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La brucelosis es una enfermedad zoonótica que puede impactar fuerte en el ámbito económico, además de representar un delicado problema de salud pública. En México, el diagnóstico oficial se realiza por serología, mediante las pruebas de tarjeta, rivanol y fijación de complemento, considerándose el aislamiento y caracterización de Brucella spp como “la prueba de oro”. En este estudio se llevó a cabo la comparación de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés), con respecto a la bacteriología y la serología, en el diagnóstico de la brucelosis bovina. Un total de 51 muestras de sangre y leche fueron recolectadas de dos hatos con prevalencia histórica de presencia de brucelosis. De las 51 muestras analizadas, 24 resultaron negativas a las pruebas serológicas, bacteriológicas y PCR, 11 resultaron positivas a todas las pruebas, seis resultaron positivas a serología y PCR, una positiva a serología y bacteriología y nueve positivas a serología. De los 12 aislamientos positivos se tomó una muestra para realizar PCR obteniendo amplificación en el 100 % de los cultivos. Los resultados muestran que la proporción de detección de animales positivos mediante el PCR fue superior al aislamiento (P0.05), por lo tanto puede ser una herramienta muy útil en la detección de brucelosis en muestras de leche. El PCR a partir de cultivos puros tiene una sensibilidad del 100 % y puede ser utilizado ya sea en la detección de Brucella o en la diferenciación de la cepa vacunal de la cepa de campo.