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In bacteria, DNA is not separated in the cell by a membrane, converse to eukaryotes, which have a nucleus. Therefore, DNA must be protected, while remaining accessible to allow for gene expression. The DNA structuring is achieved via proteins called NAPs (standing for "Nucleoid Associated Protein"). Among these NAPs, the Hfq protein is found. Hfq is a pleiotropic factor involved in bacterial physiology. Its best-known function is to regulate RNA-dependent processes. However, its ability to form an amyloid structure allows it to interact with DNA, to form bridges between distant parts of DNA and thus to compact it strongly. If this property was demonstrated in vitro, analyses were lacking in cellulo. This PhD work highlights the direct and indirect effects of Hfq on the compaction of the nucleoid. The complexes or the cells were observed using cryo-(scanning) transmission electron microscopy (cryo-(S)TEM) and cryo-soft X-ray tomography (cryo-SXT) techniques. The latter is a three-dimensional imaging technique that permits to quantify the volume and density of the bacterial nucleoid. This PhD project made possible to characterize the impact of Hfq on the structure of DNA and bacterial morphology, which will make it possible to test in cellulo the effects of new antibiotics, which could be developed in connection with this property in the future., Chez les bactéries, l'ADN n'est pas séparé du reste de la cellule par une membrane, contrairement aux eucaryotes qui possèdent un noyau. Cet ADN a donc besoin d'être à la fois protégé tout en restant accessible pour permettre l'expression génétique. Cette structuration de l'ADN se fait via des protéines appelées NAPs (pour "Nucleoid Associated Protein"). Parmi ces NAPs, on trouve la protéine Hfq. Hfq est un facteur pléiotrope impliqué dans la physiologie bactérienne. Sa fonction la plus connue est de réguler des processus ARNs dépendants. Cependant, sa capacité à former une structure amyloïde lui permet d'interagir avec l'ADN, de former des ponts entre des parties éloignées de l'ADN et ainsi de le compacter fortement. Si cette propriété a pu être démontrée in vitro, les analyses in cellulo manquaient. Ce travail de thèse met en lumière les effets directs et indirects d'Hfq sur la l'état de compaction du nucléoïde. Ainsi les complexes ou les cellules ont pu être observés à l'aide de techniques de cryo-microscopie électronique en transmission (à balayage) (cryo-(S)TEM) et de cryo-tomographie à rayons-X mous (cryo-SXT). Cette dernière, est une technique d'imagerie tri-dimensionnelle qui permet de quantifier le volume et la densité du nucléoïde bactérien. Ce projet de thèse a permis de caractériser l'impact d'Hfq sur la structure de l'ADN et la morphologie bactérienne, ce qui permettra de tester in cellulo l'effet de nouveaux antibiotiques qui pourront être développés en lien avec cette propriété dans le futur.

National audience; The filamentous yeast Candida albicans is a benign member of the healthy human microbiota but can also turn into an opportunistic pathogen in immunocompromised patients. The morphological plasticity of C. albicans is a major virulence factor. Hyphae i.e. elongated multi-cellular invasive filaments, and unicellular ovaloid yeasts, respectively participate toinvasion and dissemination in the tissues and bloodstream. The reversible yeast-to-hypha phenotypic switches depend on the physicochemical properties of C. albicans environment, notably pH, temperature and growth factors. C. albicans also secretes farnesol, a quorum-sensing molecule that is involved in inhibiting hyphal induction.In contrast to the impact of chemical parameters, little is known about how mechanical forces affect the growth phenotype. To this end, we have developed dedicated microfluidic devices allowing both live-cell imaging and high-throughput experiments to quantify the impact of compressive stress on the yeast-to-hypha transition. The principle of our devices isbased on the emergence of growth-induced pressure when cells proliferate in confined space.Using these devices, we observed expression of the hyphal-specific gene HWP1 under small compressive stress intensities. Yeast-to-hypha transition probability in the confined population seems modulated by the concentration of secreted farnesol and cell-division rate under pressure. To describe the local accumulation of farnesol in the dense population, wepropose a theoretical model of 1D advection-diffusion in a porous medium, based in particular on the Kozeny-Carman approximation. The results obtained suggest a significant underestimation of the hydrodynamic resistance of the porous material. This limitation opens new questions about the transport in a porous environment, composed of deformable and growing yeasts. The model predicts the temporal dynamics when advection is effective. Our results suggest that, taking inhibition into account, the efficiency of induction by pressure is as strong as a known inductive stress such as the addition of serum at 37°C.Single-cell characterization of HWP1 gene expression suggests a regulated mechanism during induction that compensates for biophysical pressure limitation. Single-cell reporter expression also showed that higher compressive stress values (hundreds of kPa) limits hyphal-growth maintenance. In contrast, observation of hyphae in a second uncompressed chamber showed that hyphal epigenetic program is maintained upon mechanical relaxation. Together, the results of this thesis suggest that growth-induced pressure promotes phenotype change in C. albicans, and that this transition is stable. These results pave the way for the investigation of the mechanical regulation of the yeast-to-hypha transition and its link with the pathogenicity of C. albicans.; La levure filamenteuse Candida albicans est un membre bénin du microbiote chez l'humain en bonne santé. Cependant, cet organisme peut devenir un pathogène opportuniste, particulièrement chez les patients immunodéprimés. La plasticité morphologique de C. albicans est un facteur majeur de sa virulence. Les hyphes, de longs filaments multicellulaires et invasifs, et les levures unicellulaires de forme ovaloïde, supportent respectivement l'invasion et la dissémination dans les tissues et le système sanguin. La transition de phénotype réversible levure-vers-hyphe dépend de multiples paramètres physico-chimiques de l'environnement de Candida, notamment le pH, la température et des facteurs de croissance. C. albicans sécrète également du farnésol, une molécule de quorum-sensing qui est impliquée dans l'inhibition de l'induction hyphale. Contrairement à l'impact des paramètres chimiques, la manière dont les for! ces mécaniques peuvent affecter le phénotype adopté reste peu renseignée. Nous avons utilisé des dispositifs microfluidiques permettant l'imagerie de cellules vivantes et des expériences à haut débit afin de quantifier l'impact de contraintes compressives sur la transition levure-hyphe. Le principe de ce dispositif repose sur l'émergence de la pression induite par la croissance des cellules sous confinement spatial. En utilisant ces dispositifs, nous avons observé l'expression d'un gène spécifique à la croissance hyphale (HWP1) sous de faibles intensités de forces compressives. La probabilité d'induction levure-hyphe dans la population confinée semble modulée par la concentration de farnésol sécrété, et par le taux de division sous pression. Pour décrire l'accumulation locale de farnésol dans la population dense, nous proposons un modèle théorique d'advection-diffusion 1D en milieu poreux reposant notamment sur l'approximation de Kozeny-Carman. Les ! résultats obtenus suggèrent une sous-estimation importante de la résistance hydrodynamique du poreux. Cette limitation ouvre de nouvelles questions sur le transport dans un poreux constitué de levures déformables et en croissance. Le modèle prédit la dynamique temporelle lorsque l'advection est efficace. Nos résultats suggèrent qu'en dehors de toute inhibition, l'efficacité d'induction par la pression est aussi forte qu'un stress inductif connu tel que l'addition de sérum à 37°C. La caractérisation de l'expression du gène HWP1 en cellule-unique suggère que la dynamique d'induction est régulée et compense la limitation biophysique de la pression. En parallèle, la maintenance du programme épigénétique hyphal semble limitée sous plus forte pression (centaine de kPa) via un ralentissement de la croissance. En revanche, la croissance hyphale est maintenue lorsque les hyphes accèdent à un second compartiment permettant la relaxation mécanique. Ensemble, ! les résultats de cette thèse suggèrent que la pression induite par l! a croissance confinée favorise le changement de phénotype chez C. albicans et que cette transition est stable. Ces résultats ouvrent la voie à de nouvelles investigations sur la régulation par la mécanique de cette transition et son lien avec la pathogénicité de C. albicans.

In bacteria, DNA is not separated in the cell by a membrane, converse to eukaryotes, which have a nucleus. Therefore, DNA must be protected, while remaining accessible to allow for gene expression. The DNA structuring is achieved via proteins called NAPs (standing for "Nucleoid Associated Protein"). Among these NAPs, the Hfq protein is found. Hfq is a pleiotropic factor involved in bacterial physiology. Its best-known function is to regulate RNA-dependent processes. However, its ability to form an amyloid structure allows it to interact with DNA, to form bridges between distant parts of DNA and thus to compact it strongly. If this property was demonstrated in vitro, analyses were lacking in cellulo. This PhD work highlights the direct and indirect effects of Hfq on the compaction of the nucleoid. The complexes or the cells were observed using cryo-(scanning) transmission electron microscopy (cryo-(S)TEM) and cryo-soft X-ray tomography (cryo-SXT) techniques. The latter is a three-dimensional imaging technique that permits to quantify the volume and density of the bacterial nucleoid. This PhD project made possible to characterize the impact of Hfq on the structure of DNA and bacterial morphology, which will make it possible to test in cellulo the effects of new antibiotics, which could be developed in connection with this property in the future.; Chez les bactéries, l'ADN n'est pas séparé du reste de la cellule par une membrane, contrairement aux eucaryotes qui possèdent un noyau. Cet ADN a donc besoin d'être à la fois protégé tout en restant accessible pour permettre l'expression génétique. Cette structuration de l'ADN se fait via des protéines appelées NAPs (pour "Nucleoid Associated Protein"). Parmi ces NAPs, on trouve la protéine Hfq. Hfq est un facteur pléiotrope impliqué dans la physiologie bactérienne. Sa fonction la plus connue est de réguler des processus ARNs dépendants. Cependant, sa capacité à former une structure amyloïde lui permet d'interagir avec l'ADN, de former des ponts entre des parties éloignées de l'ADN et ainsi de le compacter fortement. Si cette propriété a pu être démontrée in vitro, les analyses in cellulo manquaient. Ce travail de thèse met en lumière les effets directs et indirects d'Hfq sur la l'état de compaction du nucléoïde. Ainsi les complexes ou les cellules ont pu être observés à l'aide de techniques de cryo-microscopie électronique en transmission (à balayage) (cryo-(S)TEM) et de cryo-tomographie à rayons-X mous (cryo-SXT). Cette dernière, est une technique d'imagerie tri-dimensionnelle qui permet de quantifier le volume et la densité du nucléoïde bactérien. Ce projet de thèse a permis de caractériser l'impact d'Hfq sur la structure de l'ADN et la morphologie bactérienne, ce qui permettra de tester in cellulo l'effet de nouveaux antibiotiques qui pourront être développés en lien avec cette propriété dans le futur.

The ability of a cell to facilitate the selective and rapid movement of ions and small molecules across the plasma membrane is one of the most fundamental biological processes. Inward rectifier potassium (Kir) channels are integral membrane proteins that provide K+-selective pathways across the otherwise impermeable cell membrane along the electrochemical gradients. Kir channels support the flow of K+ ions into and out of the cell and regulate various functions in the human body, including heart rate, vascular tone, insulin secretion, and salt and fluid balance. The physiological significance of Kir channels is highlighted by the fact that genetically-inherited defects in these genes result in human diseases (channelopathies). We are particularly interested in Andersen’s syndrome, where mutations in the KCNJ2 gene coding for Kir2.1 protein are directly involved. Andersen’s syndrome (AS) is a rare disease characterized by cardiac arrhythmias, dysmorphic features, and periodic paralysis. The available treatment for AS patients is empirical rather than rational due to the lack of knowledge of this Kir2.1 channel. This thesis aimed to identify the differences between the wild-type Kir2.1 channel and two mutant AS-causing channels to find links between the structure and the function of human Kir2.1 using a combination of biochemical, structural, and functional approaches. In this study, we recombinantly expressed the human Kir2.1 channel in yeast and purified it in detergent. We characterized the interaction between Kir2.1 and the essential activator PIP2, solved the first human Kir channel structure by cryo-EM, and explored reconstitution in detergent-free systems like amphipols and nanodiscs. The findings of this study will provide a structural and functional base to understand better the mechanisms involved in Kir channels and the effects of their mutations. This manuscript is divided into three parts. The first part introduces Kir channels and state-of-the-art. The second part focuses on the characterization of the human potassium channel Kir2.1, the determination of its structure by cryo-EM, and the impact of mutations on its structure and function. The third part presents two mutations in the bacterial homolog KirBac3.1, which shares structural features with Kir2.1, to provide insight into the gating mechanism of Kir channels.; La capacité d'une cellule à faciliter le mouvement sélectif et rapide des ions et des petites molécules à travers la membrane plasmique est un processus biologique indispensable. Les canaux potassiques à rectification entrante (Kir) sont des protéines membranaires intégrales qui fournissent des voies sélectives aux ions K+ à travers la membrane cellulaire autrement imperméable, le long des gradients électrochimiques. Les canaux Kir permettent le passage des ions K+ dans les deux sens et régulent diverses fonctions chez les humains, notamment la fréquence cardiaque, le tonus vasculaire, la sécrétion d'insuline et l'équilibre salin et hydrique. L'importance physiologique des canaux Kir est mise en évidence par le fait que des défauts génétiquement héréditaires de ces gènes entraînent des maladies humaines (canalopathies). Nous nous intéressons particulièrement au syndrome d'Andersen, où des mutations du gène KCNJ2 codant pour la protéine Kir2.1 sont directement impliquées. Le syndrome d'Andersen (AS) est une maladie rare caractérisée par des arythmies cardiaques, des dysmorphies multiples et des paralysies périodiques. Le traitement disponible pour les patients atteints d’AS est empirique plutôt que rationnel en raison de la manque de connaissance de ce canal Kir2.1. Cette thèse visait à identifier les différences entre le canal Kir2.1 de type sauvage et deux canaux mutants causant l’AS afin de trouver des liens entre la structure et la fonction du Kir2.1 humain en utilisant une combinaison d'approches biochimiques, structurelles et fonctionnelles. Dans cette étude, nous avons exprimé le canal Kir2.1 humain dans la levure et l'avons purifié dans un détergent. Nous avons caractérisé l'interaction entre Kir2.1 et l'activateur essentiel PIP2, résolu par cryo-EM la première structure d'un canal Kir humain et exploré la reconstitution dans des systèmes modèles sans détergent comme les amphipols et les nanodisques. Les résultats de cette étude fourniront une base structurale et fonctionnelle pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les canaux Kir et les effets de leurs mutations. Ce manuscrit est divisé en trois parties. La première partie présente les canaux Kir et l'état de l'art. La deuxième partie porte sur la caractérisation du canal potassique humain Kir2.1, la détermination de sa structure par cryo-EM et l'impact des mutations sur sa structure et sa fonction. La troisième partie présente deux mutations dans l'homologue bactérien KirBac3.1, qui partage des caractéristiques structurelles avec Kir2.1, pour donner un aperçu du mécanisme d’ouverture et fermeture des canaux Kir.

J’ai intégré l'Institut Pasteur en 2014 en proposant un projet sur la perturbation par les virus des voies de signalisation impliquant les protéines à PDZ. En effet, de nombreuses protéines virales issues de virus de familles différentes (virus de l'hépatite B, du papillome humain, de la grippe, de la dengue, de l'encéphalite à tiques, de la rage, virus respiratoire aigu sévère) codent pour des motifs de liaison aux domaines PDZ (PBMs) permettant des interactions avec les protéines à PDZ cellulaires. L'examen des protéines à PDZ cellulaires ciblées par les PBM viraux révèle que les protéines virales interagissent avec des protéines contrôlant par exemple : l'apoptosecomme nous l’avons identifié chez le virus de la Rage, la formation de jonctions serrées et l'établissementde la polarité cellulaire comme nous l’avons déterminé chez le SARS-CoV-2. L’étude de la perturbation de la fonction des protéines cellulaires à PDZ par les virus codant pour des protéines virales ayant un PBM met en évidence une stratégie largement utilisée par les virus pour améliorer leur réplication, la dissémination dans l'hôte et la transmission à de nouveaux hôtes. Ces interactions PDZ/PBM sont importantes que ce soit dans lavirulence, la malignité ou la réplication virale. Cet axe de recherche pourrait donc accroître notre compréhension des différents aspects de la physiopathologie de l'infection par différents virus. Je concentre mes recherches sur la compréhension de la fonction des protéines contenant des domaines PDZ dans la signalisation cellulaire etleur perturbation par les virus à travers l'étude de leurs structures, interactions et dynamiques. Les aspects fonctionnels et structuraux de ces protéines sont étudiés.

Enseignement Cours – Physique des tissus biologiques Introduction Après un cours sur la matière active en 2019, les deux cours de 2020 et 2021 seront consacrés à la physique des tissus qui peuvent être considérés comme des exemples de matière active. Les cours mettent en avant le caractère actif des tissus, mais ils essaient de montrer aussi ce qu’une approche de physicien peut apporter à la biologie des tissus en discutant essentiellement deux types de tissus : les tissus cancéreux et les ti...

Cytoplasmic dyneins drive the majority of the retrograde microtubule transport events in eukaryotic cells. Cytoplasmic dynein-1 is involved in cell division, transport of organelles and vesicles, brain and muscle development, while cytoplasmic dynein-2 facilitates flagella assembly in mammalian cells. In the developing cortex, dynein-1, dynactin, and the BicD2 cargo adaptor are recruited to the nucleus, to move it from the apical to the basal side of the neocortex. The BicD2 cargo adaptor is an elongated, flexible linker protein mediating interaction with the minus-end directed dynein motor, the plus-end motor kinesin-1, nuclear pore components, RNA, and viral particles. This work focuses on two fundamental aspects of dynein-mediated transport : how does dynein generate force for movement via linker remodeling, and second how does human cargo adaptor BicD2 mediates the interaction with its cargo., Les dynéines cytoplasmiques dirigent la majorité des événements de transport rétrograde des microtubules dans les cellules eucaryotes. La dynéine cytoplasmique-1 est impliquée dans la division cellulaire, le transport des organelles et des vésicules, le développement du cerveau et des muscles, tandis que la dynéine cytoplasmique-2 facilite l'assemblage des flagelles dans les cellules de mammifères. Dans le cortex en développement, la dynéine-1,la dynactine et l'adaptateur de cargaison BicD2 sont recrutés vers le noyau, pour les déplacer du côté apical vers le côté basal du néocortex. L'adaptateur de cargaison BicD2 est une protéine de liaison allongée et flexible qui interagit avec le moteur dynéine dirigé vers l'extrémité négative, le moteur kinésine-1 dirigé vers l'extrémité positive, les composants du pore nucléaire, l'ARN et les particules virales. Ce travail se concentre sur deux aspects fondamentaux du transport médié par la dynéine : comment la dynéine génère-t-elle la force nécessaire au mouvement via le remodelage de la liaison, et comment l'adaptateur de cargaison humain BicD2 médiatise-t-il l'interaction avec sa cargaison ?

Ion transport across the cell membrane is an essential process for living cells. Active transport of ions is carried out by various ion transporters, including microbial rhodopsins (MRs).Microbial rhodopsins are light-driven membrane proteins that can perform various functions such as proton or ion pumping, photo-sensing, ion channeling, and others. Ion pumps MRs are known to be able to pump various monovalent ions such as Na+, K+, Cl-, I-. However, until recently, no microbial rhodopsin was known capable of pumping divalent ions.In 2017 first microbial rhodopsin able to pump divalent ions was described. It is rhodopsin from cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 7509 called Synechocystis halorhodopsin or SyHR. This protein belongs to the family of cyanobacterial anion pumps. It is a chloride pump with a unique ability to pump sulfate in the absence of chloride.In this thesis, the author obtained high-resolution three-dimensional structures of different states of this protein for the first time. There are chloride-bound form, sulfate-bound form, and two structures of active states: O and presumably K. All four structures have resolution better than 2.0 Å resolution. Obtained results give insights into the unique ability of this protein to pump divalent ions. In addition, the structures of active states explain the molecular mechanism of chloride transport in cyanobacterial anion pumps. This mechanism is incredibly similar to archaeal halorhodopsins, despite the fact that these two groups of MRs are not the closest relatives.The results obtained make it possible to understand better the molecular principles of ion transport by cyanobacterial anion pumps and assume that proteins from this family can become promising tools for optogenetics., Le transport des ions à travers la membrane cellulaire est un processus essentiel pour les cellules vivantes. Le transport actif des ions est assuré par divers transporteurs d'ions, dont les rhodopsines microbiennes (MR). Les rhodopsines microbiennes sont des protéines membranaires lumineuses qui peuvent remplir diverses fonctions telles que le pompage de protons ou d'ions, la photodétection, la canalisation des ions et autres. Les pompes à ions Les MR sont connues pour être capables de pomper divers ions monovalents tels que Na+, K+, Cl-, I-. Cependant, jusqu'à récemment, aucune rhodopsine microbienne n'était connue capable de pomper des ions divalents.En 2017, la première rhodopsine microbienne capable de pomper des ions divalents a été décrite. Il s'agit de la rhodopsine de la cyanobactérie Synechocystis sp. PCC 7509 appelé Synechocystis halorhodopsin ou SyHR. Cette protéine appartient à la famille des pompes à anions cyanobactériennes. C'est une pompe à chlorure avec une capacité unique à pomper le sulfate en l'absence de chlorure.Dans cette thèse, l'auteur a obtenu pour la première fois des structures tridimensionnelles à haute résolution de différents états de cette protéine. Il existe une forme liée au chlorure, une forme liée au sulfate et deux structures d'états actifs : O et vraisemblablement K. Les quatre structures ont une résolution meilleure que la résolution 2,0 Å. Les résultats obtenus donnent un aperçu de la capacité unique de cette protéine à pomper des ions divalents. De plus, les structures des états actifs expliquent le mécanisme moléculaire du transport du chlorure dans les pompes à anions cyanobactériennes. Ce mécanisme est incroyablement similaire aux halorhodopsines archéennes, malgré le fait que ces deux groupes de MR ne sont pas les plus proches parents. Les résultats obtenus permettent de mieux comprendre les principes moléculaires du transport d'ions par les pompes à anions cyanobactériennes et supposent que les protéines de cette famille peuvent devenir des outils prometteurs pour l'optogénétique.

Cytoplasmic dyneins drive the majority of the retrograde microtubule transport events in eukaryotic cells. Cytoplasmic dynein-1 is involved in cell division, transport of organelles and vesicles, brain and muscle development, while cytoplasmic dynein-2 facilitates flagella assembly in mammalian cells. In the developing cortex, dynein-1, dynactin, and the BicD2 cargo adaptor are recruited to the nucleus, to move it from the apical to the basal side of the neocortex. The BicD2 cargo adaptor is an elongated, flexible linker protein mediating interaction with the minus-end directed dynein motor, the plus-end motor kinesin-1, nuclear pore components, RNA, and viral particles. This work focuses on two fundamental aspects of dynein-mediated transport : how does dynein generate force for movement via linker remodeling, and second how does human cargo adaptor BicD2 mediates the interaction with its cargo., Les dynéines cytoplasmiques dirigent la majorité des événements de transport rétrograde des microtubules dans les cellules eucaryotes. La dynéine cytoplasmique-1 est impliquée dans la division cellulaire, le transport des organelles et des vésicules, le développement du cerveau et des muscles, tandis que la dynéine cytoplasmique-2 facilite l'assemblage des flagelles dans les cellules de mammifères. Dans le cortex en développement, la dynéine-1,la dynactine et l'adaptateur de cargaison BicD2 sont recrutés vers le noyau, pour les déplacer du côté apical vers le côté basal du néocortex. L'adaptateur de cargaison BicD2 est une protéine de liaison allongée et flexible qui interagit avec le moteur dynéine dirigé vers l'extrémité négative, le moteur kinésine-1 dirigé vers l'extrémité positive, les composants du pore nucléaire, l'ARN et les particules virales. Ce travail se concentre sur deux aspects fondamentaux du transport médié par la dynéine : comment la dynéine génère-t-elle la force nécessaire au mouvement via le remodelage de la liaison, et comment l'adaptateur de cargaison humain BicD2 médiatise-t-il l'interaction avec sa cargaison ?

Iron-sulfur clusters biogenesis is a process involving numerous proteins and the defects of one of them lead to severe diseases such as anaemia, neurodegenerative process, diabetes, cardiac hypertrophy and cancers. Iron-sulfur (Fe-S) clusters are critical prosthetic groups of proteins involved in redox processes such as ATP production, enzymatic catalysis, protein synthesis and maintenance of genome integrity. Therapeutic strategies based on the development of drugs mimicking the function of the proteins that perform the synthesis of these clusters are still in their infancy due to the lack of understanding of the exact molecular and biochemical mechanisms of their synthesis. The PhD project has mainly focused on the mechanism of Fe-S cluster biosynthesis by the ISC machinery and the functional role of frataxine in this process, a key regulator of the whole process, for which a defective expression leads to Friedreich's ataxia, a severe neurodegenerative and cardiac disease. Indeed, the assembly sequence of these Fe-S clusters was poorly defined, especially on the coordination of the insertion of iron and sulfur to form a polynuclear Fe-S cluster. Moreover, the nature of the final product of this ISC machinery was subject to debate: [2Fe2S] or [4Fe4S]. The global aim of the PhD project was to reconstitute the Fe-S cluster assembly machinery, eukaryote and prokaryote, with purified proteins to determine the structural basis of the assembly process using a panel of biochemical (kinetics, alkylation assay) and biophysical (Mössbauer, NMR, circular dichroism and EPR spectroscopies and native mass spectrometry) techniques, in order to understand how Fe-S clusters are synthesized and how frataxin regulates this process.; La biosynthèse des centres Fe-S est un processus impliquant un très grand nombre de protéines et la déficience de l’une de ces protéines conduit à des pathologies sévères : anémie, processus neurodégénératif, diabètes, hypertrophie cardiaque et même cancers. Ces centres Fe-S sont des groupements prosthétiques de protéines impliquées dans une multitude de processus redox tels que la production d'ATP, la catalyse enzymatique, la synthèse protéique ou encore la maintenance de l'intégrité du génome. Les stratégies thérapeutiques basées sur le développement de composés capable de mimer la fonction des protéines assurant la synthèse des centres Fe-S sont peu développées en raison du manque d'information sur les mécanismes moléculaires et biochimiques de synthèse de ces cofacteurs métalliques particulièrement versatiles. Le projet de thèse s’est principalement intéressé à l’élucidation du mécanisme de biosynthèse des centres Fe-S par la machinerie ISC et au rôle fonctionnel de la frataxine dans ce processus qui est une protéine centrale dont le défaut d'expression conduit à l'ataxie de Friedreich, une maladie neurodégénérative et cardiaque. En effet, la séquence d’assemblage de ces centres Fe-S était mal défini notamment sur la coordination de l’insertion du fer et du soufre pour former un centre polynucléaire Fe-S. De plus, la nature du produit final de cette machinerie ISC était sujette à débat : [2Fe2S] ou [4Fe4S]. L'objectif principal de ce projet de thèse était de reconstituer in vitro la machinerie d'assemblage des centres Fe-S, eucaryote et procaryote, à partir des protéines purifiées afin de déterminer les bases biochimiques et structurales du processus d'assemblage en utilisant un panel de techniques biochimiques (cinétique d’assemblage, test d’alkylation) et biophysiques (spectroscopies Mössbauer, RMN, RPE, spectrométrie de masse native et dichroïsme circulaire), dans le but de comprendre comment les centres Fe-S sont synthétisés et comment la frataxine régule ce processus.

Some natural systems known as Brownian ratchets use thermal fluctuations to extractmechanical power. In these systems, diffusion is biased in order to achieve unidirectionalbiological processes. Good examples are the molecular motors as kinesins or myosinsthat walk on the cytoskeleton and use ATP to bias their movement. Another case isthe transport of mRNA between the nucleus and the cytoplasm through Nuclear PoreComplexes (NPC). The NPC is a large molecular complex which selects molecules thatenter or exit the nucleus. It has been shown to be highly selective and directional. To studythe directional transport of biomolecules through the NPC, a simplified mimetic devicebased on nanoporous membranes was designed. Our approach used near-field microscopytechnique, Zero Mode Waveguide for Nanopores. With this method single DNA moleculestranslocation through nanopores was observed in real time. Ratchet agents which arepolycations that bind strongly to the DNA and cannot diffuse through the pore wereadded on the exit side of the membrane. We quantified the effect of the ratchet agent onthe translocation frequency of DNA molecules and established the proof of principle ofthe translocation ratchet. From these measurements, we defined a ratchet efficiency thatwe characterized according to its geometrical and kinetics parameters and compared withcoarse grained modeling. We observed a critical length of 3 kbp for the DNA molecule totrigger the ratchet effect, that we explained according to a DNA loop formation model.; Il existe dans la nature des systèmes connus sous le nom de ratchets browniens qui utilisent les fluctuations thermiques pour extraire un travail mécanique. Dans ces systèmes, la diffusion est biaisée de manière à rendre possible des processus biologiques unidirectionnels. Les moteurs moléculaires en sont de bons exemples, comme la kinésine et la myosine qui se déplacent sur le cytosquelette et utilisent l’ATP pour biaiser leurs mouvements. Un autre cas est le transport d’ARNm entre le noyau et le cytoplasme à travers le pore nucléaire (NPC). Le pore nucléaire est un complexe moléculaire massif sélectionnant les molécules qui peuvent entrer ou sortir à travers le noyau. Le pore nucléaire a été prouvé comme très sélectif et directionnel. Pour étudier la directionnalité du transport de biomolécules à travers le pore nucléaire, nous avons développé un système simplifié mimétique basé sur les membranes nanoporeuses. Notre approche s’est basée sur une technique de microscopie de champ proche, le Zero-Mode Waveguide pour nanopores. Avec cette méthode, nous avons observé la translocation en temps réel de molécules d’ADN uniques à travers des nanopores. Des agents de ratchet, constitués de polycations se liant fortement à l’ADN et ne pouvant pas diffuser à travers le pore, ont été ajoutés à la sortie des nanopores. Nous avons quantifié l’effet de ces agents de ratchet sur la fréquence de translocation des molécules d’ADN et mis en évidence le fonctionnement expérimental du mécanisme de ratchet de translocation. A partir de ces mesures, nous avons défini une efficacité de ratchet que nous avons caractérisée par rapport à ses paramètres géométriques et cinétiques puis nous l’avons comparée à des modèles phénoménologiques. Nous avons notamment observé l’existence d’une longueur critique de 3 kbp pour la taille de la molécule d’ADN pour activer l’effet de ratchet, ce que nous avons expliqué à partir d’un modèle de formation de boucles d’ADN.

Self organization is crucial for the wealth of living systems, both at the molecular and cellular level. To correctly achieve their role, a tight control over the shape and structure of the protein, for instance, is required. Any mistake can lead to various diseases like Alzheimer, where proteins aggregate into fibrous structures. On a larger scale, cells need to probe the mechanical response of their environment -the extra cellular matrix- and to adapt their own rigidity to collectively orientate. In this thesis, we are looking at two different models. In the first part, we study protein aggregation beyond the microscopical details. By considering elastic assembling particles, we are able to derive generic laws and understand the persistent formation of fibers. In the second part, we model the dynamical response of a fashionable class of hydrogels for their biocompatibility. Material engineers are now able to synthesize materials with more and more subtle behavior, although understanding certain emergent properties -such as non-exponential relaxation- can be a major challenge. We design a simple model for the dynamical response of hydrogels connected by large multivalent crosslinkers. We are able to account for experimental results, and rationalize their origin., Les systèmes biologiques sont entièrement auto-assemblés, à la fois à l’échelle moléculaire et cellulaire. Pour réussir la forme et la structure de chaque protéine par exemple, doit être précisément contrôlée. La moindre erreur conduit à des maladies telles qu’Alzheimer où des protéines s’agrègent entre elles pour former des structures fibreuses. À une échelle plus large les cellules ont besoin de sonder la réponse mécanique de leur environnement -la matrice extra cellulaire- et d’adapter leur propre rigidité pour être capable de s’orienter collectivement. Dans cette thèse nous étudions deux modèles différents. Dans la première partie, nous étudions l’agrégation de protéines au-delà des détails microscopiques. En considérant l’assemblage de particules élastiques, nous sommes capables de comprendre la formation générique de structures fibreuses. Dans la seconde partie, nous modélisons la réponse dynamique d’une catégorie d’hydrogel qui suscite beaucoup d’intérêt en raison de leur compatibilité biologique. Les ingénieurs en matériaux sont aujourd’hui capables de synthétiser des matériaux aux propriétés surprenantes, néanmoins comprendre l’origine de ces propriétés émergentes peut s’avérer compliqué. Nous modélisons la réponse dynamique des hydrogels connectés par de gros agents réticulants multivalent. Ceci nous permet de reproduire les résultats expérimentaux et d’en comprendre l’origine.

Hair cells of the inner ear operate as cellular microphones that convert sound-evoked vibrations into electrical signals. Each hair cell is endowed with a mechanosensitive hair bundle—a tuft of actin-filled and cylindrical stereocilia. Hearing starts when sound evokes deflections of the hair bundle. Deflections modulate tension in the tip links that interconnect stereocilia and convey force to mechanosensitive ion channels, resulting in ionic influx. The hair-bundle morphology is tightly coupled to hair-cell function as a frequency-selective detector: high-frequency hair cells have shorter hair bundles and morphological defects in the hair bundles are associated with deafness. Because hair cells do not regenerate in mammals, the mechanism that maintains the hair-bundle morphology throughout life is of great importance, yet has remained elusive. This PhD project aims at studying a feedback mechanism between mechanoelectrical transduction and hair-bundle morphology. With hair cells excised from a frog’s ear, we found that blocking the transduction channels or disrupting the tip links resulted in shortening (~15%) and widening (~17-60%) of the stereocilia. Hair bundles with blocked transduction channels showed a 2-fold increase in their stiffness, a change too large to be explained by shortening only. Electron microscopy revealed that spacing of the parallel actin filament in the core of the stereocilia does not change with blocked transduction channels or disrupted tip links. Widening thus probably resulted from an increase in the number of actin filaments constituting the stereociliary core. Inhibiting formins—proteins that promote actin polymerization—resulted in thinner stereocilia in control cells and nearly abolished stereocilia widening upon blockage of the MET channels. These observations suggest that the control of actin polymerization by the transduction channels is likely to be formin-dependent., Les cellules ciliées de l'oreille interne convertissent les vibrations induites par le stimulus sonore en signaux électriques. Chaque cellule ciliée est dotée d’une touffe de ‘stéréocils’ cylindriques remplis de filaments d’actine. Une déflexion de la touffe ciliaire module la tension dans les liens de bout-de-cil qui interconnectent les stéréocils et transmettent une force à des canaux ioniques, entraînant l’apparition d’un courant. La morphologie de la touffe ciliaire est étroitement liée à la fonction des cellules ciliées: les touffes ciliaires sont plus courtes pour la détection des hautes fréquences et des défauts morphologiques de la touffe ciliaire sont associés à des pertes auditives. Le mécanisme qui maintient la morphologie de la touffe ciliaire tout au long de la vie est donc d'une grande importance mais demeure obscur. Ce projet de thèse vise à étudier une rétroaction entre la transduction mécanoélectrique et la morphologie de la touffe ciliaire. Nous avons observé chez la grenouille que bloquer les canaux de transduction ou couper les liens de bout-de-cil entraîne un raccourcissement (~15%) et un épaississement (~17-60%) des stéréocils. En conséquence, la rigidité de la touffe ciliaire est deux fois plus grande que dans les cellules non perturbées. La microscopie électronique a de plus révélé que l'espacement entre filaments d'actine dans chaque stéréocil n’est pas modifié. L'épaississement d’un stéréocil résulte donc d'une augmentation du nombre de filaments d'actine. Enfin, l'inhibition des formines—des protéines impliquées dans la polymérisation de l'actine—produit des stéréocils plus minces dans les cellules témoins et aboli presque complètement l'épaississement des stéréocils résultant du blocage des canaux de transduction. Ces observations sont suggèrent que le contrôle de la polymérisation de l'actine par les canaux de transduction pourrait dépendre de la formine.

info:eu-repo/semantics/published

We previously identified a tight bidirectional phase coupling between the circadian clock and the cell cycle. To understand the role of the CLOCK/BMAL1 complex, representing the main positive regulator of the circadian oscillator, we knocked down Bmal1 or Clock in NIH3T33C mouse fibroblasts (carrying fluorescent reporters for clock and cell cycle phase) and analyzed timing of cell division in individual cells and cell populations. Inactivation of Bmal1 resulted in a loss of circadian rhythmicity and a lengthening of the cell cycle, originating from delayed G2/M transition. Subsequent molecular analysis revealed reduced levels of Cyclin B1, an important G2/M regulator, upon suppression of Bmal1 gene expression. In complete agreement with these experimental observations, simulation of Bmal1 knockdown in a computational model for coupled mammalian circadian clock and cell cycle oscillators (now incorporating Cyclin B1 induction by BMAL1) revealed a lengthening of the cell cycle. Similar data were obtained upon knockdown of Clock gene expression. In conclusion, the CLOCK/BMAL1 complex controls cell cycle progression at the level of G2/M transition through regulation of Cyclin B1 expression., SCOPUS: ar.j, info:eu-repo/semantics/published

National audience; La membrane plasmique (MP) forme une barrière sélective entre la cellule et le milieu extérieur.C’est un senseur des modifications environnementales et une plateforme orchestrant latransduction du signal permettant de déployer une réponse adaptée. Elle joue donc un rôleessentiel dans la physiologie cellulaire. Décrypter les bases moléculaires de l’organisation dela MP apparaît donc nécessaire pour comprendre comment les plantes s’adaptent auxmodifications environnementales. La MP est une bicouche de lipides à laquelle des protéinessont associées, et les données accumulées sur ce modèle ont révélé son organisation complexeet dynamique et le rôle essentiel joué par les lipides qui la composent dans cette organisation.Un point crucial pour lequel les données disponibles chez l’animal sont encore absentes chezles plantes concerne l’asymétrie entre les deux feuillets de la MP et leur couplage : comment laMP coordonne-t-elle la transduction du signal détecté par le feuillet externe, en une réponseopérée par la machinerie cellulaire au contact du feuillet interne. Mon projet de thèse propose(i) de mettre au point des outils (sondes fluorescentes) permettant de caractériser les propriétésbiophysiques de chacun des deux feuillets de la MP de cellules d’Arabidopsis thaliana (ii) decoupler l’utilisation d’outils pharmacologiques et génétiques pour tester in vivo l’influence desdifférents lipides sur les caractéristiques biophysiques des deux feuillets (iii) d’analyser cesparamètres lors des étapes précoces de la signalisation de défense des plantes.

Chagas disease is a vector-borne parasitic disease caused by the flagellated protozoan Trypanosoma cruzi and transmitted to humans by a large group of bloodsucking triatomine bugs. Triatomine insects, such as Rhodnius prolixus, ingest a huge amount of blood in a single meal. Their midgut represents an important interface for triatomine–trypanosome interactions. Furthermore, the development of parasites and their vectorial transmission are closely linked to the blood feeding and digestion; thus, an understanding of their physiology is essential for the development of new strategies to control triatomines. In this study, we used label-free quantitative proteomics to identify and analyze the early effect of blood feeding on protein expression in the midgut of Rhodnius prolixus. We both identified and quantified 124 proteins in the anterior midgut (AM) and 40 in the posterior midgut (PM), which vary significantly 6 h after feeding. The detailed analysis of these proteins revealed their predominant involvement in the primary function of hematophagy, including proteases, proteases inhibitors, amino acids metabolism, primary metabolites processing, and protein folding. Interestingly, our proteomics data show a potential role of the AM in protein digestion. Moreover, proteins related to detoxification processes and innate immunity, which are largely accepted to be triggered by blood ingestion, were mildly modulated. Surprisingly, one third of blood-regulated proteins in the AM have unknown function. This work contributes to the improvement of knowledge on the digestive physiology of triatomines in the early hours post-feeding. It provides key information for selecting new putative targets for the development of triatomine control tools and their potential role in the vector competence, which could be applied to other vector species., SCOPUS: ar.j, info:eu-repo/semantics/published