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Submitted by Tania Sila Campioni (taninha_campioni@hotmail.com) on 2019-01-11T13:31:17Z No. of bitstreams: 1 Tese Tania Sila Campioni.pdf: 2306450 bytes, checksum: b03425f7734b123cbb3a6f1c612f677d (MD5) Rejected by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br), reason: Prezada Tania, O documento enviado para a coleção Campus Unesp Rio Claro foi recusado pelo(s) seguinte(s) motivo(s): - Agradecimentos: A Portaria nº 206, de 04/09/2018 Dispõe sobre obrigatoriedade de citação da CAPES nos agradecimentos da seguinte forma: Art. 3º Deverão ser usadas as seguintes expressões, no idioma do trabalho: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001". Agradecemos a compreensão e aguardamos o envio do novo arquivo. Atenciosamente, Biblioteca Campus Rio Claro Repositório Institucional UNESP https://repositorio.unesp.br on 2019-01-11T16:51:13Z (GMT) Submitted by Tania Sila Campioni (taninha_campioni@hotmail.com) on 2019-01-14T23:04:28Z No. of bitstreams: 1 Tese Tania Sila Campioni 14-01-2019.pdf: 2344762 bytes, checksum: 2dba2bc4508fa90faa4ab1d936b3baa1 (MD5) Approved for entry into archive by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br) on 2019-01-15T18:42:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 campioni_ts_dr_rcla_par.pdf: 1324998 bytes, checksum: a2b24554af42224f73e6949924b45edc (MD5) Made available in DSpace on 2019-01-15T18:42:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 campioni_ts_dr_rcla_par.pdf: 1324998 bytes, checksum: a2b24554af42224f73e6949924b45edc (MD5) Previous issue date: 2018-08-02 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Desejando ao final do trabalho obter um bioprocesso integrado usando palha de cana-de-açúcar (PC), este trabalho teve início com a utilização desse substrato para produção de enzimas fribrolíticas, xilanases e celulases, em culturas axênicas, incluindo espécies de Trichoderma e Aspergillus. A triagem para o melhor produtor foi realizada em “shaker” em fermentação submersa. A cultura do fungo T. reesei QM9414 alcançou a melhor produção de enzimas, e em tanque agitado, utilizando um biorreator de 3 L, mostrou o mesmo perfil de produção (~90 U/mL, 0.6 FPU/mL para xilanase e celulases, respectivamente). Em relação a este resultado, a produção de enzimas para as misturas binárias e ternárias destes fungos foi menor, sendo que a melhor combinação, T. reesei QM 9414+A. fumigatus M51, alcançou 60 U/mL e 0.08 FPU/mL respectivamente. Com intuito de otimizar a produção de enzimas utilizando um mix de substratos: palha de cana, como principal componente, e o farelo de trigo e a polpa cítrica, como supostos indutores de atividade enzimática, foi realizado um delineamento de misturas do tipo D-optimal. O resultado da otimização da mistura dos substratos mostrou que o trigo e a polpa cítrica não tiveram um efeito indutivo na produção das enzimas tendo a palha de cana como principal substrato. A enzima xilanase foi caracterizada em seu pH e temperatura ótimos (pH 5, e 50 ºC respectivamente), bem como a estabilidade da enzima nestes parâmetros. Alguns íons e EDTA foram aplicados para determinar a estabilidade da enzima nessas condições, sendo o melhor indutor o Mn2+ com 49% de aumento de atividade (10 mM). O extrato contendo xilanases, produzido nas condições previamente otimizadas foi aplicado no biobranqueamento da polpa Kraft. A otimização da biobranqueamento mostrou uma diminuição do índice Kappa, 12.5% (30 U/g e 30 min), bem como houve a liberação de açúcares e compostos cromóforos. Este tratamento na polpa foi responsável por diminuir em 10% a quantidade de dióxido de cloro utilizado no branqueamento químico, uma vez que sua alvura foi a mesma que o controle sem tratamento enzimático. A xilana presente na PC foi extraída com NaOH por meio de tratamento termo-químico. Após este processo a xilana foi hidrolisada, para a produção de xiloligossacarídeos (XOS) por duas diferentes rotas, com enzimas (utilizando o extrato contendo xilanases), e com ácido fosfórico (95 ºC e 120 ºC). Os melhores ensaios que produziram XOS nas duas rotas não apresentaram diferença significativa, 5.34 e 5.94 g/L correspondendo a 16 e 17.45% de rendimento em XOS. A produção de XOS por via enzimática não formou furfural, entretanto, a hidrólise ácida de XOS é uma alternativa mais rápida. XOS e xilose foram produzidos por meio da hidrólise enzimática da xilana, foram assimilados por bactérias probióticas e por uma levedura produtora de xilanase e celulase. Assim, os resultados mostram que a PC pode ser usada em bioprocessos utilizando microrganismos especiais, visando a produção de enzimas, açúcares fermentecíveis, aproveitamento de resíduos e produção de moléculas nobres tais como o XOS, dentro de um conceito moderno de biorrefinaria desde que outros componentes presentes na PC possam ser utilizados em outros bioprocessos, como produção de bioenergia. In order to obtain an integrated bioprocess using Sugarcane Straw (SS), this work began with the use of this substrate for the fibrolytic enzymes production, xylanases and cellulases, in axenic fungal cultures, including Trichoderma and Aspergillus species. The screening for the best producer was performed in shaker under submerged fermentation. The T. reesei QM9414 culture achieved the best enzyme production, and in a stirred tank using a 3 L bioreactor showed the same production profile (~90 U/mL and 0.6 FPU/mL for xylanase and cellulase, respectively). Regarding this result, the enzyme production by binary and ternary mixtures of these fungi was lower, as example the best combination T. reesei QM 9414+A. fumigatus M51, reached 60 U/mL and 0.08 FPU/mL, respectively. Aiming optimize the enzyme production by a mix of substrates using SS as the main substrate, and wheat bran and citrus pulp as supposed enzyme inductors, a D-optimal mixture design was performed. The mixture substrates optimization showed that wheat bran and citrus pulp did not have an inductive effect on the enzymes production. The enzyme xylanase was characterized by its optimal pH and temperature (pH 5 and 50 ºC, respectively, as well as the stability of the enzyme in these parameters. Some ions and EDTA were applied to determine the xylanase stability under these conditions, and the ion Mn2+ was the best inductor, 49% (10 mM). The extract containing xylanases, produced under previous optimized conditions was applied in the Kraft pulp biobleaching. The biobleaching optimization showed a decrease in the Kappa number, 12.5% (30 U/g e 30 min), as well as well as the release of sugars and the presence of chromophores compounds were also observed. This treatment performed in the pulp was responsible the decrease in 10% the chlorine dioxide amount used in the chemical bleaching, since its brightness was the same found in the sample that have no enzymatic treatment. The xylan present in the SS was extracted with NaOH by thermo-chemical treatment. After this, the xylan was hydrolyzed, for the production of xylooligosaccharides (XOS), by two different routes, enzymatic (using the crude extract produced) and acid (95 ºC and 120 ºC). The best tests that produced XOS in both routes did not present significant difference, 5.34 and 5.94 g/L corresponding to 16 e 17.45% of XOS yield. The enzymatic XOS production did not produce furfural, but the acid route is a faster alternative. As products of xylan enzymatic hydrolysis, XOS and xylose, were assimilated by probiotic bacteria and a fibrolytic yeast. Thus, the results showed that SS can be used in bioprocesses using special microorganisms, aiming the production of enzymes, fermentable sugars, waste utilization and noble molecules production, such as XOS in a modern biorefinery concept since other components of the PC can be used in other bioprocesses, such as bioenergy production.

Orientadora : Profa. Dra. Luciana Porto de Souza Vandenberghe Co-orientador : Prof.. Dr. Carlos Ricardo Soccol Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 28/04/2014 Inclui referências Área de concentração: Agroindustria e biocombustíveis Resumo: Este trabalho foi desenvolvido no contexto do projeto intitulado "BIOPAL - Biorefinarias Integradas ao Processamento Sustentável da Palma - Subprojeto Rota Biológica", com o suporte financeiro da empresa Vale S.A. O projeto global visa o reaproveitamento dos resíduos do processamento da palma em um processo integrado com a aplicação do conceito de biorrefinaria. A produção em grande escala do etanol celulósico de 2ª geração possui alguns desafios a serem vencidos. São eles: obter um substrato puro em celulose, sem hemicelulose e lignina, aumentar a eficiência da hidrólise da celulose rendimento glicosídico, melhorar a fermentabilidade do hidrolisado e reduzir custos para tornar o processo viável economicamente. Grande quantidade de palma vem sendo produzida no Brasil e com isso a geração de resíduos e o seu impacto aumentam. Um dos resíduos gerados são os cachos de frutos vazios ou empty fruit bunches (EFB). O objetivo deste trabalho foi otimizar as condições da hidrólise enzimática do resíduo EFB, após pré-tratamento físico químico, para obtenção de um hidrolisado rico em glicose e subsequente fermentação para a produção de bioetanol. Para isso foram realizados pré-tratamentos consecutivos: o ácido com HCl (2,5%) e o básico com NaOH (5%), para a hidrólise da hemicelulose e lignina, respectivamente, deixando a celulose mais susceptível à hidrólise enzimática. Ambos os tratamentos foram conduzidos em autoclave a 121ºC por 60 min. Após o pré-tratamento básico, lavagens sucessivas com água deionizada no resíduo foram realizadas com o objetivo de remover os compostos inibidores, previamente à hidrólise enzimática. Otimizações das condições de hidrólise enzimática tais como concentração de enzimas, concentração de substrato (EFB ou Avicel-celulose cristalina) e tempo de reação foram realizadas, utilizando dois complexos enzimáticos diferentes, um composto somente por Cellic CTec2 e outro por Celluclast 1.5L em conjunto com Novozymes 188. A produção de etanol celulósico foi realizada pelo processo de sacarificação e fermentação separado (SHF) do hidrolisado obtido após escalonamento da hidrólise enzimática dos EFBs pré-tratados em condições otimizadas. Por meio de análises em MEV, foi possível observar que o pré-tratamento utilizado foi responsável por fragilizar as fibras de celulose, tornando-as mais acessíveis às enzimas. Além disso, a sílica presente nas fibras foi eliminada após o pré-tratamento. Após lavagens sucessivas os compostos inibidores foram retirados da fibra, ambos para melhorar a hidrólise enzimática. O pré-tratamento ácido-básico foi responsável pela hidrólise de 96,3% de hemicelulose e 49% de lignina. Depois de etapas de otimização das condições da hidrólise enzimática foi possível obter 64,9 g/L de glicose, com um rendimento de 63,5% de conversão da celulose presente no EFB pré-tratado em glicose. Estes resultados foram alcançados com 2,2% enzima Cellic CTec2, 15% de EFB pré-tratado e 39 h de hidrólise em banho-maria agitado a 50ºC e 100 rpm. O escalonamento das condições citadas gerou um hidrolisado com 72,2 g/L de glicose e 68,8% de conversão da celulose, um aumento de 11,2% da concentração de glicose no hidrolisado. Este hidrolisado foi utilizado na SHF para produção de etanol chegando-se a 16,6 g/L de glicose após 48 h. Com base nestes dados pode-se afirmar que o resíduo sólido (cachos de frutos vazios) da indústria brasileira de óleo de palma, conhecido como EFB, pode ser utilizado como matéria-prima para a produção de etanol celulósico de 2ª geração. Outros subprodutos gerados no pré-tratamento tais como, o hidrolisado da hemicelulose e da lignina solúvel, podem ser utilizados no contexto de uma biorrefinaria integrada. Palavras-chave: EFB, pré-tratamento, otimização da hidrólise enzimática, etanol de 2ª geração, biorrefinaria Abstract: This work was developed in the context of the project entitled "Biopal - Integrated Biorefineries to Sustainable Processing of Palm - Route Biological Activity", with the financial support of Vale S.A. The global project aims at the reuse of wastes from the processing of palm oil on an integrated process with applying the concept of biorefineries. The large scale production of second generation ethanol has some challenges to overcome. They are: to obtain a pure cellulose substrate without hemicellulose and lignin, to increase the efficiency of cellulose hydrolysis and the yield glycoside, to improve the fermentability of the hydrolyzate, and to reduce cost of the process to make the process economically viable. Lots of palm has been produced in Brazil and thus the generation of waste and its impact increases. One of the waste generated is the empty fruit bunches (EFB). The aim of this study was to optimize the conditions for enzymatic hydrolysis of EFB residue after physicochemical pretreatment to obtain a rich hydrolyzed into glucose, and subsequent fermentation, to production of bioethanol. For this, consecutive pretreatments were carried out: the acid with HCl (2.5%), and the basic with NaOH (5%), for the removal of hemicellulose and lignin, respectively, leaving the pulp more susceptible to enzymatic hydrolysis. Both treatments were conduced in an autoclave at 121ºC and 60 min. After the basic pretreatment, successive washes with deionized water were performed in the solid residue in order to remove inhibitors compounds, prior to enzymatic hydrolysis compounds. Optimizations of enzymatic hydrolysis conditions such as enzyme concentration, substrate concentration (EFB or crystalline cellulose Avicel), and reaction time, were performed using two different enzyme complex, one compound only by Cellic CTec2, and another by Celluclast 1.5L togheter with Novozymes 188. The production of cellulosic ethanol was performed by separate saccharification and fermentation (SHF), of the hydrolyzate obtained after sacaling the enzymatic hydrolysis of pretreated EFBs under optimized conditions. Through SEM analysis, it was observed that the pretreatment used was responsible for undermining the cellulose fibers, making them more accessible to enzymes. Furthermore, this silica was removed fron the fibers after pretreatment. After successive washings inhibitory compounds were removed from the fiber, both to improve enzymatic hydrolysis. The acid-basic pretreatment was responsible for the hydrolysis of 96.3% hemicellulose and 49% lignin. After the optimization steps of the conditions of enzymatic hydrolysis was possible to obtain 64.9 g/L of glucose, with a yield of 63.5% conversion of the cellulose present in the pretreated EFB in glucose. These results were achieved with 2.2% enzyme Cellic CTec2, 15% of EFB pretreated and 39 h of hydrolysis in stirred tank at 50º C and 100 rpm. The analysis of the conditions mentioned generated one hydrolyzate with 72.2 g/L glucose and 68.8% conversion of cellulose, a 11.2% increase in glucose concentration in the hydrolyzate. This hydrolyzate was used in the SHF for ethanol production reached to 16.6 g/L of glucose after 48 h. Based on these data it can be stated that the solid waste (EFB) of the Brazilian industry of palm oil, can be used as feedstock for 2nd generation ethanol production. Other byproducts generated during the pretreatment such as the hydrolyzate of hemicellulose and soluble lignin may be used in the context of an integrated biorefinery. Key-words: EFB, pretreatment, optimization of enzymatic hydrolysis, 2nd generation ethanol, biorefinery