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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The advanced oxidation protein products (AOPPs) are a new class of compounds identified as markers of oxidative damage to proteins. The physiology role of these products is not limited to assess the oxidative stress, and these products may actively participate in the inflammatory process, promoting different cell disorders, including induction of apoptosis and alterations in the processes of cell proliferation and differentiation. Myeloperoxidase (MPO)-derived hypochlorous acid (HOCl) produced by activated neutrophils contribute significantly to AOPP formation, and human serum albumin (HSA) is considered the main protein responsible for the generation of AOPPs However, the molecular composition of AOPPs is unclear. Additional pathways and protein targets for AOPP formation are largely unknown. The aim of this study was to induce the formation of AOPPs in vitro through Fenton reaction and to investigate whether this generation could be counteracted by N-acetylcysteine (NAC) and fructose-1,6-bisphosphate (FBP). In addition, this study aimed to examine whether AOPPs produced by Fenton reaction may induce the activation of the gene transcription of inflammatory molecules, including the nuclear factor-κB (NF-κB), cyclooxygenase-2 (COX-2) and interleukin-6 (IL-6) in human embryonic kidney cells (HEK 293). Additionally, it was investigated the collagen as a potential source of AOPPs via its exposure to HOCl. The HOCl-modified collagen stimulated the production of oxidants, such as HOCl and superoxide anion radical (O2 -), and pro-inflammatory agents, such as nitric oxide (NO) and AOPPs in human neutrophil. Furthermore, HOCl-modified collagen induced a decrease in cell viability and an increase of apoptosis in these cells. Finally, alpha-tocopherol inhibited the release of oxidants, decreased cell viability and apoptosis, suggesting a therapeutic potential means to prevent deleterious effects caused by AOPPs. Furthermore, these findings indicate that alternative pathways can form AOPPs, and these new products may contribute to the pathogenesis of several clinical conditions related to the accumulation of AOPPs. Os produtos proteicos de oxidação avançada (AOPPs) são uma nova classe de compostos formados em consequência do estresse oxidativo e considerados biomarcadores úteis na detecção de dano oxidativo proteico. No entanto, o papel desses produtos não se limita apenas a refletir o grau oxidativo de proteínas, mas também podem participar de forma ativa no processo inflamatório, promovendo diferentes perturbações celulares, incluindo a indução de apoptose e alterações nos processos de proliferação e diferenciação celular. O principal mecanismo de formação dos AOPPs é através do ácido hipocloroso (HOCl) produzido pela enzima mieloperoxidase (MPO), sendo a albumina, a principal fonte proteica para a formação desses produtos. No entanto, a via MPO/HOCl parece não ser a única responsável pela formação de AOPPs, e uma série de estudos indicam que há vias alternativas que podem contribuir para formação de AOPPs. Outro fator importante, que também não está totalmente esclarecido, é se a albumina é a única proteína suscetível a formação dos AOPPs, uma vez que a composição molecular desses produtos ainda não está totalmente definida. Além dessas questões, é de interesse avaliar se os AOPPs formados por outra via mantém as características pró-infamatórias e pró-apoptóticas dos AOPPs originados pela via MPO/HOCl. Assim, o presente estudo teve como objetivo investigar se a reação de Fenton, importante geradora de radicais hidroxilas (OH ), é uma potencial via de formação de AOPPs, bem como se o colágeno, principal proteína da matriz extracelular, é uma proteína suscetível a formação desses produtos. Em um primeiro momento, foi demonstrado que a reação de Fenton induziu a formação de AOPPs e esse processo foi inibido por agentes antioxidantes, como N-acetilcisteína (NAC) e frutose-1,6-bisfosfato (FBP). Além disso, os AOPPs gerados através da reação de Fenton induziram um aumento da transcrição gênica de agentes envolvidos no processo inflamatório, incluindo o fator de transcrição κB (NF-κB), a cicloxigenase-2 (COX-2) e a interleucina-6 (IL-6), em células renais embrionárias (HEK 293) através de ensaio de transfecção celular e atividade da Luciferase. Outro importante achado deste estudo foi demonstrar que o colágeno exposto ao HOCl também é uma fonte proteica para a formação de AOPPs. Os AOPPs formados a partir do colágeno estimularam a produção de oxidantes, como o HOCl e radical ânion superóxido (O2 -), e de agentes inflamatórios, como óxido nítrico (NO) e AOPPs, em neutrófilos humanos isolados. Além disso, os AOPPs derivados do colágeno induziram uma diminuição da viabilidade celular e um aumento do processo apoptótico nessas células. Por fim, o alfa-tocoferol inibiu a liberação de oxidantes, preveniu a diminuição da viabilidade celular e o aumento do processo apoptótico, sugerindo que esse composto pode ser uma potencial ferramenta terapêutica para prevenir os efeitos deletérios promovidos pelos AOPPs. Do mesmo modo, esses achados indicam que os AOPPs podem ser formados por vias alternativas, e esses novos produtos podem contribuir na fisiopatogênese de diversas condições clínicas relacionadas com o acúmulo de AOPPs.

A mensuração dos metabólitos do óxido nítrico pode ser útil para a melhor compreensão de diferentes processos fisiopatológicos. Este estudo avaliou a influência de diferentes anticoagulantes (ácido etilenodiaminotetracético [EDTA], citrato e heparina) e do armazenamento a -20ºC por quatro meses sobre os níveis de nitrito, sendo estes mensurados em amostras de soro e plasma pelo método de Griess. Os tipos de amostra utilizados (soro ou plasma) e de anticoagulante usado na coleta não influenciaram significativamente os níveis de nitrito, independentemente de as dosagens serem realizadas em amostras frescas ou naquelas mantidas a -20ºC por quatro meses. The measurement of nitric oxide metabolites may be useful for better understanding of different physiopathological processes. Thus, the aim of this study was to evaluate the influence of different anticoagulants (EDTA, citrate and heparin) and four-month storage at -20ºC on nitrite levels. The serum and plasma samples were analyzed by using the Griess method. The type of sample (serum or plasma) or anticoagulant used in the collection did not influence on nitrite levels significantly, regardless the fact they were fresh or four-month samples stored at -20ºC.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES The pathogenesis of neurological diseases such as major depression and Parkinson's disease remains incompletely understood. These diseases are chronic and non-communicable (NCDs), resulting from exposure to one or more stressors and related to mitochondrial dysfunction (MitD), an event that causes the production of reactive oxygen species, resulting in oxy-inflammatory, physiological and behavioral changes. Aiming to understand whether the development and progression of MitD events are evolutionarily conserved and whether they could be pharmacologically attenuated, the earthworm Eisenia fetida was used, inducing MitD events via exposure to rotenone and verifying the potential of lithium carbonate (LC) in the modulation of the resulting changes. Two complementary studies were generated from this proposition, where: (1) it was verified whether MitD, caused by chronic exposure of 14 days to rotenone, is evolutionarily conserved in E. fetida, and (2) whether the LC is capable of modulating the changes resulting from this exposure. In the first study, chronic exposure of 14 days in artificial soil was used. Flow cytometry indicated modulation of populations and cell cycle of coelomic cells when exposed to rotenone (30 nM), while histology indicated anatomical alterations in the ventral nervous ganglion. Brown pigment deposits were observed in the circular muscles, as well as upregulation of the EaTLR gene and downregulation of the ND1 gene. The data suggest that the chronic exposure process reaches its peak on the seventh day and that, after that, the animals initiate organic restoration events. However, the behavioral boric acid avoidance test confirmed the inefficiency in decision-making due to neurodegenerative events and sensory deficits resulting from MitD. The second study involved, in addition to the protocols presented in the first, new methodologies developed. The analyzes were divided into three stages: (1) the safety indicators indicated the dose of choice for the LC in a concentration-effect curve based on the drug's package insert. Next, (2) efficacy indicators were evaluated against individual and concomitant exposure to LC (12.85 mg/mL) and rotenone (30 nM) using ex vivo and in vivo methods. Finally, prostomium culture was the methodology used to evaluate the (3) causal mechanism through molecular analysis. Although some anatomical changes have been reported, the LC was able to positively modulate the damage caused by exposure to rotenone. In behavior, despite the protective effect, there was no acceleration of the organic restoration process. Molecular data are heterogeneous and mostly corroborate with the scientific literature, showing anti-inflammatory patterns when in the presence of LC, and damage when in rotenone. Thus, the general panorama evaluated in this thesis confirms the evolutionary character of MitD, since the alterations presented in a pioneering organism, both ex vivo and in vivo, are also visualized in derived groups. Rotenone continues to be an excellent model for inducing MitD, emphasizing its role in studies of the central nervous system (CNS), and which, when associated with the use of annelids, may represent an alternative and complementary line for research involving NCDs related to the CNS. A patogênese de doenças neuropsiquiátricas, como a depressão maior e a doença de Parkinson, permanece ainda não completamente compreendida. Essas doenças são crônicas e não transmissíveis (DCNTs), decorrentes da exposição a um ou mais estressores e relacionadas à disfunção mitocondrial (DMit), evento que causa produção de espécies reativas de oxigênio, acarretando em alterações oxi-inflamatórias, fisiológicas e comportamentais. Objetivando compreender se o desenvolvimento e progressão dos eventos de DMit são evolutivamente conservados e se poderiam ser atenuados farmacologicamente, utilizou-se a minhoca Eisenia fetida, induzindo quadros de DMit via exposição a rotenona e verificando a potencialidade do carbonato de lítio (LC) na modulação das alterações decorrentes. Dois estudos foram gerados a partir dessa proposição, onde: (1) verificou-se se a DMit, causada pela exposição prolongada de 14 dias à rotenona é evolutivamente conservada em E. fetida, e (2) se o LC é capaz de modular as alterações decorrentes dessa exposição. No primeiro estudo usou-se exposição prolongada de 14 dias em solo artifical. A citometria de fluxo indicou modulação das populações e ciclo celular das células celomáticas frente à exposição a rotenona (30 nM), enquanto a histologia indicou alterações anatômicas no gânglio nervoso ventral. Foi observado depósito de pigmentos marrons na musculatura circular, bem como upregulation de gene EaTLR e downregulation do gene ND1. Os dados sugerem que o processo de exposição prolongada tem seu ápice ao sétimo dia e que, posterior a isso, os animais iniciam eventos de restauração orgânica. No entanto, o ensaio comportamental de fuga em ácido bórico confirmou a ineficiência na tomada de decisão devido a eventos neurodegenerativos e déficit sensorial decorrentes da DMit. O segundo estudo envolveu, além dos protocolos apresentados no primeiro, novas metodologias desenvolvidas. As análises foram divididas em três etapas: (1) os indicadores de segurança apontaram a dose de escolha para o LC em uma curva de concentração-efeito baseada na bula do fármaco. Em seguida, (2) indicadores de eficácia foram avaliados frente a exposição individual e concomitante de LC (12.85 mg/mL) e rotenona (30 nM) usando métodos ex vivo e in vivo. Por fim, o cultivo do prostômio foi a metodologia empregada para avaliação do (3) mecanismo causal através de análises moleculares. Apesar de algumas alterações anatômicas terem sido relatadas, o LC foi capaz de modular positivamente os danos originados pela exposição a rotenona. No comportamento, apesar do efeito protetor, não houve aceleração do processo de restauração orgânica. Os dados moleculares são heterogêneos e em sua maioria corroboram com a literatura científica, apresentando padrões anti-inflamatórios quando na presença de LC, e de dano quando em rotenona. Assim, o panorama geral avaliado nessa tese confirma o cárater evolutivo da DMit, visto que as alterações apresentadas em um organismo pioneiro, tanto ex vivo quanto in vivo são visualizadas também em grupos derivados. A rotenona segue sendo um excelente modelo para indução de quadros de DMit, enfatizando seu papel em estudos do sistema nervoso central (SNC), e que, quando associados ao uso de anelídeos, pode representar uma linha alternativa e complementar para pesquisas envolvendo DCNTs relacionadas ao SNC.

Platelets are cytoplasmic fragments of megakaryocytes, cells present in the bone marrow, which are key players in hemostasis. Adequate platelet kinetics, with a balance between production, activation, and apoptosis, is essential to maintain the stability of this process. Hemostasis imbalance due to different causes results in changes in the number and/or function of platelets. In immune thrombocytopenia (ITP), this imbalance leads to a reduction in the number of platelets. In COVID-19, the imbalance results in platelet hyperactivation with consequent immunothrombotic dysregulation. Recently, in addition to counting the number of platelets, the analysis of other platelet parameters, including mean platelet volume (MPV), immature platelet fraction (IPF), absolute number of platelets, immature platelets (AIPC), platelet cell count (PCT), large platelet ratio (P-LCR), and PDW (platelet distribution amplitude) are performed using more advanced automated equipment. The aim of this study was to evaluate IPF (%), AIPC (× 109 /L), and MPV (fL) in ITP diagnosis and platelet changes present in the pathophysiology of COVID-19. EDTA-containing whole blood samples from patients diagnosed with ITP (41 patientes) and from patients diagnosed with COVID-19 (152 patients) were analyzed for the determination of these markers in the XE5000 analyzer. Samples from blood donors were used as the healthy control group. Results showed that a cutoff of 6.4% for IPF can be used as a laboratory marker for the diagnosis of ITP. In the case of COVID-19, results showed that patients requiring intensive care had a median of 6.20% (4.70–8.53) and 14.98x109 /L (11.15–21.25) for IPF and AIPC, respectively. For patients with COVID-19 without intensive treatment, the values obtained were 5.30% (3.20–6.80) and 13.39x109 /L (8.64–18.93). For the control group without COVID-19, the values were 3.40% (2.55–4.85) and 7.78x109 /L (5.58–9.97). The MPV values were 10.4 fL (9.90–11.10), 9.80 fL (9.30–10.40), and 10.1 fL (9.65–11.00) for the control group, patients with COVID-19 without intensive treatment, and those in need of intensive treatment, respectively. The results suggest that these markers can be used to assess the severity of COVID-19. Our results show that once platelet parameters are standardized with defined reference values, they can be useful in clinical practice for confirmatory diagnostic purposes in the case of ITP or for the assessment of the severity and follow-up of the disease in the case of COVID19. As plaquetas são fragmentos citoplasmáticos dos megacariócitos, células presentes na medula óssea, as quais são peças-chave na hemostasia. A adequada cinética plaquetária, com equilíbrio entre produção, ativação e apoptose é fundamental para manutenção da estabilidade desse processo. O desequilíbrio da hemostasia por diferentes causas, resulta em prejuízo na quantidade e/ou função das plaquetas. Na trombocitopenia imune (PTI) esse desequilíbrio leva a uma redução no número de plaquetas, enquanto na COVID-19 ocorre uma hiperativação plaquetária com consequente desregulação imunotrombótica. Atualmente, em adição a avaliação do número de plaquetas, os equipamentos automatizados permitem também realizar a análise de outros parâmetros plaquetários, entre eles o volume plaquetário médio (VPM), a fração de plaquetas imaturas (IPF), o número absoluto de plaquetas imaturas (AIPC), o plaquetócrito (PCT), a razão de grandes plaquetas (P-LCR), e a amplitude de distrubuição das plaquetas (PDW). O objetivo deste estudo foi avaliar IPF, AIPC e o VPM no diagnóstico da PTI e nas alterações plaquetárias presentes na fisiopatologia da COVID-19. Foram analisadas amostras de sangue total com EDTA proveniente de pacientes diagnosticados com PTI (41 indivíduos) e de pacientes diagnosticados com COVID-19 (152 indivíduos), para a determinação destes marcadores no equipamento XE5000 da Sysmex. Como grupo controle saudável foram utilizadas amostras de doadores de sangue. Nossos resultados mostraram que um ponto de corte de 6,4% para o IPF pode ser utilizado como marcador laboratorial para diagnóstico de PTI. No caso da COVID-19, nossos resultados mostraram que pacientes com COVID-19 que necessitaram de tratamento intensivo apresentaram uma mediana de 6,20% (4,70- 8,53) e 14,98x109 /L (11,15-21,25) para IPF e AIPC, respectivamente. Para os pacientes com COVID-19 sem necessidade de tratamento intensivo os valores obtidos foram de 5,30 % (3,20–6,80) e 13,39 x109 /L (8,64-18,93). Já para o grupo controle, sem COVID-19, os valores foram de 3,40% (2,55 – 4,85) e 7,78 x109 /L (5,58-9,97). Os valores de VPM foram de 10,40 fL (9,90 – 11,10), 9,80 fL (9,30-10,40) e 10,10 fL (9,65 – 11,00), para grupo controle, pacientes com COVID-19 sem e com necessidade de tratamento intensivo, respectivamente. Esses resultados sugerem que esses marcadores possam ser utilizados como auxiliares na avaliação da gravidade da COVID-19. Nossos resultados mostram que esses parâmetros plaquetários, uma vez padronizados e com valores de referência definidos, possam ser úteis na prática clínica com finalidade diagnóstica confirmatória no caso da PTI ou para avaliação da gravidade e acompanhamento da COVID-19.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Fibromyalgia is a painful condition associated with several comorbidities. Although the mechanism underlying fibromyalgia remains unknown, monoamine depletion, reactive oxygen species (ROS) overproduction, and mitochondrial dysfunction appear relevant in its pathogenesis. Once Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1), an oxidative stress sensor, is involved in conditions related to the pathogenesis of fibromyalgia, including spontaneous and musculoskeletal pain, fatigue and depressive and anxiety behaviours, we hypothesized that TRPA1 could be involved with fibromyalgia symptoms. The fibromyalgia model was induced by subcutaneous injections of reserpine (1 mg/kg) once daily for three consecutive days in Swiss and C57BL/6J mice and in TRPA1-deficient mice. All behavioural tests were performed on the 4 th day after the first administration of reserpine. Immediately after, the animals were euthanized, and different tissues (gastrocnemius and soleus muscles, plantar tissue, sciatic nerve, and spinal cord) were collected for biochemical investigations. Coenzyme Q10 and oligomycin were used to assess mitochondrial function and characteristic symptoms of fibromyalgia. α-lipoic acid was used to elucidate the role of oxidative stress in the fibromyalgia model. The TRPA1 antagonist, A-967079, was used to assess TRPA1 involvement, while the pregabalin or duloxetine were used as reference drugs for fibromyalgia symptoms. Reserpine reduced monoamine levels, caused mechanical and cold allodynia, chemical hypersensitivity, reduced muscle strength and burrowing behaviour, caused thigmotaxic behaviour and increased the immobility time of animals in the forced swim test. Oligomycin exacerbated reserpine-induced fibromyalgia-like symptoms, while coenzyme Q10, α-lipoic acid, A-967079, pregabalin, and duloxetine attenuated different reserpine-induced nociceptive and comorbid parameters. Local administration of reserpine induced acute hypersensitivity. Reserpine induced mitochondrial dysfunction (high-resolution respirometry) and altered oxidative status (ROS levels and lipid peroxidation) in the soleus and gastrocnemius muscles and spinal cord. Reserpine increased H2O2 levels in the plantar tissue and increased staining for 4-hydroxynononeal in the sciatic nerve. These oxidative parameters and fibromyalgia-like painful symptoms were not observed when reserpine was administered in TRPA1-deficient mice. Thus, mitochondrial dysfunction and oxidative stress are essential mechanisms for TRPA1 activation and, therefore, for the development and maintenance of the hypersensitivity and some comorbidities observed in this fibromyalgia model. In this way, we contribute to advances in the mechanisms involved in the pathophysiology of fibromyalgia and encourage the use of possible new treatments to control the symptoms of this pathology. A fibromialgia é uma condição dolorosa associada à diversas comorbidades. Embora o mecanismo subjacente à fibromialgia permaneça desconhecido, a depleção de monoaminas, aumento da síntese de espécies reativas de oxigênio (ROS) e disfunção mitocondrial parecem relevantes na sua patogênese. Uma vez que o Receptor de Potencial Transitório Anquirina 1 (TRPA1), um sensor de estresse oxidativo, está envolvido em condições relacionadas à patogênese da fibromialgia, incluindo dor espontânea, dor musculoesquelética, fadiga e comportamentos depressivos e ansiosos, hipotetizamos que o TRPA1 poderia estar envolvido com os sintomas da fibromialgia. O modelo de fibromialgia foi induzido por injeções subcutâneas de reserpina (1 mg/kg), uma vez ao dia por 3 dias consecutivos em camundongos Swiss e C57BL/6J e também em camundongos deficientes de TRPA1. Todos os testes comportamentais foram realizados no 4º dia após a primeira administração de reserpina. Em seguida, os animais foram eutanasiados e diferentes tecidos (músculos gastrocnêmio e sóleo, tecido plantar, nervo ciático e medula espinhal) foram coletados para investigações bioquímicas. A coenzima Q10 e a oligomicina foram usadas para avaliar a função mitocondrial e sintomas característicos da fibromialgia. O ácido α-lipoico foi usado para elucidar o papel do estresse oxidativo no modelo de fibromialgia. O antagonista do canal TRPA1, A-967079, foi utilizado para avaliar o envolvimento do TRPA1, enquanto que a pregabalina ou a duloxetina foram utilizadas como drogas de referência para aliviar os sintomas da fibromialgia. A reserpina reduziu os níveis de monoaminas, causou alodinia mecânica e ao frio, hipersensibilidade química, reduziu a força muscular e o comportamento de escavar, causou comportamento tigmotáxico e aumentou o tempo de imobilidade dos animais no nado forçado. A oligomicina exacerbou os sintomas tipo-fibromialgia induzidos por reserpina, enquanto a coenzima Q10, ácido α-lipoico, A-967079, pregabalina e duloxetina atenuaram diferentes parâmetros nociceptivos e comórbidos induzidos por reserpina. A administração local de reserpina induziu hipersensibilidade aguda. A reserpina induziu disfunção mitocondrial (respirometria de alta resolução) e alterou o estado oxidativo (níveis de ROS e peroxidação lipídica) nos músculos sóleo e gastrocnêmio e na medula espinhal. A reserpina aumentou os níveis de H2O2 no tecido plantar e aumentou a marcação para 4-hidroxinoneal no nervo ciático. Estes parâmetros oxidativos e os sintomas dolorosos tipo-fibromialgia não foram observados quando a reserpina foi administrada em animais deficientes de TRPA1. Deste modo, a disfunção mitocondrial e o estresse oxidativo são mecanismos importantes para a ativação do TRPA1 e, portanto, para o desenvolvimento e manutenção da hipersensibilidade e algumas comorbidades observadas neste modelo de fibromialgia. Desta forma, contribuímos para os avanços nos mecanismos envolvidos com a fisiopatologia da fibromialgia e incitamos a utilização de possíveis novos tratamentos para o controle dos sintomas desta patologia.