e dos canais KATP na ação da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2+; 5) a participação da via da fosfolipase C na ação da testosterona sobre a captação de 45Ca2+. As ilhotas foram isoladas de pâncreas de 3 ratos Wistar machos (pesando 180-220g) por experimento pela técnica de Lacy e Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). Nos experimentos de secreção de insulina, amostras de 10μL de ilhotas isoladas foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 3 minutos em presença ou não de testosterona (1μM), T-BSA (1μM), nandrolona (1μM), 17 -estradiol (10 nM) ou progesterona (1μM) em um incubador metabólico Dubnoff em tampão KRb-HEPES com glicose 3 mM a 37ºC, pH 7,4 e gaseificação constante com carbogênio (O2:CO2; 95:5; v/v). Nos experimentos com glutamina, lisina, alanina e leucina, as ilhotas eram incubadas por mais 3 minutos com estes aminoácidos. A incubação foi interrompida em banho de gelo. Os tubos com as ilhotas eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante coletado e a insulina quantificada por radioimunoensaio. No experimento de captação de aminoácido, as ilhotas isoladas (10μL) foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 15, 30 ou 60 minutos com 0,2 μCi de [1-14C] ácido a-metil aminoisobutírico mais testosterona (1μM). Após o final da incubação os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G. O sobrenadante (meio externo) era preservado. As ilhotas era transferidas para tubos Eppendorff contendo 1 mL de água destilada (meio interno). Os tubos com as ilhotas eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 100 μL de cada frasco e do respectivo meio externo para contagem da radioatividade. Os resultados foram expressos pela relação entre a radioatividade contida no tecido (meio interno) e no meio de incubação (meio externo). Nos experimentos de captação de 45Ca 2+, as ilhotas isoladas (50μL) eram pré-incubadas por 45 ou 50 minutos com 0,2 μCi 45Ca2+, novamente pré-incubadas por 10 minutos com nifedipina (1μM), diazoxida (100μM), glibenclamida (25μM), ou tolbutamida (10μM) e incubadas com ou sem testosterona (0,1μM) ou nandrolona (0,1μM) por 1 minuto. No experimento com U73122 (2μM), as ilhotas eram pré-incubadas por mais 15 minutos com este fármaco e incubadas com ou sem testosterona (1μM) por 1 minuto. Para a interrupção da incubação, utilizou-se 1 mL de tampão frio com cloreto de lantânio (10 mM) Após, os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante desprezado e as ilhotas lavadas duas vezes com a solução de cloreto de lantânio. As ilhotas eram transferidas para tubos tipo Eppendorff contendo 1 mL de água destilada. Os tubos eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 50 μL de cada frasco para contagem da radioatividade. A testosterona e a nandrolona estimularam a secreção de insulina após incubação de 3 minutos, através do fechamento de canais K+ ATP tendo, como conseqüência, o aumento da captação de Ca2+ e a exocitose do hormônio. A testosterona ligada à albumina, que não entra na célula e interage com receptor de membrana, também estimulou a secreção de insulina em 3 minutos, sugerindo um efeito de membrana dos andrógenos. Em nossas condições experimentais, o 17- -estradiol e a progesterona não mostraram efeito sobre a secreção de insulina. A ação androgênica sobre a secreção de insulina ocorreu somente na ausência de glicose ou em concentrações sublimiares (3mM). A testosterona não estimulou a captação do aminoácido metilaminoisobutírico [14C]. A L-alanina estimulou a secreção de insulina. Porém, quando associadas testosterona e alanina somente, houve redução na secreção. Também foi observado que uma mistura de aminoácidos (MIX- glutamina, lisina, leucina e alanina,) em diferentes concentrações proporcionais foi efetiva na secreção de insulina. Houve aumento significativo na secreção de insulina quando associados testosterona e a concentração 2x maior dos aminoácidos. Também, os andrógenos aumentaram a captação de Ca2+ em 60 segundos. A ação da testosterona sobre a captação de Ca2+ ocorreu em concentrações limiares de glicose (5 e 8 mM), porém não em concentrações elevadas (11 mM). Quando a testosterona foi incubada na presença de nifedipina (bloqueador de canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L), seu efeito estimulatório sobre a captação de 45Ca2+ foi anulado. Ocorreu inibição da ação androgênica quando a testosterona foi incubada em presença de diazoxida, a qual aumenta a probabilidade de abertura do canal K+ ATP. O efeito da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2 é análogo à ação das sulfoniluréias (glibenclamida e tolbutamida), as quais inibem o canal K+ ATP. Ambos os efeitos indicam que a ação da testosterona envolve o fechamento do canal K+ ATP e conseqüente despolarização da membrana da célula . O inibidor da fosfolipase C, o U73122, bloqueou a ação estimulatória de testosterona sobre a captação de 45Ca2+. Nossa conclusão para estes achados seria que a testosterona e a nandrolona, na presença de baixas concentrações de substratos energéticos como a glicose e aminoácidos, estimulariam a liberação da insulina para modular os efeitos catabólicos dos contra-reguladores e, assim, manter a homeostase. O mecanismo de secreção da insulina pelos andrógenos envolve a ativação de PLC via ligação ao receptor de membrana acoplado à proteína Gq, o fechamento de K+ ATP e a entrada de Ca2+ através de canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L. In men, testosterone and bioavailable testosterone levels ( free and and albumin-bound) decline with age, with high risk of developing insulin resistance and type 2 diabetes. It has been already shown the classic action of testosterone (genomic effect) on the insulin synthesis and release in rat pancreas. The objective of this survey is to determine: 1) the specific non-classical action of testosterone, nandrolone and other sex steroids on insulin secretion in isolated pancreatic islets from adult male rats; 2) aminoacids influence on this action; 3) testosterone action on amino acid transport; 4) the participation of L-type voltagegated Ca2+ channels and KATP channels in the testosterone and nandrolone action on the 45Ca2+ uptake; 5) the participation of phospholipase C via in the testosterone action on the 45Ca2+ uptake. The islets were isolated from the pancreas of 3 male Wistar rats (weighing between 180 and 200g) per experiment by the technique of Lacy and Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). In the experiments of insulin secretion, samples of 10μL of isolated islets were preincubated for 30 minutes and incubated for 3 minutes in the presence or absence of testosterone (1μM), T-BSA (1μM), nandrolone (1μM), 17 -estradiol (10 nM) or progesterone (1μM) in a Dubnoff metabolic incubator in KRb-HEPES buffer with 3 mM glucose at 37ºC, pH 7,4 and constant gasification constante with carbogen (O2:CO2; 95:5; v/v). In experiments with glutamine, lysine, alanine and leucine, the islets were incubated for another 3 minutes with these amino acids. The incubation was stopped in an ice bath. The tubes containing the islets were centrifuged for 2 minutes at 45xG, the supernatant collected and insulin measured by radioimmunoassay. In the experiment of amino acid uptake, isolated islets (10μL) were pre-incubated for 30 minutes and incubated for 15, 30 or 60 minutes with 0,2 μCi of [1-14C] a-metyl aminoisobutyric plus testosterone (1μM). After the end of incubation, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G. The supernatant (environment) was preserved. The islets were transferred to Eppendorff tubes containing 1mL of distilled water (internal environment). The tubes with islets were frozen for 24 hours and after this sonicated for 30 seconds. Samples of 100 μL were removed from each bottle and respective environment for radioactivity counting. Results were expressed by the relation between the radioactivity contained in the tissue (internal environment) and the incubation environment (external environment) . In the experiments of 45Ca 2+ uptake, the isolated islets (50μL) , were pre-incubated for 45 or 50 minutes with 0,2 μCi 45Ca2+, preincubated again for 10 minutes with nifedipine (1μM), diazoxide (100μM), glibenclamide (25μM), or tolbutamide (10μM) and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. In this experiment with U73122 (2μM), the islets were pre-incubated for more 15 minutes with this drug and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. For the interruption of incubation, it was used a cold 1mL buffer with lanthanum chloride (10mM). After, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G, the supernatant discarded and the islets washed twice with lanthanum chloride solution. The islets were transferred to Eppendorf tubes containing 1ml of distilled water. The tubes were frozen for 24 hours and after it, sonicated for 30 seconds. Samples of 50 μL were taken from each bottle for radioactivity counting. In isolated pancreatic islets of rats, testosterone and nandrolone have stimulated insulin secretion, after a 3-minute incubation period, closing the K+ ATP channels, having as consequence the increase of Ca2+ inflow and the hormone exocytosis. Testosterone conjugated to bovine serum albumin, which is not membrane permeable and interacts with the receptor of membrane, also stimulated insulin secretion in 3 minutes, suggesting an androgen membrane effect. In our experimental conditions, 17- -estradiol and progesterone have not demonstrated effects in insulin secretion. Testosterone has not stimulated the uptake of methylaminoisobutyric acid [1-14C]. L-alanine has stimulated insulin secretion. However, when testosterone was associated only with alanine, insulin secretion has decreased. It has also been noted that an aminoacid mixture (MIX-alanine, glutamine, lysine and leucine) in different proportional concentrations has been effective in insulin secretion. When associated, testosterone and MIX, there has been an increase in insulin secretion when the concentration of amino acids has been 2 times higher. Also, the androgens have increased the 45Ca2+ uptake in 60 seconds. However, the androgenic action has occurred only in absence of glucose or at sub stimulatory concentrations (3 mM). The action of testosterone on 45Ca2+ uptake has occurred at stimulatory glucose concentrations (5 and 8 mM), but not in high concentrations (11 mM). When testosterone has been incubated in the presence of nifedipine (Ca2+ type L channel blocker), its stimulatory effect on 45Ca2+ uptake has been nullified. When it was used diazoxide to produce the opening of K+ ATP channels, it has occurred the inhibition of androgenic action. The testosterone and nandrolone effect is analogous to the action of sulphonilureias (glibenclamida and tolbutamida), which inhibit the K+ ATP channel. Both effects show that testosterone action involves the K+ ATP channel closing and consequent membrane depolarization of cell. The presence of U73122, which inhibits the activation of PLC, has inhibited the testosterone action on 45Ca2+ uptake. Our conclusion for these results would be that testosterone and nandrolone, in the presence of low concentrations of energetics substrates as glucose and amino acids would stimulate the insulin liberation for modulating the catabolic effects of counter-regulators and, then, sustaining homeostasis. It can also be observed that the associated mechanism involves a Gq protein-coupled membrane receptor-binding, the PLC activation, the K+ ATP closing and Ca2+ entry through the voltage-dependent L-type calcium channels.

Resumo não disponível

The aim of this study was to evaluate the effect of pertussis toxin (PTX) on the depolarizing component of the action of follicle stimulating hormone (FSH) on the membrane potential (MP) of Sertoli cells, which is linked to the rapid entry of Ca2+ into cells and to the Ca2+ -dependent transport of neutral amino acids by the A system. This model allowed us to analyze the involvement of Gi proteins in the action of FSH in these phenomena. In parallel, using an inactive analog of insulin-like growth factor type I (IGF-1), JB1, and an anti-IGF-I antibody we investigated the possible mediating role of IGF-I on these effects of FSH because IGF-I is produced and released by testicular cells in response to stimulation by FSH and shows depolarization effects on MP similar to those from FSH. Our results have the following implications: (a) the rapid membrane actions of FSH, which occur in a time-frame of seconds to minutes and include the depolarization of the MP, and stimulation of 45Ca2+ uptake and [14C]-methyl aminoisobutyric acid ([14C]-MeAIB) transport, are nullified by the action of PTX and, therefore, are probably mediated by GiPCR activation; (b) the effects of FSH were also nullified by verapamil, an L-type voltagedependent Ca2+ channel blocker; (c) wortmannin, an inhibitor of phosphoinositide 3-kinase (PI3K), prevented FSH stimulation of 45Ca2+ entry and [14C]-MeAIB transport; and (d) these FSH actions are independent of the IGF-I effects. In conclusion, these results strongly suggest that the rapid action of FSH on L-type Ca2+ channel activity in Sertoli cells from 10- to 12-day-old rats is mediated by the Gi/βγ/PI3Kγ pathway, independent of the effects of IGF-I.

Vários trabalhos sugerem que o propofol, um anestésico intravenoso, é capaz de reduzir a injúria neuronal decorrente da isquemia cerebral. Porém, resultados dessa neuroproteção em modelos de isquemia cerebral, tanto in vitro quanto in vivo, têm sido conflitantes. Além disso, os mecanismos envolvidos na neuroproteção do propofol ainda não foram esclarecidos. Esse estudo teve como objetivo investigar o efeito neuroprotetor do propofol em um modelo de isquemia cerebral in vitro e os prováveis mecanismos envolvidos. Para avaliar o efeito neuroprotetor, foi utilizado o modelo de fatias de hipocampo submetidas à deprivação de glicose e oxigênio durante 20 minutos. Para investigar os possíveis locais de ação desse anestésico na neuroproteção usamos as seguintes ferramentas farmacológicas: conotoxina MVIIC, bloqueador de canais de cálcio do tipo N, -P/Q, tetrodotoxina, bloqueador de canais de sódio e EGTA, quelante de cálcio extracelular. Em todas as concentrações avaliadas (1-300 M) o propofol foi capaz de reduzir a morte neuronal na região CA1 do hipocampo. O efeito máximo do propofol na redução da morte neuronal (47,02%) foi atingido com a concentração de 100 M. Esse efeito parece ser dependente do influxo de Na+ pelos canais de Na+ sensíveis à voltagem e do influxo de Ca2+ do meio extracelular. A conotoxina MVIIC e o propofol apresentam efeitos somatórios em relação à neuroproteção, indicando que o propofol possa estar bloqueando canais de Ca2+ dependentes de voltagem diferentes do tipo N e P/Q. Concluindo, esse estudo sugere que o propofol apresenta efeito neuroprotetor em fatias de hipocampo submetidas à deprivação de glicose e oxigênio. O mecanismo desta neuroproteção parece envolver a redução do influxo de Na+ e Ca2+ neuronal independente de canais de Ca2+ dos tipos -N, -P/Q. There are several studies that propofol, an intravenous anesthetic, reduces neuronal injury due to brain ischemia. However, the results of such neuroprotection in ischemic models have been conflicting, both in vitro and in vivo studies. In addition, the mechanisms involved in propofol neuroprotection have not been clarified. The aim of the present study was to investigate the neuroprotector effect of propofol in a model of brain ischemia in vitro, as well as probable mechanisms involved. To investigate the neuroprotector effect of propofol, we used the model hippocampus slices submitted to glucose and oxigen deprivation for 20 minutes. To assess the possible action locations of the anesthetic neuroprotection we used the following pharmacological tools: conotoxin MVIIC, N, -P/Q type calcium channel blockers, tetrodotoxin, a sodium channel blockers and EGTA, extracelular calcium quelator. In all concentrations assessed (1-300 M), propofol was able to reduce neuronal death in the CA1 region of the hippocampus. The maximum effect of propofol in neuronal death reduction (47,02%) was obtained with the concentration of 100 M. This effect seems to be dependent on the influx of Na+ through the Na+ ion channels sensible to voltage and extracellular Ca2+ influx. conotoxin MVIIC and propofol presented additional effects regarding neuroprotection, indicating that neuroprotetion by propofol could be independent of blocking voltage-dependent -N and -P/Q type Ca2+ channels. Therefore, this study suggests that propofol presents neuroprotector effects in hippocampus slices submitted to deprivation of glucose and oxigen. The mechanism of this neuroprotection seems to involve the reduction of the neuronal Na+ and Ca2+ influx independent of -N, -P/Q type Ca2+ channels.

O hormônio folículo estimulante (FSH) desempenha um papel central no desenvolvimento da célula de Sertoli até a puberdade, e na sinalização desta célula em relação à série espermatogênica, após a puberdade. Na fase proliferativa, FSH atua estimulando a captação de Ca2+ e o transporte de aminoácidos neutros nas células de Sertoli, além de ativar a via adenilil ciclase-AMPc. Neste período, que em ratos compreende do 5º dia ao 25º após o nascimento, FSH atua aumentando o número e o tamanho das células de Sertoli, sendo esta ação fundamental para que se processe uma espermatogênese normal no indivíduo adulto. A sinalização estimulada por FSH nestas células varia com idade, reduzindo seu estímulo sobre o transporte de Aminoácidos neutros (via sistema A) no período pós- púbere. Adicionalmente, FSH estimula uma resposta eletrofisiológica bifásica, representada por uma hiperpolarização rápida, seguida de uma despolarização prolongada. O objetivo desta tese foi analisar o envolvimento de vias sinalizadas pela gonadotrofina na fase pré-puberal da célula de Sertoli de ratos. Para tanto, foram utilizadas as técnicas de captação de 45Ca2+, de transporte de [14C]MeAIB e de registro eletrofisiológico intracelular, para a verificação da ação do FSH através de proteína Gs e proteína Gi, bem como de suas vias subseqüentes. Foi observado que FSH estimula a captação de 45Ca2+ e o transporte de [14C]MeAIB via proteína Gi, ação esta independente do aumento de AMPc, pois foram bloqueadas por Toxina Pertussis (PTX) e não foram mimetizadas por forscolina. Da mesma forma, a despolarização estimulada por FSH foi inibida por PTX. Subseqüente a ativação de Gi, PI3K é estimulada por FSH, em células de Sertoli imaturas. Esta via foi bloqueada por wortmannin, o que inibiu a ação de FSH nos parâmetros analisados. Também foi estudada a ação de IGF-I sobre a captação de 45Ca2+, sobre o transporte de [14C]MeAIB e foi observada sua resposta eletrofisiológica. Verificou-se ação de IGF-I nos transportes de 45Ca2+ e [14C]MeAIB de maneira significativa, e observou-se uma despolarização como resposta eletrofisiológica à sua aplicação tópica, em células de Sertoli de ratos imaturos. Sabe-se que FSH e IGF-I agem de maneira sinérgica no desenvolvimento das células de Sertoli, e que FSH estimula a síntese e a secreção de IGF-I, nestas células durante o período pré-púbere. Então foi verificada se a ação de FSH ocorre via IGF-I ou através de mecanismos paralelos. Para esta verificação utilizou-se o bloqueador de receptor de IGF-I, JB1, o qual bloqueia o acesso do fator de crescimento ao seu receptor tirosina cinase. Como resultado foi observado que o bloqueador JB1, inibe as ações estimuladas por IGF-I, entretanto sem alterar a resposta de FSH sobre os parâmetros analisados. E com o intuito de verificar o envolvimento de Cav1 (canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L), foi utilizado verapamil, o qual bloqueou a ação de FSH sobre a captação de 45Ca2+. A partir destes resultados, é possível sugerir que FSH estimula a captação de 45Ca2+, o transporte de [14C]MeAIB, bem como apresenta uma resposta eletrofisiológica vinculada a via GPCR/Gi/Gßy/PI3K/Akt-PKB/Cav1, em células de Sertoli de ratos imaturos durante sua fase proliferativa. FSH plays a central role on Sertoli cell proliferation in development during puberty, and after this period is related to spermatogenic progression. FSH increase Sertoli cells number and size from the 5º to 15º day after birth, in the same period the FSH strongly stimulates neutral amino acid transport, also, FSH plays a biphasic electrophysiology response characterized by a rapid hyperpolarization following to a prolonged depolarizing. The aim of this work was study the pathways stimulated by FSH in Sertoli cells of rats during the pre pubertal phase. As markers we use 45Ca2+ uptake, [14C]MeAIB transport and the membrane potential (MP) to verify the action of FSH on Gi and Gs protein pathways. It was observed that FSH enhanced 45Ca2+ uptake through Gi protein pathway, independently of cAMP, this action was bloked by PTX (250ng/mL) independent of adenil ciclase action. Also 45Ca2+ uptake, [14C]MeAIB transport and MP response were blocked by wortmannin (100nM). The action IGF-1 in these parameters was also analyzed, the growth factor stimulates 45Ca2+ uptake and [14C]MeAIB transport and induce a prolonged depolarization on the MP. The use of an inactive analog of the IGF-1(JB1 1μg/ml) blocked the IGF-1 action but not the effects of FSH. The utilization of Verapamil (100 μM) blocker of the Cav1 (L type VDCC) inhibited the stimulation of FSH on 45Ca2+ uptake and [14C]MeAIB transport. These results suggest that the FSH action during proliferative stage of Sertoli cells on 45Ca2+ uptake, [14C]MeAIB transport and MP modification related to the GPCR/Gi/Gßy/PI3K/Akt-PKB/Cav1 pathway.

O influxo de cálcio através de canais de cálcio regulados por voltagem (CCSVs) medeia a informação nociceptiva no corno dorsal da medula espinhal. A administração intratecal dos bloqueadores de CCSVs, tais como a -conotoxina-MVIIA (-CTx-MVIIA), tem efeito analgésico, mas estreita janela terapêutica, apresentando muitos efeitos adversos. O veneno da aranha brasileira Phoneutria nigriventer contém uma variedade de substâncias com ação predominantemente neurotóxica, dentre elas a toxina Ph1 que foi recentemente descrita como uma potente bloqueadora da neurotransmissão por interagir com canais de cálcio sensíveis a voltagem tipo N. Neste estudo, verificamos o potencial analgésico da Ph1, administrada por via intratecal, em modelos de dor aguda e persistente em roedores. A Ph1 produziu antinocicepção prolongada e com grande eficácia no modelo da placa quente em camundongos, quando comparada com a -CTx-MVIIA. Além disso, a Ph1 ou a -CTx-MVIIA não produziram efeitos adversos motores em camundongos. Quando avaliadas em ratos, a Ph1 foi mais efetiva e potente do que a -CTx-MVIIA não somente em prevenir a nocicepção induzida pela formalina, todadvia especialmente em reverter a nocicepção inflamatória persistente, previamente instalada. Além do mais, a ação analgésica de ambas as toxinas foi relacionada com a inibição da liberação de neurotransmissores pró-nociceptivos evocados por cálcio na medula espinhal, como o glutamato. Quando os efeitos adversos foram avaliados em ratos, verificamos que a Ph1 teve um índice terapêutico maior que a -CTx-MVIIA. Porém, ambas as toxinas foram capazes de produzir alterações na pressão arterial. Entretanto, o tratamento com a toxina Ph1 é capaz de reduzir a nocicepção aguda induzida por incisão cirúrgica ou crônica xiv causada por atrite ou por lesão do nervo ciático em roedores. Por fim a toxina recombinante Ph1 expressa em Escherichia coli mostrou uma atividade antinociceptiva similar à toxina nativa. Assim, o presente estudo demonstrou que a toxina Ph1 apresentou efeitos analgésicos em diferentes modelos de dor, sugerindo que esta toxina pode ter potencial para ser usado como uma droga para o controle da dor persistente. Calcium influx through voltage sensitive calcium channels (VSCCs) plays an important role on the nociceptive transmission in the dorsal horn of the spinal cord. The intrathecal administration of VSCCs blockers, such as -conotoxin-MVIIA (-CTx-MVIIA) has analgesic effect, but it narrows the therapeutic window, presenting many adverse effects. The Brazilian spider Phoneutria nigriventer venom contains a variety of substances with predominantly neurotoxic action, among them the Ph1 which was recently described as a potent neurotransmission blocker for interacting with N-type voltage sensitive calcium channels. In this study, we verify the analgesic potential of Ph1 by its intrathecal administration in acute and persistent pain models in rodents. The Ph1 produced a prolonged antinociception and with great effectiveness in the hot plate model in mice when compared to -CTx-MVIIA. However, Ph1 or -CTx-MVIIA did not produce adverse motor effects in mice. Ph1 was more effective and powerful than -CTx-MVIIA when assessed in rats, not only in preventing the nociception induced by formalin, but particularly in reversing the persistent inflammatory nociception previously installed. Furthermore, the analgesic action of both toxins was related to inhibition of pro-nociceptive neurotransmitter release evoked by calcium in the spinal cord, such as glutamate. When the adverse effects were evaluated in rats, we verified that Ph1 had a therapeutic index higher than -CTx-MVIIA. However, both toxins were able to produce blood pressure alterations. In addition, the treatment with Ph1 toxin is able to reduce the acute nociception induced by surgical incision, or chronic, caused by arthritis or by sciatic nerve injury in rodents. Finally, the recombinant Ph1 toxin xvi expressed in Escherichia coli showed an antinociceptive activity similar to native toxin. Thus, the present study demonstrated that Ph1 toxin presented analgesic effects in different models of pain, suggesting that this toxin may have a potential to be used as a drug for the control of the persistent pain.

O papel dos bloqueadores de canais de cálcio em condições isquêmicas vem sendo investigado e descrito na literatura. A fração PhTX3 do veneno da aranha Phoneutria nigriventer é um bloqueador de canais de cálcio de amplo espectro que inibe a liberação de glutamato, a captação de cálcio e também a recaptação de glutamato em sinaptossomas. A fração PhTX3 contém 6 isotoxinas: TX3-1 a TX3-6. Algumas dessas isotoxinas bloqueiam canais de cálcio do tipo P/Q e outros canais de cálcio do tipo N. Com essa ação, essas isotoxinas inibem a captação de cálcio e a liberação de neurotransmissores. As toxinas TX3-3 e TX3-4 inibem canais de cálcio do tipo P/Q e a liberação de glutamato. Além disso foi demonstrado que a toxina TX3-4 inibe a liberação de glutamato independente de cálcio, via o transportador de glutamato. Em nosso trabalho demonstramos que a fração PhTx3 (1µg/mL) foi capaz de conferir neuroproteção (82 ± 4.1%) em um modelo experimental in vitro utilizando fatias de hipocampo cerebral de ratos e células SN56 submetidas ao evento isquêmico. As isotoxinas TX3-3 (8nM) e TX3-4(8nM) também apresentaram efeito neuroprotetor (77± 3.8% e 68 ± 4.2%) respectivamente utilizando fatias de hipocampo cerebral de ratos submetidas ao evento isquêmico. A fração PhTX3 e as toxinas TX3-3 e TX3-4 apresentaram efeito neuroprotetor até 1 hora após o evento isquêmico instalado. Esse efeito foi significativamente reduzido após 1 hora e 30 minutos do evento isquêmico instalado e não foi observado efeito neuroprotetor significativo após 2 horas. O papel do cálcio intracelular no processo isquêmico também foi investigado em nosso trabalho. Foi observado que o BAPTA-AM e o 2-APB apresentaram neuroproteção (55 ± 2.9% e 45 ± 2.4%) respectivamente. Não observamos efeito neuroprotetor utilizando dantroleno. Assim podemos sugerir que o cálcio intracelular liberado a partir dos estoques intracelulares sensíveis aos receptores IP3 participam do processo de morte celular na isquemia cerebral in vitro. Além disso, observamos que as ferramentas farmacológicas utilizadas para reduzir a quantidade de cálcio intracelular (BAPTA-AM, 2-APB e dantroleno) foram capazes de reduzir a atividade de caspase-3 (115 ± 4.32, 136± 5.6 e 157± 5.85 nmol/mg de proteína) respectivamente, comparado com as fatias de hipocampo submetidas à isquemia sem adição de compostos testes (227 ± 5.4 nmol/mg de proteína). Realizamos os mesmos experimentos com a fração PhTX3 e as toxinas TX3-3 e TX3-4 e não observamos redução significativa na atividade de caspase-3 (203 ± 4.7, 210 ± 3.35 e 212 ± 3.37 nmol/mg de proteína) respectivamente, comparado com as fatias submetidas à isquemia sem adição de compostos testes (223 ± 4.7 nmol/mg de proteína). Diante dos nossos resultados, podemos concluir que as toxinas presentes no veneno da aranha Phoneutria nigriventer (fração PhTX3, TX3-3 e TX3-4) apresentaram efeito neuroprotetor significativo, mostrando ser uma nova classe de agentes terapêuticos com grande potencial de utilização nos casos de isquemia cerebral. The role of calcium channel blockers in ischemic conditions has been studied and described in literature. The PhTx3 fraction of the venom of Phoneutria nigriventer spider is a broad spectrum calcium channel blocker, which inhibits glutamate release and calcium uptake in synaptossomes. The PhTx3 fraction contains six isotoxins: Tx3-1 to Tx3-6. Some of these isotoxins block calcium channels type -P/Q, and other blocks the N-type calcium channels. With this action, these isotoxins inhibit calcium uptake and the release of neurotransmitters. The Tx3-3 and Tx3-4 toxins inhibit calcium channels type P/Q and the release of glutamate. It was also shown that the Tx3-4 toxin inhibit calcium-independent glutamate release via glutamate transporter. In our work we demonstrated that the PhTx3 (1µg/mL) was capable of providing neuroprotection (82±4.1%) in an experimental in vitro model using hippocampal slices of rats submitted to ischemic event. The PhTx3 fraction and the Tx3-3 and Tx3-4 toxins presented neuroprotector effect up to one hour after the ischemic event was induced. This effect was significantly reduced after one hour and thirty minutes after the ischemic event and no significant neuroprotection was observed after two hours. The role of intracellular calcium was also investigated in our work. It was observed that the BAPTA-AM and the 2-APB presented neuroprotection (55±2.9% and 45±2.4%), respectively. No neuroprotection was observed using dantrolene. Thus we may suggest that intracellular calcium released from intracellular stocks sensible to IP3 is involved in the process of cellular death in brain ischemia in vitro. Furthermore, we observed that the pharmacological tools used to reduce the amount of intracellular calcium, BAPTA-AM, and blockers of intracellular calcium 2-APB and dantrolene were able to reduce the caspase-3 activity of the ischemic tissue (115 ±- 4.32, 136± 5.6 e 157± 5.85 nmol/mg of proteina), respectively, compared to the hippocampal slices submitted to ischemia without the addition of test compounds (227±5.4 nmol/mg of protein). On the same experiments with the PhTx3 fraction and the Tx3-3 and Tx3-4 toxins no significant reduction on the caspase-3 activity (203 ± 4.7, 210 ±3.35 e 212± 3.37nmol/mg of protein), respectively, was observed when compared to the ischemia submitted slices without the addition of test compounds (223 +/- 4.7nmol/mg de proteína). Thus we concluded calcium channels are not involved in the caspase activity while blockers of intracellular calcium stores reduced the caspase-3 activity on brain ischemia. Based on our results, we can conclude that the toxins present on the Phoneutria nigriventer spider venom (PhTx3 fraction, Tx3-3 and Tx3-4) showed significant neuroprotection of brain ischemia and thus have potential as a new class of therapeutical agents to be used on brain ischemia.

O influxo de cálcio e a exocitose de vesículas sinápticas no terminal nervoso são eventos chave na neurotransmissão. A entrada de cálcio, em resposta a um estímulo despolarizante, através de canais de cálcio regulados por voltagem é o principal sinal que dispara a ativação da maquinaria exocitótica e consequente liberação de neurotransmissores. A existência de diferentes subtipos de canais de cálcio regulados por voltagem com funções fisiológicas distintas motiva a busca de novos agentes farmacológicos atuantes sobre estes canais. O veneno da aranha brasileira Phoneutria nigriventer contém uma variedade de substâncias com ação predominantemente neurotóxica, dentre elas a fração PhTx3-4 foi recentemente descrita como uma potente bloquadora da neurotransmissão em diversos modelos experimentais. Para testar o efeito dessa toxina nas alterações intracelulares da concentração 2+]) induzidas por KCl, terminais nervosos centrais isolados de cálcio ([Ca(sinaptosomas) foram marcados com a sonda fluorescente Fura 2-AM. A 2+PhTx3-4 reduziu a [Ca] induzida por KCl de uma forma dependente da dose encontrado inibindo 53% desse efeito em concentrações saturantes. O IC502+para o efeito inibitório da Tx3-4 na [Ca ] foi de 1,4 nM. As toxinas bloqueadoras de canais de cálcio -conotoxina MVIIC, -conotoxina GVIA e -agatoxina IVA reduziram por 47, 22 e 24%, respectivamente, o aumento na 2+] induzida por KCl. Em associação à PhTx3-4, somente a -agatoxina IVA [Ca2+mostrou efeito inibitório aditivo no aumento da [Ca] induzida por KCl. Para investigar o efeito da PhTx3-4 na exocitose de vesículas utilizamos a sonda fluorescente FM2-10. A PhTx3-4 também reduziu com elevada potência (IC = 501,1 nM) a exocitose induzida por KCl, efeito comparativamente maior que o das toxinas -conotoxina MVIIC, -conotoxina GVIA e -agatoxina IVA. Tal como ocorreu nas medidas de cálcio intracelular, somente a -agatoxina IVA apresentou efeito aditivo inibitório com a PhTx3-4 na exocitose induzida por KCl. Juntos esses dados mostram que PhTx3-4 é um potente inibidor de canais de cálcio Tipo-P/Q envolvidos no controle da entrada de cálcio e exocitose de vesículas sinápticas em sinaptosomas cérebro-corticais. Calcium influx and synaptic vesicle exocytosis at nerve terminals are key events in the neurotransmission. Calcium entrance throughout voltage-gated calcium channels in response to a depolarizing stimulus is the main signal that triggers the exocytotic machinery leading to neurotransmitter release. Existence of multiple subtypes of voltage-gated calcium channels with distinct physiological functions has leading to the search for new pharmacological agents that act on these channels. Venom of the brazilian spider Phoneutria nigriventer contains several substances with action markedly neurotoxic. Amongst them the fraction PhTx3-4 has been show to be a potent blocker of neurotransmission at various experimental models. To test for the effect of 2+PhTx3-4 on the calcium concentration changes ([Ca ]) induced by KCl, isolated central nerve endings (synaptosomes) were stained with the 2+fluorescent probe Fura 2-AM. PhTx3-4 reduces the [Ca ] induced by KCl in a dose dependent way, reducing by 53% this effect at saturating concentrations. 2+IC found for the PhTx3-4 effect on KCl induced changes in [Ca ] was 1,4 nM.50 The calcium blockers toxins -conotoxin MVIIC, -conotoxin GVIA and -2+ agatoxin IVA reduced by 47, 22 e 24% respectively the changes in [Ca ] induced by KCl. In association with PhTx3-4, only -agatoxin IVA showed an 2+ addictive inhibitory effect on the KCl induced [Ca ] increase. To test for the PhTx3-4 effect on vesicle exocytosis, we used the fluorescent probe FM2-10. PhTx3-4 also reduces with great potency (IC50 = 1,1 nM) the KCl induced exocytosis. This effect was comparatively stronger than that observed with - conotoxin MVIIC, -conotoxin GVIA and -agatoxin IVA. As like as in the calcium measurements, only -agatoxin IVA showed an addictive inhibitory effect on the KCl induced exocytosis. Taken together these data show that PhTx3-4 is a potent inhibitor of P/Q calcium channels involved in controlling calcium entry and exocytosis of synaptic vesicles in brain cortical synaptosomes.

Submitted by Joana Lopes Dias (jdias@ubi.pt) on 2015-01-07T22:29:07Z No. of bitstreams: 1 Tese Paulo Saldanha_ Final.pdf: 3033258 bytes, checksum: 83d0de2c5ed0febc06a9dc4750eaa0e1 (MD5) Made available in DSpace on 2015-01-07T22:29:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Paulo Saldanha_ Final.pdf: 3033258 bytes, checksum: 83d0de2c5ed0febc06a9dc4750eaa0e1 (MD5) Previous issue date: 2012