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Orientador: Maria Angela de Almeida Meireles Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Os compostos bioativos têm sido alvo de estudos, devido aos seus benefícios comprovados como fonte primária na prevenção de doenças, através da ingestão de alimentos funcionais. Algumas espécies utilizadas como fonte destes compostos são encontradas na alimentação diária, compondo as especiarias e plantas aromáticas e corantes naturais. Dentre as diversas espécies conhecidas cita-se a cúrcuma (Curcuma longa L.) e a falsa melissa (Lippia alba M.), que apresentam atividades farmacológicas comprovadas como atividade anticâncer, antiinflamatória e anticolinasterase, utilizadas no tratamento de câncer e Alzheimer, respectivamente. O objetivo deste trabalho foi identificar os parâmetros de processo da extração com fluido supercrítico (SFE) para maximização do rendimento de extratos da Curcuma longa L. e Lippia alba M., e comparar a outras metodologias convencionais de extração como hidrodestilação (HD), soxhlet (SoE) e extração com solventes orgânicos a baixa pressão (LPSE). Para a avaliação dos processos foram utilizadas as taxas de extração, tempo de processo, rendimento global de extração e perfil fitoquímico dos extratos, propriedades funcionais como atividade antiproliferativa e antimicobacteriana. Os experimentos foram conduzidos numa unidade de Extração Supercrítica (SFE) com extrator de leito fixo com diâmetro de 2,74×10¿2 m e comprimento de 0,375 m. Para a cúrcuma os experimentos foram realizados a 30 ºC e 300 bar; a mistura de etanol e isopropanol, na proporção 1:1, foi usada como co-solvente. Foram estudados os efeitos da variação da geometria do leito, ou seja, da relação altura/diâmetro do leito (HB/DB), da extração acelerada com solvente e período estático, e extração fracionada. Os extratos foram analisados por CG-DIC, CCD e Espectrofotômetro-UV. Na razão HB/DB de 1,8 obteve-se o maior rendimento em curcuminóides; maiores rendimentos em curcuminóides também foram obtidos com o uso de 50% de co-solvente com período estático de 30 minutos. O maior rendimento obtido na extração supercrítica de falsa melissa foi de aproximadamente 7 % (massa), as extrações a baixa pressão e por Soxhlet obtiveram altos rendimentos (17 e 20%, respectivamente), porém muitas substâncias indesejáveis foram co-extraídas. Para a obtenção dos compostos de interesse da falsa melissa, as melhores condições da SFE foram 80 bar/ 45 ºC para a obtenção de carvona (80%, massa) e 120 bar/45 ºC para a obtenção de limoneno (17%, massa); para todas as metodologias testadas a extração supercrítica promoveu a melhor extração de carvona e a hidrodestilação a extração do limoneno. O amido residual do processo de extração de oleoresina de cúrcuma e gengibre, que podem ser utilizados como amidos especiais, foram observados quanto às suas características físico-químicas e comparados, com amidos comerciais. A fração volátil do extrato de cúrcuma apresentou atividade antiproliferativa seletiva para as células cancerosas de mama e ovário, pulmão, próstata e cólon. A atividade antimicobacteriana foi identificada em todos os extratos de cúrcuma, independente da concentração dos curcuminóides Abstract: Bioactive compounds have been target of studies due to benefits proved as primary source to prevent diseases, through the intake of functional foods. Some species used as compounds bioactive source are presents in dairy foods, which are inside the category of spices, aromatic plants and natural colors. Among many species known, there are turmeric (Curcuma longa L.) and ¿falsa melissa¿ (Lippia alba M.), that have pharmacological activities as anticancer, anti-inflammatory and anticolinasterase activities used on cancer and Alzheimer treatments, respectively. The objective of this work was identify the process parameters of supercritical fluid extraction (SFE) for maximization of the extracts yield of Curcuma longa L. and Lippia alba M., and to compare to other conventional methodologies of extraction as hydrodistillation (HD), Soxhlet (SoE) and low pressure solvent extraction (LPSE) with organic solvents. As a methodology to evaluate the process, some process parameters were used as extraction rate, process time, global extraction yield and phytochemical profile of extracts, some functional properties as antiproliferative and antimycobacterial activities. The essays were conducted in the SFE Unity with fix bed extractor (2.74×10¿2 m of diameter and 0.375 m of length). The turmeric essays were made at 30 ºC and 300 bar; the mixture of ethanol and isopropyl alcohol was used (1:1) as cosolvent. The effects of the bed geometry were studied, in other words, the ratio of bed height / bed diameter (HB/DB); the accelerated solvent extraction and fractioned extraction as well as the effects of the static period were also studied. The extracts were analyzed using GC-FID, TLC and Spectrophotometer ¿ UV. The essay done with HB/DB =1.8 showed the largest yield in curcuminoids; using 50% of cosolvent and static period was also possible to obtain higher contents of curcuminoids. The maximum extract yield obtained for SFE from the ¿falsa melissa¿ was approximately 7% (mass), the LPSE and Soxhlet extraction had very high yields (17 and 20%, respectively), but many undesirable compounds were extracted. To obtain the target compounds of ¿falsa Melissa¿, the best conditions for SFE were 80 bar/45 ºC to obtain large amounts of carvona (80%, mass) and 120 bar/45 ºC to obtain large amounts of limonene (17%, mass); the highest yield in carvone was obtained by the SFE process while the largest yield in limonene was obtained in the hydrodistillation process. The residual starch from SFE process used to obtain turmeric and ginger oleoresins, which can be used as special starches, were observed with their chemical and physical characteristics and compared to industrial starches. The volatile fraction of turmeric extracts showed antiproliferative activity selective for cancers cells of breast and ovary, lung, prostate and colon. The antimycobacterial activity was identified among all turmeric extracts, independently of curcuminoids concentration Doutorado Doutor em Engenharia de Alimentos

Orientadores: Ângela Maria Moraes, Mara Elga Medeiros Braga Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: As lesões de pele representam um grande desafio para os profissionais da saúde, sendo que os curativos mais modernos disponíveis atualmente são, em sua maioria, importados e de alto custo. Existe, assim, a necessidade de criar recursos mais acessíveis à população, os quais utilizem matérias-primas renováveis e sejam produzidos por meio de tecnologias simples e de baixo custo. A quitosana e o alginato são biopolímeros biocompatíveis, apresentam propriedades cicatrizantes e são abundantes na natureza, características estas que os tornam atrativos para a confecção de curativos de lesões de pele. A inclusão de agentes antimicrobianos, como polihexametileno biguanida (PHMB), aos curativos produzidos a partir destes biopolímeros pode levar a um melhor desempenho dos mesmos. Neste trabalho de tese, membranas densas e porosas de quitosana-alginato foram obtidas na presença de diferentes quantidades do tensoativo Pluronic F68. Os resultados obtidos mostraram que a inclusão de até 10% (m/m) de tensoativo provoca o aumento da porosidade (de 0,46 para 0,84), da espessura (de 0,08 para 0,50 mm), da rugosidade (de 1,27 para 21,20 µm), da capacidade de absorção de fluidos (de 14,22 para 21,27 g/g para NaCl a 0,9%) e de vapor d¿água (de 15,5 para 36,5%) e a diminuição da resistência à tração (de 31,1 para 1,1 MPa) e do alongamento na ruptura (de 4,0 para 2,0%) das membranas. Os materiais obtidos não se mostraram citotóxicos a fibroblastos de camundongos. O agente antimicrobiano PHMB foi incorporado às membranas por três diferentes métodos: adição à mistura polimérica, adsorção a partir de solução aquosa e impregnação mediada por CO2 supercrítico. A incorporação de PHMB por adição à mistura polimérica foi considerada como a mais satisfatória, pois não provocou alterações no aspecto e morfologia das membranas e resultou em altas eficiências de incorporação, variando entre 72 e 86 %. Observou-se também adequado controle da cinética de liberação, sendo que grande parte do antimicrobiano incorporado não foi liberada em tampão fosfato-salino (PBS), indicando alta afinidade entre o PHMB e a matriz de quitosana-alginato. As membranas apresentaram atividade antimicrobiana adequada, o que sugere que possam ser empregadas como barreira contra microrganismos comumente presentes em lesões de pele, tais como Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa Abstract: Skin lesions represent a great challenge for health professionals, since most of the existing modern wound dressings are imported and expensive. Therefore, there is a need to create more accessible products to the public, made from renewable raw materials and processed through simple and low cost technologies. Chitosan and alginate are biocompatible biopolymers that have healing properties and are abundant in nature, which are attractive characteristics to the production of wound dressings. The incorporation of antimicrobial agents, such as polyhexamethylene biguanide (PHMB), to these dressings can lead to a better performance. In this work, dense and porous chitosan-alginate membranes were obtained in the presence of different proportions of the surfactant Pluronic F68. It was noticed that inclusion of up to 10% (w/w) Pluronic F68 caused an increase in porosity (from 0.46 to 0.84), thickness (from 0.08 to 0.50 mm), roughness (from 1.27 to 21.20 µm), fluids absorption capacity (from 14.22 to 21.27 g/g for 0.9% NaCl) and water vapor absorption capacity (from 15.5 to 36.5%) and a decrease in tensile strength (from 31.1 to 1.1 MPa) and elongation at break (from 4.0 to 2.0%) of the membranes. The obtained materials were not toxic to mouse fibroblasts. The antimicrobial agent PHMB was incorporated to the membranes through three different methods: addition to the polymeric mixture, adsorption in aqueous solution and via supercritical fluid. The addition to the polymeric mixture was considered the most promising incorporation method, since it had high yields (between 72 and 86 %) and did not cause changes in the membranes aspect and morphology. Release kinetic studies in PBS showed that most of the PHMB loaded remained in the membranes, indicating high affinity between PHMB and the polymeric matrix. The obtained membranes showed adequate antimicrobial activity, having potential applicability as barriers against microorganims commonly found in skin wounds, such as Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa Doutorado Engenharia Química Doutora em Engenharia Química

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As impregnações/deposições de bioativos em matrizes poliméricas são realizados por diferentes métodos, que têm em comum o uso intensivo de solventes orgânicos e um número excessivo de etapas do processo. Alternativamente, a impregnação/deposição supercrítica, realizada com dióxido de carbono a elevadas pressões, apresenta algumas vantagens como a rapidez no processamento, a eliminação do uso de solventes orgânicos e a secagem do produto ao final do processo. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo estudar a viabilidade técnica dos processos de impregnação/deposição de compostos bioativos da copaíba, em 2 curativos comerciais biopoliméricos: SpongostanTM e Promogran®. O método de impregnação/deposição supercrítica (SSI/SSD) com dióxido de carbono e o método clássico por imersão em solvente orgânico foram utilizados e comparados. No método SSI/SSD, quanto maior a pressão e a densidade do solvente, maior o rendimento de oleorresina impregnada/depositada por biopolímero. Observou-se que a SpongostanTM sofreu alterações na área superficial, quando processada a pressões elevadas. A solubilidade da oleorresina no solvente supercrítico foi o fator de maior influência, para o rendimento do processo, relacionado ao aumento de pressão do sistema. Os compostos terpênicos (bioativos da oleorresina) foram detectados nos dois curativos impregnados/depositados. O método de impregnação/deposição clássica por imersão usou o solvente orgânico diclorometano, e nesse método o extrato das folhas e a oleorresina de copaíba foram impregnados/depositados no curativo SpongostanTM. Os resultados dos bioativos impregnados/depositados foram promissores tanto para o extrato de folhas, quanto da oleorresina no biopolímero. Os compostos bioativos da copaíba foram identificados nos curativos impregnados/depositados por espectroscopia de ressonância magnética nuclear. O extrato das folhas e a oleorresina apresentaram atividades antibacterianas, obtendo inibição de crescimento bacteriano de Gram-positiva e Gram-negativa. Em ambos métodos de impregnação/deposição, as estruturas porosas dos curativos foram preservadas. Além disso, observou-se em micrografias que a oleorresina de copaíba teve uma distribuição superficial homogênea nos diferentes biopolímeros independentemente do tipo de método. Os resultados revelam que a solubilidade dos compostos bioativos da copaíba, nos diferentes solventes usados nos processos (dióxido de carbono supercrítico e diclorometano) são fundamentais para o sucesso e viabilidade técnica da impregnação/deposição de compostos bioativos em matrizes biopoliméricas. O método SSI/SSD usando CO2 supercrítico mostrou vantagens em relação ao método por imersão usando diclorometano, porque permitiu o controle das quantidades do bioativo impregnado/depositado, através de ajustes finos na pressão e temperatura, além de evitar a presença de solvente orgânico residual na matriz biopolimérica. Polymeric dressings are used in the treatment of chronic and acute wounds, especially those that are impregnated/deposited with bioactive compounds from medicinal plants to replace synthetic drugs, with less side effect to the patient. The impregnations/depositions of bioactive in polymeric matrices carried out by different methods, which have in common the intensive use of organic solvents and an excessive number of process steps. On the other hand, the supercritical impregnation/deposition, carried out with carbon dioxide at high pressures, has some advantages such as speed in processing, the elimination of the use of organic solvents and the drying of the product at the end of the process. In this context, the present work aimed to study the technical feasibility of the impregnation/deposition processes of bioactive compounds from copaiba, in 2 biopolymeric commercial dressings: SpongostanTM and Promogran®. The supercritical impregnation/deposition method (SSI/SSD) with carbon dioxide and the classic method by immersion in organic solvent were used and compared. In the SSI/SSD method, the higher the pressure and density of the solvent , the greater the yield of oleoresin impregnated/deposited into biopolymer. It was observed that SpongostanTM underwent changes in the surface area, when processed at high pressures. The solubility of oleoresin in the supercritical solvent was the factor of greatest influence, for the process yield, related to the increase in system pressure. The terpenic compounds (bioactives of oleoresin) were detected in the two impregnated/deposited dressings. The classic impregnation/deposition method by immersion used the organic solvent dichloromethane, and in this method the leaf extract and oleoresin from copaiba were impregnated/deposited in the SpongostanTM dressing. The results of the impregnated/deposited bioactives were promising for both leaf extract and oleoresin in the biopolymer. The bioactive compounds of copaiba were identified in the impregnated/deposited dressings by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Leaf extract and oleoresin showed antibacterial activities, obtaining inhibition of Gram-positive and Gram-negative bacterial growth. In both methods of impregnation/deposition, the porous structures of the dressings were preserved. In addition, it was observed in micrographs that the copaiba oleoresin had a homogeneous surface distribution in the different biopolymers regardless of the type of method. The results reveal that the solubility of the bioactive compounds of copaiba, in the different solvents used in the processes (supercritical carbon dioxide and dichloromethane) are fundamental for the success and technical viability of the impregnation/deposition of bioactive compounds into biopolymer matrices. The SSI/SSD method using supercritical CO2 showed advantages than immersion method using dichloromethane, because it allowed the control of the amounts of the impregnated/deposited bioactive, through fine adjustments in pressure and temperature, in addition to avoiding the presence of residual organic solvent in the biopolymer matrix.

Despite advances in ophthalmological pharmacology, the treatment of eye diseases have limitations since conventional methods of drug delivery are not completely effective. A possible solution for the maintenance of therapeutic levels within the eye includes the controlled release systems such as implants, capsules, liposomes and iontophoresis. Supercritical carbon dioxide (scCO2) foaming/mixing methodology (SFM) is an alternative processing method that has unique advantages over standard techniques, including porosity control, absence of organic solvents and reduction of the melting (Tm) and glass transition temperatures (Tg) which is an important condition in what concern the incorporation of thermally and chemically sensitive drugs. In this type of processing, the polymer phase melts due to the dissolution of the fluid phase, and pores are formed upon fluid release. Thus, the main propose of this work was the development of poly (ε-caprolactone) (PCL) ocular implants loaded with drugs of ophthalmological interest (dexamethasone (DXMT), used to prove the concept and due to its lower price and frequent use in the treatment of ophthalmological disorders, and 2-Chloro-N6-(3-iodobenzyl)-adenosine-5'-N-methyluronamide (2-Cl-IB-MECA), a promising drug for future in vivo application) using SFM process. To achieve viable implant dimensions and to evaluate the effect of material porosity in drug release were also defined objectives. Pure PCL, PCL with glycofurol and PCL with glycofurol and the selected drugs were processed by scCO2 at 45 ° C, 200 bar, for two hours. Depressurization rates tested were 10, 20 and 30 bar/min. Produced implants have similar dimensions to ophthalmologic implants currently marketed (length 2 mm and diameter ≤ 0.464 mm). Glycofurol was shown to be important to ensure compatibilization of the polymer/drug mixture because, when used, there was greater drug incorporation. The ideal percentage of glycofurol determinate was 8% (w/w). SEM images show that all samples have a heterogeneous pore distribution influenced by depressurization rate and glycofurol presence: higher depressurization rate produces smaller pores and additive presence generates larger pores at the same depressurization rate. Largest pores obtained were for SFM10. There is a small difference in pore size between SFM20 and SFM30 which suggests that, on a small scale, like the ocular implants one, this variation in the depressurization rate may not be relevant. At same depressurization rate, additive presence generates larger pores. DSC analysis shows that PCL thermal properties were not significantly altered after processing. Dexamethasone implants revealed controlled release for more than 500 hours. Comparing DXMT implants produced by hot melting and processed with supercritical carbon dioxide, it is observed that until 200h of release, SFM implants release is more stable and higher than HM implants. After that time, HM appears to become stable but still lower. This is due to higher porosity in SFM implants. Implants produced by hot melting have smaller surface area and less porosity. Despite a similar release trend, due to porosity effect, 2-Cl-IB-MECA SFM20-G implants have higher drug release than 2-Cl-IB-MECA SFM30-G. 2-Cl-IB-MECA implants showed sustained release over 100 h. Release is greater in the first 60% of release profile and faster without additive addition due to less polymer-drug compatibilization. The amount of drug released in the first hour was eight times higher than the required on an intravitreal injection. Preliminary in vivo tests with PCL implants drug free didn’t reveal adverse side effects. Apesar dos avanços na farmacologia oftalmológica, o tratamento das patologias do olho apresenta limitações uma vez que os métodos convencionais de administração de fármacos não são completamente eficazes. Uma possível solução para a manutenção de níveis terapêuticos no interior do olho inclui os sistemas de libertação controlada na forma de implantes, cápsulas, lipossomas e iontoforese. A metodologia de foaming/ mistura com dióxido de carbono supercrítico é um método de processamento alternativo que tem vantagens únicas relativamente às técnicas padrão, incluindo o controlo da porosidade, a possibilidade de ausência de solventes orgânicos e a redução da temperatura de fusão e de transição vítrea, que é uma condição importante no que se refere à incorporação de fármacos térmica e quimicamente sensíveis. Neste tipo de processamento ocorre fusão da fase polimérica, devido à dissolução da fase do fluido, e formam-se poros aquando da libertação do fluido. Assim, o principal objectivo deste trabalho é o desenvolvimento de implantes oculares de poly(ε-caprolactona) (PCL) carregados com fármacos de interesse terapêutico a nível oftalmológico (a dexametasona (DXMT), utilizada para provar o conceito e devido ao seu baixo preço e à sua utilização frequente no tratamento de patologias oftalmológicas, e 2-Cloro-N6-(3-iodobenzil)-adenosina-5′-N-metiluronamida (2-Cl-IB-MECA), um fármaco promissor para futura aplicação in vivo) utilizando foaming/ mistura com dióxido de carbono supercrítico. Obter implantes de dimensões viáveis e avaliar o efeito da porosidade do material na libertação do fármaco foram também objectivos definidos. PCL pura, PCL com glicofurol e PCL com glicofurol e os fármacos seleccionados, foram processados por dióxido de carbono supercrítico, a 45ºC, 200 bar, durante duas horas. As taxas de despressurização testadas foram 10, 20 and 30 bar/min. Os implantes produzidos têm dimensões semelhantes aos implantes de aplicação oftalmológica actualmente comercializados (comprimento de 2 mm e diâmetro ≤ 0.464 mm). O glicofurol mostrou ser importante para garantir a compatibilização da mistura polímero/ fármaco porque aquando da sua utilização houve maior incorporação de fármaco. A percentagem ideal de glicofurol a utilizar foi de 8% (m/m). As imagens de SEM mostram que todas as amostras apresentam uma distribuição de poros heterogénea influenciada pela taxa de despressurização e presença de glicofurol: maior taxa de despressurização gera poros mais pequenos e a presença de aditivo gera poros maiores para uma mesma taxa de despressurização. Os maiores poros obtidos foram para SFM10. Existe pouca diferença no tamanho de poro entre SFM20 e SFM30 o que sugere que, numa escala pequena, esta variação da taxa de despressurização poderá não ser relevante. A presença de aditivo para uma mesma taxa de despressurização gera poros de maiores dimensões. A análise de DSC mostra que as propriedades térmicas da PCL não foram significativamente alteradas depois do processamento. Os implantes de Dexametasona revelaram libertação controlada durante mais de 500h. Comparando os implantes de DXMT produzidos por hot melting e processados com dióxido de carbono supercrítico, constata-se que até às 200h de libertação, esta é mais estável e elevada no caso do foaming do que no caso do hot melting. Depois deste tempo a libertação dos implantes de HM estabiliza mas continua mais baixa. Isto fica a dever-se a uma porosidade superior nos implantes processados por tecnologia supercrítica. Os implantes produzidos por HM têm uma área de superfície e porosidade menores. Apesar de uma tendência de libertação semelhante, nos implantes de 2-Cl-IB-MECA com uma taxa de despressurização de 20 bar/min a libertação de fármaco é maior do que nos implantes com uma taxa de despressurização de 30 bar/min devido ao efeito da porosidade. Os implantes de 2-Cl-IB-MECA apresentaram libertação sustentada mais de 100 h. A libertação foi muito superior nos primeiros 60% do perfil de libertação e foi mais rápida na ausência de aditivo devido a uma menor compatibilização entre o polímero e o fármaco. A quantidade de fármaco libertada foi, na primeira hora de libertação, oito vezes superior ao requerido numa injecção intra-vítrea. Os testes preliminares in vivo com implantes de PCL sem fármaco não revelaram efeitos secundários adversos.

Dissertação de Mestrado Integrado em Engenharia Química apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra

Dissertação de Mestrado Integrado em Engenharia Química apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra

Orientadores: Theo Guenter Kieckbusch, Mariana Altenhofen da Silva, Mara Elga Medeiros Braga Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: Filmes ativos à base de alginato de sódio reticulados com íons cálcio e/ou bário e contendo natamicina como antimicrobiano foram confeccionados por um processo envolvendo duas etapas. Inicialmente, filmes com baixo grau de reticulação foram formados por casting (1º estágio). Após a secagem, estes pré-filmes foram submetidos a um segundo tratamento por imersão em soluções mais concentradas de agentes reticulantes, gerando quatro diferentes formulações (Ca-Ca, Ba-Ca, Ba-Ba e Ca-Ba, dependendo do íon utilizado no 1º e no 2º estágio de reticulação). Foram avaliadas as propriedades físico-químicas, a cinética de liberação da natamicina e o efeito antimicótico in vitro e em fatias de queijo Prato das diferentes formulações. O Ba2+ apresentou potencialidade para uso em filmes de alginato somente quando a reticulação era combinada com íons Ca2+. Os filmes Ca-Ca e Ba-Ca apresentaram características adequadas para aplicações como embalagem. Os filmes Ba-Ba tiveram um aspecto insatisfatório, alta solubilidade em água e alto intumescimento. O tempo de imersão na solução reticuladora influenciou as propriedades dos filmes Ca-Ba, que apresentaram maior permeabilidade ao vapor de água e ao oxigênio, maior opacidade e rugosidade, consequência de uma reticulação ineficiente da estrutura interna do filme. Três métodos de incorporação de natamicina foram avaliados: o método convencional, em que o antimicrobiano é adicionado diretamente à solução polimérica, a impregnação por imersão dos filmes em soluções contendo natamicina e a impregnação por solvente supercrítico. Filmes ativos confeccionados pelo método convencional apresentaram maior quantidade de natamicina, mas a formação de cristais na superfície afetou a sua transparência, rugosidade e resistência mecânica. O processamento com CO2 supercrítico (200 bar, 40°C) e etanol como cossolvente (10% molar) resultou em filmes Ca-Ca com alta transparência devido à micronização da natamicina, e com carga adequada de antimicrobiano, mas o processo é extremamente lento. Todos os filmes contendo natamicina apresentaram efeito antimicótico frente às espécies testadas, porém uma inibição menos intensa do crescimento fúngico foi observada para os filmes Ba-Ca. Em amostras de queijos Prato, os filmes Ca-Ca sem natamicina foram capazes de inibir o crescimento microbiano por 5 dias a 25°C. Filmes ativos impediram o crescimento por até 30 dias a 25°C. Ensaios de liberação da natamicina em água apresentaram bom ajuste ao modelo difusional da segunda Lei de Fick, com valores de difusividades na ordem de 10-11 cm2/s para os filmes impregnados pelo método convencional e de 10-10 cm2/s para os filmes processados com CO2 supercrítico. Um novo modelo baseado na solução matemática de difusão em dois meios compostos semi-infinitos foi desenvolvido e aplicado aos dados de liberação de natamicina em materiais semi-sólidos (géis de ágar e gelatina e fatias de queijo). Utilizando difusividades de natamicina nos filmes com a mesma atividade de água dos meios sólidos de liberação, o modelo foi adequado para estimar a difusividade nos géis e no queijo Abstract: Alginate antimycotic films crosslinked with calcium and/or barium ions and containing natamycin as antimicrobial agent were prepared in a two step process. Initially, films with a low degree of reticulation were obtained by casting. After solvent evaporation, these pre-films were further crosslinked by immersion in a more concentrated Ca2+ or Ba2+ solution resulting in four different formulations (Ca-Ca, Ba-Ca, Ba-Ba e Ca-Ba, depending on the ion used in the 1st and 2nd stage). Physico-chemical properties, release behavior of natamycin and antimicrobial activity in vitro and on cheese slices of the different film formulations were monitored. Ba2+ ions were relevant as crosslinking agents only if combined with Ca2+ ions. Ca-Ca and Ba-Ca films presented appropriated features as packaging material. Ba-Ba films showed unsuitable attributes such as heterogeneities and high soluble matter in water and high swelling degree. The immersion time in the crosslinking solution affected the properties of Ca-Ba films. These films showed high opacity, surface roughness and water vapor and oxygen permeabilities due to inefficient bulk crosslinking. Three loading methods were tested: the conventional method, with natamycin added directly to the polymeric film forming solution, the absorption technique when prepared films are immersed in solutions containing natamycin and by supercritical CO2 impregnation. Active films manufactured by the conventional method showed higher loading capacities, but crystal deposits across the film affected their transparency, roughness and mechanical properties. The supercritical method (200 bar, 40°C) using ethanol as cosolvent (10% molar) resulted in Ca-Ca transparent films due to natamycin micronization, with suitable loading yields but the process is extremely time-consuming. All films containing natamycin exhibited antimycotic activity against the tested species and the smallest halo inhibition diameter was observed for Ba-Ca films. On cheese slices, Ca-Ca films without natamycin were able to inhibit the microbial growth for 5 days at 25°C, due to low O2 permeability. Active films inhibit the growth up to 30 days at 25°C. Data of natamycin release in water fitted well to Fick¿s diffusional model, with effective diffusivity values of the order of 10-12 cm2/s in conventional loaded films but 10-10 cm2/s for CO2 loaded films. Release tests in aqueous ethanolic solutions indicated a strong influence of the water activity on the diffusivities. A new release model based on the mathematical solution of the diffusion in two semi-infinite composite media was developed and applied to data of natamycin transferred to semi-solid material (agar and gelatine gels, and cheese slices). Using natamycin diffusivities in films with the same water activity of the solid release media, the model was able to estimate natamycin diffusivities in the gels and in cheese Doutorado Engenharia de Processos Doutora em Engenharia Química

Dissertação de Mestrado Integrado em Engenharia Química apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra

Dissertação de mestrado em Engenharia Química apresentada á Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. Abstract This work aimed to obtain silica and composite materials based on silica (bioglass) using "green" techniques and biomimetic catalysts (glutathione (GSH) and cysteamine (Cys)) for further biomedical applications. Silica was prepared using a sol-gel method in aqueous solution developing and innovating an extraction/high pressure/supercritical drying technique (HPSE), using "green" solvents (water, ethanol and carbon dioxide). With this extraction/drying method it was intended to remove residual catalysts and dry the materials prepared for further comparison with conventional drying methods (freeze-drying and evaporation). Bioglass preparation was obtained through the sol-gel method in aqueous solution and freeze drying. Some drug impregnation/deposition tests were conducted, using dexamethasone, in silica and bioglass samples in order to study kinetic release. It was possible to demonstrate that HPSE drying method could remove the most part of the catalysts used. The characteristic bands of silica and bioglass samples were identified using FTIR, leading to the conclusion that the techniques and catalysts used led, indeed, to its formation. The physical characterization of silica samples revealed that density values were between 1.8 and 2 g/cm3. The average pore diameter depended on the catalyst used and the resulting biomimetic reaction mechanism associated: micropores were obtaining with GSH silica samples; mesopores with Cys silica samples, and the for the mixture of two catalysts was observed that the materials had a combination of micro and mesopores resulting from the formation of silica by two mechanisms, with a combination of morphological properties similar to those obtained when the two catalysts are used separately (extreme pH, acid and basic). Surface area highest values corresponded to the lower average pore diameter samples so the number of pores is considerably elevated. In particle size distribution, evaporation and HPSE drying samples led to higher particle size since the milling was hampered by the after drying morphology. Likewise, by scanning electron microscopy (SEM), larger silica samples particles had a more dense visual aspect. In bioglass samples it was very clear the influence of the pH, and in those using chitosan additions. Releasing tests of dexamethasone were done with bioglass and silica samples. It was possible to identify a slow release and an impregnation/deposition of 6μg of drug/mg of sample. Haemocompatibility tests concluded that obtained materials were haemolytic with the exception of HPSE drying silica, with a mixture of catalysts, where the removal of waste reaction was more effective. With this work was possible to obtain promising materials for later use in tissue engineering, particularly in hard tissues. Through "green" and "friendly" environment techniques, it was possible to obtain mesoporous materials with a good drug impregnation/deposition in order to improve bone regeneration. Resumo Este trabalho teve como objectivo a obtenção de sílica e de materiais compósitos à base de sílica (biovidro) através da utilização de técnicas “verdes” e de catalisadores biomiméticos (glutationa (GSH) e cisteamina (Cys)) para aplicações biomédicas. A sílica foi preparada utilizando um método sol-gel em meio aquoso e desenvolvendo uma técnica inovadora de extracção/secagem de alta pressão/supercrítica (HPSE), utilizando apenas solventes “verdes” e “amigos” do ambiente (água, etanol e dióxido de carbono). Com este método de extracção/secagem pretendeu-se remover os catalisadores residuais e secar os materiais preparados para posterior comparação com os métodos de secagem convencionais (liofilização e evaporação). A preparação de biovidro foi efectuada através da metodologia sol-gel, em meio aquoso e a sua secagem foi feita por liofilização. Foram realizados testes de impregnação/deposição de um fármaco, dexametasona, nas amostras de sílica e biovidro para posterior estudo de cinética de libertação. Foi possível demonstrar que o método de secagem HPSE conseguiu remover grande parte dos catalisadores utilizados. Identificaram-se, através da utilização do FTIR, as bandas características das amostras de sílica e de biovidro levando a concluir que as técnicas e catalisadores utilizados conduziram, efectivamente, à sua formação. A caracterização física das amostras de sílica revelou que a massa volúmica tinha valores compreendidos entre 1,8 e 2 g/cm3. Estes materiais apresentavam diâmetro médio de poros dependentes do catalisador biomimético utilizado e consequente mecanismo de reacção associado: obtenção de microporos nas amostras formadas com GSH; mesoporos nas amostras formadas com Cys e, nas amostras com a mistura dos dois catalisadores foi possível observar que os materiais tinham uma combinação de micro e mesoporos, resultante da formação de sílica através de dois mecanismos, havendo combinação de propriedades morfológicas semelhantes às obtidas quando os dois catalisadores são utilizados separadamente (pH’s extremos, ácido e alcalino). Os valores mais elevados de área de superfície corresponderam às amostras de menor diâmetro médio de poros podendo-se concluir que, nestas amostras, o número de poros é consideravelmente elevado. Na distribuição granulométrica, as amostras obtidas por evaporação e secagem HPSE possuíam maior tamanho de partículas uma vez que a moagem esteve dificultada pela sua morfologia após secagem. Da mesma forma, através da microscopia electrónica de varrimento (MEV) identificou-se que as amostras de sílica de maior tamanho de partículas possuíam um aspecto mais denso. Nas amostras de biovidro foi notória a influência do pH conduzindo a um aspecto mais denso nas amostras de pH neutro e na adição de quitosano. Fizeram-se ainda ensaios de libertação de dexametasona, nas amostras de sílica e biovidro, onde foi possível identificar uma libertação lenta e uma impregnação/deposição de 6!g de fármaco por mg de amostra. Realizaram-se testes de hemocompatibilidade de onde se concluiu que os materiais obtidos eram hemolíticos com a excepção da sílica obtida por secagem HPSE, com a mistura dos catalisadores, onde a remoção de resíduos de reacção foi mais eficaz. Com este trabalho foi possível a obtenção de materiais promissores para uma posterior aplicação em engenharia de tecidos, nomeadamente em tecidos duros. Através de técnicas “verdes” e “amigas” do ambiente, obtiveram-se materiais com características mesoporosas, com boa capacidade de impregnação/deposição de fármacos, visando melhorar a regeneração óssea.