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Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2022 La proteína específica de leucocitos 1, LSP1, es una fosfoproteína intracitoplasmática de 52 kDa que se une a F-actina y es expresada en todos los leucocitos humanos y murinos, como así también en células endoteliales. Múltiples estudios indican que polimorfismos o disminuciones en los niveles de expresión de LSP1 constituyen factores de riesgo para el desarrollo de distintos tipos de cáncer, como cáncer de mama y hepatocarcinoma. A pesar de su bajo número tanto en tumores como en órganos linfoides, las células dendríticas son esenciales para la inducción de la respuesta inmune antitumoral. Las células dendríticas capturan antígenos asociados a tumor, los procesan transformándolos en péptidos inmunogénicos que son cargados en las moléculas del MHC, y los presentan a los linfocitos T proveyendo además coestimulación y citoquinas, permitiendo de esta manera la generación de linfocitos T citotóxicos, células fundamentales en la inmunidad antitumoral. Estudios previos llevados a cabo por nuestro grupo de investigación revelaron que la ausencia de LSP1 en células dendríticas, afecta la inducción de una respuesta citotóxica in vivo en animales WT y la activación de linfocitos T CD8+ vírgenes in vitro. Además, las células dendríticas LSP1 KO exponen menor proporción de péptidos antigénicos asociados a MHC-I en su superficie debido a un defecto en la traslocación del antígeno desde los endosomas al citosol, proceso fundamental para una eficiente presentación cruzada de antígenos. Para determinar el rol de LSP1 en la generación de una respuesta inmune antitumoral utilizamos la línea de melanoma murino B16-OVA. Observamos que luego de implantar de manera subcutánea 1.105 células, ratones carentes de LSP1 desarrollan tumores de manera más temprana, los mismos crecen a una velocidad superior y alcanzan tamaños mayores que los respectivos tumores implantados en animales WT. Dichos tumores presentan una menor área de necrosis, fenómeno que se ve acompañado de un menor infiltrado por parte de las células del sistema inmune. Sin embargo, la composición del infiltrado inflamatorio es similar en ambos grupos de animales, siendo las células dendríticas CD103+ la población minoritaria en tumores extraídos tanto de ratones WT como de ratones LSP1 KO. La ausencia de LSP1 a nivel leucocitario condiciona su capacidad para acceder al microambiente tumoral, lo que podría explicar, al menos en parte, la menor frecuencia leucocitaria hallada en tumores extraídos de ratones carentes de LSP1. Por otro lado, el análisis del microambiente tumoral reveló que los tumores que se desarrollan en ratones LSP1 KO presentan una mayor concentración de múltiples citoquinas inflamatorias, incluyendo IL-23, TNF-α, IL-12p70, IL-1β, IL-10, IL-27, IL-17A, IFN-β, y GM-CSF, que presentes en altas concentraciones de manera crónica pueden favorecer el desarrollo del tumor. La caracterización de las poblaciones leucocitarias en ganglio linfático indicó que no existen diferencias a nivel basal entre los animales WT y LSP1 KO. Sin embargo, el análisis de los ganglios drenantes de tumor muestra varias diferencias al comparar los grupos experimentales. En ratones LSP1 KO, los ganglios drenantes de tumor presentan una menor frecuencia de neutrófilos y linfocitos B, sumado a una mayor proporción de monocitos y linfocitos T. Además, existe una mayor frecuencia de células dendríticas totales, pero de mayor relevancia para el desarrollo de una respuesta inmune antitumoral es la remodelación que existe en este compartimento celular, ya que hay una menor frecuencia de células dendríticas CD103+ y CD8α+ capaces de efectuar la presentación cruzada de antígenos. La funcionalidad de las células dendríticas también se ve comprometida por la ausencia de LSP1. Las mismas, capturan antígenos tumorales de manera deficiente y consecuentemente, las células dendríticas CD103+, principales responsables de transportar antígenos al ganglio drenante de tumor, lo hacen en una menor proporción, lo cual no se encuentra condicionado por los niveles de expresión de CCR7. Además, las células dendríticas LSP1 KO presentes en ganglio drenante a tumor inducen una menor activación y proliferación de linfocitos T CD8+, afectando la generación de la respuesta inmune antitumoral. Dichas células dendríticas, expresan mayores niveles de la molécula inhibitoria PD-L1, sin embargo, esta vía de señalización no es la principal responsable del deficiente control tumoral observado en los ratones LSP1 KO ya que el bloqueo de la interacción PD-L1/PD-1 mediante la utilización de un anticuerpo monoclonal dirigido contra PD-1 no modifica el tamaño tumoral en estos animales. La evaluación de linfocitos T específicos en sangre periférica indica que los niveles son comparables entre ratones WT y LSP1 KO. Lamentablemente, dichas células no pudieron ser halladas a nivel tumoral ni el ganglio drenante, posiblemente por su bajo número y por problemas de sensibilidad y especificidad de la técnica. Sin embargo, la producción de moléculas efectoras como perforinas y granzima B, como así también la producción simultánea de IFN-γ y el marcador de degranulación Lamp1, es significativamente menor en linfocitos T CD8+ intratumorales en ratones LSP1 KO, lo que indica que dichos linfocitos poseen alteraciones a nivel funcional. Al evaluar la capacidad citotóxica in vivo en ratones con tumor no se detectó lisis específica en ninguno de los dos grupos de animales estudiados. Por ello, con el objetivo de potenciar la respuesta inmune, los animales fueron inmunizados con OVA/CpG-ODN/Coa-ASC16, lo cual evidenció un menor porcentaje de lisis en los ratones LSP1 KO, reflejando su menor capacidad citotóxica a pesar del fuerte estímulo brindado para desarrollar este tipo de respuesta. Finalmente, los resultados indican que una única inmunización con OVA/CpG-ODN/Coa-ASC16 protege parcialmente a los ratones tanto WT como LSP1 KO frente al desarrollo tumoral e incrementa su sobrevida. Sin embargo, la respuesta generada en los animales LSP1 KO continúa siendo inferior a la que se desencadena en los animales WT, lo que indica que la menor citotoxicidad desarrollada en los animales LSP1 KO condiciona su respuesta frente a tumores e impide un adecuado control de los mismos. A partir de los resultados obtenidos podemos concluir que la ausencia de LSP1 afecta la generación de la respuesta inmune antitumoral en varios niveles. Los leucocitos presentan limitaciones en su capacidad migratoria o de extravasación lo que dificulta su acceso al microambiente tumoral y genera la menor proporción de infiltrado observado en los animales LSP1 KO, limitando de esta manera la eliminación de las células transformadas. Además, se afecta tanto la captura de antígenos tumorales por parte de las células dendríticas como su transporte al ganglio drenante a tumor, sitio donde se inicia la respuesta inmune específica. Así, sumado a los defectos en la traslocación antigénica previamente observados en nuestro grupo, las DCs presentan dificultades para activar e inducir la proliferación de linfocitos T CD8+ vírgenes, células fundamentales en la eliminación de tumores. Adicionalmente los linfocitos T CD8+ generados poseen una alteración en su funcionalidad, lo cual reduce su capacidad citotóxica y limita aún más el control del tumor. La falta de control del desarrollo tumoral podría ser responsable de la generación de un microambiente inflamatorio que se sostiene de manera crónica a nivel intratumoral, lo que favorecería a un mayor desbalance en la respuesta inmune, dificultando aún más el control del desarrollo tumoral. Por lo tanto, podemos concluir que el mayor tamaño tumoral observado en animales LSP1 KO es el resultado de múltiples factores que condicionan el desarrollo de la respuesta inmune antitumoral, con las células dendríticas como un claro factor central. LSP1 is an intracellular phosphoprotein expressed in leukocytes and endothelial cells from humans and mice. LSP1 polymorphisms or reduced expression are risk factors for some cancer types. We demonstrated that B16-OVA tumors implanted in LSP1 KO mice reach bigger sizes and grow faster than tumors inoculated in WT mice. Our results indicate that LSP1 lack modifies antitumor immune response. Leukocytes have a reduced extravasation ability, resulting in a diminished access to the tumor microenvironment and in a lower frequency of total leukocytes in tumors harvested from LSP1 KO mice. Dendritic cells antigen capture and draining lymph node migration is also influenced by LSP1 absence. In addition, LSP1 KO dendritic cells cannot activate and induce CD8+ T cells proliferation in an appropriate way. CD8+ T cells functionality is affected too. CD8+ lymphocytes have a reduced cytotoxic activity demonstrated by perforin, granzyme B and IFN-γ lower production, contributing to the deficient control of tumor growth. The uncontrolled tumor development observed in LSP1 KO mice contributes to a chronic proinflammatory microenvironment generation, favoring the unbalanced immune response and hindering the tumor growth control. Therefore, we conclude that the bigger tumor size observed in LSP1 KO mice is the result of multiple factors that influence the development of antitumor immune response, having dendritic cells a key role. 2024-09-30 Fil: Pascual, María Mercedes. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.

INTRODUÇÃO: De papel indispensável, as células dendríticas, importantes apresentadoras de antígeno com heterogeneidade fenotípica e funcional, ligam as respostas imunes inatas e adaptativas. São responsáveis pela regulação e modulação de respostas efetoras contra microrganismos e células tumorais, também realizam a manutenção da tolerância imunológica em condições homeostáticas. Sua plasticidade funciona de acordo com estímulos e microambiente em que estão inseridas. A imunoterapia utilizando essas células, está em constante estudo para a obtenção de ativação suficiente de uma resposta imune celular. Vários protocolos e patentes foram e ainda são testados para diferenciação e maturação de um perfil apropriado de células dendríticas para uma imunoterapia eficaz. OBJETIVO: Testar o perfil de ativação e migração apresentado pela cultura de células dendríticas submetida a maturação por diferentes protocolos de estímulos (TNF-α e TNF-α, IL-12 e CCL5) em ensaio in vitro. METODOLOGIA: Sangue periférico de voluntários saudáveis (n=10) foi utilizado para o isolamento de monócitos e linfócitos. As células aderentes foram diferenciadas em células dendríticas que foram submetidas a maturação por 2 diferentes protocolos (protocolo 1 com estímulo de TNF-α; protocolo 2 referente a estimulação com TNF-α, IL-12 e CCL5) e posteriormente co-cultura com células não aderentes. Para a caracterização do perfil fenotípico das células totais (aderentes e não aderentes), foi analisada a intensidade média de fluorescência de marcadores de superfície (CD209, CD11c, HLA-DR, CD123, CD209, CD80, CD86, CD83, CD3, CD8, CD4, CD25, FOX-P3, NKG2D e CD54) e citocinas (granzimas, perforinas, IL-10, IFN γ, TNF-α, IL-12, TGF-β, IL-4 e IL-17), por citometria de fluxo. A migração das células dendríticas maturadas foi vista sobre coloração e contagem de células em membrana de poliestireno submetidas a cultura com um gradiente quimiotático (MCP-1 e CCL5). RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os resultados mostram aumentos significativos na expressão de moléculas de adesão/co-estimulatórias CD209, CD11c, HLA-DR, CD123, CD80, CD86, CD83 e citocinas (IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL-10 e TGF-β) das células dendríticas do protocolo 2 comparado com o protocolo 1. De tal forma, vemos a ativação de subtipos importantes de células T (Th1 e Th17, com redução de Treg) e Natural Killer (NK) produtoras de IFN-γ, com expressão diminuída de IL-10 no mesmo protocolo. CONCLUSÃO: Nossos estudos indicam que o protocolo de estimulação com TNF-α, IL-12 e CCL5 foi capaz de gerar um perfil de células dendríticas maduras e eficazes para ativação de subtipos balanceados de linfócitos T e células NK, importantes na resposta imune antitumoral. INTRODUCTION: With an indispensable role, dendritic cells, important antigen presenters with phenotypic and functional heterogeneity, link innate and adaptive immune responses. They are responsible for regulating and modulating effector responses against microorganisms and tumor cells, and also maintain immunological tolerance under homeostatic conditions. Their plasticity works according to stimuli and microenvironment in which they are inserted. Immunotherapy using these cells is under constant study to obtain sufficient activation of a cellular immune response. Several protocols and patents have been and are still being tested for differentiation and maturation of an appropriate profile of dendritic cells for effective immunotherapy. OBJECTIVE: To test the activation and migration profile presented by the culture of dendritic cells submitted to maturation by different stimulus protocols (TNF-α and TNF α IL-12 and CCL5) in an in vitro assay. METHODOLOGY: Peripheral blood from healthy volunteers (n=10) was used for the isolation of monocytes and lymphocytes. Adherent cells were differentiated into dendritic cells that were subjected to maturation by 2 different protocols (protocol 1 with TNF-α stimulation; protocol 2 regarding stimulation with TNF-α, IL-12 and CCL5) and then co-culture with cells non-adherent. To characterize the phenotypic profile of total cells (adherent and non-adherent), the mean fluorescence intensity of surface markers (CD209, CD11c, HLA-DR, CD123, CD209, CD80, CD86 CD83, CD3, CD8, CD4) was analyzed, CD25, FOX-P3, NKG2D and CD54) and cytokines (granzymes, perforins, IL-10, IFN-y, TNF-α, IL-12, TGF-β, IL-4 and IL-17) by cytometry of flow. The migration of mature dendritic cells was seen on staining and counting of cells in polystyrene membrane cultured with a chemotactic gradient (MCP-1 and CCL5). RESULTS AND DISCUSSION: The results show significant increases in the expression of adhesion/co-stimulatory molecules CD209, CD11c, HLA-DR, CD123, CD80, CD86 and CD83 and cytokines (IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL-10 and TGF -β) of dendritic cells from protocol 2, compared to protocol 1. Thus, we see the activation of important subtypes of T cells (Th1 and Th17, with reduced Treg) and Natural Killer (NK) that produce IFN-γ, with decreased expression of IL-10 in the same protocol. CONCLUSION: Concluding our findings, we demonstrate that the stimulation protocol with TNF-α, IL-12 and CCL5 was able to generate a profile of mature dendritic cells and effective for activation of balanced subtypes of T lymphocytes and NK cells, important in the antitumor immune response. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Financiadora de Estudos e Projetos - Finep Fundação de Ensino e Pesquisa de Uberaba - FUNEPU Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

Submitted by Ana Paula Prudente Jacintho (ap.jacintho@unesp.br) on 2022-06-27T19:41:12Z No. of bitstreams: 1 DEFESA_DOUTORADO_ANA_PAULA_DEFINITIVO_REPOSITÓRIO.pdf: 1747448 bytes, checksum: 28a4620bb21f7a2f6a07e36938c1c0dc (MD5) Approved for entry into archive by Laudicélia Martins Arantes (lm.arantes@unesp.br) on 2022-06-28T12:05:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 jacintho_app_dr_jabo.pdf: 1788706 bytes, checksum: 1eb584a2cc7c45af723929e895e3d057 (MD5) Made available in DSpace on 2022-06-28T12:05:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 jacintho_app_dr_jabo.pdf: 1788706 bytes, checksum: 1eb584a2cc7c45af723929e895e3d057 (MD5) Previous issue date: 2022-05-03 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A Leishmaniose Visceral (LV) é uma antropozoonose causada pelo protozoário Leishmania infantum, cuja pele é o sítio inicial da infecção, antes da visceralização do parasita. Os efeitos imunopatológicos da resposta imune sistêmica interferem com a função dos órgãos injuriados. A enzima IDO é responsável pelo catabolismo do triptofano e esgota o L-Triptofano do microambiente local, resultando na produção de metabólitos da via quinurenina, comprometendo a função de linfócitos T e resultando em imunossupressão. Existem poucos estudos que correlacionam os metabólitos de triptofano à imunopatogenia da LV canina. Portanto, o objetivo deste estudo foi comparar as lesões cutâneas com a carga parasitária, a imunodetecção de subprodutos do triptofano da via da quinurenina (ácido quinurênico e ácido quinolínico), dos linfócitos Treg, das células dendríticas imaturas e maduras (CD11 e CD83 respectivamente), IL-10 e de macrófagos M1 e M2. Para isso foram utilizados fragmentos de pele (ponta de orelha e plano nasal) de 30 cães com LV (grupo infectado) e de 05 cães não infectados (grupo controle), que foram submetidas à análise imuno-histoquímica. Todas estas variáveis estavam aumentadas no grupo infectado, exceto M1 e CD83, que não diferiram estatisticamente entre os grupos, tanto na orelha quanto no plano nasal. No grupo infectado houve maior proporção de macrófagos M2, de células dendríticas imaturas, ácido quinolínico e quinurênico, IL10 e linfócitos Treg, o que indica a predominância de uma resposta imune Th2, inibição da ativação de linfócitos T e da apresentação eficiente de antígenos. Os metabólitos do triptofano no microambiente cutâneo tiveram um papel imunossupressor durante a infecção por Leishmania infantum, possivelmente contribuindo para a persistência da infecção na pele e com a distribuição sistêmica do parasita. Visceral Leishmaniasis (VL) is an anthropozoonosis caused by the protozoan Leishmania infantum, whose skin is the first site of infection, before the visceralization of the parasite. The immunopathological effects of the systemic immune response interfere with the function of injured organs. The IDO enzyme is responsible for tryptophan catabolism and depletes L-Tryptophan from the local microenvironment, resulting in the production of kynurenine pathway metabolites, compromising T lymphocyte function and resulting in immunosuppression. There are few studies that correlate tryptophan metabolites to the immunopathogenesis of canine VL. Therefore, the aim of this study was to compare the skin lesions with the parasite load, with the immunodetection of tryptophan by-products of the kynurenine pathway (kynurenic acid and quinolinic acid), Treg lymphocytes, immature and mature dendritic cells (CD11 and CD83 respectively), IL-10 and M1 and M2 macrophages. For this, skin fragments (ear tip and nasal plane) of 30 dogs with VL (infected group) and 05 uninfected dogs (control group) were used, which were submitted to immunohistochemical analysis. All these variables were increased in the infected group, except for M1 and CD83, which did not differ statistically between the groups, both in the ear and in the nasal plane. In the infected group, there was a higher proportion of M2 macrophages, immature dendritic cells, quinolinic and kynurenic acid, IL10 and Treg lymphocytes, which indicates the predominance of a Th2 immune response, inhibition of T lymphocyte activation and efficient antigen presentation. Tryptophan metabolites in the skin microenvironment had an immunosuppressive role during Leishmania infantum infection, possibly contributing to the persistence of the infection in the skin and the systemic distribution of the parasite.

Submitted by Giovanna Valle Germano (giovanna.valle@unesp.br) on 2022-03-03T09:36:44Z No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado Giovanna versao final revisada.pdf: 1195596 bytes, checksum: 8396b18cbd4f884f1f109966b0d00f67 (MD5) Rejected by Elida Daniele de Antonio null (elida_daniele@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: Problema 1: Folha em branco No arquivo submetido consta uma folha em branco após a página de rosto. Favor verificar e corrigir. Problema 2: Financiamento Fapesp No arquivo submetido consta financiamento Fapesp, mas no formulário você só coloca o número do processo, não selecionou a agência. Favor verificar e corrigir. Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão on 2022-03-03T12:51:23Z (GMT) Submitted by Giovanna Valle Germano (giovanna.valle@unesp.br) on 2022-03-03T15:49:20Z No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado Giovanna versao final revisada.pdf: 1194931 bytes, checksum: e09d9a6010252f9724bd6dba8d47053b (MD5) Approved for entry into archive by Elida Daniele de Antonio null (elida_daniele@btu.unesp.br) on 2022-03-03T16:41:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 germano_gv_dr_bot.pdf: 1194931 bytes, checksum: e09d9a6010252f9724bd6dba8d47053b (MD5) Made available in DSpace on 2022-03-03T16:41:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 germano_gv_dr_bot.pdf: 1194931 bytes, checksum: e09d9a6010252f9724bd6dba8d47053b (MD5) Previous issue date: 2022-01-29 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) A hanseníase é considerada ainda um problema de saúde pública com mais de 200.000 novos casos detectados em 2019, sendo 27.863 no Brasil. Causada pelo Mycobacterium leprae, patógeno intracelular obrigatório, a hanseníase quando não tratada pode resultar em incapacidades físicas permanentes devido a tropismo do bacilo por células de Schwann dos nervos periféricos. É uma doença espectral com duas formas polares estáveis e três intermediárias instáveis, sendo o polo tuberculoide caracterizado pelo predomínio de resposta imune celular e doença localizada, enquanto o polo virchowiano apresenta elevada resposta humoral e doença disseminada. As células dendríticas (DCs) ativam a resposta imune específica, portanto a expressão de moléculas coestimulatórias e as citocinas liberadas pelas DCs durante a infecção pelo M. leprae determinam o perfil de resposta imune gerado e podem prevenir ou favorecer sua sobrevivência e disseminação. O objetivo deste estudo foi analisar o perfil de ativação de DCs derivadas de pacientes com hanseníase infectadas por M. leprae viável bem como sua capacidade de ativar linfócitos (LFs) autólogos. DCs foram diferenciadas a partir de monócitos de sangue periférico de controles saudáveis (CS), pacientes tuberculoides (6 tuberculoide-tuberculoides e 2 dimorfo-tuberculoides) e virchowianos (5 virchowiano-virchowianos e 5 dimorfo-virchowianos) empregando GM-CSF e IL-4. As DCs foram estimuladas por (i) M. leprae vivo na multiplicidade de 10:1 (bacilos:DC, MLDCs); (ii) coquetel de maturação padrão (CQM) composto por IL-1β, IL-6, TNF, PGE2 (mDCs); ou (iii) permaneceram não estimuladas (iDCs) por 48 horas. Após o estímulo, as DCs foram co-cultivadas com LFs por cinco dias. O estímulo de DCs com M. leprae viável não induziu expressão de moléculas coestimulatórias e levou à produção de baixos níveos de IL-1β, IL-6, TNF e IL-23 tanto em pacientes quanto em controles. DCs de pacientes virchowianos produziram mais IL-1β frente ao M. leprae do que aquelas de pacientes tuberculoides e maiores quantidades de IL-23 e IL-10 comparado aos controles. Independente da forma clínica da hanseníase, DCs de pacientes produziram menos IL-12p70 em resposta ao M. leprae do que DCs de controles saudáveis. Quanto à ativação dos LFs, verificamos que pacientes virchowianos apresentaram menor proliferação e produziram níveis menores de IL-2 após estímulo com M. leprae. A produção de IFN-, TNF, IL-9 e IL-22 nas culturas de MLDCs e LFs foi semelhante à encontrada quando iDCs foram empregadas e menor do que observado em culturas com mDCs. Nos pacientes virchowianos a frequência de LFs IL-4+ foi maior em paralelo com menor número de LFs expressando IFN- e IL-17A nas culturas estimuladas com MLDCs quando comparados com controles saudáveis. Em conjunto, nossos dados sugerem que o M. leprae é um fraco ativador de DCs, o que compromete a capacidade destas células induzirem a ativação de LFs autólogos. Pacientes com hanseníase virchowiana apresentam menor frequência de LFs produtores de citocinas de perfil Th1 e Th17 após estímulo com M. leprae o que pode contribuir para a persistência do bacilo. Leprosy is still considered a public health problem with more than 200,000 new cases detected in 2019, being 27,863 registered in Brazil. Caused by Mycobacterium leprae, an obligate intracellular pathogen, leprosy can result in permanent physical disabilities when untreated due to the tropism of the bacillus by Schwann cells from peripheral nerves. It is a spectral disease presenting two polar stable forms and three intermediate unstable forms. Tuberculoid pole is characterized by the predominant cell-mediated immune response and localized disease while lepromatous pole shows prevalent humoral response and disseminated disease. Dendritic cells (DCs) activate specific immune responses, so the pattern of costimulatory molecules expressed, and the cytokines released by DCs during M. leprae infection determine the profile of immune response generated that can prevent or favor its survival and dissemination. This study aimed to analyze the profile of DCs derived from leprosy patients infected with viable M. leprae as well as their ability to activate autologous lymphocytes. DCs were differentiated from peripheral blood monocytes of healthy controls, tuberculoid (6 tuberculoid-tuberculoid and 2 borderline-tuberculoid) and lepromatous (5 lepromatous-lepromatous and 5 borderline-lepromatous) leprosy patients employing GM-CSF and IL-4. DCs were stimulated by (i) live M. leprae at a multiplicity of 10:1 (bacilli:DC, MLDCs); (ii) standard maturation cocktail (CQM) composed by IL-1β, IL-6, TNF, PGE2 (mDCs); or (iii) remained unstimulated (iDCs) for 48 hours. After stimulation, DCs were cultured with lymphocytes for five days. Stimulation of DCs with viable M. leprae did not induce the expression of costimulatory molecules but stimulated the production of low levels of IL-1β, IL-6, TNF and IL-23 in both patients and controls. DCs from lepromatous patients produced more IL-1β against M. leprae than those from tuberculoid patients and greater amounts of IL-23 and IL-10 compared to healthy controls. Regardless of the clinical form of leprosy, DCs from leprosy patients produced fewer IL-12p70 in response to M. leprae than DCs from healthy controls. Considering the activation of lymphocytes, we found that lepromatous patients showed lower proliferation and produced lower levels of IL-2 after stimulation with M. leprae. The production of IFN-, TNF, IL-9 and IL-22 in cultures of MLDCs and lymphocytes was similar to that found when iDCs were used and lower than that observed in cultures with mDCs. In lepromatous patients the frequency of IL-4+ lymphocytes were higher in parallel with a lower number of lymphocytes expressing IFN- and IL-17A in cultures stimulated with MLDCs when compared to healthy controls. Together, our data suggest that M. leprae is a weak activator of DCs, which compromises the ability of these cells to induce the activation of autologous lymphocytes. Lepromatous leprosy patients had a lower frequency of lymphocytes producing Th1 and Th17 cytokines after stimulation with M. leprae, which may contribute to the persistence of the bacillus. FAPESP: 15/23256-6

Background Immediate drug hypersensitivity reactions (IDHRs) to clavulanic acid (CLV) have increased in the last decades due to a higher consumption alongside amoxicillin (AX). Due to its chemical instability, diagnostic procedures to evaluate IDHRs to CLV are difficult, and current in vitro assays do not have an optimal sensitivity. The inclusion of the specific metabolites after CLV degradation, which are efficiently recognised by the immune system, could help to improve sensitivity of in vitro tests. Methods Recognition by dendritic cells (DCs) of CLV and the synthetic analogues of two of its hypothesised antigenic determinants (ADs) was evaluated by flow cytometry in 27 allergic patients (AP) and healthy controls (HC). Their ability to trigger the proliferation of T cells was also analysed by flow cytometry. Results The inclusion of synthetic analogues of CLV ADs, significantly increased the expression of maturation markers on DCs from AP compared to HC. A different recognition pattern could be observed with each AD, and, therefore, the inclusion of both ADs achieves an improved sensitivity. The addition of synthetic ADs analogues increased the proliferative response of CD4+Th2 compared to the addition of native CLV. The combination of results from both ADs increased the sensitivity of proliferative assays from 19% to 65% with a specificity higher than 90%. Conclusions Synthetic ADs from CLV are efficiently recognised by DCs with ability to activate CD4+Th2 cells from AP. The combination of analogues from both ADs, significantly increased the sensitivity of DC maturation and T-cell proliferation compared to native CLV. This work has been supported by Institute of Health ‘Carlos III’ (ISCIII) of the Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO) (grants co-funded by European Regional Development Fund: PI15/01206, PI17/01237, PI18/00095, PI20/01734, RETICS ARADYAL RD16/0006/0001); Andalusian Regional Ministry of Health (grants PI-0241-2016, PE-0172-2018, PI-0127-2020); Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (Proyectos de I+D+I «Programación Conjunta Internacional», EuroNanoMed 2019 (PCI2019-111825-2), Ministerio de Ciencia y Educación (PID2019-104293GB-I00), Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) of MINECO (RD16/0006/0012), Junta de Andalucía ( PY20_00384 ). AA and NPS hold Senior Postdoctoral Contracts (RH-0099-2020 and RH-0085-2020) from Andalusian Regional Ministry of Health (cofunded by European Social Fund (ESF): ‘Andalucía se mueve con Europa’). JLP holds a Sara Borrell fellowship (CD19/00250) by ISCIII of MINECO (cofunded by ESF, “El FSE invierte en futuro”). GB holds a ‘Juan Rodes’ contract (JR18/00054) by ISCIII of MINECO (cofunded by ESF). MIM holds a ‘Miguel Servet II’ grant (CPII20/00028) by ISCIII of MINECO (cofunded by ESF). ML holds a ‘Rio Hortega’ contract (CM20/00210) by ISCIII of MINECO (cofunded by ESF). CM holds a ‘Nicolas Monardes’ research contract by Andalusian Regional Ministry Health (RC-0004-2021). NMR experiments for characterizing molecule structures have been performed in the ICTS ‘NANBIOSIS’, by the U28 Unit at the Andalusian Centre for Nanomedicine and Biotechnology (BIONAND). Funding for open access charge: Universidad de Málaga

L'esclerosi múltiple (EM) és la malaltia inflamatòria més freqüent del sistema nerviós central (SNC). Tot i que sabem que es tracta d'una malaltia immunomediada, avui dia molts dels mecanismes implicats en la seva patogènia continuen sent desconeguts. És precisament això el que dificulta trobar la curació de la malaltia. En les darreres 2 dècades s'han comercialitzat uns 10 fàrmacs immunosupressors o immunomoduladors amb diferents mecanismes d'acció que ens permeten controlar l'activitat inflamatòria, però malgrat això molts pacients experimenten progressió de la malaltia. D'altra banda, aquests fàrmacs tenen riscos potencialment greus que els pacients han d'assumir. En aquest context emergeixen les teràpies cel·lulars com a tractaments que ens permeten abordar la malaltia des del seu origen, intentant reparar la disfunció del sistema immune sense afectar la immunitat protectora. Fa més d'una dècada que el nostre equip investiga en el desenvolupament d'una teràpia basada en cèl·lules dendrítiques tolerogèniques (CDtol) per a pacients amb EM. Els estudis realitzats in vitro i in vivo al model animal van apuntar que la teràpia podia ser beneficiosa per al control de la malaltia. Per això es va posar en marxa un assaig clínic fase I en pacients amb EM per avaluar la seguretat de la teràpia cel·lular amb CDtol tractades amb vitamina D3 (CDtol-VitD3) i carregades amb pèptids de mielina administrada directament als ganglis limfàtics cervicals. Els resultats derivats d'aquest assaig clínic, descrits en aquesta tesi doctoral, confirmen que l'administració intraganglionar de la nostra teràpia cel·lular amb CDtol-VitD3 és segura i ben tolerada. El benefici terapèutic serà determinat en futurs assaigs de fase II. La esclerosis múltiple (EM) es la enfermedad inflamatoria más frecuente del sistema nervioso central (SNC). Aunque sabemos que se trata de una enfermedad inmunomediada, a día de hoy muchos de los mecanismos implicados en su patogenia siguen siendo desconocidos. Es precisamente esto lo que dificulta encontrar la curación de la enfermedad. En las últimas 2 décadas se han comercializado unos 10 fármacos inmunosupresores o inmunomoduladores con diferentes mecanismos de acción que nos permiten controlar la actividad inflamatoria, pero a pesar de ello, muchos pacientes experimentan progresión de la enfermedad. Por otra parte, estos fármacos tienen riesgos potencialmente graves que los pacientes deben asumir. En este contexto emergen las terapias celulares como tratamientos que nos permiten abordar la enfermedad desde su origen, intentado reparar la disfunción del sistema inmune sin afectar la inmunidad protectora. Nuestro equipo lleva más de una década investigando en el desarrollo de una terapia basada en células dendríticas tolerogénicas (CDtol) para pacientes con EM. Los estudios realizados in vitro e in vivo en el modelo animal apuntaron que la terapia podía ser beneficiosa para el control de la enfermedad. Por ello se puso en marcha un ensayo clínico fase I en pacientes con EM para evaluar la seguridad de la terapia celular con CDtol tratadas con vitamina D3 (CDtol-VitD3) y cargadas con péptidos de mielina administrada directamente en los ganglios linfáticos cervicales. Los resultados derivados de este ensayo clínico, descritos en la presente tesis doctoral, confirman que la administración intraganglionar de nuestra terapia celular con CDtol-VitD3 es segura y bien tolerada. El beneficio terapéutico será determinado en futuros ensayos de fase II. Multiple sclerosis (MS) is the most common inflammatory disease of the central nervous system (CNS). Although we know that it is an immune-mediated disease, today many of the mechanisms involved in its pathogenesis remain unknown. It is precisely this, which makes it difficult to find a cure for the disease. In the last 2 decades, some 10 immunosuppressive or immunomodulatory drugs have been marketed with different mechanisms of action that allow us to control inflammatory activity but, despite this, many patients experience progression of the disease. On the other hand, these drugs have potentially serious risks which patients must assume. In this context, cell therapies emerge as treatments that allow us to address the disease from its origin, trying to repair the dysfunction of the immune system, without affecting protective immunity. Our team has spent more than a decade researching the development of a tolerogenic dendritic cell (tolDC)-based therapy for MS patients. The studies carried out in vitro and in vivo in the animal model, pointed out that the therapy could be beneficial for the control of the disease. For this reason, a phase I clinical trial was launched to assess the safety of cell therapy with tolDC treated with vitamin D3 (tolDC-vitD3) and loaded with myelin peptides for patients with MS administrated directly in the cervical lymph nodes. The results derived from this clinical trial, described in this doctoral thesis, confirm that the intranodal administration of our cell therapy with tolDC-vitD3 is safe and well tolerated. The therapeutic benefit will be determined in future phase II trials.

Esta tesis trata sobre el estudio lipidómico de la activación y maduración de células dendríticas y el efecto del ácido araquidónico y de los isómeros del ácido hexadecenoico., Doctorado en Investigación Biomédica

Orientadores: Fernanda Loureiro de Andrade Orsi, Bruna de Moraes Mazetto Fonseca Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O risco trombótico na síndrome antifosfolípide (SAF) é conferido pela associação dos anticorpos antifosfolípides (aPL) com estímulo pró-coagulante adicional, como a inflamação. Dentre as respostas inflamatórias, a produção de grandes quantidades de interferon (IFN)-1 pelas células dendríticas plasmocitóides (pDCs) faz parte da fisiopatologia dos distúrbios autoimunes sistêmicos, o que levanta a hipótese de que esse mecanismo também possa estar associado às manifestações vasculares da SAF. Este projeto teve como objetivo avaliar a associação entre pDCs e produção de IFN-1 com SAF trombótica. Foram incluídos pacientes com SAF trombótica (SAF-t) primária e secundária, portadores de aPL assintomáticos e indivíduos sem trombose (controles). A contagem de pDCs em sangue periférico e a expressão intracelular de IFN-? (na presença ou não de estímulo com oligodesoxinucleotídeos [CPG]) foram quantificadas por citometria de fluxo. A expressão de cinco genes indutores de IFN-I: ISG15, OASL, Ly6E, MX1 e OAS1 em células mononucleares foi determinada por qPCR. As diferenças entre os grupos foram avaliadas por testes qui-quadrado ou Kruskal-Wallis. Um total de 50 pacientes com SAF-t secundária, 50 pacientes com SAF-t primária, 20 portadores assintomáticos de aPL e 50 indivíduos sem trombose foram incluídos. A expressão intracelular de IFN-? foi aumentada após estimulação com CPG na SAF-t secundária (1,56%; IQR 1,07-2,02) e SAF-t primária (0,96%; IQR 0,55-1,24), quando comparados aos portadores de aPL (0,71%; IQR 0,42-0,93) e controles (0,48%; IQR 0,24-0,78; P

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2021 Resumen: La evidencia acumulada a lo largo de las últimas décadas demuestra una estrecha interrelación entre los sistemas neuroendócrino e inmune. Con el fin de mantener la homeostasis del organismo y dirigir respuestas coordinadas frente a los distintos desequilibrios y patologías, ambos sistemas se encuentran en constante comunicación a través de una variedad de citoquinas, hormonas, neurotransmisores y sus receptores. En los últimos años el estudio de la relación entre las hormonas tiroideas (HTs) y el sistema inmune ha tomado relevancia. Sin embargo, la comprensión de la conexión entre las HTs y el sistema inmune es todavía incompleta debido a la complejidad de cada sistema y más aún a su interacción. Actualmente las HTs son reconocidas por desempeñar un rol esencial en las células de la inmunidad innata y adaptativa, y sus respuestas asociadas. El papel de las HTs en el inicio de la respuesta inmune y su efecto en el direccionamiento de la respuesta inmune adaptativa fue abordado hace poco más de una década. En este sentido el laboratorio donde se desarrolló esta tesis doctoral reportó los primeros hallazgos del efecto de triiodotironina (T3) sobre las características y funcionalidad de las Células Dendríticas (DCs), consideradas las principales células presentadoras de antígenos. En este contexto, se evidenció por primera vez la expresión de receptores de HTs (TR) en DCs murinas, principalmente la isoforma β1. Además, se demostró que niveles fisiológicos de la HT activa, T3, inducen la maduración de DCs y su capacidad de secreción de IL-12. A su vez, las DCs estimuladas con T3 incrementaron la capacidad aloestimulatoria de linfocitos T, direccionando la respuesta inmune hacia los perfiles proinflamatorios T helper 1 (Th1), Th17 y citotóxicos con aumentada producción de la citoquina efectora IFN-. Asimismo, el tratamiento de las DCs con T3 aumentó significativamente la producción de las citoquinas TNF-α, IL-6 e IL-23, involucradas en la producción de IL-17 y disminuyó la población de células T regulatorias. Por otro lado, T3 fue capaz de reducir la apoptosis de DCs y aumentar su migración hacia los ganglios linfáticos. Considerando estos resultados se desarrolló una vacunación antitumoral basada en DCs estimuladas con T3 en un modelo tumoral de melanoma. Este tratamiento fue capaz de aumentar el porcentaje de animales libres de tumor, retrasar la aparición y disminuir el volumen del tumor en los ratones afectados, aumentando la sobrevida de los mismos. Sobre la base de los antecedentes presentados, esta tesis doctoral implica la profundización del efecto de las HTs sobre la inducción de respuestas inmunes adaptativas a través de las DCs como objetivo general. En lo particular, este trabajo abordó 2 objetivos específicos: 1) Desarrollo de una estrategia de vacunación para el tratamiento antitumoral basada en la manipulación de DCs estimuladas con T3 expuestas a antígenos asociados al tumor (AATs) y 2) Estudio de los efectos de T3 sobre las características y funcionalidad de las DCs humanas. 1) Los resultados obtenidos en la primera parte de este trabajo de tesis doctoral indicaron, por un lado, que el tratamiento con T3 no modifica la capacidad de captación antigénica de las DCs frente a antígenos propios del tumor, sin embargo, esta hormona es capaz de incrementar la expresión del marcador de maduración CD86. Además, se evidenció un marcado aumento por parte de las DCs en la producción de citoquinas proinflamatorias, como IL-12, IL-6 y TGF- luego de ser tratadas con T3. En el modelo murino de carcinoma de colon, T3 potenció los efectos antitumorales de la vacunación a base de DCs cargadas con antígenos tumorales, evidenciados por una reducción en el tamaño tumoral. En efecto, la respuesta inmune generada por la inmunoterapia basada en DCs estimuladas con T3 consistió en un marcado incremento en las poblaciones Th1 (CD4+ IFN-+), Th17 (CD4+ IL-17+), como así también en las células T citotóxicas CD8+ IFN-+, y citotóxicas 17 (Tc17), acompañada por un incremento en la secreción de IFN- e IL-17. Teniendo en cuenta estos resultados y los antecedentes del grupo que relacionan estrechamente la estimulación de las DCs con T3 con una mayor producción de IL-17, sumado a las controversias bibliográficas relacionadas al papel de esta citoquina en cáncer, decidimos analizar la importancia de IL-17 como mediador de los efectos inmunoterapéuticos en nuestro tratamiento antitumoral. Para ello evaluamos el crecimiento tumoral en ratones IL-17 A/F-doble Knockout (IL-17KO), aplicando el mismo esquema de vacunación y comparando dicho crecimiento en ratones Wild Type (WT) como control. De este modo, pudimos evidenciar que la ausencia de IL-17 en los ratones IL-17KO conduce a un mayor crecimiento tumoral, dado que observamos un significativo aumento del volumen del tumor, al comparar los ratones transgénicos que fueron vacunados con DCs cargadas con AATs y tratadas con T3, con aquellos animales WT que recibieron el mismo tratamiento. A su vez, observamos que IL-17 presentaría un rol en la angiogénesis tumoral, lo que favorecería la reducción del tumor por la inmunoterapia basada en DCs estimuladas con T3 en el modelo de carcinoma de colon MC38. En conclusión, los resultados aquí presentados refuerzan los conocimientos de las propiedades adyuvantes de T3 para su utilización en la vacunación antitumoral basada en DCs, y profundizan en los mecanismos involucrados en el desarrollo de una respuesta inmune eficiente luego de la vacunación. 2) Los resultados obtenidos en la segunda parte de este trabajo de tesis doctoral demuestran que concentraciones fisiológicas de T3 tienen efectos inmunomoduladores sobre las DCs diferenciadas a partir de monocitos de sangre periférica (huDCs). Esto fue evidenciado por una mayor expresión de la molécula CD86 en la superficie celular y una tendencia a incrementar en el porcentaje de células CD11c+ HLA-DR+ luego del tratamiento con la hormona. Por otro lado, se demostró que la presencia de T3 es capaz de inducir una mayor producción de la citoquina proinflamatoria IL-12 por parte de las huDCs. Estos resultados iniciales aportan en el conocimiento del efecto de T3 sobre la maduración y la activación de DCs humanas, induciendo la liberación de IL-12 por parte de estas células, y probablemente favoreciendo la polarización de la respuesta inmune hacia un perfil proinflamatorio. Estos hallazgos son prometedores y alientan la profundización del estudio del efecto de T3 sobre DCs humanas, aspecto muy poco explorado y de trascendencia considerando la potencial transferencia de los resultados obtenidos en modelos murinos a la oncología humana. 2023-09-30 Fil: Soler, María Florencia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Montesinos, María Del Mar. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Montesinos, María del Mar. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigación en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Porporatto, Carina. Universidad Nacional de Villa María. Instituto de Investigación; Argentina. Fil: Porporatto, Carina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones y Transferencia de Villa María; Argentina. Fil: Ropolo, Andrea Silvana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Ropolo, Andrea Silvana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina. Fil: Pellizas, Claudia Gabriela. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Pellizas, Claudia Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Toscano, Marta Alicia. Salta. Gobierno de la Provincia de Salta. Ministerio de Salud Pública. Hospital Doctor Arturo Oñativia. Laboratorio de Biología Molecular y Citogenética; Argentina.

gráficas, ilustraciones, tablas Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es uno de los patógenos más exitosos de la humanidad, siendo el principal causante de tuberculosis, responsable del mayor número de muertes a nivel mundial por un agente infeccioso, estimándose que un tercio de la población mundial es portadora del bacilo. La adaptación evolutiva de este patógeno se debe principalmente a su habilidad para evadir el sistema inmune del hospedero, evitando que éste despliegue una respuesta inmune efectiva en casos donde se desarrolla tuberculosis activa. Es así como se hace necesario mejorar el reconocimiento del patógeno por actores del sistema inmune para lo cual se pueden emplear células dendríticas (CDs) derivadas por métodos estándares con 1,25 ng/mL IL-4 y 2,5 ng/mL GM-CSF fueron pulsados con péptidos sintéticos (n=114) provenientes de proteínas (n=16) involucradas en la interacción micobacteria-hospedero, los cuales han sido modificados en la secuencia de aminoácidos; los cambios estratégicos permiten una mayor interacción con el CMH-II del hospedero y de esta manera hacen que los péptidos sean más inmunogénicos que las secuencias nativas. Esta interacción permite entrar en contacto con linfocitos TCD4+ lo que se evaluó mediante la expansión clonal de células de memoria; además estos linfocitos permitieron el control del crecimiento intracelular de Mtb en macrófagos infectados. Este trabajo contribuye así a que empleando péptidos modificados considerados como candidatos vacunales contra tuberculosis y presentados por CDs, se pueda aumentar la respuesta inmunológica del individuo y llegar a contribuir en el control de la infección por Mtb mediante la presentación antigénica a linfocitos TCD4+ conocidos como los mayores efectores en la inmunidad contra tuberculosis.(Texto tomado de la fuente) Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is one of the most successful pathogens of humanity, being the main cause of tuberculosis, responsible for the highest number of deaths worldwide by an infectious agent that estimates a third of the world's population is a carrier of the bacillus. The evolutionary adaptation of this pathogen is mainly due to its ability to evade the host's immune system, preventing it from displaying an effective immune response in cases where active tuberculosis develops. This is how it is necessary to improve the recognition of the pathogen by actors of the immune system for which dendritic cells (DC). That was how, DC’s were derived by standard methods with 1,25 ng/mL IL-4 and 2,5 ng/mL GM-CSF were pulsed with synthetic peptides (n=114) from proteins (n=16) involved in the mycobacterial-host interaction, which have been modified in the amino acid sequence; the strategic changes allow greater interaction with the host MHC-II and thus make the peptides more immunogenic than the native sequences. This interaction allows contact with TCD4+ lymphocytes, which is evaluated by clonal expansion of memory; in addition, these lymphocytes allowed the control of the intracellular growth of Mtb in infected macrophages. This work thus contributes to the fact that using peptides modified specifically as vaccine candidates against tuberculosis and pulsed by CD, can increase the individual's immune response, and contribute to the control of Mtb infection by antigenic presentation to TCD4+ lymphocytes known as major effectors in immunity against tuberculosis. Maestría Magister en Bioquímica Tuberculosis

Producción Científica, Murine dendritic cells, when pulsed with heat-killed Burkholderia pseudomallei and used to immunise naïve mice, have previously been shown to induce protective immunity in vivo. We have now demonstrated the in vitro priming of naïve human T cells against heat-killed B. pseudomallei, by co-culture with syngeneic B. pseudomallei-pulsed dendritic cells. Additionally, we have enriched the DC fraction such that a study of the differential response induced by pulsed DCs of either myeloid or plasmacytoid lineage in syngeneic human T cells was achievable. Whilst both mDCs and pDCs were activated by pulsing, the mDCs contributed the major response to B. pseudomallei with the expression of the migration marker CCR7 and a significantly greater secretion of the proinflammatory TNFα and IL1β. When these DC factions were combined and used to prime syngeneic T cells, a significant proliferation was observed in the CD4+ fraction. Here, we have achieved human T cell priming in vitro with unadjuvanted B. pseudomallei, the causative organism of melioidosis, for which there is currently no approved vaccine. We propose that the approach we have taken could be used to screen for the human cellular response to candidate vaccines and formulations, in order to enhance the cell-mediated immunity required to protect against this intracellular pathogen and potentially more broadly against other, difficult-to-treat intracellular pathogens. To date, the polysaccharide capsule of B. pseudomallei, fused to a standard carrier protein, e.g., Crm, looks a likely vaccine candidate. Dendritic cells (DCs), providing, as they do, the first line of defence to infection, process and present microbial products to the immune system to direct downstream immune responses. Here, we have sought to use DCs ex vivo to identify immunogenic products from heat-killed B. pseudomallei. Using practical volumes of fresh human donor blood, we show that heat-killed B. pseudomallei activated and stimulated the expression of pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6 from both myeloid and plasmacytoid DCs. Furthermore, B. pseudomallei-pulsed DCs cultured with naïve syngeneic T cells ex vivo, induced the activation and proliferation of the CD4+ T-cell population, which was identified by cell surface marker staining using flow cytometry. Thus, both DC subsets are important for driving primary T helper cell responses to B. pseudomallei in healthy individuals and have the potential to be used to identify immunogenic components of B. pseudomallei for future therapies and vaccines., Ministerio de Defensa de Reino Unido - Defence Science and Technology Laboratory (Dstl) - (grant DSTL/AGR/00254/01)

INTRODUÇÃO: As células dendríticas são uma das pontes entre as respostas imunológicas inata e adaptativa e ainda contribuírem no desenvolvimento de uma resposta especializada para cada tipo de tumor. No começo dos anos 2000 alguns pesquisadores levantaram a hipótese de as células dendríticas serem usadas no tratamento de alguns tipos de canceres como imunoterapia. Muitos resultados positivos foram alcançados desde então e a imunoterapia com células dendríticas contra o câncer foi estabelecida como uma imunoterapia tão eficiente quanto eficaz. OBJETIVOS: Para melhor entendermos a dinâmica que envolve os mecanismos pelos quais a imunoterapia com células dendríticas influência na resposta imunológica avaliamos linfonodos e tumores de camundongos induzidos a desenvolver tumor tratados com imunoterapia de células dendriticas. METODOLOGIA: foram utilizados 70 camundongos isogênicos da linhagem Balb/c e para indução tumoral 5x105 de células de carcinoma mamário de camundongos Balb/c 4T1 foram injetado por animal. Estes animais foram utilizados para avaliarmos de maneira dinâmica a influência da imunoterapia no sistema imunológico dividimos estes animais em grupos 7 e 14 dias após a primeira dose da imunoterapia com células dendríticas. Ao final ficamos com 7 grupos experimentais: GI – grupo controle, GII – grupo controle CD 7 dias, GIII – grupo tumor 7 dias, GIV – grupo tumor CD 7 dias, GV – grupo controle CD 14 dias, GVI – grupo tumor 14 dias, GVII – grupo tumor CD 14 dias. RESULTADOS: Durante o período experimental o volume do tumor foi medido periodicamente e notamos que o desenvolvimento tumoral foi menor no grupo tumor CD (0,0003988mm3 - 0,2670mm3 ) quando comparado ao grupo tumor (0,03703mm3 - 0,2670mm3 ). Notamos ainda através do qPCR que a expressão do fatore de transcrição T-bet de perfil de células Th1, aquele que induz o combate ao tumor de maneira eficaz é maior no grupo tumor CD em 14 dias (1,83) quando comparado ai grupo tumor (1,08). Já o fator de transcrição de células Treg, FOXP3, é maior no grupo tumor tanto em 7 (3,85) quanto em 14 (20,73) dias quando comparado ao grupo tumor tratado em 7 (2,32) e 14 (2,16) dias; mostrando um cenário de difícil reversão. Através de imunofluorescência encontramos maior intensidade média de fluorescência de MHCI e moléculas coestimulatorias nos linfonodos do grupo tumor CD em 14 dias quando comparado ao grupo tumor. Observamos também que moléculas de adesão podem frente a estímulos diferentes durante a imunoterapia, notamos que ICAM1 tinha maior MFI nos linfonodos do grupo tumor tanto em 7 (79,32) quanto em 14 (147,3) dias quanto comparados ao grupo tratado 7 (39,59) e 14 (81,49) dias, já ICAM2 teve maior MFI nos linfonodos do grupo tumor CD em 14 (66,52) dias quando comparado ao grupo tumor 14 dias (56,4). CONCLUSÃO: Concluímos que a imunoterapia de células dendríticas no combate ao câncer, já comprovadamente eficaz, inicia o processo de modulação do sistema imunológico em 7 dias, porém com 14 dias a modulação é se torna mais eficaz. Para melhor entendimento deste mecanismo e melhoramento dos protocolos de vacinação mais estudos que analisem de forma dinâmica a resposta imunológica frente ao câncer deve ser realizados e outras moléculas devem ser analisadas. INTRODUCTION: Dendritic cells are one of the bridges between innate and adaptive immune responses and also contribute to the development of a specialized response for each type of tumor. In the early 2000s, some researchers hypothesized that dendritic cells could be used as immunotherapies in the treatment of some types of cancer. Promising results have been achieved since then and immunotherapy with dendritic cells against cancer has been established as an immunotherapy as efficient as it is effective. OBJECTIVES: To better understand the dynamics surrounding the mechanisms by which immunotherapy with dendritic cells influences the immune response, we evaluate lymph nodes and tumors of mice induced to develop tumors treated with dendritic cell immunotherapy. METHODOLOGY: 70 isogenic mice of the Balb/c lineage were used and for tumor induction 5x105 of mammary carcinoma cells of Balb/c mice were (4T1) injected per animal. These animals were used to dynamically assess the influence of immunotherapy on the immune system. We divided these animals into groups 7 and 14 days after the first dose of immunotherapy with dendritic cells. Then we have 7 experimental groups: GI - control group, GII - control group CD 7 days, GIII - tumor group 7 days, GIV - tumor group CD 7 days, GV - control group CD 14 days, GVI - tumor group 14 days, GVII - CD tumor group 14 days. RESULTS AND DISCUSSION: During the experimental period, the tumor volume was measured periodically and we noticed that the tumor development was lower in the CD tumor group (0.0003988mm3 - 0.2670mm3) when compared to the tumor group (0.03703mm3 - 0.2670mm3). We also noticed through the qPCR that the expression of the T-bet transcription factor of the Th1 cell profile, the one that effectively induces the fight against the tumor is greater in the CD tumor group in 14 days (1.83) when compared to the tumor group (1.08). The Treg cell transcription factor, FOXP3, is higher in the tumor group both in 7 (3.85) and in 14 (20.73) days when compared to the tumor group treated in 7 (2.32) and 14 (2 ,16 days; showing a scenario of difficult reversal. Through immunofluorescence, we found a higher mean fluorescence intensity of MHCI and co-stimulatory molecules in the lymph nodes of the CD tumor group in 14 days when compared to the tumor group. We also observed that adhesion molecules can face different stimuli during immunotherapy, we noticed that ICAM1 had a higher MFI in the lymph nodes of the tumor group both in 7 (79.32) and in 14 (147.3) days as compared to the treated group 7 ( 39.59) and 14 (81.49) days, ICAM2 had higher MFI in the lymph nodes of the CD tumor group in 14 (66.52) days when compared to the tumor group 14 days (56.4). CONCLUSION: We conclude that immunotherapy with dendritic cells in the fight against cancer, already proven effective, starts the process of modulating the immune system in 7 days, however with 14 days the modulation becomes more effective. For a better understanding of this mechanism and improvement of vaccination protocols, further studies that dynamically analyze the immune response to cancer should be performed and other molecules should be analyzed.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2016. As células dendríticas (DCs) são um dos mais importantes componentes do sistema imunológico e desempenham funções essenciais como reconhecimento do antígeno no local da infecção bem como sua internalização e apresentação de forma eficiente. Estas células tem papel central na ligação das respostas imunes naturais e adquiridas contra Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas. As DCs podem modular a resposta imunológica do hospedeiro, dependendo da sua subpopulação, do seu nível de maturação, das citocinas presentes no meio e do receptor dessas células envolvido nas interações com o T. cruzi, influenciando o desenvolvimento das formas clínicas da doença. Dentro desde contexto, esta dissertação apresenta a padronização da obtenção de DCs provenientes de monócitos de três doadores voluntários e otimização da diferenciação da forma tripomastigota metacíclica (TM) do parasito in vitro para posterior interação entre ambas as células e extração do RNA total para sequenciamento e montagem do transcriptoma por duplicata. Entre as cepas G e CL Brener de T. cruzi, a 2ª mostrou um melhor rendimento no que diz respeito a velocidade de crescimento em cultura, porcentagens finais de metaciclogênese e taxa de infecção. Durante a obtenção e diferenciação das DCs, três técnicas foram aplicadas para confirmação, incluindo citometria de fluxo, visualização em microscópio óptico e de fluorescência. O tempo estabelecido para interação parasito-célula hospedeira foi de 12 h, depois de transcorrido esse tempo obteve-se 39% de taxa de infecção, média de 2,4 amastigotas/DC infectada e 80% de DCs infectadas ativadas contra 47% das células controle. O passo seguinte foi a extração do RNA total das amostras controle e infectadas para sequenciamento e a montagem dos reads. Os resultados provenientes deste processo mostram ser confiáveis devido à cobertura satisfatória dos reads dentro do genoma humano com ~23.000.000 reads por amostra, e ao coeficiente de correlação próximo a 1 entre as duplicatas, fortes indícios da qualidade dos dados. A obtenção de uma visão detalhada da biologia das células apresentadoras de antígenos após os contatos iniciais com T. cruzi poderá proporcionar novos alvos para o tratamento da doença e ajudará no entendimento da evolução diferencial da doença nos pacientes e nos mecanismos de resistência e tolerância ao T. cruzi. Dendritic cells (DCs) are one of the most important components of human immunologic system and are able to develop essential functions like antigen recognition at the infection site and its internalization and presentation are accomplished with high efficiency. These cells play a central role in linking natural and acquired immune response against Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. DCs can modulate host immunologic response depending on their subset, maturation level, cytokine milieu and DC receptor involved in the interactions with T. cruzi, influencing the development of the disease clinic forms. Therefore, this dissertation presents the standardization of DCs derived from monocyte obtained from three voluntaries and the optimization of in vitro metacyclic trypomastigote form differentiation to proceed to interaction between both cells and subsequently total RNA extraction for sequencing and transcriptome assembly. Among G and CL Brener T. cruzi strains, the second yielded more with respect to culture grow velocity, final metacyclogenesis percentages and infection rate. During DCs obtainment and differentiation, three technics were applied to confirmation, including flow cytometry and optic or fluorescence microscopy visualization. A parasite-host cell interaction time of 12 h was established and after it, infection rates of about 39%, an average of 2.4 amastigotes/infected DC were obtained and also 80% of DCs from infected assays were activated. The next step was extraction of total RNA from control and infected samples for sequencing and assembly of the reads accordingly to human reference genome. These results showed good reliability because of the satisfactory human genome coverage obtained with ~23,000,000 reads per sample, and correlation coefficient of ~1 between duplicates, which are strong indications of data quality. A detailed vision of antigen presenting cells biology after initial contacts with T. cruzi could provide new targets for the disease treatment and it will help understanding the differential evolutions of Chagas disease in patients and in resistance and tolerance to parasite.

Orientadores: Adriana Gut Lopes Riccetto, Maria Ângela Bellomo Brandão Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Diferentes subtipos de linfócitos e Células Dendríticas tem sido implicadas na fisiopatologia da Hepatite Auto Imune (HAI). Células Dendríticas Plasmocitóides (pDC ¿ do inglês plasmacytoid dendritic cell) produzem caracteristicamente Interferons tipo 1 em resposta à infecções virais, porém também estão presentes em diferentes doenças autoimunes. Neste estudo foram avaliados 27 pacientes com HAI em tratamento imunossupressor (grupo caso) e 28 indivíduos saudáveis (grupo controle), quanto à populações de células imunes através de citometria de fluxo ¿ pDCS (BDCA2+) e linfócitos T (TCD3+, TCD4+, TCD8+, Tregs ¿ TCD4+/TCD25+ e TregFoxP3, Relação CD4/CD8, CD39 em TregFOXP3); linfócitos B (CD19+ e CD38+ em CD19+) e outras subpopulações linfocitárias ( TCD3 ??; linfócitos CD4-CD8 ¿ duplo negativo). Viu-se que 92,6% (25/27) dos pacientes com HAI apresentaram remissão total ou parcial dos sinais e sintomas. Entretanto, para nenhum deles foi possível reduzir doses ou retirar a medicação sem recrudescimento da doença. No grupo caso observou-se aumento da porcentagem de linfócitos T citotóxicos (TCD8+)( p=0,009) e diminuição de pDCs (p=0,003) em relação ao grupo controle. Com relação as demais populações avaliadas, não houve diferença. A análise de células imunes em pacientes com HAI em uso de imunossupressores pode ser útil para se determinar o momento de redução de doses ou retirada do esquema terapêutico. Estudos com maior número de indivíduos e análises mais amplas destas e outras populações de células imunes podem apontar biomarcadores auxiliares no manejo da HAI Abstract: Different subtypes of lymphocytes and Dendritic Cells have been implicated in the pathophysiology of Autoimmune Hepatitis (AIH). Plasmacytoid Dendritic Cells (pDC) characteristically produce type 1 Interferons in response to viral infections, but are also present in different autoimmune diseases. In this study, 27 patients with AIH in immunosuppressive treatment (study group) and 28 healthy individuals (control group) were evaluated for the population of immune cells through flow cytometry - pDCS (BDCA2 +) and T lymphocytes (TCD3+, TCD4+, TCD8+, Tregs ¿TCD4+/TCD25+ and TregFOXP3, CD4/CD8 ratio, CD39 on TregFOXP3); B lymphocytes (CD19+ and CD38+ in CD19+) and other lymphocytic subpopulations (TCD3 ??; double negative Lymphocytes ¿ CD4-/CD8-). It was observed that 92.6% (25/27) of patients with AIH showed total or partial remission of signs and symptoms. However, it was not possible for any of them to reduce doses or withdraw medication without worsening the disease. In the study group, there was an increase in the percentage of cytotoxic T lymphocytes (TCD8+) (p = 0.009) and a decrease in pDCs (p = 0.003) in relation to the control group. Regarding the other lymphocyte populations evaluated, there was no difference. Analysis of immune cells in patients with AIH using immunosuppressants may be useful in determining the time for dose reduction or withdrawal of the therapeutic regimen Mestrado Saúde da Criança e do Adolescente Mestra em Ciências

Inflammasomes are cytosolic complexes composed of a Nod-like receptor, NLR, the adaptor protein, ASC, and a proteolytic enzyme, caspase-1. Inflammasome activation leads to caspase-1 activation and promotes functional maturation of IL-1β and IL-18, two prototypical inflammatory cytokines. Besides, inflammasome activation leads to pyroptosis, an inflammatory type of cell death. Inflammasomes are vital for the host to cope with foreign pathogens or tissue damage. Herein, we show that quantum-dot-based iron oxide nanoparticles, MNP@QD, trigger NLRP3 inflammasome activation and subsequent release of proinflammatory interleukin IL-1β by murine bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs). This activation is more pronounced if these cells endocytose the nanoparticles before receiving inflammatory stimulation. MNP@QD was characterized by using imaging techniques like transmission electron microscopy, fluorescence microscopy, and atomic force microscopy, as well as physical and spectroscopical techniques such as fluorescence spectroscopy and powder diffraction. These findings may open the possibility of using the composite MNP@QD as both an imaging and a therapeutic tool.

Orientadores: Ronei Luciano Mamoni, Maria Heloisa Souza Lima Blotta Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Pesquisas recentes têm demonstrado a importância da resposta imune inata no controle da resposta adaptativa. Em estudo anterior pudemos demonstrar que as células Natural Killer (NK) participam da resposta imunológica ao Paracoccidioides brasiliensis, agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM). Atualmente sabe-se que células dendríticas (DCs) são capazes de interagir com células NK, aumentando a sua atividade. O objetivo deste trabalho foi avaliar o mecanismo utilizado pelas células NK no reconhecimento de células leveduriformes de P. brasiliensis e, se DCs estimuladas pelo fungo são capazes de interagir com células NK e por conseguinte influenciar a diferenciação de linfócitos T. Foram utilizadas DCs derivadas de monócitos e células CD56+ (NK) isoladas do sangue periférico de indivíduos saudáveis. A análise do papel dos receptores do tipo toll (TLR-2 e TLR-4) e do receptor de complemento 3 (CR3 - CD11b) no reconhecimento do P. brasiliensis pelas células NK demonstrou que este último receptor é provavelmente mais importante, uma vez que o seu bloqueio diminuiu a ativação e a atividade citotóxica direta das células NK contra o fungo. Enquanto que o TLR2, em conjunto com o CR3 leva à produção de citocinas como IFN-gama e TNF-alfa. Além disso, nossos resultados demonstraram que DCs estimuladas com o fungo são ativadas e produzem citocinas importantes para a ativação de células NK (IL-12, IL-18, IL-23 e IL-15). Células NK estimuladas com essas citocinas ou cocultivadas com DCs (previamente estimuladas com leveduras do fungo) apresentam maior capacidade de proliferação, aumento na expressão de marcadores de ativação (CD25 e CD69), aumento na capacidade fungicida e aumento da produção de citocinas como IFN-gama e TNF-alfa. Esses efeitos foram parcialmente dependentes de contato, provavelmente envolvendo a participação de IL-15 associada à membrana das DCs, e também à produção de citocinas solúveis (IL-12, IL-23 e IL-18) pelas DCs. Por outro lado, a interação entre células NK e DCs leva estas últimas a aumentarem a expressão de moléculas coestimulatórias (CD80 e CD86) e de moléculas de MHC de classe II, importantes para a apresentação de antígenos aos linfócitos T. Também pudemos observar que a interação entre DCs estimuladas com células leveduriformes de P. brasiliensis e células NK levam a diferenciação de linfócitos T CD4+ e T CD8+ produtores de IFN-gama, ao mesmo tempo inibindo a diferenciação de linfócitos T produtores de IL-4. Em conjunto nossos resultados demonstraram que a interação entre DCs e células NK estimuladas com células leveduriformes de P. brasiliensis leva a um aumento tanto da ativação das DCs quanto das células NK, e que essa interação pode ser importante para modular a resposta imunológica adquirida subsequente Abstract: Several studies have shown that the innate immune response presents a fundamental role in controlling the adaptive immune response. In a previous study we demonstrated that natural killer cells (NK) participate in the immune response to Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM). Currently it is known that dendritic cells (DCs) are able to interact with NK cells, increasing its activity. The objective of this study was to evaluate the mechanism used by NK cells in the recognition of P. brasiliensis yeast cells and, whether DCs stimulated by the fungus are able to interact with NK cells and therefore influence the differentiation of T lymphocytes. We used DCs derived from monocytes and CD56 + (NK) cells isolated from peripheral blood of healthy individuals. We analyzed the role of some toll-like receptors (TLR-2 and TLR-4) and the complement receptor 3 (CR3 - CD11b) in the recognition of P. brasiliensis NK cells. Our results showed that the CR3 is probably more important, since that its blockage decreased the activation and the direct cytotoxic activity of NK cells against the fungus. Furthermore, activation via TLR2, together with CR3, leads to the production of cytokines such as IFN-gamma and TNF-alpha. Moreover, our results demonstrated that DCs stimulated with the fungus are activated and produce cytokines important for the activation of NK cells (IL-12, IL-18, IL-23 and IL-15). NK cells stimulated with these cytokines or co-cultured with DCs (previously stimulated with yeast cells) presented greater capacity for proliferation, increased expression of activation markers (CD25 and CD69), increased fungicide capacity and increased production of cytokines such as IFN-gamma and TNF-alpha. These effects were partially dependent on contact, probably involving the participation of membrane associated IL-15, and also the production of soluble cytokines (IL-12, IL-23 and IL-18) by DCs. In addition, the interaction between NK cells and DCs leads to an increased expression of molecules important for the antigen presentation to T cells, such as costimulatory molecules (CD80 and CD86) and class II MHC on DCs. We also observed that the interaction between DCs (stimulated with the fungus) and NK cells increased the differentiation of T CD4+ and T CD8+ cells into IFN-gamma producing lymphocytes, while inhibited the differentiation of IL-4 producing T lymphocytes. Altogether our results demonstrate that the crosstalk between DCs and NK cells stimulated with P. brasiliensis yeast cells leads to an increased activation of both DCs and NK cells, and that this interaction can be important for modulating the subsequent acquired immune response against the fungus Doutorado Ciências Biomédicas Doutora em Ciências Médicas