RESUMO: As patologias oculares estão entre as condições médicas mais debilitantes que afetam todos os segmentos da população. Como as opções tradicionais de tratamento são frequentemente ineficazes e por vezes inexistentes, a terapia génica tem potencial para se tornar uma abordagem alternativa para o tratamento de diversas patologias. Os primeiros veículos desenvolvidos para entregar material genético eram de origem viral. Devido a algumas complicações clínicas iniciais, começaram a ser desenvolvidos os veículos não-virais, baseados em lipídios e polímeros. Os polímeros de metacrilato foram descritos como altamente biocompatíveis e utilizados com sucesso em aplicações médicas, como cimento ósseo e lente intraocular. Alguns destes polímeros possuem propriedades catiónicas que podem ser usadas para formar poliplexos com DNA de forma a proceder à sua entrega. O presente trabalho tem como objetivo estudar o potencial do PDMAEMA (poli(2-dimetilamino)etil metacrilato) como um sistema de administração não viral de genes à retina. Para atingir esse propósito, primeiro tentámos entender o potencial de entrega de genes do PDMAEMA que anteriormente sintetizamos. Para melhorar o PDMAEMA, é fundamental primeiro esclarecer a entrada e o mecanismo intracelular pelo qual o polímero entrega o material genético. Elucidamos o mecanismo de entrada de polyplexes PDMAEMA em células RPE ao determinar que a endocitose mediada por clatrina é a via principal para a absorção de poliplexos PDMAEMA. Em relação ao tráfico intracelular, os poliplexos escapam do sistema degradativo lisossomal 24 horas após incubação com células RPE e acumulam-se ao redor do núcleo. O estudo de dissociação sugere, desta forma, que o polímero conseguiu liberar o DNA nas primeiras 24 horas após a entrada na célula. A segunda parte deste trabalho teve como finalidade avaliar a eficiência de transfeção in vivo do PDMAEMA, usando para tal os ratinhos rd10, um modelo de Retinite Pigmentosa. Os poliplexos PDMAEMA/DNA foram preparados em duas proporções de nitrogênio/fósforo (N/P).Para validar melhor o PDMAEMA como um potencial vetor não viral na retina, injetámos poliplexos PDMAEMA subretinalmente, os quais foram capazes de entrar e promover a expressão de GFP na camada RPE da retina. O passo seguinte foi testar os poliplexos PDMAEMA num modelo de doença. Procedemos a uma caracterização do modelo da doença de Retinite Pigmentosa, dos ratinhos rd10 com marcadores para fotorreceptores: bastonetes (rodopsina e PDE6β) e cones (arrestina do cone) e observámos alterações nos padrões de expressão começando a P18. Também medimos a espessura das camadas nucleares externas (ONL) e internas (INL) e observámos uma diminuição significativa, que começava a P18 e ia até P35. Uma vez que uma mutação “missense” no gene PDE6β leva à morte de fotorreceptores, dando o rd10 o seu fenótipo, clonámos o gene PDE6β no plasmídeo pEPito-hCMV e realizámos injeções subretinais. Observámos que os polyplexos PDMAEMA foram capazes de expressar o gene PDE6β na camada nuclear dos fotorreceptores. Ao caracterizar os murganhos rd10, observamos que a proteína PDE6β não estava a ser detetada por imunofluorescência, o que nos levou a questionar se a proteína estava realmente a ser produzida. Aproveitando a PDE6β clonada no plasmídeo pEPito, realizámos mutagénese direcionada no local, de forma a explorar melhor a observação anterior. Mutámos o gene com a mutação rd10 (c> t, posição 1678) e também o codão STOP. Construímos quatro plasmídeos: pEPito-hCMV-PDE6β (PDE6β normal); pEPito-hCMV-PDE6βR560C (PDE6β mutado); pEPito-hCMV-PDE6βeGFP (PDE6β normal fundido com GFP) e pEPito-hCMV-PDE6βR560CeGFP (PDE6β mutado fundido com GFP). Os nossos resultados sugerem assim que a formação do complexo de PDE6 in vivo com PDE6βR560C mascara o site que o anticorpo reconhece, prevenindo assim a deteção de PDE6β mutada. Uma vez que o mecanismo da doença no ratinho rd10 ainda é pouco compreendido, consideramos que essas ferramentas genéticas poderão ser utilizadas para estudá-lo melhor. No seu conjunto, estes resultados sugerem, portanto, que o PDMAEMA é um candidato viável para a administração de genes não-virais à retina. No entanto, torna-se ainda necessário realizar mais injeções subretinais do nosso vetor não viral, do modo a aumentar o número de repetições e a avaliar a função da retina. ABSTRACT: It is known that an efficient gene therapy vector must overcome several steps to be able to express the gene of interest: (I) enter the cell by crossing the cell membrane; (II) escape the endo-lysosomal degradation pathway; (III) release the genetic material; (IV) traffic through the cytoplasm and enter the nucleus; and last (V), enable gene expression to synthetize the protein of interest. In recent years, we and others have demonstrated the potential of poly(2-(N,N’- dimethylamino)ethylmethacrylate) (PDMAEMA) as a gene therapy vehicle. Further optimization of gene transfer efficiency requires the understanding of the intracellular pathway of PDMAEMA. Therefore the goal of this study was to determine the cellular entry and intracellular trafficking mechanisms of our PDMAEMA vectors and determine the gene transfer bottleneck. For this, we have produced rhodamine-labeled PDMAEMA polyplexes that were used to transfect retinal cells and the cellular localization determined by co-localization with cellular markers. Our vectors quickly and efficiently cross the cell membrane, and escape the endo-lysosomal system by 24h. We have observed the PDMAEMA vectors to concentrate around the nucleus, and the DNA load to be released in the first 24h after transfection. These results allow us to conclude that although the endolysosomal system is an important obstacle, PDMAEMA gene vectors can overcome it. The nuclear membrane, however, constitutes the bottleneck to PDMAEMA gene transfer ability.