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Orientadora : Elaine Machado Benelli Co-orientador : Emanuel Maltempi de Souza Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2007 Inclui bibliografia

Orientadora: Profª. Drª. Ana Claudia Bonatto Coorientadora: Profª. Drª. Roseli Wassem Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 28/11/2019 Inclui referências Resumo: A fixação biológica de nitrogênio é o processo onde ocorre a conversão de nitrogênio gasoso em amônia através da atividade do complexo enzimático da nitrogenase presente em bactérias diazotróficas. Sinorhizobium fredii NGR234 é uma bactéria capaz de fixar nitrogênio no interior de estruturas conhecidas como nódulos, e apresenta um sistema de secreção tipo III que secreta cinco proteínas efetoras (NopM, NopJ, NopT, NopP e NopL). Estas proteínas provocam modificações na célula vegetal e determinam a eficiência de nodulação de diferentes maneiras dependendo da planta hospedeira. Phaseolus vulgaris (feijão comum) é uma leguminosa com grande importância na alimentação nos países da América Latina e África. O feijão pode se associar a S. fredii NGR234 e formar nódulos na raiz, onde ocorre a fixação de nitrogênio. Nesta associação, o sistema de secreção de S. fredii NGR234 tem efeito negativo na nodulação de P. vulgaris. O processo de nodulação depende do reconhecimento planta-bactéria e envolve uma cascata com várias etapas, incluindo a secreção de flavonóides pelas raízes da planta e a produção de fatores Nod, polissacarídeos e proteínas efetoras (Nops) pela bactéria. Pouco se conhece sobre os aspectos moleculares do reconhecimento das proteínas Nops pela da planta. Assim, este trabalho teve como objetivo identificar os genes de P. vulgaris diferencialmente expressos em resposta aos Nops de S. fredii NGR234, como também as vias metabólicas em que eles estão envolvidos. Para tanto, o transcriptoma de P. vulgaris inoculado com as estirpes selvagem NGR234 e mutantes nopM-, nopJ- e rhcN- foi analisado. As amostras de RNA foram obtidas em duas fases de desenvolvimento do nódulo, com 10 dias (primórdio) e 21 dias (nódulo). As bibliotecas de cDNA foram sequenciadas, os reads gerados foram mapeados no genoma de P. vulgaris e os genes foram comparados entre as condições testadas (NGR234 vs nopJ-, NGR234 vs nopM-, NGR234 vs rhcN, rhcN- vs nopJ-, rhcNvs nopM- e nopJ- vs nopM-) para primórdio e nódulo. Os genes considerados diferencialmente expressos entre as condições (valor de p ? 0.05 e fold-change ? 2) foram categorizados quanto a função no programa Mapman v 3.5.1. Os resultados sugerem que os Nops translocados pelo sistema de secreção tipo III de NGR234 no citoplasma de P. vulgaris ativam a transcrição de vários genes envolvidos na defesa da planta e resposta ao estresse. Abstract: Biological nitrogen fixation is the process of dinitrogen conversion into ammonia through the activity of the nitrogenase enzyme complex present in diazotrophic bacteria. Sinorhizobium fredii NGR234 is a bacterium capable of fixing nitrogen inside structures known as nodules, and presents a type III secretion system that secretes five effector proteins (NopM, NopJ, NopT, NopP and NopL). These proteins cause modifications in the plant cell physiology and determine nodulation efficiency in different ways depending on the host plant. Phaseolus vulgaris (common bean) is a legume of great importance for food in Latin America and Africa countries. Beans can associate with S. fredii NGR234 and form nodules in the root where nitrogen fixation occurs. In this association, the S. fredii NGR234 secretion system has a negative effect on P. vulgaris nodulation. The nodulation process depends on the plant-bacteria recognition and involves a cascade of many steps, including flavonoids secretion by plant roots and the production of Nod factors, polysaccharides and effector proteins (Nops) by the bacteria. The molecular aspects of Nops recognition by the host are poorly known. Thus, this work aimed to identify the P. vulgaris genes differentially expressed in response to S. fredii NGR234 Nops, as well as the metabolic pathways in which they are involved. For this, the P. vulgaris transcriptome after inoculation with NGR234 wild-type strain and nopM-, nopJ- and rhcN- mutants was analysed. RNA samples were obtained in two phases of nodule development, 10 days (primordia) and 21 days (nodule). cDNA libraries were sequenced and the reads obtained were mapped into the P. vulgaris genome. The genes were compared between the conditions tested (NGR234 vs nopJ-, NGR234 vs nopM-, NGR234 vs rhcN-, rhcN- vs nopJ-, rhcN - vs nopM- and nopJvs nopM-) for primordia and nodule samples. Genes differentially expressed between conditions (p value ? 0.05 and fold change ? 2) were categorized by function in the Mapman v 3.5.1 program. The results suggest that Nops translocated by the NGR234 type III secretion system in the P. vulgaris cytoplasm activate the transcription of several genes involved in plant defense and stress response.

Orientadora: Profª. Dra. Lupe Furtado Alle Coorientadores: Profª. Dra. Ana Claudia Bonnato, Prof. Dr. Michel Fleith Otuki Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 28/03/2019 Inclui referências: p. 45-48 Resumo: Os efeitos de uma dieta rica em carboidratos refinados (dieta HC), assim como a suplementação de whey protein isolado em uma dieta rica em carboidratos refinados (dieta HCW) e de uma dieta basal normocalórica e normoglicídica (dieta BD), na expressão de Chrebp? e Chrebp? no tecido adiposo e fígado são pouco entendidos. O objetivo deste estudo foi avaliar se uma dieta rica em açúcar refinado com ou sem a adição de whey protein isolado, ou uma dieta basal são capazes de influenciar a saciedade, induzir mudanças na expressão de Chrebp, alterar a infiltração de células imunes no tecido adiposo e modular o desenvolvimento de esteatose hepática em camundongos. Desenho e métodos: Camundongos machos de linhagem suíça (Mus musculus) foram divididos em três grupos com 10 animais em cada, e foram alimentados com três tipos diferentes de dietas: 1) dieta HC (grupo HC), 2) dieta HC mais whey protein isolado (grupo HCW) e 3) dieta basal (grupo BD), em um total de 12 semanas de experimento. Ao fim das 12 semanas, foram mensurados o consumo alimentar e de energia, a expressão de Chrebp? e Chrebp? no fígado e no tecido adiposo, a atividade enzimática da mieloperoxidase (MPO) no tecido adiposo, e também a análise histológica do fígado. Resultados: Observou-se que as dietas podem influenciar significativamente a expressão gênica em ambos os tecidos, e que, diferente do grupo HC, o grupo HCW foi protegido da esteatose hepática. Chrebp? no fígado teve sua expressão influenciada pela atividade da MPO, provavelmente devido a mecanismos de inflamação sistêmica de baixo grau, gerados pelo aumento da adiposidade visceral. A expressão de Chrebp? mostrou-se muito alta em relação a Chrebp? no fígado do grupo HC, um padrão que ocorre apenas em um ambiente rico em glicose, sinalizando uma potencial resistência à insulina nos tecidos periféricos. Conclusões: As dietas foram capazes de influenciar a expressão de Chrebp ? e ?, tanto no tecido adiposo quanto no fígado. A dieta HC parece induzir um aumento na infiltração de células imunes no tecido adiposo, e o grupo de HCW foi protegido da esteatose hepática. Palavras-chave: Fator de transcrição. Lipogênese de novo. Whey protein isolado. Abstract: The effects of a high refined carbohydrate-containing diet (HC diet), as well as the supplementation of whey protein isolate in a high refined carbohydratecontaining diet (HCW diet) and a basal normocaloric and normoglicid diet (BD diet), in the expression of Chrebp? and Chrebp? in adipose tissue and liver are poorly understood. The objective of this study was to evaluate whether a high refined carbohydrate-containing diet with or without whey protein isolate supplementation, or a basal diet are able to influence satiety, induce changes in Chrebp expression, alter the infiltration of immune cells in adipose tissue and modulate the development of hepatic steatosis in mice. Design and methods: Male Mus musculus Swiss lineage mice were divided into three groups with 10 animals each, and fed three different types of diets: 1) HC diet (HC group), 2) HC diet plus whey protein isolated (HCW group) and 3) basal diet (BD group), in a total of 12 weeks of experiment. At the end of the experiment, food and energy consumption, Chrebp? and Chrebp? expression in liver and adipose tissue, myeloperoxidase enzymatic activity (MPO) in adipose tissue, as well as liver histological analysis were measured. Results: It was observed that diets can strongly influence the gene expression in both tissues, and that the HCW group was protected from hepatic steatosis, but not HC group. Chrebp? in the liver had its expression influenced by MPO activity, probably due to mechanisms of low-grade systemic inflammation generated by increased visceral adiposity. Chrebp? expression was very high in relation to Chrebp? in the liver of the HC group, a pattern that occurs only in a glucose-rich environment, signaling a potential insulin resistance in the peripheral tissues. Conclusions: Diets were able to influence the expression of Chrebp ? and ?, both in adipose tissue and in the liver. The HC diet appears to induce an increase in the infiltration of immune cells into adipose tissue, and the HCW group was protected from hepatic steatosis. Key-words: Transcription factor. De novo lipogenesis. Whey protein isolate.

Orientadora : Profª Drª Roseli Wassen Coorientadora : Profª Drª Ana Claudia Bonatto Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 31/03/2017 Inclui referências Resumo: O processo de fixação biológica de nitrogênio atmosférico por rizóbios é de grande importância uma vez que reduz a necessidade de fertilizantes nitrogenados em culturas de interesse agronômico. Entre os rizóbios, S. fredii NGR234 tem sido amplamente estudado devido a sua grande faixa hospedeira. O intercâmbio de sinais moleculares requerido para uma nodulação ótima de NGR234 em leguminosas tem sido muito estudado, mas alguns fatores nele ainda têm função desconhecida. Entre eles o par regulatório NodV e NodW. Através do estudo do transcriptoma do mutante nodVW?, em comparação com o transcriptoma da estirpe selvagem, foram determinados alguns alvos de regulação por este sistema. Dentre eles os operons NGR_b03250-NGR_b03190, rmlB-wbgA, NGR_c06030-NGR_c06080, nopB-rhcU, nopC-NGR_a00520, e os genes nopT, nopJ, fixF, nodU e rgpF que são modulados por NodV e NodW em presença de flavonoides, enquanto que os operons NGR_c26130-NGR_c26200, NGR_c26090-NGR_26120, e os genes NGR_c30010 e hmgA são modulados na ausência destas substâncias. Os operons pqqEDCBA, cysHDN, cysG-NGR_c13080, thuEFGKAB e o gene suhB são modulados nas duas condições. Através do uso de fusões transcricionais das regiões regulatórias dos genes nopJ, nopB-rhcU, nopC-NGR_a00520, nopT, fixF e pqqEDCBA com o gene repórter de proteína fluorescente verde (GFP), a expressão diferencial destes foi confirmada. Ademais, foi detectada a ligação de NodW á região regulatória de nopB, in vitro, sugerindo que o sistema NodV-NodW pode participar diretamente da ativação deste gene. Além disso, foi feita uma nova descrição dos genes modulados por flavonoides em NGR234, confirmando o descrito por outros autores, através de RNA-seq. Desta maneira, este trabalho agrega informação para um maior entendimento do diálogo molecular rizóbio-leguminosa e abre portas para novas pesquisas no futuro. Palavras-chave: Sinorhizobium fredii NGR234, nodV, nodW, RNA-seq. Abstract: The process of biological nitrogen fixation by rhizobia is of great importance since it reduces the need for nitrogen fertilizers in crops of agronomic interest. Among rhizobia, S. fredii NGR234 has been extensively studied due to its large host range. The exchange of molecular signals required for optimal nodulation of NGR234 in legumes has been well studied, but some factors in it still have unknown function. Among them is the NodV and NodW regulatory pair. Through the transcriptome study of the nodVW? mutant in comparison with the wild-type transcriptome some regulatory targets have been described for this system. Among them, the operons, NGR_b03250-NGR_b03190, rmlB-wbgA, NGR_c06030-NGR_c06080, nopB-rhcU, nopC-NGR_a00520, and the nopT, nopJ, fixF, nodU and rgpF genes are modulated by NodV and NodW in the presence of flavonoids, while the operons NGR_c26130-NGR_c26200, NGR_c26090-NGR_26120, and the genes NGR_c30010 and hmgA are in the absence of these substances. The pqqEDCBA, cysHDN, cysG-NGR_c13080, thuEFGKAB and suhB gene operons are modulated under both conditions. Through the use of transcriptional fusions of the regulatory regions of the nopJ, nopB-rhcU, nopC-NGR_a00520, nopT, fixF and pqqEDCBA genes with the green fluorescent protein (GFP) reporter gene, the differential expression of these genes has been confirmed. In addition, NodW binding to the regulatory region of nopB-rhcU has been detected in vitro, suggesting that the NodV-NodW system can participate directly in the activation of this gene. Additionally, a new description of the flavonoid-modulated genes in NGR234 has been made, confirming the one described by other authors, through RNA-seq. Therefore, this work aggregates information for a better understanding of rhizobial-legume molecular conversation, and opens the door to further research in the future. Key-words: Sinorhizobium fredii NGR234, nodV, nodW, RNA-seq.

Orientadora : Profª Drª Roseli Wassem Co-orientadora : Profª Drª Ana Claudia Bonatto Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 30/03/2016 Inclui referências : f. 95-111 Área de concentração Resumo: Sinorhizobium fredii NGR234 é um microrganismo capaz de fixar nitrogênio e é considerado um organismo modelo para estudos envolvendo interação simbiótica, devido a diversos trabalhos realizados com essa estirpe e ao conhecimento que se tem acerca de seu genoma. As interações planta-bactéria são consequência da troca de sinais moleculares específicos entre as espécies, de forma coordenada e integrada. Conhecer, a nível molecular e genético, as mudanças que ocorrem no metabolismo desses organismos, além da regulação de sinais e a expressão diferencial de genes quando o rizóbio se encontra sob diferentes condições é de grande importância para o processo de simbiose. Com o intuito de identificar diferenças no processo de interação entre S. fredii NGR234 e Phaseolus vulgaris, Tephrosia vogelii e Vigna unguiculata, foi analisado o transcriptoma de NGR234 através de RNA-Seq buscando os genes diferencialmente expressos. A confirmação de alguns genes que se mostraram diferenciais foi realizada através de RT-qPCR e de fusão transcricional a gene repórter (gfp) para observação de fluorescência em cortes de nódulos utilizando microscopia confocal. Além disso, esses genes foram analisados, com a finalidade de indicar as vias metabólicas e processos celulares de S. fredii NGR234 que esses genes pertencem, e assim, discutir a nível gênico as causas e consequências dessas diferenças. Como resultado, um pequeno número de genes diferencialmente expressos foi associado com o tipo de nódulo (determinado ou indeterminado), e várias evidências confirmaram que uma melhor fixação de nitrogênio ocorre em T. vogelii e em V. unguiculata. Os genes que compõem os operons do sistema de secreção tipo três (TTSS) e de síntese de lipopolissacarídeos ricos em ramnose foram mais expressos nos bacteroides de P. vulgaris e T. vogelii, em relação aos de V. unguiculata. Além das análises de genes diferencialmente expressos, uma análise preliminar de identificação de ncRNAs também foi realizada, já que nessa espécie não existe um amplo conhecimento acerca dos ncRNAs presentes em seu genoma. De um modo geral, esse trabalho gerou um conjunto de dados que poderá ser utilizado como referência para futuras investigações e estudos de vias e sistemas envolvidos na simbiose. Esses estudos serão importantes para um entendimento mais específico do processo de nodulação. Abstract: Sinorhizobium fredii NGR234 is a microorganism that is able to fix nitrogen. It is considered a model organism in studies involving symbiotic interaction due to extensive research with this strain and what is known about its genome. Plant-bacteria interactions are a result of the exchange of specific molecular signals between species, in a coordinated and integrated way. The information about molecular and genetic changes that occur in the metabolism of these organisms, the signaling regulation, and the differential expression when the Rhizobium is under different conditions is of great importance in the process of symbiosis. In order to identify differences in the interaction process between S. fredii NGR234 and Phaseolus vulgaris, Tephrosia vogelii and Vigna unguiculata, the NGR234 transcriptome was analyzed using RNA-Seq, seeking differentially expressed genes. Confirmation of genes that seemed differential was performed by RT-qPCR and by confocal microscopy with transcriptional fusion with gfp as reporter gene. In addition, these genes were analyzed in order to recognize the S. fredii NGR234 metabolic pathways and cellular processes in which they take part, and thus discuss the causes and consequences of these differences. As a result, a small number of differentially expressed genes was associated with the type of nodule (determinate or indeterminate), and multiple lines of evidence confirmed that better nitrogen fixation occurs in T. vogelii and V. unguiculata. The genes present in the operons of the Type Three Secretion System (TTSS) and the synthesis of lipopolysaccharides rich in rhamnose were more expressed in P. vulgaris and T. vogelii bacteroids when compared to V. unguiculata. ncRNAs preliminary analysis was also performed, since there is no extensive knowledge about the ncRNAs that are present in the S. fredii NGR234 genome. Overall, this study has generated a data set which can be used as reference for future research and studies of the pathways and systems involved in symbiosis. These studies will be important for a more specific understanding of the nodulation process.

Orientadora : Profª Drª Roseli Wassem Coorientadora : Profª Drª Ana Claudia Bonatto Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 30/04/2013 Inclui referências : f. 46-49;65-73 Área de concentração Resumo: Rhizobium sp. NGR234 é um bacilo gram-negativo pertencente à família Rhizobiaceae que tem a capacidade de estabelecer uma relação simbiótica e induzir a formação de nódulos radiculares com 112 gêneros da família Fabaceae, sendo considerado um simbionte promíscuo em comparação com outros rizóbios. Sabe-se que a expressão de genes envolvidos na nodulação e fixação de nitrogênio em Rhizobium sp. NGR234 é controlada por uma complexa cascata regulatória cujo regulador chave é NodD1. No entanto, outros ativadores transcricionais, tais como SyrM1 e SyrM2, também estão envolvidos no controle dessa cascata e ainda não possuem suas funções muito bem esclarecidas. No presente trabalho, foram construídas estirpes mutantes nos genes syrM1 e syrM2, além de uma estirpe duplo mutante syrM1/syrM2. Essas estirpes mutantes foram avaliadas quanto à sua capacidade de nodulação, sendo possível observar que SyrM2 aumenta o número de nódulos nas raízes de Phaseolus vulgaris e diminui a nodulação em Tephrosia vogelii, Macroptilium atropurpureum e Vigna unguiculata. Uma complementaridade das atividades de SyrM1 e SyrM2, que é hospedeiro-específica, também foi observada em Phaseolus vulgaris, Tephrosia vogelii e Vigna unguiculata. A análise da expressão de potenciais genes alvo mostrou que os genes rhcC1 e nodPQ possuem expressão constitutiva, não sendo induzidos por flavonóides nem regulados por SyrM1 ou SyrM2. Também foi observado que SyrM2 pode estar diretamente envolvido na ativação de y4xD e nodD2 e é capaz de aumentar indiretamente a expressão de nopB. Ensaios de EMSA (ensaio de alteração da mobilidade eletroforética) confirmaram que SyrM2 reconhece e interage fisicamente com a região regulatória de y4xD e nodD2. Além disso, SyrM1 pode desempenhar uma atividade repressora em y4xD e nopB, que atenua os níveis de expressão desses genes. Palavras-chave: Rhizobium sp. NGR234, nodulação, syrM1 e syrM2. Abstract: Rhizobium sp. NGR234 is a gram-negative bacillus belonging to the family Rhizobiaceae that has the ability to establish a symbiotic relationship and induce the development of root nodules with 112 genera of the family Fabaceae; it is considered a promiscuous microsymbiont compared with other rhizobia. It is known that expression of genes involved in nodulation and nitrogen fixation of Rhizobium sp.NGR234 is controlled by a complex cascade whose regulatory key regulator is NodD1. However, other transcriptional activators, such as SyrM1 and SyrM2, are also involved in the control of this cascade and their functions have not been clearly established. In the presentstudy, we constructed mutant strains in both syrM1 and syrM2 genes and a double mutant strain syrM1/syrM2. These mutant strains were evaluated for their ability to nodulate host plants, revealing that syrM2 increases the number of nodules on the roots of Phaseolus vulgaris and decreases inTephrosia vogelii, Macroptilium atropurpureum and Vigna unguiculata. A potential complementary activity of syrM1syrM2, which is host-specific, was also observed in Phaseolus vulgaris, Tephrosia vogelii and Vigna unguiculata. Analysis of the expression of potential target genes showed that rhcC1 and nodPQ genes have constitutive expression and are not regulated by syrM1 or syrM2 and are not induced by flavonoids. It was also observed that SyrM2 may be directly involved in activating y4xD and nodD2 and can indirectly increase the expression of nopB. EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays) assays confirmed that SyrM2 recognizes and physically interacts with the regulatory region of y4xD and nodD2. Furthermore, a SyrM1may act as a repressor of y4xD and nopB genes, which attenuates the expression levels of these genes. Key-words: Rhizobium sp. NGR234, nodulation, syrM1 e syrM2.