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Orientador: Lucia Regina Durrant, Matthew James Grossman Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Dentre os contaminantes ambientais mais abundantes, destacam-se os Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs), que apresentam elevado potencial tóxico, sendo imprescindível sua remoção do ambiente. O objetivo deste trabalho foi analisar, em microcosmos, a biodegradação de HAPs por um consórcio bacteriano e identificar fatores que influenciam nesta degradação e na análise dos dados. A degradação dos HAPs no solo sem histórico de contaminação foi muito semelhante em todos os microcosmos, apresentando uma porcentagem de aproximadamente 85%. Para analisar a toxicidade do solo antes e depois da biorremediação, realizou-se um testes de germinação de sementes de Lactuca sativa (alface). O teste mostrou baixa toxicidade do solo após 80 dias da contaminação, com ou sem a adição do consórcio. Durante estudos de remediação biológica, é necessário utilizar um marcador interno para minimizar a dispersão e extração irregulares dos contaminantes. Neste estudo foi utilizado o hexaclorobenzeno, que mostrou excelente, uma vez que não sofreu nenhum tipo de degradação. Análises moleculares mostram que a adição de HAPs alterou significativamente a comunidade microbiana, favorecendo os membros degradadores de tais poluentes. O consórcio adicionado inibiu o crescimento de alguns micro-organismos autóctones. Além disso, não houveram evidências de que os micro-organismos degradadores de HAPs adicionados persistiram, sugerindo que eles podem não competir eficientemente com a população microbiana autóctone. Não houve efeito claramente identificado do hexaclorobenzeno sobre o crescimento de micro-organismos, com exceção de um aumento no número de organismos pertencentes da classe Alphaproteobacteria Abstract: Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) stand out as among the most abundant and toxic of environmental contaminants, and their removal from contaminated sites is indispensable for a healthy environment. The objective of this study was to analyze, in soil microcosms, the biodegradation of PAHs by a bacterial PAH degrading consortium and identify factors that influence this degradation and data analysis. Degradation of PAHs in soil with no history of contamination was very similar in microcosms with or without bioaugmentation, with the extent of PAH removal of about 85% in all cases. The germination of Lactuca sativa (lettuce) in soils taken from the microcosms was used to examine the toxicity of the soil before and after bioremediation. The test showed a low toxicity of the soil 80 days after PAH contamination, with or without the addition of the consortium. During studies of biological remediation it is necessary to use an internal non-biodegradable marker to minimize the effect of uneven dispersion and irregular extraction of pollutants. This study used hexachlorobenzene as the nonbiodegradable marker and it proved to be an excellent marker as it did not suffer any significant degradation in the soil microcosms. Molecular analyzes showed that the addition of PAHs significantly altered the microbial community by encouraging the growth of PAH degraders. In addition, the added microbial consortium was found to inhibit the growth of some of the indigenous microorganisms. Furthermore, there was no evidence that the added PAH degraders persisted, suggesting that they might not compete effectively with the native microbial population. There was little effect of hexachlorobenzene on the microbial community or on the removal of the PAH contaminants, with the exception of an increase in the number of organisms belonging to the class Alphaproteobacteria Mestrado Ciência de Alimentos Mestra em Ciência de Alimentos

Orientador: Lucia Regina Durrant Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A água residuária da extração de petróleo é altamente salina e contém uma mistura complexa de hidrocarbonetos, muitos dos quais são altamente tóxicos. Com o aumento da preocupação em preservar o meio ambiente, as tecnologias voltadas para a recuperação e despoluição de áreas degradadas tem ganhado a atenção. A biorremediação tem sido utilizada como método de biodegradação natural através da otimização de processos biológicos por ser econômica, versátil e a que mais se aproxima de uma despoluição ecologicamente aceitável. No entanto, a biorremediaçao depende de alguns fatores tais como: pH, temperatura, salinidade e pressão. Condições extremas desses fatores podem matar ou inibir espécies que não estejam adaptadas a ambientes extremos, por isso o desenvolvimento e otimização de processos de biorremediação de ambientes extremos contaminados por é de grande relevância. Desta forma, este trabalho teve como objetivos o isolamento e caracterização de bactérias halofílicas presentes na água residuária da extração de petróleo, além do estudo molecular dos genes envolvidos na degradação de compostos aromáticos para que posteriormente utilizássemos essas linhagens na biorremediação desse efluente, outra vertente desse trabalho foi o estudo da diversidade microbiana presente nesta água para auxiliar o direcionamento de esforços na minimização dos impactos causados com a exploração de petróleo. Foram isoladas sete linhagens de bactérias halofílicas da água de produção de petróleo, sendo todas pertencentes a família Halomoneaceae e com potencial para degradação de compostos aromáticos. A linhagem que apresentou maior taxa de crescimento nos compostos testados (ácido benzóico, fenol, ácido p-hidroxibénzoico) foi a denominada df2. Com relação à taxa de degradação dos compostos aromáticos testados, a dp3 degradou cerca 90% do fenol disponível, seguida pela df2 que degradou 80% desse mesmo composto. Quando a fonte de carbono foi o ácido benzóico, a df1 e DP3 degradaram 99% do composto e 70% do ácido p-hidroxibenzóico foi degradado em 12 dias de experimento pela linhagem df2. Para a degradação desses compostos a linhagem Halomonas organivorans seguiu a via de degradação do catecol na rota do ß- cetoadipato compreendendo a codificaçao de diferentes enzimas por catRBCA. A comparação das seqüências da biblioteca de bactérias com as sequências do gene RNA ribossomal 16S presente nos bancos de dados GenBank e RDP revelou a presença de micro-organismos pertencentes aos gêneros Marinobacter e Halomonas e na comparação da técnica clássica de isolamento com a técnica independente de cultivo (biblioteca do gene RNA ribossomal 16S), foi encontrada uma maior diversidade na última. Finalmente de todos os testes realizados na tentativa de biorremediar a água de produção de petróleo, a bioestimulação foi a mais efetiva, sendo conseguida uma diminuição de 77% da carga orgânica com a adição de solução de fosfato e alanina. Estes resultados demonstraram o grande potencial destas linhagens para a degradação de compostos aromáticos, bem como para a biorremediação da água de produção de petróleo, além de descrever a via metabólica utilizada por membros da família Halomoneaceas na degradação de compostos aromáticos, auxiliando assim nos esforços para biorremediação de ambientes salinos contaminados Abstract: The wastewater from oil extraction (produced water) is highly saline and contains a complex mixture of hydrocarbons, many of which are highly toxic. With increasing concern about preserving the environment, the technologies for recovery and remediation of degraded areas has been gaining attention. Bioremediation has been used as a method of natural biodegradation by optimizing biological processes because it is economical, versatile and it is the closest to a ecologically acceptable decontamination. However, bioremediation depends on factors such as pH, temperature, salinity and pressure. Extremes of these factors can inhibit or kill species that are adapted to extreme environments, so the development and optimization of bioremediation processes for contaminated extreme environments is of great importance. Thus, this work aimed at the isolation and characterization of halophilic bacteria present in the wastewater from oil extraction, and molecular studies of the genes involved with the degradation of aromatic compounds so that later we could use these strains in the bioremediation of this wastewater. Another aspect of this work was to study the microbial diversity present in this wastewater to assist in directing the efforts to minimize the impact of oil drilling. Seven strains of halophilic bacteria were isolated from of the produced water of oil production, all belonging to the family Halomoneaceae having potential for degradation of aromatic compounds. The strain that showed the highest growth rate in the tested compounds (benzoic acid, phenol, p-hydroxybenzoic acid) was strain DF2. Regarding the rate of degradation of the aromatic compounds tested, dp3 degraded about 90% of available phenol, followed by DF2 that degraded 80% of this compound. When the carbon source was benzoic acid, DP3 and df1 and degraded 99% and strain DF2 degraded 70% when the compound was p-hydroxybenzoic acid. For the degradation of these compounds the strain Halomonas organivorans followed the catechol degradation pathway ending in the formation of ß-Ketoadipate and was shown to produce various enzyme activities encoded by catRBCA. Comparison of the 16S rRNA gene sequences of the isolates with the sequences present in the GenBank and RDP databases revealed the isolates belonged to the genera Marinobacter and Halomonas. Comparing these results with those obtained by classical taxonomic techniques demonstrated that the 16S ribosomal RNA gene analysis (culture independent method), found greater diversity. Finally, of all tests performed to bioremediate the produced water, biostimulation by addition of nutrients was the most effective, and achieved a reduction of 77% of the organic load with the addition of phosphate combined with alanine. These results demonstrate the great potential of these strains for the degradation of aromatic compounds, as well as for the bioremediation of produced water from crude oil production, and describe the metabolic pathway used by members of the family Halomoneaceas for the degradation of aromatic compounds, thus assisting in efforts to develop methods for the bioremediation of contaminated saline environments Doutorado Ciência de Alimentos Doutor em Ciência de Alimentos