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Orientadores: Sara T. O. Saad, Carlos Lenz Cesar Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Lasers têm sido uma ferramenta cada vez mais utilizada na área da Biologia Celular e Medicina para medidas, diagnóstico e manipulação. Dentre essas utilizações destaca-se o trabalho pioneiro de A. Ashkin e colaboradores em 1986 que demonstraram o uso de uma técnica baseada na transferência de momentum dos fótons para capturar partículas dielétricas. Logo a seguir eles utilizaram essa técnica para capturar e manipular partículas biológicas com tamanhos variando de décimos a centenas de micra, demonstrando, desta forma, que este sistema funciona como uma "pinça óptica" para realizar manipulações intra e extracelulares sem causar prejuízo algum ao organismo vivo. Neste trabalho, a pinça óptica foi empregada para a análise do comportamento mecânico de hemácias normais, portadoras de hemoglobina 5 (homozigotos e heterozigotos) no estado normal e em crise falcêmica, esferocitose hereditária e anemia ferropriva. Foi ainda estudada a ação da hidroxiureia na reologia dos eritrócitos, da irradiação gama e da heterozigose para hemoglobina 5 em células estocadas em bolsas de doação de sangue. As análises foram feitas com um feixe de laser fortemente focado por uma objetiva de x100 de um microscópio, acoplado a um sistema de vídeo utilizado para gravar as imagens e posteriormente envia-Ias para análise em um computador. Pelo menos 20 células de cada participante foi pinçada pelo laser e arrastada contra plasma humano AS + com viscosidade conhecida em 6 velocidades constantes variando de 150 J.1m1s a 250J.1m1s (150, 170, 190, 210, 230, 250J.1m1s). A análise da deformação celular em razão da velocidade nos permitiu ter uma visão da elasticidade celular. A pinça óptica apresenta uma vantagem em relação as técnicas comumente utilizadas para aferir a deformabilidade celular, a análise das células é individual, levando em consideração a interação do citoplasma e da membrana. Os resultados sugerem que alterações na membrana da hernácia ou da hemoglobina causam um distúrbio no comportamento mecânico normal dos eritrócitos,. tomando-os mais rígidos, algumas vezes ultrapassando a capacidade de medida da metodologia. Com a pinça foi possível caracterizar a ação da HU no comportamento mecânico das células HbSS. A metodologia de pinça óptica pode ser muito útil para se verificar o efeito de outras drogas na deformabilidade de hemácias normais ou em pacientes com alterações da hemoglobina ou da membrana celular e também, estudar o efeito de diferentes conservantes para estocagem de hemácias Abstract: The deformability of erythrocytes is a critical determinant of blood flow in microcirculation. By capturing red blood cells with optical tweezers and dragging them through a viscous fluid we were able to measure their overall elasticity. Laser optical tweezers, based on photon momentum transfer, have been used successfully in a variety of biological applications. This technique is capable of measuring the whole red blood cell elasticity and viscosity. The optical trap was performed with a Nd:YAG laser strongly focused in a microscope connected to a CCD camera. A computer captured the images, where they were quantitatively and qualitatively analyzed. The elasticity measurement was obtained by dragging the RBC with the optical tweezers through the plasma fluid with a known viscosity. It should be pointed out that the laser does not exert any pressure or photo-damage on the cell. The analysis of the cell deformation vs velocity allowed us to obtain cell elasticity expressed in dyn/cm. The model we used to extract the values for the membrane elasticity and viscosity assumed that the cell is a parallelepiped with length lo, width W and negligible thickness which is located at distance Z1 trom the bottom of the Neubauer chamber and Z2 trom the cover slip. We assumed that the elastic response to an applied force is given by F=J.1(WILo)~L, where F is the force, J.1 is the elasticity and ~L is the cell length deformation. We assumed a drag force F given by F=TI(Wl.o(kq)V, where TI is the plasma viscosity, (1/Zeq)= (11Z1)+ (11Z2) and Vis the drag velocity. The equilibrium occurs when one force cancels the other. Therefore the elongation ~L as a function of drag velocity is given by ~L= (Tllo 1(J.1Zeq)] V, which can be used to extract a value for J.1 provided by the plasm viscosity TI, length lo and Zeq which are easily measured. We measured, and compared, the red blood cell deformability trom normal contrais (HbAA) , patients with: homozygous (HbSS) and heterozygous (HbAS) sickle hemoglobin, HbSS subjects on sickling crisis, hereditary spherocytosis and with iron deficiency anemia. We also studied ,the action of hydroxyurea on rheologic behavior of HbSS cells, the gamma irradiation and the heterozygosis for sickle hemoglobin on cells storage on blood donation bags. Our results showed that the red blood cell deformability was significantly lower in HbS subjects (HbSS and HbAS) , except for HbSSIHU cells, whose deformability was similar to the normal controls. Our data showed that the laser optical tweezers technique is able to detect differences in HbS red blood cells trom subjects taking hyd,roxyurea as well as to differentiate red blood cells trom normal controls and HbAS, indicating that this is a very sensitive method and can be applied for detection of drug-response in sickle cell disease. The sensitivity of the laser optical tweezers method showed that there is no significant change in elasticity over time up to 14 days of storage, regardless of whether the unit was irradiated or not. However, beyond 21 days of storage, irradiated units demonstrate decreased elasticity. RBCs elasticity trom AS units stored for 1, 14 and 21 days presented significantly lower elasticity when compared to HbAA cells stored for the same period. Mostly of RBcs trom HbAS units stored for 28 and 35 days, Hereditary spherocytosis cells and sickle crisis cells were very rigid or escaped trom the optical trapo So these cells did not stay in the trap when the velocities were increased. Hence, the accuracy of elasticity measurement was impaired. Doutorado Clínica Médica Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Marcelo Mendes Brandão, Karina Lucas da Silva Brandão Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os ecossistemas de areia branca da Amazônia (conhecidos como campinas e campinaranas) são manchas isoladas de vegetação escleromórfica que ocorrem sob solos de areia branca, exclusivamente na Amazônia. Esses ecossistemas apresentam baixa diversidade e alto endemismo floral e faunístico devido às características únicas do solo, alta luminosidade e temperatura. No entanto, esses ecossistemas são sub-representados em estudos geológicos e biológicos, especialmente no que diz respeito à estrutura genética e diversidade das espécies que os habitam. Neste trabalho, investigamos a variabilidade genética entre subpopulações de Heliconius hermathena, uma espécie de borboleta endêmica dos ecossistemas de areia branca da Amazônia. Utilizando todo o genoma mitocondrial como marcador molecular, inferimos alta diferenciação genética entre indivíduos de seis subespécies diferentes de H. hermathena, que ocorrem em oito localidades diferentes (subpopulações). Nossos dados confirmam a hipótese prévia sobre a diversificação da espécie, na qual o isolamento das áreas de areia branca pode ter desempenhado um papel importante na geração e manutenção da variabilidade genética e da estrutura populacional encontradas nas subpopulações de H. hermathena. Além disso, acreditamos que este estudo esteja de acordo com outros que estudaram espécies adaptadas a esses ambientes em relação a diferenciação genética, mostrando que é necessário avaliar o papel dos ecossistemas de áreas de areia branca de forma mais profunda, afim de entender melhor os padrões que levaram à grande biodiversidade amazônica Abstract: Amazonian white sand ecosystems (campinas and campinaranas) are strongly isolated patches of escleromorphic vegetation above white sandy soils that occur exclusively in the Amazon. These ecosystems present low diversity and high floral and faunal endemism due to unique soil characteristics, harsh luminosity and temperature conditions. Nevertheless, these ecosystems are underrepresented in geological and biological studies, especially regarding the genetic structure and diversity of the species inhabiting them. Here, we investigate the genetic differentiation among subpopulations of Heliconius hermathena, an endemic butterfly to the Amazonian white sand ecosystems. Using the whole mitochondrial genome as molecular marker, we inferred high values of genetic differentiation among individuals from six different subspecies of H. hermathena occuring in eight different localities (subpopulations). Our data confirms previous hypotheses regarding the species diversification in which the isolation of the patches of white sand areas might have played an important role in generating and maintaining the species structure across subpopulations. Furthermore, we believe that this work is in accordance with others on white sand areas genetic differentiation, showing that it is necessary to assess the role of white sand areas in generating and maintaining diversification patterns in the Amazon in order to better appreciate Amazonian biodiversity Mestrado Genética Animal e Evolução Mestre em Genética e Biologia Molecular CAPES 8888.329587/2019-01

Orientadores: Marcelo Mendes Brandão, Renato Vicentini dos Santos Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Spodoptera frudiperda (JE Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) é uma praga de grande importância agrícola. Isso acontece, principalmente, devido a ser um inseto polífago. Utiliza como fonte de alimento algumas culturas de grande relevância para a indústria como milho, arroz e algodão. Essa espécie é dividida em duas raças que não se distinguem morfologicamente. Porém apresentam padrões de comportamento, preferência alimentar e desenvolvimento distintos quando alimentadas em diferentes hospedeiros. Insetos e plantas têm tido um longo processo de interações e coevolução que afetam organismos em níveis desde bioquímica básica até genética de populações. Suas defesas têm sido articuladas no tempo e espaço por redes regulatórias altamente complexas que são moduladas através de outras vias de sinalização. Essas respostas integradas levam a um padrão de expressão gênica característico que resulta em alterações em cada organismo. Herbívoros dependem das proteases digestivas para degradar proteínas em peptídeos e aminoácidos essenciais para a biossíntese de suas proteínas funcionais e estruturais. Inibidores de proteases produzidos pela planta são sua principal defesa contra herbivoria. Insetos podem contornar esses efeitos deletérios. Um dos maiores objetivos da biologia de sistemas tem sido integrar informações de diversos bancos de dados e modelá-los através de técnicas de matemática e estatística para entender e predizer o comportamento de células e organismos sob determinadas condições. Este trabalho objetivou inferir redes de regulação de genes responsáveis pela diferenciação dos padrões de expressão gênica nos processos de digestão de duas raças, arroz e milho, de S. frugiperda. Para isso, foram utilizadas estratégias de obtenção de redes incluindo redes de coexpressão, redes de coexpressão ponderada e redes bayesianas. Além disso, a expressão desses genes foi relacionada com caracteres fenotípicos. Foi possível obter uma visão geral das relações entre os genes dos transcriptoma das raças milho e arroz de S. frugiperda quando alimentadas por cinco tipos de dieta, sendo elas dieta artificial, milho, arroz, algodão e algodão rico em gossipol. A rede de coexpressão total do transcriptoma apresentou um padrão característico de redes biológicas. Isso permitiu estudar o comportamento da rede aplicando propriedades já descritas para esse tipo de rede. Foram identificados genes com alto número de ligações que podem ter papel-chave. A rede ficou dividida em duas porções. Uma dessas porções é mais robusta e apresenta genes de resposta mais lenta. Pode-se sugerir que são genes de housekeeping. Genes diferencialmente expressos ficaram agrupados numa mesma região da rede. A rede foi dividida em aglomerados de genes mais correlacionados. Foram identificados genes que têm relação direta com peptidases e suas funções. Trinta e dois genes exclusivos da raça milho e quatro da raça arroz estão ligados diretamente às peptidases. Peptidases da mesma classe ficaram próximas na rede. As peptidases fazem um grande número de ligações. Foi mostrado como é o comportamento da expressão gênica da rede das peptidases em cada raça sob cada dieta. A rede de coexpressão ponderada permitiu observar como grupos de genes mais relacionados podem influenciar as características fenotípicas. As redes bayesianas permitiram relacionar como cada uma das variáveis fenotípicas e dietas se relacionam com genes específicos. Houve diferença dos padrões de expressão gênica nas redes bayesianas com relação a raça e dieta. Isso permitiu identificar genes mais expressos em cada raça, dieta e o comportamento deles na rede Abstract: Spodoptera frudiperda (JE Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) is a pest of great agricultural importance. This happens mainly because it is a polyphagous insect. It uses as food source some crops of great relevance for the industry like maize, rice and cotton. This species is divided into two races that are not morphologically distinguishable. However, they present distinct patterns of behavior, food preference and development when fed on different hosts. Insects and plants have had a long process of interactions and coevolution affecting organisms at levels ranging from basic biochemistry to population genetics. Their defenses have been articulated in time and space by highly complex regulatory networks that are modulated through other signaling pathways. These integrated responses lead to a characteristic pattern of gene expression that results in changes in each organism. Herbivores rely on digestive proteases to degrade proteins in peptides and essential amino acids for the biosynthesis of their functional and structural proteins. Inhibitors of proteases produced by the plant are its main defense against herbivory. Insects can overcome these deleterious effects. One of the major goals of systems biology has been to integrate information from various databases and model them through math and statistical techniques to understand and predict the behavior of cells and organisms under certain conditions. This work aimed to infer the regulation networks of genes responsible for the differentiation of gene expression patterns in the digestion processes of two strains, rice and corn, of S. frugiperda. For this, network strategies were used including coexpression networks, weighted coexpression networks and Bayesian networks. In addition, the expression of these genes was related to phenotypic characters. It was possible to obtain an overview of the relationships between the transcriptome genes of the corn and rice S. frugiperda strains when fed on five types of diets: artificial diet, corn, rice, cotton and cotton rich in gossypol. The total co-expression network of the transcriptome presented a characteristic pattern of biological networks. This allowed to study the behavior of the network applying properties already described for this type of network. We have identified genes with high number of interactions that plays a key role. The network was divided into two portions. One of these portions is more robust and has slower response genes. One might suggest that they are housekeeping genes. Differentially expressed genes were grouped in the same region of the network. The network was divided into clusters of more correlated genes. Genes that have a direct relationship with peptidases and their functions have been identified. Thirty-two genes unique to the corn strain and four genes unique to rice strain are linked directly to the peptidases. Peptidases of the same class were nearby in the network. The peptidases make a large number of interactions. The behavior of the gene expression of the peptidase network in each strain under each diet was shown. The weighted coexpression network allowed to observe how groups of more related genes can influence the phenotypic characteristics. The Bayesian networks allowed to relate how each of the phenotypic variables and diets relate to specific genes. There were differences in gene expression patterns in the Bayesian networks with respect to strain and diet. This allowed to identify more expressed genes in each strain, diet and their behavior in the network Doutorado Bioinformática Doutora em Genética e Biologia Molecular CNPQ 140909/2013-3

Orientadores: Anete Pereira de Souza, Marcelo Mendes Brandão Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os manguezais são ecossistemas extremamente importantes em termos de biodiversidade aquática e terrestre, possuindo peculiaridades em termos de características e composição de seus habitats, sendo considerado um ambiente extremo para a sobrevivência de plantas vasculares. No litoral Brasileiro, a composição arbórea dos manguezais é restrita a apenas seis espécies evolutivamente adaptadas à complexidade funcional destes ecossistemas. Rhizophora mangle é uma das espécies mais abundantes deste ecossistema na costa Atlântica do litoral Americano. Estudos com marcadores microssatélites neutros na espécie apontaram uma forte estruturação populacional que divide a espécie em dois grandes grupos no Brasil: um ao norte e outro ao sul do Rio Grande do Norte. O estudo genômico de R. mangle pode fornecer um acréscimo às informações já existentes sobre mecanismos que influenciam na distribuição da diversidade e nas respostas adaptativas desta planta ao ambiente que ocupa. Apesar de ser conhecida a importância dos manguezais na estabilidade geomórfológica da linha de costa, na preservação da biodiversidade e na manutenção dos seus serviços ecossitêmicos, estes ecossistemas estão constantemente ameaçados pelas ações antrópicas e pelas mudanças climáticas globais (MCG). A capacidade de adaptação e regeneração das espécies verdadeiras de mangue face às perturbações e mudanças nas condições ambientais é dependente, além das características físico-ambientais de cada ambiente de mangue, das adaptações fenotípicas e genotípicas em resposta as condições ambientais. Este projeto propõe o sequenciamento do transcriptoma e elaboração do perfil de expressão gênica de indivíduos que caracterizem populações naturais de R. mangle nos extremo sul e norte da sua ocorrência na costa brasileira. Este estudo visa compreender como diferentes pressões seletivas associadas às MCG podem afetar os padrões e níveis da expressão gênica em populações naturais de R. mangle, permitindo a elaboração de melhores estratégias para conservação e manejo dos recursos genéticos de R. mangle e de seus habitats. Utilizando os dados do sequenciamento pela técnica de RNA-seq de R. mangle, foram testadas montagens de novo com três software de montagem, CLC, Trinity e Mira. A montagem final do transcriptoma foi gerada a partir da união entre a montagem gerada pelo Mira e pelo Trinity, mantendo os transcritos comuns e hibridando os transcritos únicos de cada montagem. Desta forma, foi possível obter melhores métricas de montagem. Um total de 50.379.733 reads paired-end foram utilizadas para a montagem de novo de R. mangle em 72.054 unigenes com N50 de 1350 pb. Um total de 34% de contigs/unigenes foram anotados no banco de dados Swiss-Prot e 43,86% de contigs/unigenes anotados no Non-Redundant Protein Database (NR) do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Foram identificadas 22.669 ORFs completas nos transcritos de R. mangle e um total de 18.888 contigs forneceu informações de domínios e famílias de sequências de proteínas identificadas pela ferramenta InterProScan. Foram também identificadas 11.751 repetições de sequências simples (SSRs) e 46.508 variantes SNPs no alinhamento das reads das amostras de Santa Catarina e 87.813 SNPs nas reads das amostras do Pará. Dentre as variantes SNPs detectadas, 20.741 foram comuns entre ambas populações. Através da anotação funcional por termos de ontologia gênica (GO), foram identificados 159 termos em " response to stress", que podem estar associados ao ambiente ostil que R. mangle habita. Para a validação dos resultados do sequenciamento e das análises de bioinformática, 11 genes diferencialmente expressos foram selecionados para validação em RT-PCR (PCR em tempo real), confirmando os resultados de análise de abundância de reads do RSEM Abstract: Mangroves are extremely important ecosystems in terms of aquatic and terrestrial biodiversity, with peculiarities in terms of the characteristics and composition of their habitats, being considered an extreme environment for the survival of vascular plants. In the Brazilian littoral, the arboreal composition of the mangroves is restricted to only six species evolutionarily adapted to the functional complexity of these ecosystems. Rhizophora mangle is one of the most abundant species of this ecosystem on the Atlantic coast of the American coast. Studies with neutral microsatellite markers in the species pointed to a strong population structure that divides the species into two large groups in Brazil: one to the north and one to the south of Rio Grande do Norte. The genomic study of R. mangle can provide an addition to existing information on mechanisms that influence the distribution of diversity and the adaptive responses of this plant to the environment it occupies. Although the importance of mangroves in the geomorphic stability of the coastline, the preservation of biodiversity and the maintenance of their ecosystem services are well known, these ecosystems are constantly threatened by anthropic actions and global climate change (GCM). The adaptability and regeneration capacity of the true mangrove species in the face of disturbances and changes in environmental conditions is dependent, in addition to the physical and environmental characteristics of each mangrove environment, of phenotypic and genotypic adaptations in response to environmental conditions. This project proposes the sequencing of the transcriptome and elaboration of the gene expression profile of individuals that characterize natural populations of R. mangle in the extreme south and north of its occurrence in the Brazilian coast. This study aims to understand how different selective pressures associated to MCGs can affect the patterns and levels of gene expression in natural populations of R. mangle, allowing the elaboration of better strategies for conservation and management of R. mangle genetic resources and their habitats. Using the sequencing data by the R. mangle RNA-seq technique, new assemblies were tested with three assembly software, CLC, Trinity and Mira. The final assembly of the transcriptome was generated from the union between the assembly generated by Mira and Trinity, keeping the common transcripts and hybridizing the unique transcripts of each assembly. In this way, it was possible to obtain better assembly metrics. A total of 50,379,733 paired-end reads were used for reassembly of R. mangle in 72,054 unigenes with a N50 of 1350 bp. A total of 34% of contigs / unigenes were annotated in the Swiss-Prot database and 43.86% of contigs / unigenes annotated in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Non-Redundant Protein Database (NR). A total of 22,669 ORFs were identified in R. mangle transcripts and a total of 18,888 contigs provided information on domains and families of protein sequences identified by the InterProScan tool. We also identified 11,751 single sequence repeats (SSRs) and 46,508 SNPs in the alignment of the reads of the Santa Catarina samples and 87,813 SNPs in the reads of the Pará samples. Among the SNP variants detected, 20,741 were common between both populations. Through the functional annotation by terms of gene ontology (GO), we identified 159 terms in "response to stress", which may be associated with the osteous environment that R. mangle inhabits. For the validation of sequencing results and bioinformatics analyzes, 11 differentially expressed genes were selected for validation in RT-PCR (real-time PCR), confirming the results of analysis of abundance of RSEM reads Mestrado Genética Vegetal e Melhoramento Mestra em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2014/11426-1 CAPES 23038010030/2013-25