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Epidemiological surveillance for community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus revealed prevalences of 33% and 13% in pediatric and adult patients, respectively, in Cordoba, Argentina, in 2005. This study describes for the first time the emergence and dissemination of the sequence type 5 (ST5) lineage as the most prevalent clone (89%) (pulsed-field gel electrophoresis type I-ST5-staphylococcal cassette chromosome type IVa-spa type 311) harboring the Panton-Valentine leukocidin and enterotoxin A genes.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2022 El desarrollo de un embarazo saludable depende en gran medida de la funcionalidad de las células trofoblásticas que constituyen la placenta. Durante su desarrollo, los trofoblastos extravellosos adquieren un fenotipo invasivo y migratorio para anclar la placenta al útero y remodelar las arterias espirales uterinas. Una diferenciación anómala o pérdida de la homeostasis de los trofoblastos producen un deterioro de la función placentaria impactando en la salud de la madre y del feto. Si bien las células tumorales son muy diversas en sus fenotipos y en muchas de las respuestas a señales externas e internas, la mayoría comparte con las células trofoblásticas su gran actividad biosintética, escasa inhibición por contacto, elevado índice de proliferación, capacidad para escapar a efectores del sistema inmune y propiedades migratorias e invasivas. Ambos tipos celulares se enfrentan a variaciones en la tensión de oxígeno y el aporte de nutrientes, y una demanda incrementada en la síntesis proteica por lo que requieren de una adecuada función del retículo endoplásmico (RE) y de un sistema que mantenga el balance redox evitando el daño oxidativo o reductivo. Históricamente el aumento en las especies reactivas del oxígeno (ROS) ha sido asociado a daño y muerte celular, pero actualmente se sabe que bajos niveles de ROS y/o la exposición pasajera a éstos son necesarios para la regulación de numerosos procesos celulares. El microambiente oxidante del RE es necesario para la correcta maduración proteica. Diversas situaciones pueden alterar su homeostasis, conducir a una acumulación de proteínas mal plegadas y activar la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) a través de tres vías principales dependientes de tres proteínas transmembrana: Ire1α, PERK y ATF6. En células en reposo, los tres sensores se mantienen en un estado inactivo a través de su asociación con BiP, que es considerado el regulador maestro de la UPR. La UPR normalmente tiene funciones de supervivencia y protege a las células restableciendo el procesamiento proteico y la homeostasis celular, mientras que una disfunción de la UPR o el estrés prolongado y severo puede conducir a la muerte celular. Numerosos antecedentes dan cuenta de la importancia tanto de las ROS como de efectores de alguna o varias vías de la UPR en la fisiopatología de la placenta y de diversos tumores. El factor de transcripción tipo Krüppel-6 (KLF6) es un factor de transcripción ubicuo altamente expresado en la placenta y necesario para su correcto desarrollo. Participa en múltiples procesos como la progresión del ciclo celular, apoptosis, angiogénesis, remodelado vascular, migración y diferenciación, pudiendo desempeñar funciones antagónicas dependiendo del contexto celular. Además, se lo ha descrito como un gen de respuesta al estrés ya que su expresión se incrementa bajo condiciones asociadas a un aumento de ROS. En la placenta su expresión es inducida tempranamente por hipoxia y por la presencia del organofosforado clorpirifos, que además de incrementar el estrés oxidativo genera estrés del RE. Sin embargo, se desconocía si KLF6 participa en la homeostasis celular modulando los niveles de ROS y de los componentes de la UPR en el contexto de células trofoblásticas y tumorales. Este fue el objetivo abordado en esta tesis. Los estudios realizados revelaron que la disminución en la expresión de KLF6 mediante siRNA en células trofoblásticas HTR-8/SVneo indujo un aumento en las ROS. Este incremento en las ROS no fue de origen mitocondrial, si no que podría deberse a un rol de KLF6 como regulador transcripcional de NOX4. Considerando que el aumento de ROS puede conducir a un estado de estrés oxidativo, se estudiaron el potencial de membrana mitocondrial, el índice de apoptosis y la viabilidad celular frente al silenciamiento de KLF6, como así también la respuesta antioxidante a través de la medición de moléculas clave como catalasa, 2-cys-peroxiredoxinas y la vía de Nrf2. No se observaron modificaciones en ninguno de estos parámetros debido al silenciamiento de KLF6. En cambio, el silenciamiento de KLF6 disminuyó la proliferación celular e incrementó los niveles de p21 de manera independiente de p53. Además, se observó un cambio morfológico en las células silenciadas volviéndose más fibroblastoides y aumentando su capacidad migratoria de manera ROS - dependiente. Estos resultados indican que las ROS generadas no incrementan la muerte celular ni la respuesta antioxidante de las células HTR-8/SVneo, y sugieren que los niveles de ROS inducidos no serían dañinos y podrían actuar como una señal reguladora de la función o diferenciación celular del trofoblasto extravelloso. El silenciamiento de KLF6 en las líneas celulares tumorales HepG2, T98G y MDA-MB 231 también condujo a un aumento de ROS total de origen no mitocondrial. Similar a lo observado en la línea trofoblástica, no se modificó la viabilidad celular ni hubo cambios en los niveles de catalasa o 2-cys-peroxiredoxinas. Sin embargo, en contraste con las HTR-8/SVneo, en HepG2 y MDA-MB 231 no se observó un cambio morfológico ni tampoco un incremento en los niveles de p21. Si bien, no se pudo determinar la consecuencia del aumento de ROS en estas líneas, los resultados indican que KLF6 también modula los niveles de ROS en ellas y sugieren que este podría ser uno de los mecanismos por los cuales KLF6 ejerce efectos diferenciales en contextos tumorales. En cuanto a la modulación de componentes de la UPR los estudios realizados revelaron que la disminución en la expresión de KLF6 disminuyó los niveles de factores claves en la UPR tales como BiP, Ire1α, calnexina y el procesamiento del ARNm de Xbp1 (Xbp1s). Al someter las células a un tratamiento con tapsigargina, conocido inductor de la UPR, las células silenciadas para KLF6 no aumentaron los niveles de BiP, sugiriendo que KLF6 es requerido para activar la expresión de BiP. Además, en presencia de tapsigargina se observó una activación en la vía de PERK evidenciada por el incremento en la fosforilación de eIF2α en las células con expresión disminuida de KLF6. Por otra parte, se demostró mediante diferentes estrategias experimentales que el silenciamiento de KLF6 no indujo la autofagia ni tampoco impidió el tráfico intracelular de proteínas en condiciones basales. El silenciamiento de KLF6 en las líneas celulares tumorales no se acompañó de los mismos cambios en la expresión de los componentes de la UPR. De hecho, los cambios fueron dependientes de la línea celular. Mientras que en las células MDA-MB231 se observó un aumento basal de BiP y una disminución de Xbp1s, en la línea HepG2 no se detectaron cambios. En cambio, en la línea T98G se observó un incremento significativo en la expresión de BiP en células silenciadas para KLF6 sólo cuando fueron tratadas con tapsigargina; mientras que basalmente sólo se observó una disminución en la fosforilación de eIF2α al silenciar KLF6. Estos resultados están en concordancia con el rol multifacético que presenta KLF6 dependiendo del contexto celular, como se ha reportado previamente. Los resultados de esta tesis son la primera evidencia de una función de KLF6 como modulador de los niveles de ROS y de componentes de la UPR en células trofoblásticas y tumorales, de manera dependiente del contexto celular. Además, demostraron que en células trofoblásticas el aumento de ROS, posiblemente como consecuencia de un aumento en la expresión de NOX4, incrementa su fenotipo migratorio 2024-09-30 Fil: Kourdova, Lucille Tihomirova. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2022. Resumen: La enzima arginil-ARNt transferasa (Ate1) cataliza la transferencia de arginina desde un ARN de transferencia a una proteína aceptora. Este proceso conocido como arginilación postraduccional está involucrado en el catabolismo de proteínas, particularmente en la señalización de sustratos del sistema de degradación ubiquitina-proteasoma (UPS). En situaciones donde el UPS está comprometido, la célula activa el mecanismo proteolítico de autofagia para evitar la acumulación de especies tóxicas y mantener el fitness celular. No obstante, se desconoce si la arginilación es necesaria para el reconocimiento y la degradación de proteínas por la vía autofágica. Por este motivo, en este trabajo de tesis se propuso investigar la implicancia funcional de Ate1 en la autofagia. Se analizaron aspectos moleculares y celulares de las distintas variantes alternativas de la enzima durante la respuesta autofágica inducida por la inhibición del proteasoma. Utilizando diferentes metodologías, se demostró que las isoformas de Ate1 se localizan en el citosol y núcleo de la célula, mientras que una fracción de las mismas se une a membranas biológicas y proteínas del citoesqueleto. Esta distribución se correlaciona con la formación de estructuras de alto peso molecular, que se localizan en las proximidades del núcleo junto a la proteína adaptadora autofágica p62 y otros sustratos de degradación. Dada la importancia de p62 en el reconocimiento de sustratos, la compartimentación de Ate1 junto a esta proteína sugiere que podría ser necesaria durante la respuesta autofágica. Además, para comprender la implicancia biológica de la enzima en este proceso degradativo, se analizó la actividad autofágica en ausencia de Ate1, y frente a la expresión endógena y ectópica de la enzima en células. Con esta finalidad, se realizaron ensayos bioquímicos y de microscopía confocal que permitieron descubrir aspectos funcionales de la enzima. Se demostró que en ausencia de Ate1, el complejo mTORC1 está hiperactivado, lo cual disminuye el flujo de autofagia y provoca la acumulación de vacuolas y sustratos autofágicos en la célula. Además, se observaron defectos en la inducción de autofagia en condiciones de déficit nutricional. La expresión ectópica de una única isoforma de Ate1 permitió recuperar parcialmente el fenotipo salvaje. Este estudio sugiere que Ate1 podría contribuir al proceso de reconocimiento de los sustratos junto a p62 y permite establecer la importancia de la arginilación en la regulación del proceso de degradación autofágico. Abstract: arginyl-tRNA transferase (Ate1) enzyme catalyzes the transfer of arginine from a transfer RNA to an acceptor protein. This process known as post-translational arginylation is involved in protein catabolism, notably during substrates recognition by the ubiquitin-proteasome degradation system (UPS). When the UPS is compromised, cells activate autophagy, a proteolytic mechanism that prevents the accumulation of toxic species and maintains cellular homeostasis. To further investigate whether protein arginylation is required in this process, this work was focused on the functional implication of Ate1 in the autophagic pathway. Molecular and cellular aspects of Ate1 isoforms were analyzed during the autophagic response induced by proteasome inhibition using different experimental approaches. Ate1 isoforms were found in the cytosol and nucleus of the cell, whereas a fraction was associated with biological membranes and cytoskeleton proteins. This subcellular distribution correlates with the formation of high molecular weight structures, which are localized in the perinuclear region of the cell together with the autophagic adaptor protein, p62 and other degradation substrates. Given the importance of p62 in substrate recognition, the compartmentalization of Ate1 with this protein suggests that it may be required during autophagic response. To understand the biological implication of Ate1 in this degradative process, we assessed autophagic activity in the absence of the enzyme, and under endogenous or ectopic expression of Ate1 in cultured cells. Ate1 deletion causes mTORC1 complex hyperactivation, a decrease of autophagic flux and leads to an accumulation of autophagosomes and their substrates. Moreover, autophagic induction is impaired under fasting conditions. The observed phenotype can be partially rescued by reintroduction of stably expressed Ate1-specific isoform. Finally, this study suggests that Ate1 may contribute to the substrate recognition process together with p62 and highlights the importance of post-translational arginylation in the regulation of the autophagic degradation process. 2024-06-30 Fil: Bonnet, Laura Vanesa. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2022 Las ADN glicosilasas son enzimas que catalizan el primer paso del sistema de reparación de bases por escisión (BER). En plantas, un homólogo de la enzima MBD4 de humanos llamada MBD4L tiene la capacidad de reconocer y escindir timina, uracilo y derivados halogenados de uracilo (5-FU, 5-BrU y 5-hmU) in vitro. La timina y el uracilo pueden ser generados por la desaminación de 5mC y C, respectivamente, mientras que 5-hmU se genera por desaminación/oxidación de 5mC. Esas bases modificadas podrían formarse durante condiciones de estrés. Como MBD4L presenta localización nuclear, la enzima podría reconocer y escindir tales bases modificadas del ADN genómico in vivo. En este trabajo de tesis Doctoral se estudió la actividad in vivo de MBD4L y el efecto fenotípico de mutantes para el gen que codifica esta enzima bajo condiciones de estrés genotóxico por 5-FU y 5-BrU, y estrés biótico causado por infección bacteriana (Pseudomonas syringae pv. tomato -Pst-). Determinamos el rol diferencial entre MBD4L y AtUNG, otra ADN glicosilasa con capacidad de reconocer U in vitro. Nuestros resultados muestran que las mutantes mbd4l presentan niveles bajos de ADN fragmentado en presencia de 5-FU y 5-BrU. Curiosamente, estas plantas presentan un crecimiento reducido y una elevada muerte celular en sus ápices radicales. Por otro lado, determinamos que AtUNG está presente en el núcleo, y es activa en presencia de 5-FU, pero no frente a 5-BrU. Por otra parte, debido a que MBD4L promueve la descondensación de cromocentros (CCs) en presencia de Pst, analizamos si otras ADN glicosilasas, que responden a daños oxidativos, podrían también participar de este proceso. Además, evaluamos qué relación existe entre la descondensación de CCs y la reparación del ADN bajo estas condiciones. En primer lugar, demostramos que OGG1 y FPG no son esenciales para descondensar los CCs en presencia de Pst. Por ello, MBD4 y OGG1/FPG tienen efectos diferenciales en la descondensación de CCs y reparación del ADN en respuesta a Pst. Más aún, MBD4L sería la principal ADN glicosilasa que media la reparación y alteración de la heterocromatina centromérica en plantas sometidas a este estrés biótico. Finalmente analizamos los blancos genómicos de MBD4L. Para ello, seleccionamos secuencias peri/centroméricas (heterocromatina) y distales al centrómero (eucromatina) para evaluar los niveles de metilación bajo condiciones de daño de bases por desaminación y/o oxidación de 5mC (Pst). En mutantes mbd4l detectamos hipermetilación de secuencias peri/centroméricas tratadas con Pst. Sin embargo, también observamos hipometilación en algunos loci distales al centrómero. Estos resultados nos sugieren que MBD4L tendría un efecto dual (desmetilación y re-metilación) en la regulación de la metilación del ADN, dependiendo de las características de la cromatina en la que actúa. 2024-01-31 Fil: Torres, José Roberto. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Álvarez, María Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Álvarez, María Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Bocco, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Bocco, José Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Argaraña, Carlos Enrique. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Argaraña, Carlos Enrique. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Asís, Ramón. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Asís, Ramón. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Spampinato, Claudia Patricia. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Bioquímica y Farmacia; Argentina. Fil: Spampinato, Claudia Patricia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020 La Síntesis por Translesión (TLS) y la Recombinación Homóloga (HR) cooperan durante la fase S para garantizar la integridad de la horquilla de replicación. En consecuencia, la inhibición de TLS es una estrategia prometedora para la intervención terapéutica de tumores deficientes en HR dónde la inhibición de TLS promueva la inducción de letalidad sintética (LS). La principal limitación para evaluar esta hipótesis es la falta de inhibidores farmacológicos selectivos para TLS. En este trabajo de tesis se desarrolló una plataforma de cribado de Western-Blot miniaturizado para identificar inhibidores de la mono-ubiquitinación de la proteína PCNA (Antígeno nuclear de células en proliferación), una modificación pos-traduccional clave y necesaria para la activación eficiente de TLS. Luego del cribado de una biblioteca de 627 inhibidores de quinasas, se observó que la inhibición de la quinasa de sobrevida AKT dispara un profundo bloqueo de la ubiquitinación de PCNA. Mecanísticamente, se comprobó que la regulación de AKT sobre la ubiquitinación de PCNA luego de irradiación UV requiere de la actividad río arriba de la PI3-quinasa (PI3K), sin afectar los niveles basales de la ubiquitinación de PCNA en células sin perturbar. Además, se confirmó que la persistencia de la inhibición de AKT bloquea el reclutamiento de las polimerasas de TLS a los sitios de daño de ADN y afecta la procesividad de las horquillas de replicación luego de la irradiación UV, resultando en un aumento del estrés replicativo y el posterior disparo del programa de muerte celular. Notablemente, cuando se comparó la diferencia de sobrevida de células HR-proficientes versus HR-deficientes luego de irradiación UV en combinación con inhibidores de AKT, se observó inducción de LS de manera robusta en la población celular HR-deficiente. Este fenotipo se asocia a la habilidad de AKT de inhibir la Tesis de doctorado ubiquitinación de PCNA, pues la disminución dirigida de los niveles de RAD18, E3 ubiquitina ligasa de PCNA, recapitula la inducción de LS observada. Además, mediante un modelo no ubiquitinable de PCNA en el que la lisina 164 (sitio de la mono-ubiquitinación de PCNA) fue mutada por una arginina se observó inducción de LS. Además, se desarrolló en colaboración con el grupo de investigación del Dr. Marcos Villareal y el Dr. Rodrigo Quiroga del Departamento de Matemática de la Facultad de Ciencias Químicas, UNC, una nueva metodología de cribado basada en docking molecular donde se identificó un compuesto capaz de unirse al sitio de interacción de ubiquitina con PCNA y que fue validado en primera instancia en modelos celulares. Aunque todavía no se han realizado ensayos experimentales que garanticen que la inhibición de la mono-ubiquitinación de PCNA por este compuesto no se debe a efectos de tipo indirecto u “off-target” del mismo, esta aproximación preliminar demuestra la capacidad del algoritmo desarrollado para identificar inhibidores de la ubiquitinación de PCNA. Conjuntamente, este trabajo de tesis identifica a AKT como un nuevo regulador de la mono-ubiquitinación de PCNA y proporciona la prueba de concepto de que inhibir TLS es una estrategia terapéutica para eliminar selectivamente las células HR-deficientes sometidas a estrés replicativo. Adicionalmente, mediante la utilización de una estrategia de docking molecular se identificaron inhibidores de la mono-ubiquitinación de PCNA, no descriptos previamente, y que abren nuevas posibilidades al desarrollo de terapias basadas en la inhibición eficiente y selectiva de la ubiquitinación de PCNA. 2023-06-30 Villafañez, Florencia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Soria, Gastón. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Agnese, Alicia Mariel. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Ciencias Farmacéuticas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentina. Argaraña, Carlos Enrique. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Bocco, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Muñoz, Manuel Javier. Universidad Nacional de Buenos Aires. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020 El presente trabajo de Tesis aborda el desarrollo y evaluación de sistemas portadores de fármacos antimicrobianos, utilizando una plataforma tecnológica en nuestro grupo de investigación que se basa en la utilización de polielectrolitos (polímeros ionizables) que vehiculizan fármacos de carga opuesta. Utilizamos un polímero catiónico, Eudragit E100 (EuE) y dos fármacos, vancomicina (VAN) y ciprofloxacino (CIP). Se diseñaron y prepararon los sistemas y se obtuvieron dispersiones acuosas (EuE-VAN y EuE-CIP). Se evaluaron propiedades físico químicas de interés biofarmacéutico para su potencial utilización en formulaciones de uso oftálmico. Se estudió la influencia de EuE en la eficacia antibacteriana in vitro de los fármacos vehiculizados. Los sistemas en desarrollo exhiben potenciación de la acción de VAN frente a S. aureus a la vez que exhiben acción bactericida frente a P. aeruginosa, Gram negativo considerado fuera del espectro de acción de VAN. Cabe destacar, que, a diferencia de lo descripto para otros polímeros catiónicos, EuE no exhibe actividad antimicrobiana por sí mismo. El uso de diversas microscopías evidenció alteraciones morfológicas tanto en S. aureus como en P. aeruginosa, atribuidas a la interacción de EuE con las envolturas bacterianas. El uso de VAN con un probe fluorescente puso en evidencia que tales interacciones facilitan el acceso de VAN a la capa de mureína (sitio de acción). Lo expuesto permite explicar la potenciación de EuE-VAN. Además, se implementaron estudios de eficacia antibiofilm. Se determinó un efecto EuE concentración-dependiente tanto para inhibir parcialmente la formación de biofilm de P. aeruginosa, como para reducir la actividad metabólica de células en biofilms maduros. Posteriormente, se evidenció potenciación del efecto antibiofilm de CIP vehiculizada en sistemas EuE-CIP frente a P. aeruginosa resistente a este fármaco. Posteriormente, se evaluó la selectividad del polímero frente a células eucariotas mediante diversos estudios de sensibilización in vitro. Los resultados obtenidos indican que los sistemas estudiados exhiben propiedades adecuadas para su utilización en el diseño de sistemas farmacoterapéuticos de administración oftálmica, con mayor eficacia antibacteriana y espectro ampliado respecto de los fármacos libres. 2022-12-31 Corti, Melisa Belén. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina Alovero, Fabiana Del Lujan. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Ciencias Farmacéuticas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica; Argentina. Bocco, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Palma, Santiago Daniel. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Ciencias Farmacéuticas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica; Argentina. Martinelli, Marisa. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Orgánica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación y Desarrollo en Ingeniería de Procesos; Argentina. Beltramo, Dante Miguel. Córdoba. Gobierno de la Provincia de Córdoba. Ministerio de Ciencia y Tecnología. Centro de Excelencia en productos y procesos de Córdoba; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019 Chlamydia trachomatis es el patógeno bacteriano de transmisión sexual más común en humanos y una causa frecuente de infecciones asintomáticas y persistentes que conducen a complicaciones graves, particularmente en mujeres jóvenes. Chlamydia presenta un estilo de vida intracelular obligado único que involucra la transición cíclica entre su forma de desarrollo infectiva o cuerpo elemental y su forma replicativa o cuerpo reticular dentro de una vacuola denominada “inclusión”. En presencia de factores estresantes como el interferón gamma (IFNγ) o los antibióticos beta-lactámicos, C. trachomatis sufre una interrupción en su ciclo replicativo y entra en un estado viable pero no cultivable, “persistente”, también llamado persistencia clamidial, generalmente asociado a la presencia de cuerpos reticulares aberrantes y de mayor tamaño. Al removerse los factores de estrés, estas bacterias reanudan la división celular y las transiciones entre sus formas de desarrollo. Por lo tanto, la persistencia clamidial se considera un factor clave en la capacidad de estas bacterias para evadir diferentes efectos antimicrobianos. En esta tesis, se describe un screening genético para identificar y caracterizar mutantes de C. trachomatis con defectos en la recuperación post-estrés inducido por IFNγ y/o penicilina. Utilizando una colección de aproximadamente 1000 mutantes químicas completamente secuenciadas de C. trachomatis LGV-L2, se encontró que la mutante M275 es defectuosa en la recuperación de estrés inducido por IFNγ pero no por penicilina. Mediante la transferencia lateral de genes y análisis de recombinantes se identificó ptr, que codifica una posible proteasa, como un gen probablemente requerido para la recuperación del estrés inducido por IFNγ. Para confirmar estos resultados se construyó una cepa nula para ptr (L2 ptr::GII), la cual también mostró defectos en la recuperación del estrés inducido por IFNγ, y este defecto se restableció mediante la complementación de la expresión de Ptr. L2 ptr::GII, al igual que M275, mostró una menor tasa de diferenciación de RB a EB y una replicación del genoma reducida durante la recuperación después del tratamiento con IFNγ, lo que indica que Ptr es necesaria para una salida rápida del estrés inducido por IFNγ. Asimismo, se desarrollaron anticuerpos contra Ptr que nos permitieron observar que esta proteína es secretada al lumen de la inclusión clamidial. Utilizando un modelo murino de infección vaginal se observó un clearance disminuido a los 14 días post-infección para L2 ptr::GII, sugiriendo que la anulación de ptr causa una demora en la eliminación de C. trachomatis en el tracto genital femenino durante la infección in vivo. Por otro lado, se caracterizó la mutante M111, que presentó defectos en la recuperación luego del estrés inducido por IFNγ o por penicilina. Dicha mutante porta una única mutación sin sentido en pmpC, además de mutaciones con cambio de sentido en 5 genes adicionales. El gen pmpC codifica para una proteína polimórfica de membrana perteneciente a una familia de proteínas exclusiva de Chlamydia. Mediante la inactivación sitio-dirigida de genes por inserción se identificó pmpC como un gen necesario para la recuperación del estrés inducido por IFNγ o penicilina. Adicionalmente, se observó que la anulación de pmpC causa un defecto en la adherencia e invasión en las células hospedadoras, e induce la formación de agregados bacterianos dentro de la inclusión clamidial. En conclusión, este trabajo de tesis identificó a ptr y pmpC como genes involucrados en la persistencia clamidial. 2021-12-31

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019 La diseminación de Staphylococcus aureus (S. aureus) resistente a la meticilina (MRSA) es una preocupación mundial tanto en los hospitales (HA-MRSA) como en la comunidad (CAMRSA). El conocimiento sobre cuándo y dónde se adquiere la colonización de MRSA y qué clones están involucrados, ayudaría a concentrar esfuerzos para la prevención de las infecciones adquiridas en el hospital por MRSA, especialmente en América Latina, donde los datos son escasos. Además, existe limitada evidencia de la prevalencia, epidemiología molecular y factores de riesgo (FR) para la colonización por MRSA al ingreso, discriminados por genotipos CA-MRSA y HA-MRSA (CA-MRSAGy HA-MRSAG). Por esto, en la primera parte de esta tesis, se llevó a cabo un estudio multicéntrico en 8 instituciones de Córdoba, durante 3 meses, con el fin de analizar las implicancias de la colonización por CA-MRSAG,comparativamente con HA-MRSAGy S. aureus sensibles a meticilina (MSSA), en los pacientes que se hospitalizan. De 1419 pacientes hospitalizados, se obtuvo una prevalencia de colonización por MRSA de 4,2% (n: 60) en la admisión, con mayor proporción en pediatría que en adultos (6,1% vs 2,5%), dada por una mayor proporción de CA-MRSAG(4,8%) comparada con la de adultos (1,9%), p= 0,002. Los clones MRSA más frecuentes en la admisión fueron, CA-MRSAG:I-ST5-IV (n: 17, 28,3%), N-SnO-IV (n: 12,20%), Y HA-MRSAG: C-STlOO-IV (n: 9, 15%). Se identificaron FR para colonización por MRSA, discriminando FR para CA-MRSAG de FR para HA-MRSAG. Esta diferencia en los FR, implica diferentes orígenes y nichos de transmisión de ambos genotipos, y avala la importancia de conocer los genotipos prevalentes en una población, a la hora de llevar a cabo el "screening" de MRSA en la admisión, para implementar medidas de control de infección que reduzcan la , transmisión y consecuentemente las infecciones adquiridas en el hospital. Se detectaron 10 casos de adquisiciones hospitalarias, todas ellas por CA-MRSAG demostrando la circulación y adquisición de estas cepas dentro del hospital, donde los clones más frecuentes fueron: I-ST5- IV (n: 4, 40%), N-SnO-IV (n: 2, 20%), R-ST72-IV (n: 2, 20%), QQ-STl649-IV (n: 1, 10%). Por lo tanto, se demostró que estos clones, se adquieren y probablemente se transmiten, causando infecciones adquiridas en los hospitales, siendo la comunidad el principal reservorio. Estas infecciones, son prevenibles y, por lo tanto, son objetivos para un programa de control de infecciones en el hospital y la comunidad. A su vez, con el fin de estudiar la evolución en el tiempo de la epidemiología molecular de las infecciones por MRSA en nuestro país, desde los primeros estudios de vigilancia realizados por nuestro grupo de investigación, se llevó a cabo un estudio de carácter prospectivo multicéntrico a nivel nacional en abril de 2015, en 61 hospitales de 20 provincias. Se analizaron 668 casos de infecciones por s. aureus, utilizando definiciones epidemiológicas de las infecciones causadas por MRSA, de acuerdo al origen de la infección, hospital (HO) o comunidad (CO). Se determinó una prevalencia nacional de MRSA de 51% con mayor proporción de CA-MRSAG (88,6%) vs HA-M RSAG(11,4%) p

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017. La Transición Epitelio-Mesenquimal (EMT) es un programa esencial de la embriogénesis y un evento crítico en la progresión tumoral. Durante la EMT las células epiteliales experimentan cambios moleculares que promueven un fenotipo mesenquimal, caracterizado por la pérdida de la polaridad celular y uniones intercelulares y la ganancia de propiedades migratorias e invasivas. Este programa es finamente regulado a diversos niveles por factores de transcripción, entre los que se incluyen los miembros de las familias ZEB (Zinc Finger E-box Binding Homeobox), SNAIL y TWIST. Estudios recientes demuestran que ZEB1, uno de los miembros de la familia ZEB, tiene una activa participación en la inducción de EMT en diversos tumores epiteliales, tales como colon, próstata y mama. Sin embargo, existen pocos reportes respecto a las señales extracelulares y los mecanismos que regulan a ZEB1 durante el programa EMT. Bajo la hipótesis de que la función de ZEB1 está regulada a distintos niveles (transcripcional, postranscripcional, traduccional y postraduccional) por elementos presentes en el entorno intracelular o extracelular, el objetivo general de esta Tesis Doctoral fue caracterizar los mecanismos moleculares y las vías de transducción de señales que tienen impacto sobre la regulación funcional de ZEB1 y su relevancia en el programa EMT y la progresión tumoral. Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral, en primer lugar, se estudió el rol de la región amino terminal de ZEB1 en el programa EMT, se identificó la porción mínima de ZEB1 (NZEB1) que recapitula la función de ZEB1 wild type (wt) en la EMT en una línea celular de epitelio mamario murino no transformado (NMuMG). En segundo lugar, a través del estudio de múltiples cascadas de transducción de señales se estableció que las vías del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1R) y de las proteínas quinasa C (PKCs) regulan los niveles proteicos de ZEB1 y consecuentemente el programa EMT. En este sentido, se demostró que la vía de IGF-1R regula la función de NZEB1 mediante la modulación de su estabilidad proteica por un mecanismo dependiente del proteasoma. En tercer lugar, se evaluó la participación de la vía de PKCs en la regulación de la función biológica de ZEB1 utilizando 10 líneas celulares de mama con diferente grado de agresividad. Esto permitió establecer una correlación lineal entre los niveles de expresión de PKCα, ZEB1 y el estado de activación de la EMT. Mediante ensayos con ARNi y el uso de inhibidores farmacológicos se estableció que PKCα regula los niveles de ZEB1, revirtiendo el fenotipo migratorio e invasivo de células MDA-MB-231. De esta manera se demostró por primera vez que la vía de transducción de señales de PKCs regula la función biológica de ZEB1, definiendo un nuevo eje regulatorio del programa EMT en células MDA-MB-231. Palabras clave: ZEB1, EMT, cáncer de mama, vías de transducción de señales, PKCα, IGF-1R. Llorens de los Ríos, Candelaria. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Cabanillas, Ana María de Los Angeles. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Bocco, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Daniotti, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Lopez, Pablo Héctor Horacio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina. Simian, Marina. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Nanosistemas; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017 La mutagénesis es uno de los mecanismos esenciales involucrados en la generación de variabilidad genética y en la adquisición de fenotipos adaptativos en bacterias. En este sentido, frente a cambios ambientales repentinos o en la colonización de nuevos nichos ecológicos, un incremento en la tasa de mutación aumenta la probabilidad de adquirir aquellos fenotipos beneficiosos, constituyendo de esta manera una estrategia clave para la adaptación. Particularmente, las infecciones pulmonares crónicas causadas por Pseudomonas aeruginosa en pacientes con fibrosis quística (FQ) exhiben una alta prevalencia de cepas con una tasa de mutación espontánea incrementada, denominadas hipermutadoras, fundamentalmente asociada a la emergencia de mutantes deficientes en el sistema de reparación de bases apareadas incorrectamente (MRS). En este contexto, P. aeruginosa se desarrolla en las vías aéreas del pulmón FQ en un estilo de vida denominado biofilm, en donde las bacterias crecen adheridas a la mucosa respiratoria a través de una matríz de exopolisacáridos por ellas producida y exhiben características morfológicas y metabólicas diferentes a las expresadas durante el crecimiento planctónico. Este estilo de vida está asociado a un proceso de diversificación que implica la emergencia, selección y fijación de múltiples variantes fenotípicas a través de la adquisición de mutaciones beneficiosas. En contrapartida, durante la etapa de dispersión del biofilm, la cual consiste en el desprendimiento de las células desde el biofilm maduro, se produce una reversión de parte de estos rasgos adaptativos y las células vuelven a un estadío de vida planctónico, brindando la posibilidad de colonizar nuevos nichos y propagar la infección. Así, los procesos de formación y dispersión de biofilms suponen la emergencia y reversión de morfotipos específicamente adaptados. Debido a que ambos fenómenos estarían basados en mecanismos mutagénicos, un incremento en la tasa de mutación podría resultar beneficioso y favorecer el proceso completo. Dentro de este marco teórico, el objetivo principal de este estudio consistió en estudiar la flexibilidad de P. aeruginosa para diversificar y revertir en forma sucesiva a fenotipos característicos del crecimiento en biofilms y al mismo tiempo estudiar cuál es la implicancia de la hipermutabilidad en dicho proceso. Para ello, se utilizó como modelo al fenotipo de colonias pequeñas (SCV) de P. aeruginosa, uno de los morfotipos adaptados e hiperproductores de biofilms, el cual fue ensayado en cuanto a su emergencia y reversión en un ensayo de evolución in vitro experimental. Este ensayo fue realizado de manera repetida y sucesiva, analizando en paralelo líneas evolutivas independientemente fundadas a partir de un ancestro normomutador e hipermutador común. Los resultados obtenidos demuestran que la flexibilidad en la conversión y reversión sucesiva al fenotipo SCV se encuentra favorecida ante un aumento en la tasa de mutación. En este sentido, el proceso de diversificación fenotípica así como el valor de frecuencia de reversión del fenotipo SCV fueron notablemente mayores en cepas hipermutadoras respecto a la cepa normomutadora, incluso cuando las propiedades fenotípicas de las SCV y sus respectivas variantes revertidas y ancestrales fueron similares. Mediante análisis de genómica estructural comparativa, se determinó que la base molecular que subyace al proceso de conversión/reversión SCV consiste en la regulación de los niveles intracelulares del segundo mensajero c-di-GMP, existiendo un marcado paralelismo evolutivo y una fuerte selección positiva, tanto en las líneas WT como en las hipermutadoras, para la mutagénesis de los sistemas de transducción wsp e yfi. En todos los casos, las mutaciones en estos sistemas se adquieren de un modo compensatorio, determinando el incremento y la disminución de los niveles de c-di-GMP en cada ciclo de conversión y reversión, respectivamente. Interesantemente, a medida que los ciclos evolutivos avanzan las líneas normomutadoras muestran a partir del ciclo 5 de evolución una fuerte restricción genética, evidenciada como una caída significativa en la frecuencia de conversión SCV. Esta restricción no fue observada para las líneas hipermutadoras, las cuales evolucionaron hasta el ciclo de evolución 16 inclusive. A partir del ciclo 5 de evolución, estas líneas muestran la adquisición de mutaciones en otras enzimas y reguladores involucrados en el metabolismo del c-di-GMP, las cuales no serían suficientes para adaptarse al esquema impuesto sosteniendo puramente un mecanismo de mutaciones compensatorias. La presencia de mutaciones de tipo inserción/deleción en secuencias repetidas pequeñas (SSR) de G:C en algunos genes implicados en la regulación de los niveles de este segundo mensajero, abren la posibilidad de que la mayor flexibilidad y adaptabilidad de las líneas hipermutadoras se base a su vez en un mecanismo de conversión y reversión de una misma mutación (“switch on/off mutations”), el que, a manera de un interruptor genético, permitiría la variación fenotípica de manera indefinida. El presente trabajo constituye un importante aporte para el conocimiento de la implicancia de la hipermutabilidad, por deficiencia en el MRS, en la adaptabilidad de P. aeruginosa, la cual subyace la notable versatilidad que esta especie bacteriana despliega para prosperar en un sin número de ambientes diferentes y, como patógeno oportunista, persistir en las vías aéreas de pacientes con FQ a lo largo de la vida del paciente sin poder ser erradicada por ninguna terapia hasta el momento conocida. Fil: Tobares, Romina Alín. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Smania, Andrea María. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil. Smania, Andrea María. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Sotomayor, Claudia Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Sotomayor, Claudia Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Becerra, María Cecilia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Ciencias Farmacéuticas; Argentina. Fil: Becerra, María Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentina. Fil: Bocco, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Bocco, José Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Studdert, Claudia Alicia. Universidad Nacional del Litoral; Argentina. Fil: Studdert, Claudia Alicia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017 Candidiasis vaginal: estudio de receptores y mediadores inmunes innatos locales involucrados en la patogenia de la infección La infección vaginal por especies de Candida, conocida como Candidiasis Vulvovaginal (CVV), constituye una enfermedad inflamatoria aguda y una razón frecuente de consulta ginecológica. Junto con su forma recurrente (CVVR) representan un importante problema de salud a nivel mundial. Pese a que el conocimiento sobre las causas y factores de riesgo para la adquisición y el desarrollo de esta micosis es extenso, los mecanismos inmunes que rigen la respuesta antifúngica protectora a nivel vaginal aún no han sido completamente esclarecidos. A pesar de la marcada incidencia de esta patología, varios aspectos de su etiopatogenia aún no han sido resueltos. Se desconocen muchos de los mecanismos que rigen las interacciones entre el hongo y las células residentes a nivel del tracto genital femenino. El rol del dimorfismo fúngico, la liberación de factores de virulencia como enzimas hidrolíticas y su efecto en la modulación de mediadores inmunes por la célula del epitelio vaginal aún no están totalmente establecidos. En este escenario el rol de los péptidos antimicrobianos, en particular las β-Defensinas, su mecanismo de inducción, regulación e impacto en la respuesta local en esta patología permanecen aún sin definir. En este trabajo de tesis estudiamos la relevancia de diversos receptores de la inmunidad innata en el desarrollo de la patología, a través de un modelo murino de CVV. Asimismo, fue nuestro objetivo esclarecer la participación de péptidos antimicrobianos de la familia de las β-Defensinas durante la infección vaginal por C. albicans. Nuestros resultados demuestran un rol protector de las señales mediadas por el receptor innato TLR2 y la molécula adaptadora MyD88 en la infección vaginal por C. albicans, siendo necesarios para el correcto control de la invasión tisular y de la respuesta inflamatoria asociada. El receptor innato Dectin-1 demostró ser importante durante esta patología contribuyendo en el reconocimiento del patógeno y limitando la exacerbación de la inflamación. Demostramos que β-Defensina 1, péptido antimicrobiano constitutivo y de relevantes funciones en los tractos mucosos, se encuentra aumentado durante la infección vaginal por C. albicans. Estudios efectuados en pacientes con CVV y CVVR, nos permitieron establecer las características clínico-epidemiológicas de esta infección en nuestro medio. Evaluando el lavado cervicovaginal de estas pacientes encontramos un perfil diferencial en la respuesta de mediadores inmunes como citoquinas y péptidos antimicrobianos en los dos grupos en estudio, que aportan nueva evidencia sobre los mecanismos inmunopatogénicos y la recurrencia de la patología en pacientes con CVVR. Finalmente, el uso de un modelo in vitro de interacción Candida-célula epitelial de tracto genital femenino humano, permitió establecer las señales involucradas en la modulación de la β-Defensina 1 Fil: Miró, María Soledad Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Sotomayor, Claudia Elena.Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Sotomayor, Claudia Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Bocco, José Luis Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil. Bocco, José Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Smania, Andrea María. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Smania, Andrea María. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Touz, María Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina. Fil: Baldi, Pablo César. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017. Staphylcoccus aureus Resistente a Meticilina (MRSA) es un exitoso patógeno que se presenta asociado tanto al ambiente hospitalario (HA-MRSA) como a la comunidad (CA-MRSA), ha demostrado tener alta virulencia, capacidad para adquirir resistencia a diferentes antimicrobianos y adaptabilidad para transmitirse y diseminarse a través de la colonización de seres humanos y de la supervivencia en superficies inertes comportándose, estas, como reservorios ambientales para el microorganismo. A partir de 1990 CA-MRSA emergió y se diseminó en diferentes países del mundo y en aquellos de mayores prevalencia (> 50%) se ha descripto que estas cepas CA-MRSA comenzaron a introducirse en el ambiente hospitalario. Sin embargo, el conocimiento de su impacto en los hospitales es limitado, particularmente en América Latina. En este trabajo de tesis se realizó un estudio prospectivo de corte transversal y multicéntrico (nov-2009) de las infecciones por S. aureus mediante el análisis de 591 aislamientos clínicos de 66 hospitales de Argentina. Los casos se clasificaron considerando el tipo de inicio de la infección y la presencia o ausencia de factores de riesgo relacionados a la atención sanitaria (HRF) Se consideró que una infección es de inicio hospitalario (HO) si el cultivo positivo para S. aureus se obtuvo 48 horas después de la admisión en el hospital y el paciente no tenía evidencia de infección en el momento de la admisión Todos los demás casos se definieron como infección de inicio en la comunidad (CO). Las infecciones asociadas a la comunidad (CA) fueron definidas como casos de inicio en la comunidad de pacientes sin HRF durante el año anterior (CACO), según los criterios del CDC. Las infecciones asociadas al hospital o a la atención sanitaria (HA) incluyen: (i) infecciones de inicio hospitalario independientemente de la presencia de otros HRF (HAHO) e (ii) infecciones de inicio en la comunidad que ocurren en pacientes con al menos un HRF (HACO). Las cepas de MRSA fueron genéticamente tipificadas como genotipos CAMRSA y HA-MRSA (CA MRSAG y HA-MRSAG) por tipificación de SCCmec y spa, PFGE, MLST y perfil de genes de virulencia por PCR. Teniendo en cuenta todos los aislamientos, el 63% fueron de infecciones de inicio en la comunidad (CO) y de ellas el 55% fueron MRSA [39% CA-MRSAG y 16% HA-MRSAG].Detectó la proporción significativamente mayor de MRSA entre las infecciones de inicio en la comunidad CO vs las de inicio en el hospital HAHO (58% vs 49% respectivamente); Esta diferencia se notó principalmente en pediatría (48 hospitalization hours) and community-onset (CO) infections [including both, infections (HACO) in patients with healthcare-associated risk-factors (HRFs) and infections (CACO) in those without HRFs]. MRSA strains were genetically typed as CA-MRSA and HA-MRSA genotypes (CA-MRSAG and HA-MRSAG) by SCCmecand spa-typing, PFGE, MLST and virulence genes profile by PCR. Considering all isolates, 63% were from CO-infections and 55% were MRSA [39% CAMRSAG and 16% HAMRSAG]. A significantly higher MRSA proportion among CO- than HAHO-S. aureus infections was detected (58% vs 49%); mainly in children (62% vs 43%). The CAMRSAG/ HA-MRSAG have accounted for 16%/33% of HAHO-, 39%/13% of HACO- and 60.5%/0% of CACO-infections. In addition trends over time in MRSA were studied based on the national annual antimicrobial-susceptibility reports [WHONET-database, 2001- 2011, 49.909 S. aureus infections] using Phenotypic-definitions. These ones were validated by genotyping of isolates from the prospective cross-sectional multicenter study. Hence, the phenotypic definitions were significantly associated with genotypic definitions (p

Fil: Fontana, Diego Sebastián. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. El objetivo principal de la presente tesis consistió en desarrollar una vacuna de nueva generación para rabia, basada en la expresión de virus-like particles (RV-VLPs) en células de mamífero. En una primera etapa de trabajo, se evaluó la expresión de RV VLPs en tres líneas celulares distintas: HEK293, BHK-21 y VERO. La expresión de la glicoproteína G fue confirmada por citometría de flujo, microscopía de fluorescencia y ELISA. De los resultados obtenidos, se seleccionaron la línea recombinante HEK293 para continuar el trabajo. Posteriormente, se llevó a cabo la caracterización morfológica y fisicoquímica de las RV-VLPs obtenidas y más adelante, se llevó a cabo un protocolo de inmunización en ratones, en donde se pudo concluir que las RV-VLPs son capaces de inducir la producción de anticuerpos neutralizantes. Por otro lado, se llevó a cabo el test de potencia del NIH para vacuna antirrábica confirmando que las RV-VLPs inducen una respuesta inmune protectiva. A partir de esos resultados, se seleccionó un clon celular productor el cual fue adaptado para su crecimiento en suspensión en medio libre de suero. Finalmente, el clon sP2E5 fue cultivado en reactores de 1 y 5 L, operados en modo continuo, confirmando que las RV-VLPs son producidas durante todas las etapas de cultivo, el cual puede mantenerse por tiempos prolongados, demostrando de esta forma la elevada productividad del proceso. En conclusión, todos los resultados obtenidos durante este trabajo de tesis confirmaron que el proceso desarrollado constituye una plataforma de producción de una vacuna antirrábica de última generación, totalmente biosegura. The main goal of this thesis was to develop a new generation vaccine for rabies, based on the expression of virus-like particles (RV-VLPs) in mammalian cells. In a first stage of work, the expression of RV VLPs in three different cell lines, HEK293, VERO and BHK-21, was evaluated. The glycoprotein G expression was confirmed by flow cytometry, fluorescence microscopy and ELISA. From the results obtained, the recombinant HEK293 line was selected for further work. Subsequently, it was performed the morphological and physicochemical characterization of the RV-VLPs obtained and, later, we performed an immunization protocol in mice, where it was concluded that the RV-VLPs are capable of inducing the production of neutralizing antibodies. On the other hand, it was carried out the NIH potency test for rabies vaccine confirming that the RV-VLPs induce a protective immune response. From these results, a producer cell clone which was adapted for growth in suspension with serum free medium was selected. Finally, the clone sP2E5 was cultured in 1 and 5 L bioreactors, operated in continuous mode, confirming that RV-VLPs are produced during all stages of culture, which can be maintained for long periods, thus demonstrating the high productivity of process. In conclusion, the results obtained during this thesis confirmed that the process developed is a platform for production of a new generation rabies vaccine, totally biosecure. Universidad Nacional del Litoral Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2015. En células eucariotas, la selección e incorporación de las proteínas cargo ocurre en sitios especializados del Retículo Endoplásmico (ERES), y es llevada a cabo por proteínas del complejo de cubierta tipo COPII. Luego, en el compartimiento intermedio entre RE y Golgi (ERGIC o VTCs) se intercambia COPII por otro complejo de cubierta, COPI, y se originan conglomerados de vesículas y túbulos que se transportan e integran a las cisternas del cis-Golgi. La GTPasa Rab1b es esencial para el transporte anterógrado de proteínas y lípidos desde el Retículo Endoplásmico (RE) al complejo de Golgi, donde interacciona con múltiples proteínas (efectores) que integran la vía secretoria, como son los componentes del complejo COPA, proteínas relacionadas a COPI en los VTCs, y factores de anclaje o "tethering" tales como p115 y GM130, en VTCs y cis-Golgi, respectivamente. Aunque estas interacciones han sido bien caracterizadas, se desconoce la relación espacio/temporal de las mismas y su dinámica durante el transporte anterógrado de cargo. El objetivo principal de este trabajo es analizar los mecanismos moleculares que regulan diferentes eventos vinculados a la función de Rab1b en el transporte de proteínas del RE al Golgi. Los resultados se presentaron en 2 capítulos independientes: En el capítulo 1 se analizaron los mecanismos dinámicos de moléculas que contribuyen/participan en el "sorting" de cargo y su rol en la regulación de la transición ERES (COPII)-VTCs (COPI), mientras que en el capítulo 2 se analizó la implicancia que posee el incremento de los niveles de Rab1b en el proceso de secreción regulada de células secretorias de tiroides (FRTL5). Las asociaciones de Rab1b con Sec24 y Rab1b con p115 son mayoritariamente transitorias, y sugieren que estas podrían ocurrir al mismo tiempo o de forma simultánea en etapas espacialmente distintas del transporte RE-Golgi. Además, se evidenció un incremento de la re-localización, tanto de p115 como de Rab1b, en los ERES, mientras que el tiempo de permanencia de Rab1b en estructuras COPA es dependiente del reclutamiento y/o actividad de GBF1 y del reclutamiento de COPI en la interfase de ERES-VTCs, sugiriendo que una vez que Rab1b interacciona con GBF1, necesitaría que esta se disocie para EU posterior separación de los ERES. Por último, se observó que durante el transporte anterógrado, Rab1b se asocia de manera transitoria y en distintos momentos a todas las estructuras COPII estables para promover el "sorting" de cargo en los ERES. Por otro lado, Rabib se expresa de forma ubicua en tejidos humanos, sin embargo, en tejidos que poseen alta actividad secretoria, como tiroides, placenta y células epiteliales bronquiales, 35 niveles de ARNm de Rab1b se encuentran significativamente elevados. En presencia de la hormona estimulante de tiroides o tirotropina (TSH), las células FRTL5 sintetizan y secretan tiroglobulina (Tg) y una proteína de membrana transportadora de sodio y yodo (NIS). Se observó que la sobre-expresión de Rablb incrementó los niveles proteicos de NIS incluso en -esencia de TSH. Además, se demostró que Rablb modula la expresión de NIS regulando su promotora, sugiriendo que en células y/o tejidos secretorios, un estímulo que promueve la secreción produciría un aumento en los niveles de Rabib que activaría las vías de señalización que modulan la expresión de genes necesarios para la adaptación al estímulo. Fil: Martínez Beladelli, Hernán Esteban. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Alvarez, Cecilia Inés. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Alvarez, Cecilia Inés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Bocco, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Bocco, José Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Lorenzo, Alfredo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología; Argentina. Fil: Valdez Taubas, Javier. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Valdez Taubas, Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Damiani, María Teresa. Universidad Nacional de Cuyo; Argentina. Fil: Damiani, María Teresa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2015 c-Fos es una proteína codificada por un gen perteneciente a la familia de genes de expresión inmediata temprana. Junto a otras proteínas (Fra- 1, Fra-2, FosB y AF0sB), c-Fos es miembro de una familia de factores de transcripción que forma hetero-dímeros con proteínas pertenecientes a la familia Jun, para así constituir el factor de transcripción tipo AP-1. Como factor de transcripción, c-Fos regula la expresión de diversos genes blanco, pero además de su función nuclear, a nivel citosólico activa enzimas claves de la vía de síntesis de fosfolípidos, incrementando la misma. A pesar de su reconocida participación en eventos de proliferación, diferenciación y apoptosis, ratones knock-out para este proto-oncogén resultan viables, por lo que constituyen un modelo adecuado para el estudio del rol de esta proteína en el desarrollo y funcionalidad de los diferentes órganos y sistemas. Teniendo en cuenta las alteraciones de comportamiento que presentan los ratones c-fos -/- y la reducción en el tamaño de su corteza cerebral respecto a los animales wild-type, se evaluó la importancia de c-Fos para el adecuado funcionamiento de las células madres/progenitoras neurales (NSPCs) localizadas en la corteza cerebral en desarrollo de embriones c-fos +/+ y c-fos -/-. El análisis in vivo muestra una reducción de -15% en el espesor de la corteza cerebral en embriones c-fos -/- de 14.5 días de gestación comparado a los embriones c-fos +/+, lo cual se relaciona con una disminución en el número de células diferenciadas y un incremento en la muerte celular por apoptosis en la zona ventricular. No se observaron diferencias en la tasa de mitosis celular, aunque el ángulo de división mitótico resulta ser predominantemente vertical en los embriones c-fos -/-, sugiriendo una menor tendencia de las NSPCs c-fos -/- a diferenciar. Al evaluar el rol molecular de c-Fos en términos de su actividad como factor de transcripción y como activador de la síntesis de lípidos, a partir de extractos de la corteza cerebral en desarrollo, se encuentran diferencias en el contenido y composición del factor de transcripción AP-1, sin observar cambios significativos en la marcación de fosfolípidos. Los resultados obtenidos permiten postular a c-Fos como una proteína que, por medio de su función nuclear como factor de transcripción, participa en la regulación de la neurogénesis embrionaria. Fil: Velazquez, Fabiola Noelia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.