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UniGene è un sistema sperimentale per ripartire in maniera non ambigua le sequenze nucleotidiche contenute in GenBank ed attribuirle a gruppi di sequenze (cluster) rappresentativi di geni trascritti. Nella costruzione di UniGene, ad ogni locus genico è assegnato un gruppo di sequenze di RNA che possono essere determinate sperimentalmente in modo accurato “finished”, etichette di sequenze espresse (EST) o sequenze predette. Come conseguenza, UniGene risulta fondamentale in tutte le analisi bioinformatiche che coinvolgono dati a partire da sequenze nucleotidiche, come l’attribuzione di sonde nucleotidiche utilizzate nell’analisi del profilo d’espressione genica, l’integrazione dei dati tra banche dati differenti, l’identificazione di nuovi geni e la predizione della funzione o, infine, l’analisi di profili d’espressione per specifici tessuti o per posizione di mappa genica. Esistono due modalità per l’accesso ai dati UniGene: la ricerca di specifiche schede attraverso il portale web “Entrez” selezionando UniGene tra la lista di banche dati, o il prelievo dell’intera banca dati dal sito “ftp” abilitato. In entrambi i casi, il risultato è l’ottenimento di un file di testo semplice (flat file) da cui le informazioni necessarie devono essere estratte appositamente per essere utilizzate. Il processo di estrazione dati da un file di testo (parsing) richiede l’applicazione di conoscenze informatiche complesse, come i linguaggi BioPerl, JAVA o C++ utilizzati per analizzare le banche dati MedLine (Oliver et al. 2004) ed Entrez Gene (Liu and Grigoriev, 2005), o l’utilizzo di pacchetti software mirati, ad esempio GeneRecords (D’Addabbo et al. 2004) per analizzare il formato GenBank. Tuttavia, ad oggi, non esistono pubblicazioni riguardanti algoritmi o applicazioni dedicati al parsing del formato UniGene. UniGene Tabulator è stato da noi sviluppato per gestire i dati contenuti nel formato UniGene: il file di testo semplice viene importato direttamente in una banca dati apposita, al cui interno avviene il parsing delle informazioni. La banca dati è costituita da sei tabelle, una per ogni tipo di informazione presente nella scheda UniGene (informazioni generali, somiglianze con altre proteine note, sequenze STS note, dati di relativi alla mappa di trascrizione ed informazioni sulle genoteche utilizzate per la creazione delle EST, associate nel cluster UniGene) relazionate tra loro mediante l’identificativo del cluster UniGene. Ogni “record” di una tabella contiene i dati di una singola sequenza, o di un cluster solo per le informazioni generali, ed è suddiviso in campi che contengono i valori estratti. Ogni campo è indicizzato per eseguire rapidamente ricerche specifiche ed il risultato può essere esportato in un file di testo per essere utilizzato per ulteriori analisi o altre ricerche. UniGene tabulator è basato su FileMaker Pro 8, un gestore di basi di dati di semplice utilizzo, ed è distribuito come applicazione stand-alone per piattaforme Macintosh e Windows corredato di una guida descrittiva delle operazioni utili ad importare il file UniGene con i dati per la specie animale in studio.

Nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (CL/P) is a complex genetic trait and little is known about its aetiology. Recent investigations on rare clefting syndromes provided interesting clues about genes involved in face development. The PVRL1 gene encodes nectin1, a cell-to-cell adhesion molecule. Mutations in its sequence have been shown to cause the rare autosomal recessive syndrome CL/P-ectodermal dysplasia syndrome (CLPED1), while heterozygosity for the mutation W185X seemed to increase the risk of non syndromic CL/P in a population from northern Venezuela. In the present study, we screened 143 Italian CL/P patients for mutations in PVRL1. Three rare sequence variants in exon 3 that create amino-acid changes were detected in a total of 7 patients. Two of these mutations were not found in a panel of 292 unaffected controls, while the third was found in two controls. This study describes new mutations that may represent genetic risk factors for CL/P. Even though a study to look at the effects of the mutations on nectin1 function was not feasible, supporting evidence was reported, thus confirming the involvement of PVRL1 in the aetiology of non-syndromic CL/P malformation.

È noto che i metodi classici di clonaggio del cDNA sono influenzati da una potenziale incapacità di amplificare efficacemente la regione 5´ dell’mRNA. Dato che la sequenza amminoacidica dei prodotti genici è di norma dedotta dalla sequenza dei nucleotidi del relativo cDNA clonato, è importante verificare che una sequenza codificante identificata (o open reading frame, ORF) sia quanto più possibile completa al relativo 5´. In studi precedenti abbiamo dimostrato, mediante analisi bioinformatica accurata e successivo clonaggio del cDNA (reazione a catena della polimerasi dopo retrotrascrizione, RT-PCR), che in 4 su 109 geni noti localizzati sul cromosoma 21 umano, le ORF annotate erano incomplete all’estremità 5´. Scopo del presente lavoro è stato valutare la completezza nella regione 5´ delle sequenze ORF di mRNA di Danio rerio (zebrafish), organismo modello sempre più utilizzato in studi di genomica. Abbiamo sviluppato un innovativo metodo automatizzato che consente di: 1) confrontare in modo sistematico le EST (expressed sequence tags, etichette di sequenze espresse) disponibili con tutte le sequenze di mRNA conosciute di Danio rerio; 2) identificare eventuali tratti di sequenza da aggiungere nella regione 5´; 3) verificare la presenza di tutte le condizioni necessarie a dimostrare l’esistenza di una nuova ORF estesa. Queste condizioni sono, in breve, la presenza di un nuovo “primo codone AUG” in fase con quello precedentemente descritto e la mancanza di uno qualsiasi dei tre codoni di stop in fase tra il codone di recente identificazione e quello inizialmente annotato. Il nostro programma ha analizzato gli 8.528 mRNAs di Danio rerio estratti dal database RefSeq (disponibili al 31/12/2005) e ha permesso di identificare 265 (3,1%) mRNA con ORF potenzialmente incomplete nella regione 5´. Attraverso RT-PCR e sequenziamento automatico abbiamo dimostrato per tre geni (selt1a, unc119, nppa), scelti tra quelli candidati, che la regione codificante all'estremità 5' era stata caratterizzata in modo incompleto nelle descrizioni originali. La conoscenza delle ORF complete dell’mRNA assume una particolare valenza in zebrafish per gli studi di localizzazione del prodotto genico, di sovraespressione genica nonché per la realizzazione di organismi knockdown mediante oligonucleotidi morfolinici. Il metodo sviluppato, la cui utilizzazione è applicabile anche all’analisi di altri genomi, ha consentito di descrivere in questo lavoro la rilevanza del problema dell’incompleta caratterizzazione delle estremità 5´ degli mRNA e di sottolinearne le possibili conseguenze nell’ambito dell'annotazione genomica e degli esperimenti funzionali eventualmente progettati in zebrafish.

Tramite analisi di sequenze EST (Expressed Sequence Tags) è stato osservato che il gene umano CYYR1 (cysteine/tyrosine-rich 1) mostra un’alta espressione in cellule appartenenti al sistema APUD (Amine Precursor Uptake and Decarboxylation). E’ noto che anomalie del differenziamento cellulare in cellule APUD sono spesso alla base di alcuni tipi di tumore di origine neuroendocrina (APUDomi), come le neoplasie endocrine multiple, i tumori carcinoidi, il feocromocitoma e il melanoma. E’ stata analizzata, mediante RT-PCR specifica e successivo sequenziamento, l’intera sequenza codificante (CDS) dell’mRNA di CYYR1 umano in 32 tumori neuroendocrini (NE). In tutti i campioni analizzati la CDS di CYYR1 è risultata sovrapponibile a quella di riferimento con eccezione della sequenza ottenuta dall’unico tumore localizzato nel collo, un carcinoma scarsamente differenziato con aspetti neuroendocrini. In quest’ultimo caso, l’analisi ha evidenziato la presenza di una mutazione, in eterozigosi, in posizione 333 della CDS (T al posto di C) che porta alla sostituzione amminoacidica P111S. L’analisi di sequenza, inoltre, ha mostrato chiaramente l’esistenza di due isoforme di mRNA dovuta alla presenza di due possibili siti accettori di splicing all’estremo 3¢ dell’introne 3 che termina con la sequenza CAGCAG (splicing alternativo “sottile”). Tale splicing alternativo è presente anche nei tessuti normali. Le due isoforme di mRNA prodotte differiscono per una tripletta CAG (CAG-: assenza della tripletta, CAG+: presenza della tripletta); ne derivano due prodotti proteici putativi diversi per assenza o presenza di un residuo di alanina nel punto di giunzione fra esone 3 ed esone 4. E’ stata successivamente quantificata l’espressione relativa delle due isoforme messaggeriali (CAG- e CAG+) in 29 tumori NE e in 8 tessuti normali tramite un metodo che si basa su una RT-PCR condotta in condizioni altamente standardizzate e stringenti. Il metodo impiega la beta-2 microglobulina (B2M) come gene di riferimento e i risultati della elettroforesi dei prodotti di PCR sono elaborati con un analizzatore di immagini (Gel Doc 2000). Nei campioni tumorali è stata ritrovata una espressione significativamente più bassa della isoforma CAG- rispetto ai controlli normali in un rapporto di 2:3 (p=0,022). Infine abbiamo condotto un’analisi bioinformatica per verificare o meno la presenza delle due isoforme degli ortologhi di CYYR1 in altre specie: solo in Pan troglodites si può ipotizzare l’esistenza delle due isoforme per la presenza, nella sequenza genomica, di un confine introne-esone analogo a quello umano.

E’ di recente osservazione (Hiller et al., Nat Genet, 2005) la presenza, in almeno il 30% dei geni umani, di uno splicing alternativo “sottile”, causato da una sequenza NAGNAG situata al confine fra un sito accettore di splicing intronico e l’inizio dell’esone successivo. Questa breve sequenza offre all’apparato di splicing due punti di taglio distanti solo tre basi l’uno dall’altro con conseguente trascrizione di due isoforme di mRNA che differiscono per la presenza o assenza di una tripletta NAG. Ne derivano due proteine diverse per uno o al massimo due aminoacidi. Tale differenza è sufficiente per ipotizzare una diversa funzione delle due forme, sinora dimostrata in vitro solo per l'insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R). L’attivazione del sistema insulin-like growth factor 1 (IGF1)/IGF1R è un evento cruciale nei processi di trasformazione neoplastica in diversi tumori umani. Tale sistema è stato recentemente studiato in tumori carcinoidi che sono caratterizzati da ipersecrezione di amine biologiche e di neuropeptidi responsabili delle manifestazioni sintomatologiche. Sono stati descritti due trascritti del gene IGF1R, dovuti a splicing alternativo “sottile”, che differiscono per tre nucleotidi (CAG) nella sequenza codificante. L’assenza della tripletta CAG (isoforma CAG-) dà origine ad una proteina che rispetto alla forma originariamente descritta (codificata dalla isoforma CAG+) presenta una Arginina in sostituzione della coppia Treonina-Glicina nella porzione extracellulare della subunità beta del recettore. Trasfettando con entrambe le isoforme la linea cellulare CHO si è visto che la forma CAG-, rispetto alla forma CAG+, mostra un aumento della attività mitogenica di circa due volte in risposta a IGF1. Nel presente lavoro proponiamo un metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi dopo retrotrascrizione (reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) per lo studio semiquantitativo della espressione differenziale di mRNA che differiscono per poche basi, e lo applichiamo alla analisi della espressione relativa delle due isoforme di mRNA di IGF1R in un’ampia casistica di tumori neuroendocrini umani (32 campioni) e in tessuti normali (9 campioni). Il metodo prevede condizioni altamente standardizzate e stringenti, impiega la beta-2 microglobulina (B2M) come gene di riferimento e i risultati della elettroforesi dei prodotti di PCR sono elaborati con un analizzatore di immagini (Gel Doc). Nei campioni tumorali è stata ritrovata una espressione significativamente più alta (di circa 2 volte) di entrambe le isoforme rispetto ai controlli normali, mentre il rapporto fra le due isoforme CAG+/CAG- si mantiene costante sia nei tipi cellulari tumorali che in quelli normali studiati (circa 3:1). Lo studio filogenetico del locus IGF1R, condotto sulle sequenze disponibili di diverse specie animali, suggerisce che l’isoforma messaggeriale IGF1R CAG- sia, da un punto di vista evoluzionistico, più recente rispetto alla isoforma CAG+, per questa ragione l’apparato di splicing potrebbe utilizzare con minor efficienza il sito di splicing che la origina. Questo lavoro sottolinea la espressione differenziale di isoforme di splicing alternativo “sottile” per il locus IGF1R e rimanda alla necessità di evidenziare e caratterizzare, con metodi di bioinformatica e di biologia molecolare, analoghe forme di splicing sottile per i geni umani noti non ancora studiati sotto questo profilo e per tutti i nuovi geni via via identificati.

Folate receptor family members (FOLRs) mediate the delivery of 5-methyltetrahydrofolate to the interior of, out of within, or between cells in a process known as potocytosis. Three FOLRs and a pseudogene map to 11q13.4. The aim of this study was to verify whether FOLRs could be responsible for the onset of nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (CL/P). Linkage and linkage disequilibrium between genetic markers and disorder were analyzed. Patients and their mothers from 71 familial CL/P pedigrees and 75 sporadic cases from Italian population were investigated by PCR-SSCP analysis. Data from mutation scanning allowed us to find only a silent mutation in FOLR1 present in a mother and her child. Our findings do not support FOLR1 and FOLR2 genes in the onset of CL/P.

Nel corso dello studio del gene umano CYYR1 (Vitale et al., 2002), localizzato sul cromosoma 21, abbiamo isolato e clonato in vettore un cDNA corrispondente a una isoforma di splicing che differisce di 3 basi (CAG) dalla forma precedentemente da noi identificata e descritta. La sequenza del cDNA della isoforma permette di prevedere la codifica di un prodotto polipeptidico con un amminoacido aggiuntivo (alanina) inserito tra P111 e G112. Lo studio mediante RT-PCR (reazione a catena della polimerasi dopo retrotrascrizione) semiquantitativa ha permesso di dimostrare che le due isoforme sono espresse differenzialmente in diversi tessuti normali studiati. L’analisi genomica ha rivelato che l’origine dello splicing alternativo risiede nella sequenza terminale dell’introne 3 del gene CYYR1 (CAGCAG), che presenta due siti accettori di splicing canonici “AG” distanti tre basi tra loro ed entrambi utilizzabili dalla cellula. E’ stata quindi eseguita una revisione sistematica, basata su analisi bioinformatica e in alcuni casi anche sul clonaggio mediante RT-PCR, degli mRNA umani che si presentano in due possibili isoforme differenti per la presenza o l’assenza di una tripletta CAG. In particolare, abbiamo analizzato con uno specifico programma da noi sviluppato le sequenze di circa 30.000 introni umani (banca dati SRS), dimostrando che in 39 casi (0,13 %) un introne umano termina con la sequenza CAGCAG. In 10 casi, l’analisi della banca dati EST (expressed sequence tags, etichette di sequenze espresse) mostrava l’effettiva esistenza di mRNA differenti per la tripletta CAG. In alcuni casi, la tripletta aggiuntiva si trova nella regione codificante, permettendo la previsione di una sequenza amminoacidica del prodotto variante più lunga di 1 amminoacido. Abbiamo dimostrato la presenza di splicing alternativo, mediante RT-PCR, per i geni: SGNE1 (secretory granule, neuroendocrine protein 1), G6PD (glucose-6-phosphate dehydrogenase), PKD1 (polycystic kidney disease 1 gene). Nel caso di IGF1R (codificante il recettore per l’insulin-like growth factor 1), dati di letteratura precedenti hanno mostrato che i prodotti polipeptidici tradotti a partire dalle due differenti isoforme di mRNA e differenti per un singolo amminoacido possono svolgere una diversa funzione biologica (in termini di oncogenicità in saggi di trasfezione cellulare). La identificazione sistematica di isoforme di splicing minimamente differenti con produzione di catene polipeptidiche varianti, oltre ad aver permesso l’identificazione rapida di nuove isoforme di splicing di geni umani noti da tempo e svolgenti azioni biologiche fondamentali, amplia la nozione di variabilità dei prodotti di trascrizione genica che possono essere originati da un singolo locus e prelude alla ricerca di meccanismi simili operanti a livello dei siti donatori di splicing o di altre analoghe sequenze a livello dei siti accettori.

Il gene DSCR1L2 (1p35.3-p33), identificato e clonato nel nostro laboratorio, appartiene alla famiglia genica umana DSCR1L (Down Sindrome critical region 1-like) di cui fanno parte anche i geni DSCR1 (21q22.12) e DSCR1L1 (6p12.3). Le sequenze del cDNA di questi geni non presentano alcuna somiglianza con quelle di membri di famiglie geniche note. L’analisi genomica mostra che, mentre gli invertebrati contengono un solo gene di tipo DSCR1-like, nei vertebrati sono presenti tre membri della famiglia. Lo studio dei loci DSCR1, DSCR1L1 e DSCR1L2 mostra l’esistenza nel genoma umano di una nuova regione di paralogia segmentale di circa 500 kb che comprende l’1,4% del cromosoma 21, nella quale si trovano nello stesso ordine tre membri delle tre famiglie geniche DSCR1L, Runt (AML, acute myeloid leukemia) e CLIC (chloride intracellular channel). L’analisi filogenetica mostra una divergenza tardiva di DSCR1L1 e DSCR1L2 dal gene DSCR1 più ancestrale, e la conservazione della paralogia segmentale fin dai vertebrati inferiori. Lo studio dell’mRNA di DSCR1L2 mostra una espressione ubiquitaria del gene, con un livello molto alto di espressione nel tessuto muscolare, in particolare in quello cardiaco. L’analisi bioinformatica e mediante reazione a catena della polimerasi dopo retrotrascrizione (RT-PCR) ha permesso di identificare tre isoforme di mRNA generate da splicing alternativo. Una delle isoforme si ottiene per perdita degli esoni 2 e 3 del gene, con conseguente perdita della regione codificante per il dominio ricco in prolina caratteristico della famiglia, una seconda forma mostra la perdita dell’esone 2, mentre la terza si caratterizza per la mancanza di 30 basi codificanti per 10 amminoacidi nella regione centrale della proteina. E’ stato recentemente dimostrato da altri Autori che le proteine DSCR1 e DSCR1L1 si legano alla Calcineurina (CnA), una fosfatasi calcio-calmodulina dipendente che modula l’espressione genica nel muscolo scheletrico e cardiaco durante lo sviluppo e in condizioni di ipertrofia provocata da stress ambientali o da patologie. Da parte di più Autori è stato supposto il legame anche di DSCR1L2 con la CnA stessa nonostante l’assenza di prove sperimentali, solo sulla base dell’omologia di sequenza. Il test dei due ibridi in lievito da noi eseguito per individuare l’interazione proteina-proteina tra DSCR1L2 e una o più proteine tradotte a partire dai cDNA presenti in una genoteca di cuore umano non ha potuto tuttavia rilevare nessuna interazione con la CnA. E’ stata invece dimostrata l’interazione tra DSCR1L2 e la troponina I (TNNI3) cardiaca umana, la subunità inibitoria del complesso delle troponine coinvolte nella contrazione muscolare. L’interazione con TNNI3 della proteina DSCR1L2 mostra un caso interessante di divergenza funzionale nell’ambito della famiglia genica DSCR1L, e contribuisce alla chiarificazione dei complessi proteici implicati nella contrazione muscolare. Inoltre, abbiamo identificato un secondo interattore proteico di DSCR1L2, corrispondente a un cDNA tradotto secondo un modulo di lettura non fisiologico; questo polipeptide non naturale di 48 amminoacidi potrebbe risultare di interesse farmacologico per il suo eventuale ruolo nella modulazione della funzione di DSCR1L2. L’interazione tra DSCR1L2 e TNNI3 è stata confermata mediante cotrasformazione in lievito dei due plasmidi contenenti DSCR1L2 e TNNI3. Una ulteriore conferma di tale interazione viene da esperimenti di coimmunoprecipitazione in vitro. La zona di interazione è stata infine mappata mediante cotrasformazione del cDNA corrispondente alla isoforma di splicing di DSCR1L2 mancante degli esoni 2 e 3 e del cDNA di TNNI3. I risultati mostrano l’assenza di interazione, individuando la zona di interazione nei domini codificati dagli esoni 2 e 3.

La riproduzione sessuata richiede l'ovocito, di origine materna, e lo spermatozoo, che proviene dal padre. Questi gameti si uniscono nel processo della fecondazione, originando lo zigote, prima cellula del nuovo organismo, dotato di un patrimonio genetico diploide. Le prime divisioni mitotiche, nella fase detta segmentazione, portano alla blastocisti, in grado di dare il via al processo di annidamento nell'endometrio materno. La gastulazione ci conduce fino alla formazione del disco embrionale trilaminare. Una breve descrizione degli annessi embrionali e della loro funzione, con particolare attenzione alla placenta, completa il capitolo.

Nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (CL/P; MIM 119530), a common birth defect, is a genetically complex trait. Several genetic and environmental factors seem to be involved in the development of this malformation [Carinci et al., 2003]. Nevertheless, CL/P also occurs as a part of many single gene syndromes, and some of these genes may also have roles in nonsyndromic CL/P. Suzuki et al. [2000] showed that the rare autosomal recessive syndrome CL/P-ectodermal dysplasia (CLPED1; MIM 225060) is caused by the loss-of-function of PVRL1 gene, which encodes nectin-1, a cell-to-cell adhesion molecule. The same group demonstrated that heterozygosity of the nonsense mutation W185X is a genetic risk factor for nonsyndromic CL/P in northern Venezuela [Sozen et al., 2001]. To verify whether the W185X mutation is a genetic risk factor for nonsyndromic CL/P in the Italian population, 71 familial CL/P belonging to 71 different pedigrees, 75 sporadic CL/P, and 100 unrelated unaffected individuals were enrolled in this study. The W185X mutation is a singlenucleotide change G!A that creates a StyI restriction endonuclease site. Therefore, a 160 bp segment of the exon 3 containing the mutation was amplified by PCR using the following primers: W185X.for 50CCACCAATTGGATAGAGGGTA30 and W185X.rev 50CGGATCTCCTGGTACTCTGC30. Amplimers were digested with StyI restriction endonuclease, electrophoresed on 2.5% agarose gel, and visualized by ethidium bromide. Positive controls, containing the mutation generated by site-directed mutagenesis (www.buckinstitute. org/benz/prot/prot12.htm), were included to verify the assay efficiency in each test. Of the 146 CL/P patients and of the 100 unaffected individuals analyzed in this study for the presence of the W185X mutation in the PVRL1 exon 3, none was positive. The results of this investigation indicate that in Italy the W185X mutation is not common and in turn, it does not constitute a risk factor for nonsyndromic CL/P. As suggested by Suzuki et al. [2000], since the PVRL1 gene product constitutes a receptor for herpesviruses, in the Margarita Island population the mutation may be selected positively for an increased resistance to infections of the carriers. Our findings significantly differ from those previously observed in the Venezuelan population [Sozen et al., 2001]. This discrepancy likely reflects the complex etiology of the CL/P malformation. Indeed, the numerous genetic and environmental factors involved probably contribute differently to the development of the malformation in distinct populations.