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Dysregulated proteostasis is a key feature of a variety of neurodegenerative disorders. In Alzheimer's disease (AD), progression of symptoms closely correlates with spatiotemporal progression of Tau aggregation, with "early" oligomeric Tau forms rather than mature neurofibrillary tangles (NFTs) considered to be pathogenetic culprits. The ubiquitin-proteasome system (UPS) controls degradation of soluble normal and abnormally folded cytosolic proteins. The UPS is affected in AD and is identified by genomewide association study (GWAS) as a risk pathway for AD. The UPS is determined by balanced regulation of ubiquitination and deubiquitination. In this work, we performed isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ)-based Tau interactome mapping to gain unbiased insight into Tau pathophysiology and to identify novel Tau-directed therapeutic targets. Focusing on Tau deubiquitination, we here identify Otub1 as a Tau-deubiquitinating enzyme. Otub1 directly affected Lys48-linked Tau deubiquitination, impairing Tau degradation, dependent on its catalytically active cysteine, but independent of its noncanonical pathway modulated by its N-terminal domain in primary neurons. Otub1 strongly increased AT8-positive Tau and oligomeric Tau forms and increased Tau-seeded Tau aggregation in primary neurons. Finally, we demonstrated that expression of Otub1 but not its catalytically inactive form induced pathological Tau forms after 2 months in Tau transgenic mice in vivo, including AT8-positive Tau and oligomeric Tau forms. Taken together, we here identified Otub1 as a Tau deubiquitinase in vitro and in vivo, involved in formation of pathological Tau forms, including small soluble oligomeric forms. Otub1 and particularly Otub1 inhibitors, currently under development for cancer therapies, may therefore yield interesting novel therapeutic avenues for Tauopathies and AD. This work was supported by the Belgian Fonds National pour la Recherche Scientifique-Fonds de la Recherche Scientifique (FNRS-FRS; Qualified Researcher, Impulse Financing, Research Credits), by Interuniversity Attraction Poles Programme-Belgian State-Belgian Science Policy, by the Belgian Fonds de la Recherche Scientifique Medicale, by the Queen Elisabeth Medical Foundation of Belgium (QEMF-FMRE), by the Stichting Alzheimer Onderzoek (SAO), by the Institute for the Promotion of Innovation by Science and Technology (IWT) in Flanders (IWT O&O, currently FWO), Belgium, and by Stellar funding of Janssen Research Foundation. We would like to thank Markus Boesche, Carola Doce, Frank Fischer, and Melanie Jundt for their technical expertise.

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra A proteína Tau esta envolvida no assembly e na estabilização dos microtúbulos (MT) contribuindo para a normal função destes. Alterações na quantidade e na estrutura da Tau, como é o caso da hiperfosforilação, desencadeiam a libertação da Tau que medeia a estabilização dos MT, levando ao sequestro desta, formando agregados. Este processo pode estar envolvido em muitas doenças neurodegenerativas referidas como Tauopatias, como e o caso da doença de Alzheimer. Uma das características mais evidentes da doença de Alzheimer é a formação de tranças neurofibrilares compostas por deposições intracelulares de agregados de Tau hiperfosforilados. Contudo, o mecanismo que está na origem da transformação de Tau solúvel em agregados insolúveis, bem como o mecanismo envolvido na propagação dos agregados, continua sem explicação. Um modelo in vitro que reproduza as principais características envolvidas na doença pode ser uma útil ferramenta para estudar as causas e consequências da agregação da Tau. No presente estudo, foram optimizados dois modelos celulares, um em que foram utilizadas células QBI e outro em que foram utilizados neurónios corticais de rato. As culturas foram expostas a fibrilas pré-agregadas sinteticamente produzidas, a partir de Tau recombinante (K18P301L), que podem recrutar Tau endógena solúvel transformando-a em agregados insolúveis. A vantagem destes modelos é o rápido processo de agregação, uma vez que com o uso das fibrilas o passo limitante, a nucleação, é ultrapassado, e a transformação de Tau de forma monomérica em agregados é acelerada. Foi provado que em culturas neuronais primarias as fibrilas pré-agregadas são absorvidas espontaneamente, não sendo necessário o uso de nenhum reagente de entrega, o que leva a crer que este processo é mediado por endocitose. A indução de agregação endógena através das fibrilas de Tau sintéticas é um processo dependente do tempo de exposição, uma vez que foi detectado um aumento de agregação com um aumento do tempo de exposição às fibrilas, o que representa um ponto de suporte na hipótese de propagação patológica da Tau. No presente estudo foi também descrito que o processo de agregação desencadeado no modelo de agregação neuronal hTauP301L, não é um processo neurotóxico. Os modelos descritos neste estudo foram utilizados como uma plataforma para testar compostos que têm como finalidade diminuir os níveis de agregação da Tau. Neste estudo, foi também testado um inibidor de Hsp90 que demonstrou um evidente efeito na diminuição da Tau solúvel e insolúvel. Utilizando os modelos celulares apresentados, no presente estudo foi testado o processo da agregação da Tau em células. Foram desenvolvidos dois ensaios, um ensaio de BRET e um ensaio de Venus split complementation para estudar o processo de agregação da Tau no QBI seeding model. Resumidamente, o estudo apresentado tem por objectivo estabelecer uma relevante plataforma que pode ser utilizada para o estudo da patologia da Tau, bem como identificar futuras terapias com base na proteína Tau. Tau protein promotes assembly and stabilization of microtubules (MT), which contributes to proper neuronal function. Alterations in the amount and structure of Tau protein, as hyperphosphorylation, results in detachment from MTs and sequestration into aggregates leading to a loss of Tau-mediated MT stabilization. This process is present in some neurodegenerative disorders referred as Tauopathies, such as Alzheimer Disease (AD). One of the major hallmarks of the AD is the formation of neurofibrillary tangles (NFTs) composed of intracellular deposition of hyperphosphorylated Tau aggregates. However the mechanisms causal of the conversion of soluble Tau in insoluble Tau aggregates, as well the propagation of Tau aggregates remains inconclusive. An in vitro system recapitulating the characteristics of this disease would provide a useful tool to study the causes and consequences of Tau aggregation. In this study, we optimized two cellular models, in QBI cells and in rat cortical neurons, wherein synthetic pre-aggregated fibrils made from recombinant protein (K18P301L) introduced in cell cultures can recruit soluble endogenous Tau into insoluble fibrillar aggregates. The advantage of these models is a faster aggregation process once the fibrils can overstep the rate limiting nucleation and accelerate the transformation of monomeric Tau into aggregates. We found that pre-aggregated fibrils are spontaneously taken up by primary cortical neurons and that this does not require any delivery reagent. This could mean that the uptake of this material is mediated by endocytosis. The induction of endogenous aggregation by synthetic Tau fibrils is a time-dependent process, since we observed an increase in Tau aggregation with increasing exposure time to fibrils, supporting the hypothesis of propagation of pathological Tau. We also found that the aggregation process triggered in the hTauP301L neuronal aggregation model is not a neurotoxic process to rat cortical neurons. The models described in this study were used as a platform to test compounds that could potentially decrease the levels of Tau aggregation. In this study an HSP90 inhibitor was test that demonstrated evident effects in decreased of soluble and insoluble Tau. The cellular models present here, were also used to study Tau aggregation process in life cells. In this study, we developed two assays, a BRET assay and a Venus split complementation assay to study Tau aggregation process in the QBI seeding model. In summary, we have developed and optimized a platform which can be used to study the pathogenesis of Tauopathies, and indentify new Tau-based therapies.

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra A doença de Alzheimer é a forma de demência mais prevalente. Quando a proteína Tau perde a conformação correcta forma agregados, começando por originar oligomeros e mais tarde fibrilas de grandes dimensões dando origem a trancas neurofibrilares. Alguns estudos sugerem que estas espécies são transmitidas através das áreas do cérebro danificando o circuito neuronal. Para parar o avanço da doença muitos trabalhos têm em foco o desenvolvimento de terapias que manipulam a fosforilação desta proteína, a estabilização dos microtubulos e a indução da degradação da Tau. Para desenvolver terapias que impedem a agregação ou que induzam a degradação da Tau, é necessário desenvolver modelos que recapitulam a agregação. Neste trabalho “seeding effect” foi a estratégia utilizada para induzir a agregação da hTauP301L. No presente trabalho dois modelos in vitro baseados nesta estratégia foram utilizados – um desenvolvido em linhas celulares e outro em culturas neuronais primarias – onde se observou a hiper-fosforilação e agregação da Tau. A co-expressão da GSK3β aumentou a fosforilacao na ser202/thr205 na Tau solúvel e insolúvel, mas apenas a sua expressão não foi suficiente para induzir agregação. Em culturas neuronais primárias a fosforilação e agregação da Tau aumentam ao longo do tempo. A inibição da Hsp90 reduziu os níveis de Tau totais de e fosforilados no epitopo AT8, dando importância a esta estratégia como um potencial mecanismo para degradação da Tau.Com este trabalho produzimos dois modelos onde estudos em nucleação, agregação e transmissão sináptica da Tau poderão ser feitos. Estes modelos são ferramentas válidas para o desenvolvimento de fármacos para AD e outras Tauopatias Alzheimer Disease is the most prevalent dementia. Abnormal folding of Tau leads to generation of aggregated Tau species like oligomers and further NFTs. Toxic Tau species were suggested to spread trough human brain and damage the neuronal circuit. To halt disease progression a noteworthy development in therapies based on phosphorylation modulation, Microtubule stabilization and enchantment of Tau clearance have been done. To develop therapies against Tau aggregation and aggregates clearance, the build up of models that recapitulates Tau pathology are required. In the following work the “seeding” strategy was used to achieve aggregation of hTauP301L. We worked with two in-vitro seeding models – cellular and primary neuronal- where phosphorylated insoluble hTauP301L is present. GSK3β was shown to increase ser202/thr205 phosphorylation in soluble and insoluble hTauP301L expressed in QBI but was not sufficient to induce aggregation alone. In primary neuronal seeding model tau aggregation and phosphorylation was increased over-time. Hsp90 inhibition was found to reduce total and AT8 immuno-reactive hTauP301L levels, emerging as a potential drug for Tau clearance. With this work we provide two models to study the mechanisms behind tau nucleation, aggregation, and trans-synaptic spreading. These models are valuable tools for the development of drugs for AD and Tauopathies.