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Introduction: Participation in proficiency testing (PT) is used to evaluate the competence of testing and calibration laboratories. Objective: To evaluate the viability of the freeze-drying technique to produce six lots of PT items containing two Escherichia coli, two containing Bacillus cereus and Staphylococcus aureus concomitantly, and two containing Salmonella Enteritidis in baked shredded chicken matrix. Method: Homogeneity according to harmonized protocol and long and short-term stability testing according to ISO GUIDE 35 were carried out. Results: All lots produced were sufficiently homogeneous. In the long-term stability study, all lots were sufficiently stable at temperatures of -80 ± 10°C and -20 ± 4°C, except for the lot containing B. cereus and S. aureus. The other lots presented stability for at least 126 days at -80 ± 10°C and 84 days at -20 ± 4°C. The short-term stability was carried out only with the lots sufficiently stable in the long-term stability study. The lots were sufficiently stable at temperatures of 5 ± 3°C and at 35 ± 2°C, except for the lot containing Salmonella Enteritidis at 35 ± 2°C due to the significant decrease in cell concentration. Conclusions: The freeze-drying technique was satisfactory for the production of test items containing E. coli e Salmonella Enteritidis in the chicken matrix viable to use in a PT, but the lot containing Salmonella Enteritidis must be transported to the laboratories at the temperature ≤ 8°C for up to four days. Lots containing S. aureus e B. cereus simultaneously presented insufficient stability, indicating that the production of individual lots containing each bacteria individually is necessary. Introdução: A participação em ensaios de proficiência (EP) é utilizada para avaliar a competência de laboratórios de ensaio e calibração. Objetivo: Avaliar a viabilidade da técnica de liofilização na produção de seis lotes de itens de EP, dois contendo Escherichia coli, dois contendo Bacillus cereus e Staphylococcus aureus concomitantemente, e dois contendo Salmonella Enteritidis em matriz frango desfiado cozido. Método: Foram realizados testes de homogeneidade segundo o protocolo harmonizado e de estabilidade em longo prazo pelo modelo clássico e curto prazo pelo modelo isócrono segundo a ISO Guide 35. Resultados: Todos os lotes produzidos foram considerados suficientemente homogêneos. No estudo de estabilidade em longo prazo, todos os lotes se apresentaram suficientemente estáveis nas temperaturas de -80 ± 10ºC e -20 ± 4ºC, exceto o lote contendo B. cereus e S. aureus. Os outros lotes apresentaram estabilidade por pelo menos 126 dias a -80 ± 10ºC e 84 dias a -20 ± 4ºC. Na avaliação da estabilidade em curto prazo, foram analisados apenas os lotes suficientemente estáveis no estudo em longo prazo. Os lotes foram suficientemente estáveis nas temperaturas de 5 ± 3ºC e 35 ± 2ºC, com exceção do lote contendo Salmonella Enteritidis a 35 ± 2ºC, devido ao decréscimo significativo da concentração celular. Conclusões: A técnica de liofilização foi satisfatória para produção de itens de ensaio contendo E. coli e Salmonella Enteritidis em matriz frango viáveis para utilização em um EP, sendo que o lote contendo Salmonella Enteritidis deve ser transportado aos laboratórios participantes em temperatura ≤ 8ºC por até quatro dias. Lotes contendo S. aureus e B. cereus, simultaneamente, apresentaram estabilidade insuficiente, indicando que a produção de lotes individuais contendo cada bactéria individualmente é necessária.

Resumo Cronobacter é uma bactéria oportunista, associada a infecções em neonatos devido ao consumo de fórmulas infantis desidratadas. Atualmente, sabe-se que Cronobacter pode causar infecções em indivíduos de qualquer idade, sendo, em idosos, a sua maior prevalência, e a infecção urinária, a síndrome mais comum neste grupo. A identificação de fórmulas infantis desidratadas como veículo de contaminação em casos de meningite causada por Cronobacter em neonatos levou as agências de regulação a criarem medidas específicas para o controle destes patógenos nestes produtos. Uma revisão bibliográfica foi realizada sobre a epidemiologia das infecções por Cronobacter, a ocorrência do patógeno e a regulação na área de alimentos no Brasil. Constatou-se que casos de infecções foram reportados no país no período de 1997-2013, com maior ocorrência em neonatos. O número preciso de casos não pôde ser determinado e, em alguns dos relatos, a identificação fidedigna dos micro-organismos pode ser questionável. Na maioria dos casos relatados o veículo de contaminação não foi investigado ou não pôde ser determinado. Já ocorreram relatos da contaminação de amostras de fórmulas infantis desidratadas comercializadas no Brasil por Cronobacter, mas sua ocorrência parece ter sido reduzida após a adoção de medidas sanitárias mais rígidas pelos órgãos reguladores. Cronobacter também foi isolada de temperos e condimentos, farinhas, queijo e misturas de cereais para crianças; destas amostras, quatro espécies foram identificadas: C. sakazakii, C. malonaticus, C. dublinensis e C. muytjensii. A presença do patógeno em diferentes classes de alimentos é preocupante pois pode representar um risco caso sejam consumidos por indivíduos pertencentes a algum grupo de risco (neonatos e idosos). O incentivo à realização de pesquisas sobre a epidemiologia do gênero Cronobacter é importante para identificar as classes de alimentos que podem atuar como veículo de contaminação e a real prevalência das infecções no Brasil. Abstract Cronobacter is an opportunistic bacterium associated with infections in newborns due to the consumption of powdered infant formulae. It is now known that Cronobacter can cause infections in individuals of any age with a higher prevalence in the elderly, urinary infections being the most common syndrome in this group. The identification of powdered infant formulae as the contamination vehicle in cases of meningitis caused by Cronobacter in neonates led the regulatory agencies to establish specific measures to control such pathogens in these products. Thus a literature review was carried out concerning the epidemiology of Cronobacter infections, the occurrence of the pathogen and food regulations in Brazil. It was found that cases of the infection were reported in Brazil from 1997-2013, with a higher occurrence in neonates. The precise number of cases could not be determined, and in some reports, identification of the microorganism was questionable. In most of the cases reported the contamination vehicle was not investigated or could not be determined. There have been reports of contamination by Cronobacter in samples of powdered infant formulae commercialized in Brazil, but their occurrence seems to have reduced after the adoption of stricter sanitary measures by the regulatory agencies. Cronobacter has also been isolated from spices and herbs, flours, cheese and from cereal mixes destined for children; and from these samples, four species were identified: C. sakazakii, C. malonaticus, C. dublinensis and C. muytjensii. The presence of the pathogen in different types of food is worrying because it may represent a risk if consumed by individuals belonging to one of the risk groups (neonates and elderly). It is important to encourage research about the epidemiology of the genus Cronobacter in order to identify the classes of food that can act as contamination vehicles and the real prevalence of infections in Brazil.

The aim of this study was to develop lyophilized test items (TI) containing Salmonella spp., in chocolate matrix to be used in proficiency testing programs (PTP). Microbial analysis was conducted on samples of granulated chocolate to verify that the sample was free of the target microorganisms. Homogeneity and stability studies in long and short term were carried out to monitor TI quality; the presence of vacuum in the samples was also verified, to ensure the efficiency of the lyophilization process. The results of the microbial testing indicated no contamination by Salmonella spp.; thus, the sample was appropriate to be used as matrix. The lyophilization technique, using trehalose as cryoprotectant, has proven to be effective for desiccation of TI produced. The Salmonella batch proved to be sufficiently homogeneous, because the microorganism was present in all analyzed flasks. The batch was held stable at -20°C (five weeks) and -70°C (26 weeks). As for the transportation stability, the batch was considered stable at 4°C (in four days). The TI produced batch in this study showed a quality level that makes it suitable to be used in PTP, to contribute to the increasing reliability of the test results from laboratories and to provide subsidies for identification of problems and troubleshooting. O objetivo desse estudo foi desenvolver itens de ensaio (IE) liofilizados contendo Salmonella spp., em matriz chocolate, para utilização em ensaio de proficiência (EP). Foi realizada a análise microbiológica de uma amostra de chocolate granulado para verificar se estava livre do micro-organismo alvo. Para monitoramento da qualidade dos IE, realizou-se estudos de homogeneidade e estabilidade em longo e curto prazo, bem como verificou-se a presença de vácuo nas amostras garantindo a eficiência do processo de liofilização. A análise microbiológica do chocolate indicou ausência de contaminação por Salmonella spp., estando apto para ser utilizado como matriz. A técnica de liofilização, com uso de trealose como crioprotetor, se mostrou eficaz para dessecação dos IE produzidos. O lote produzido se apresentou suficientemente homogêneo, pois o micro-organismo estava presente em todos os frascos analisados. O lote se apresentou estável à temperatura de -20ºC (em cinco semanas) e -70ºC (em 26 semanas); na estabilidade de transporte, foi considerado estável a 4ºC (em quatro dias). O lote de IE produzido nesse estudo apresentou qualidade que o torna apto para uso em EP, o que visou contribuir para o aumento da confiabilidade dos resultados das análises dos laboratórios e propiciar subsídios para a identificação e solução de problemas.

The participation of analytical laboratories in proficiency testing allows the verification of the reliability of results in analysis of quality control. The aim of this study was to produce a batch of test items (TI) to be used in a proficiency assay for Salmonella spp. research in a cheese matrix. Ultrafiltered Minas cheese was used as the matrix and spiked with a strain of Salmonella Enteritidis. Trehalose was used as cryoprotectant, and freeze-drying was used as the preservation technique. The batch was evaluated for vacuum verification, homogeneity study, and long-term stability testing at temperatures of -70ºC (reference temperature) and -20ºC (storage temperature). The batch was also evaluated for short-term stability at temperatures of 4ºC, 25ºC, and 35ºC (transport temperatures). The results showed vacuum in 95.6% of the bottles, and the batch was considered sufficiently homogeneous. TI remained stable at -70ºC for more than 360 days and at -20ºC for more than 160 days. TI was shown to be stable for up 6 days at 4ºC and 25ºC but not at 35ºC. It is concluded that the methodology used was satisfactory for this TI production for Salmonella spp. research in a cheese matrix. A participação de laboratórios analíticos em ensaio de proficiência permite a verificação da confiabilidade dos resultados gerados nas análises de controle da qualidade. O objetivo deste estudo foi produzir um lote de itens de ensaio (IE) a ser utilizado em ensaio de proficiência (EP) para pesquisa de Salmonella spp. em matriz queijo. Queijo Minas Frescal (QMF) Ultrafiltrado foi utilizado como matriz e fortificado com uma cepa de Salmonella Enteritidis. A trealose foi utilizada como crioprotetor e a liofilização como técnica de preservação. O lote foi avaliado quanto a verificação do vácuo, teste da homogeneidade, estudo da estabilidade em longo prazo nas temperaturas de -70oC (referência) e -20oC (armazenamento) e em curto prazo nas temperaturas de 4, 25 e 35ºC (transporte). O lote apresentou presença de vácuo em 95,6% dos frascos e foi considerado suficientemente homogêneo. Os IE apresentaram estabilidade a -70ºC superior a 360 dias e a -20ºC superior a 160 dias. Os IE demonstraram ser estáveis por até seis dias nas temperaturas de 4 e 25ºC, mas não a 35ºC. Conclui-se que a metodologia utilizada foi satisfatória para produção de IE para o ensaio de pesquisa de Salmonella spp. em matriz queijo.

Cronobacter spp. are considered opportunistic pathogens that cause severe infections in newborns due to the consumption of powdered infant formulas. In 2013, three cases of infection in neonates caused by the Cronobacter spp. were reported in a Maternity Hospital at Teresina, Piauí. The objective of this study was to investigate the outbreak to elucidate the source of contamination, identify the species involved, and assess the genetic relatedness among the clinical isolates. The samples of powdered infant formulas and pasteurized human milk that were ingested by the neonates were analyzed by different cultivation methods. The clinical strains were phenotypically characterized by the Vitek 2.0 system and conventional biochemical tests. To identify the genus and species, polymerase chain reaction targeting gluA and rpoB, respectively, was performed. The isolates were typed by pulsed-field gel electrophoresis using the restriction enzyme Spel. No food sample showed contamination by Cronobacter spp. Three blood isolates were identified as C. malonaticus, two classified as biogroup 9 and one as biogroup 5, and were grouped in the same genotype. Our results suggest that the same clone was responsible for infection in three patients, but the source of contamination could not be identified. Cronobacter spp. são considerados patógenos oportunistas que causam infecções severas em neonatos devido ao consumo de fórmulas infantis desidratadas. Em 2013, três casos de infecção em neonatos associados à Cronobacter spp. foram relatados em um Hospital Maternidade na cidade de Teresina, Piauí. O objetivo deste trabalho foi investigar o surto para elucidar o veículo de contaminação, identificar a espécie envolvida e avaliar a relação genética entre os isolados clínicos. As amostras de fórmulas infantis desidratadas e de leite humano pasteurizado ingeridas pelos neonatos foram analisadas por diferentes métodos de cultivo. As cepas clínicas foram caracterizadas fenotipicamente pelo sistema Vitek 2.0 e por provas bioquímicas convencionais. Para identificação do gênero e espécie, foi realizada a reação em cadeia pela polimerase (PCR) com alvo nos genes gluA e rpoB, respectivamente. Os isolados foram tipificados por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) utilizando-se a enzima de restrição Spel. Nenhuma amostra de alimento apresentou contaminação por Cronobacter spp. Três isolados de hemocultura foram identificados como C. malonaticus, sendo duas classificadas no biogrupo 9 e uma no 5, e foram agrupados no mesmo genótipo. Os resultados sugerem que o mesmo clone foi responsável pela infecção nas três pacientes, porém não foi possível identificar a fonte de contaminação.

Phosphate saline buffer (PBS) and glycine buffer (GB) were evaluated as elution buffers in an adsorption-elution method using a negatively charged membrane associated with quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and seminested PCR for detection of Norovirus genogroup II (NoV GII) from lettuce. In this methodology, PP7 bacterio-phage was used as a virus sample for process control. The qPCR showed more sensitivity than semi-nested PCR for NoV GII detection. The recovery efficiency, using PBS and GB, ranged from 24.72 to 60.78% and 19.48 to 137.26% for NoV GII, and from 0.01 to 0.15% and 0.13 to 6.04% for PP7 bacteriophage, respectively. Elution with GB was more effi-cient for PP7 bacteriophage recovery (p = 0.03), but no difference was seen for NoV GII (p = 0.57). The GB performed better than PBS as an eluent solution and can be consid-ered a methodological improvement. Título PT: Recuperação de Norovirus a partir de alface (Lactuca sativa) utilizando um método de adsorção-eluição com membrana negativamente carregada — comparação de dois tampões de eluiçãoSalina tamponada fosfatada (STF) e tampão glicina (TG) foram avaliados como eluentes em um método de adsorção-eluição, utilizando membrana carregada negativamente associada com reação quantitativa de polimerase em cadeia (qPCR) e semi-nested PCR, para detecção de Norovírus do genogrupo II (NoV GII) a partir de alface. Nesta metodologia, o bacteriófago PP7 foi utilizado como controle do processo. A qPCR apresentou maior sensibilidade do que o semi-nested PCR na detecção de NoV GII. A eficiência de recuperação, utilizando STF e TG, variou de 24,72 a 60,78% e de 19,48 a 137,26% para NoV GII e de 0,01 a 0,15% e de 0,13 a 6,04% para o bacteriófago PP7, respectivamente. A eluição com TG foi mais eficiente na recuperação do bacteriófago PP7 (p = 0,03) em-bora nenhuma diferença tenha sido observada para NoV GII (p = 0,57). O TG apresentou melhor desempenho que a STF como solução para eluição e pode ser considerada uma melhoria do método.

The participation in proficiency testing (PT) is essential for testing laboratories to prove their technical competence. The aim of this study was to produce a quantitative reference material (RM) for PT containing Bacillus cereus in milk powder. A sterile solution of 10% skim milk containing 100 mM sucrose was contaminated with a B. cereus strain in a specific concentration. The homogenized matrix was distributed into vials and freeze-drying. The batch produced was considered sufficiently homogeneous assigning a target standard deviation of 0.25. The RM was stable at ≤ -70 ºC and (-20 ± 4) ºC for 1,058 and 60 days, respectively. In the evaluation of temperatures for the transport of material, the RM was stable at 4, 25 and 35 ºC during four days. It is concluded that the batch produced had all the necessary requirements to be used as items of PT. A participação em ensaios de proficiência é essencial para que um laboratório de ensaio possa ter seu desempenho avaliado por meio de uma comparação interlaboratorial. O objetivo deste trabalho foi produzir um material de referência (MR) quantitativo para EP contendo Bacillus cereus em leite em pó. Uma solução estéril de leite desnatado a 10% contendo 100 mM de sacarose foi contaminada com uma cepa de B. cereus em uma concentração previamente determinada. A matriz foi homogeneizada, distribuída em frascos e liofilizada. O lote produzido foi considerado suficientemente homogêneo atribuindo-se um desvio-padrão alvo de 0,25 log10 UFC/mL. O MR apresentou-se estável a ≤ -70 ºC e (-20 ± 4) ºC durante 1.058 e 60 dias, respectivamente. Na avaliação da influência de diferentes temperaturas para o transporte deste material, o MR se apresentou estável a 4 ºC, 25 ºC e 35 ºC durante o período de quatro dias de estudo. Conclui-se que o lote produzido apresentou todos os requisitos necessários para ser utilizado como itens de EP.