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Agradecimentos: This work was supported by São Paulo Research Foundation (FAPESP) (Grants: #2013/20456-9 and #2014/14891-7), National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (Grants: #403865/2013-1, #302763/2014-7 and #305804/2017-0). This study was financed, in part, by the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001 Abstract: A large variety of cheeses exist in Brazil, reflecting historical and cultural aspects. Brazilian artisanal cheeses present differences in the processing, ripening time (when applied), type of milk used, texture, size, shape, color, moisture content, flavor, the use or not of starter cultures, among others. This review describes the main artisanal cheeses produced in Brazil, focusing on general and particular characteristics associated with their making process and geographical identity. Overall, the high variability of the physicochemical data and deficiency of information on sensorial properties of Brazilian artisanal cheeses were noticed. On the other hand, culture-dependent methods were mostly used to expand the knowledge into the microbiology of these cheeses, whereas their microbial diversity has been recently discovered through the use of 16S rRNA gene sequencing-based methods. The certification of a geographical indication for Brazilian artisanal cheeses may encompass an essential milestone for adding value to these products. Regardless of their significance in the diet, culture, and economy of producing regions, taken together, the reviewed literature discloses the need of insightful studies to generate scientific data to support the expansion of the market, while ensuring the protection of historic aspects related to the production of Brazilian artisanal cheeses FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Fechado

Agradecimentos: Authors are grateful to Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo for the financial support (Grants 2014/14891-7 and 2016/09346-5). Dr. Gonzales-Barron acknowledges the financial support provided by the Portuguese Foundation for Science and Technology through the award of an Investigator Fellowship (IF) in the mode of Development Grants (IF/00570). A. S. Sant’Ana acknowledges Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (Grant # 302763/2014-7, 305804/2017-0), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Finance Code 001 Abstract: This study compares dynamic tertiary and competition models for L. monocytogenes growth as a function of intrinsic properties of a traditional Brazilian soft cheese and the inhibitory effect of lactic acid bacteria (LAB) during refrigerated storage. Cheeses were prepared from raw or pasteurized milk with or without the addition of selected LAB with known anti-listerial activity. Cheeses were analyzed for LAB and L. monocytogenes counts, pH and water activity (aw) throughout cold storage. Two approaches were used to describe the effect of LAB on L. monocytogenes: a Huang-Cardinal model that considers the effect of pH and aw variation in a dynamic kinetic analysis framework; and microbial competition models, including Lotka-Volterra and Jameson-effect variants, describing the simultaneous growth of L. monocytogenes and LAB. The Jameson-effect with ? and the Lotka-Volterra models produced models with statistically significant coefficients that characterized the inhibitory effect of selected LAB on L. monocytogenes in Minas fresh cheese. The Huang-Cardinal model [pH] outperformed both competition models. Taking aw change into account did not improve the fit quality of the Huang-Cardinal [pH] model. These models for Minas soft cheese should be valuable for future microbial risk assessments for this culturally important traditional cheese CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES Fechado

Orientador: Anderson de Souza Sant'Ana Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Assegurar-se o uso de matérias-primas e ingredientes com baixas populações iniciais de micro-organismos esporulados, constitui-se uma das principais premissas para obter-se produtos alimentícios estáveis durante a vida de prateleira e microbiologicamente seguros. A nível industrial, são comuns os relatos de recolhimento de produtos submetidos ao tratamento ultra-high temperature (UHT) deteriorados, como leites achocolatados. Em muitos destes casos, a causa da deterioração são micro-organismos pertencentes ao gênero Bacillus spp. e a fonte da contaminação é o cacau em pó. Apesar de sua importância como matéria-prima industrial, existem poucos estudos cujos objetivos tenham sido estudar a ecologia microbiana com referência à micro-organismos esporulados em diferentes unidades produtoras (fazendas de cacau) localizadas em zonas tropicais, como o Brasil. Portanto, o principal objetivo deste trabalho foi avaliar as populações de bactérias esporuladas durante todo o processamento do cacau em pó. 618 amostras foram coletadas de duas fazendas e de três linhas industriais, localizados no estado da Bahia. Além disso, avaliou-se o impacto da fermentação e da torrefação sobre cepas de B. cereus e G. stearothermophilus. Os resultados mostraram que a contaminação por bactérias esporuladas ocorre durante a fermentação, e pode chegar a industria com contagens altas (5.6 log esporos/g). Etapas de torrefação e alcalinização do processo industrial reduziram a população de esporulados em alguns casos (3-6 log esporos/g), porém houve resistência ao processo. Na simulação da fermentação do cacau em laboratório, a população de B. cereus e G. stearothermophilus permaneceu estável (3-4 log esporos/g), com exceção aos dois últimos dias, quando ocorreu um ligeiro aumento. Na simulação do processo de torrefação observou-se que esta pode ter um efeito limitado na inativação de esporos. Estes resultados são importantes pois o conhecimento dos efeitos do processamento do cacau sobre os micro-organismos esporulados, é essencial não somente para a melhoria da qualidade microbiológica, mas também para a melhoria dos métodos de preservação visando-se garantir a segurança e estabilidade microbiológica de produtos formulados com cacau em pó Abstract: Ensuring the use of raw materials and ingredients with low initial populations of spore forming bacteria is one of the main assumptions for obtaining shelf-stable and microbiological safety food products. At industrial level, reports of spoilage of ultra-high temperature (UHT) products such as chocolate milks are common. In many of these cases, the cause of the spoilage is spore forming bacteria belonging to the genus Bacillus spp. and the source of contamination is cocoa powder. Despite its importance as an industrial raw material, there are few studies whose objectives have been to study microbial ecology with reference to spore forming bacteria in different production units (cocoa farms) located in tropical zones, such as Brazil. Therefore, the main objective of this work was to evaluate populations of spore forming bacteria along the processing of cocoa powder. 618 samples were collected from two farms and three industrial lines, located in the state of Bahia, Brazil. In addition, the impact of fermentation and roasting on B. cereus and G. stearothermophilus strains was evaluated. The results showed that contamination by spore forming bacteria occurs during fermentation, and this contamination can reach industry with high counts (5.6 log spore/g). Roasting and alkalization stages of the industrial process reduced the spore population in some cases (3-6 log spore/g), but there was resistance to the process. In the simulation of cocoa fermentation in the laboratory, the population of B. cereus and G. stearothermophilus remained stable (3-4 log spore/g), except for the last two days, when a small increase occurred. In the simulation of the roasting process it was observed that this may have a limited effect on the inactivation of spores. These results are important because knowledge of the effects of cocoa processing on spore population is essential not only for the improvement of microbiological quality but also for the improvement of preservation methods in order to guarantee microbiological safety and stability of products formulated with cocoa powder Doutorado Ciência de Alimentos Doutora em Ciência de Alimentos CAPES 001 CNPQ 208343/2017-2

Orientador: Anderson de Souza Sant'Ana Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Os queijos artesanais brasileiros (QAB) apresentam características singulares que podem refletir a história, a cultura e o estilo de vida das comunidades tradicionais produtoras. A microbiota endógena destes queijos, constituída principalmente por bactérias láticas (BAL), atua nas reações bioquímicas precursoras de texturas, aromas e sabores distintos. O objetivo deste estudo foi estudar as propriedades tecnológicas e probióticas de BAL isoladas a partir de QAB produzidos nas 5 regiões do país. No primeiro capítulo são reportados resultados da avaliação do potencial tecnológico (taxa de acidificação, proteólise, lipólise, atividade antimicrobiana e crescimento em diferentes condições de pH, sais biliares e cloreto de sódio) de 1.002 cepas de BAL isoladas a partir de 578 amostras de QAB. Para isso foi realizado um screening de alta performance em microplacas de 96 poços e os dados analisados no software R. O intuito foi selecionar as melhores cepas (n=220) com potencial para aplicação em culturas lácteas. No segundo capítulo, são apresentados resultados sobre a ocorrência de cepas do gênero "Enterococcus" e aspectos relacionados à sua segurança e potencial aplicação como culturas lácteas, devido ao papel controverso deste gênero em alimentos. No terceiro capítulo, são apresentados resultados de testes relacionados à formação de aroma, textura e produção de antimicrobianos de origem proteica das 220 BAL selecionadas. No quarto capítulo são reportados os resultados dos testes de potencial probiótico das 220 BAL, avaliado por meio da resistência à condições encontradas no trato gastrointestinal (TGI), propriedades de adesão e presença de genes de virulência. Uma cepa de Lactobacillus plantarum (1QB77) foi escolhida e empregada na produção de microqueijos em co-cultura com coquetéis de cepas de Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus. O quinto capítulo reporta resultados sobre a aplicação do método de engenharia evolutiva (EV) para a cepa 1QB77 a fim de melhorar sua performance na etapa inicial de acidificação do leite. Os resultados mostraram uma grande diversidade de BAL com potencial tecnológico, pertencentes aos gêneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc e Pediococcus. A espécie de L plantarum foi a mais recorrente nos QAB, demonstrando grande heterogeneidade intra-espécie, de acordo com a região de isolamento. Houve associação entre algumas propriedades das BAL e a fonte de isolamento, como a produção de antimicrobianos de origem proteica ativos contra L. monocytogenes e os queijos Minas Artesanal e a produção de enzimas lipolíticas com os queijos do Marajó. A associação de métodos de screening de alto rendimento e análise multivariada proporcionou a seleção racional de um elevado número de cepas, agrupadas de acordo com seu potencial probiotico, biopreservativo ou como culturas adjuntas para potencial aplicação na produção de queijos, podendo contribuir para a segurança, qualidade e valorização de culturas regionais. O gênero "Enterococcus" foi considerado componente natural da microbiota de QAB, principalmente dos queijos Marajó, Coalho e Manteiga e 63% apresentaram potencial para aplicação como culturas iniciadoras e/ou biopreservadoras, devido a não produção de hemolisinas e sensibilidade a vancomicina. A cepa Lb. plantarum 1QB77 preencheu os principais critérios in vitro para avaliação de potencial probiótico, reduzindo em até 4 unidades logarítmicas a contagem dos patógenos testados ao longo da maturação dos microqueijos e após submissão às condições simuladas do TGI. O método de EV empregado para melhorar a performance da cepa Lb. plantarum 1QB77 aumentou em seis vezes a taxa de acidificação do leite das cepas evoluídas, em comparação com as parentais (não evoluídas), e aumentou em 90% a viabilidade desta cepa quando exposta à condições simuladas do TGI. O protocolo de produção de microqueijos (~ 190 mg) desenvolvido neste estudo apresentou resultados dentro dos apresentados na produção em larga escala (0,5-1 kg) para queijos de média umidade, configurando excelente alternativa para estudos envolvendo novas formulações, novas culturas, porém, com redução drática dos custos. Em suma, os QAB demonstraram ser excelentes fontes de bactérias láticas endógenas com potencial para serem aplicadas como culturas adjuntas ou biopreservativas na produção de produtos lácteos Abstract: Brazilian artisanal cheeses (BAC) have unique characteristics, which reflect the history, culture, and lifestyle of traditional producing communities. The endogenous microbiota of these cheeses is mainly composed of lactic acid bacteria (LAB). These microorganisms play a crucial role in biochemical reactions that precede different textures, aromas, and flavors. This study aimed to investigate the technological and probiotic properties of LAB isolated from BAC produced in the five regions of Brazil. Chapter one shows results about the technological potential (acidification rate, proteolysis, lipolysis, antimicrobial activity, and growth under different pH conditions, bile salts, and sodium chloride) of 1,002 BAL strains isolated from 578 samples of BAC. For this purpose, high-throughput screening was performed using 96-well microplates, and all data analyzed using software R. The best strains (n=220) were selected due to its potential to be applied in dairy cultures. Chapter two aimed to investigate the occurrence of Enterococcus sp. strains and to access its safety and potential application as dairy cultures, due to the controversial role of Enterococci sp. in food. In chapter three, properties related to diacetyl (related to flavor), exopolysaccharide (EPS) (related to texture), and antimicrobials (with protein origin) formation of selected LAB (n =220) was accessed. Chapter four focused on studying some probiotic properties of the same LAB strains (n=220), as resistance to conditions found in the gastrointestinal tract (GIT), analysis of adhesion, and presence of virulence genes. Besides, a strain of Lactobacillus plantarum (1QB77) was chosen and used as adjunct culture in the manufacturing of microcheeses, in co-culture with cocktails containing Listeria monocytogenes and enterotoxigenic Staphylococcus aureus strains, separately. The fifth chapter aimed to apply a method called evolutionary engineering (EV) (or adaptative engineering) in order to improve the performance of Lb. plantarum (1QB77) in the initial step of the cheese process (acidification of milk). The results showed a great diversity of LAB with technological potential belonging to Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, and Pediococcus genus. The Lb. plantarum species was the most recurrent in BAC, showing a great heterogeneity intra-species, according to cheese and region of isolation. There was an association between some properties of LAB and source of isolation, such as the production of antimicrobials with protein origin active against L. monocytogenes and Minas Artesanal cheeses and production of lipolytic enzymes with cheeses from Marajó. The association between high-performance screening methods and multivariate analysis provided a rational selection of a high number of strains, making it possible to group them according to their features in probiotic, biopreservative, and adjunct cultures, which may contribute to safety, quality and enhancement of regional cultures in the dairy process. The Enterococcus genus was considered a natural component of BAC microbiota, mainly in Marajó, Coalho, and Manteiga cheeses, and 63% had the potential for application as a starter or biopreservative cultures, due to the absence of hemolysins and susceptibility to vancomycin. Strain Lb. plantarum 1QB77 met the main in vitro criteria for the evaluation of probiotic potential being able to reduce counts of pathogens tested along microcheeses process by up to 4 logarithmic units from the whole process (22 days of ripening) after submission to the simulated conditions of the GIT. The EV method used to improve the performance of Lb. plantarum 1QB77 increased milk acidification rates of evolved strains in six times, compared to parental (non-evolved) strains, and increased the viability of evolved strains by 90% when exposed to simulated GIT conditions. The microcheese production protocol (~ 190 mg) developed in this study showed results within those presented in large scale production (~ 0.5-1 kg) for medium moisture cheeses, configuring an excellent alternative for studies involving new formulations, new cultures, but with a drastic reduction in costs. In short, BAC has proved to be an excellent source of endogenous lactic acid bacteria with high potential to be applied as an adjunct or biopreservative cultures in the production of dairy products Doutorado Ciência de Alimentos Doutora em Ciência de Alimentos FAPESP 2015/25641-4; 2017/03899-5