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Orientador: Gláucia Maria Pastore Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: O objetivo do presente trabalho foi efetuar estudos de biotransformação de monoterpenos para a obtenção de compostos de aromas naturais, ou bioaromas, enfatizando os processos bioquímicos envolvidos nos procedimentos empregados para possíveis aplicações industriais. Assim, o estudo se iniciou com 70 linhagens, isoladas em uma planta de processamento de suco de laranja e selecionadas em um estudo prévio pois mostraramse capazes de utilizar este R-(+)-limoneno como única fonte de carbono. Estes microorganismos foram testados quanto a sua capacidade de biotransformar este monoterpeno em compostos de aroma. Dentre todas as linhagens potencialmente degradantes do R- (+)-limoneno, apenas a linhagem LB285JLB mostrou acúmulo significativo de metabólito de interesse em concentração que justifique estudos de otimização. A seguir, o método de Superfície de Resposta foi empregado para otimizar os principais parâmetros do processo de produção de biomassa desta linhagem, utilizando glicerol como fonte de carbono. Dentre os parâmetros analisados, três (concentração de substrato, temperatura e agitação) influenciaram significativamente (p < 0,10) a produção de biomassa da linhagem LB285JLB, dentro das faixas estudadas. A otimização dessas variáveis por um Delineamento Composto Central Rotacional revelou que as condições ótimas para a fermentação foram 6-9 g.L-1 de glicerol, temperatura entre 35-40 °C e agitação de 230 a 300 rpm. Finalmente, estudos preliminares de prospecção do potencial dos microorganismos endofíticos isolados do Baru (Dipteryx alata Vog.), visando o desenvolvimento de processos biotecnológicos de interesse industrial. Até o presente momento os trabalhos conduzidos demonstraram que as linhagens endofíticas podem ter aplicação potencial em processos de produção de bioaromas a partir da biotransformação de monoterpenos, juntamente com a co-produção de enzimas. Esses resultados abrem precedentes para que novas pesquisas sejam consideradas a fim de determinar o potencial deste nicho de micro-organismos Abstract: The objective of the present work was to study the biotransformation of monoterpenes to obtain natural flavor compounds (bioflavors), focusing the biochemical processes involved in the procedures investigated for possible industrial applications. Therefore, the study started with 70 strains, isolated in a previous study from a citrus processing plant and capable of use R-(+)-limonene as sole carbon and energy source. These microorganisms were tested for their ability to biotransform this monoterpene on flavor compounds. Among the strains potentially degrading of R-(+)-limonene, just the strain LB285JLB showed significant accumulation of interest metabolite concentration which could justify optimization studies. Subsequently, the Response Surface Methodology was employed to optimize the main parameters of the process of LB285JLB biomass production, using glycerol as carbon source. Only three (glycerol concentration, temperature and agitation) of all parameters tested influenced significantly (p < 0.1) the biomass production. TheT optimization of these variables applying a Central Composite Design revealed that the optimal biotrasformation conditions were 6-9g.L-1, 35-40 °C and 230-300 rpm. Finally, preliminary propection studies evaluating the potential of endophytes isolated from Baru (Dipteryx alata Vog.), for the development of biotechnological processes of industrial interest. To date, the studies conducted have shown that endophytic microorganisms may have potential application in biotransformation process for bioflavors production, and also should be considered with process of enzymes co-production. These results encourages that further researchs should be considered to determine the potential of these microorganisms Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Gláucia Maria Pastore Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Esta tese de doutorado teve como objetivos principais a prospecção de novos biocatalisadores fúngicos para serem utilizados no processo de biotransformação de monoterpenos (R-limoneno, S-limoneno, 'alfa'-pineno, ß-pineno e citronelol) para obtenção de aromas naturais, assim como otimizar as condições de processo para a maximização da concentração dos produtos obtidos. A primeira etapa do trabalho prático deste projeto envolveu o isolamento de micro-organismos endofíticos e seleção das melhores linhagens para a produção de bioaromas. Estes micro-organismos foram isolados de frutos verdes de jenipapo (Genipa americana L.), um fruto da flora brasileira rico em monoterpenos. Quinze linhagens diferentes de fungos filamentosos endofíticos foram isoladas de frutos verdes de jenipapo, dos quais, três mostraram a capacidade de metabolizar os monoterpenos testados. A linhagem identificada como JV-7 foi capaz de bioconverter 'alfa'-pineno e produzir verbenol e verbenona, compostos muito visados na indústria de aromas e fragrâncias. Na biotransformação de ß-pineno, foi possível a obtenção de pinocarveol, utilizando-se a linhagem JV-15. Este composto tem maior valor agregado comparado a seu precursor, e este é um dos poucos trabalhos envolvendo sua produção. Os isômeros de limoneno foram biotransformados pela linhagem JV-10 a dois produtos majoritários diferentes: neodihidrocarveol e limoneno-1,2-diol a partir de R- e S- limoneno respectivamente. Visando aumentar a concentração dos compostos de aroma previamente obtida utilizando as linhagens de fungos endofíticos, as variáveis agitação, temperatura, concentração inicial de substrato e quantidade de biomassa fúngica adicionada foram estudadas em dois delineamentos experimentais. No primeiro delineamento composto central rotacional (DCCR), as condições de processo para a biotransformação de 'alfa'-pineno em verbenol foram otimizadas: 200 rpm, 22 ºC, concentração de substrato igual a 1,25 % (v/v) e 5 g de biomassa de biocatalisador em 50 mL de meio. Nessas condições, foi possível aumentar aproximadamente 1,4 vezes a concentração final de verbenol, de 222,4 ± 2 mg/L para 318,4 ± 2,4 mg/L. O segundo DCCR envolveu a biotransformação de ß-pineno para produção de pinocarveol. Neste caso, as condições otimizadas foram: concentração de substrato de 1 % (v/v), biomassa fúngica 5 g/50 mL de meio, agitação de 150 rpm e 30 ºC, o que resultou em um aumento na concentração de produto de 64,8 ± 0,6 mg/L para 141,32 ± 2,6 mg/L, ou seja, o dobro da concentração inicial pode ser obtida. O estudo da otimização das condições de processos para a produção de aromas naturais é uma das estratégias mais promissoras que vem sendo utilizadas para o aumento da concentração de produto e consequentemente, para redução de custos e viabilização da sua produção. Além disso, este trabalho demonstra o potencial de micro-organismos endofíticos, encontrados naturalmente em fontes ricas em terpenos para serem utilizados como novos biocatalisadores na biotransformação destes compostos e obtenção de extratos com características sensoriais inovadoras e interessantes Abstract: This work aimed to prospect novel fungal biocatalysts to be employed in biotransformation of terpenes (R-limonene, S-limonene, 'alpha'-pinene, ß-pinene e citronellol) for natural aroma production, as well as the optimization of process conditions in order to increase final product concentration. Initially, the practical work comprised the isolation of endophytic microorganisms and the screening of the best strains for bioflavors production. These microorganisms were isolated from unripe genipap (Genipa americana L.) fruits, a Brazilian unexploited source of monoterpenes and iridoids. Fifteen endophytic filamentous fungi strains were isolated from unripe genipap, from which, three strains showed the ability to metabolize the tested monoterpenes. A strain identified as JV-7 was able to bioconvert 'alpha'-pinene into verbenol and verbenone, interesting compounds for flavors and fragrance industries. In the biotransformation of ß-pinene, the major product obtained was pinocarveol, using the strain JV-15. Pinocarveol has higher reference price when compared to its precursor, and, there are few works regarding its production. The isomers of limonene were metabolized by JV-10 strains and two different products could be obtained: neodihydrocarveol and limonene-1,2-diol, from R- and S-limonene respectively. Aiming to increase final product concentration obtained with endophytic strains, the variables agitation, temperature, substrate concentration and amount of biocatalyst biomass were evaluated in two experimental designs. In the first central composite design (CCD), the biotransformation of 'alpha'-pinene into verbenol could be optimized using the process conditions: 200 rpm, 22 ºC, substrate concentration of 1.25 % (v/v) and fungal biomass of 5 g in 50 mL media, increasing verbenol concentration from 222.4 ± 2 mg/L to 318.4 ± 2.4 mg/L. The second CCD, aimed to optimize ?-pinene biotransformation for pinocarveol production. In this case, the optimum conditions were substrate concentration of 1% (v/v), 150 rpm, 30 ºC and 5g of fungal biomass per 50 mL media. It was achieved a 2-fold increase in pinocarveol concentration, from 64.8 ± 0.6 mg/L to 141.32 ± 2.6 mg/L. The study of process parameters for natural aroma production is one of the most promising tools that are being used to increase product concentration and consequently to reduce costs in its production. In addition, this work shows the potential of endophytic microorganisms that can be naturally found in terpene rich sources to be employed as new biocatalysts in biotransformation assays, obtaining extracts with novel and interesting sensorial characteristics Doutorado Ciência de Alimentos Doutora em Ciência de Alimentos FAPESP 2013/18390-0 CNPQ 130038/2014-8

Bioflavors and oligosaccharides are two classes of substances that may be produced biotechnologically through microbial bioprocesses. These compounds have attracted the interest of pharmaceutical and food industries not only due to their technological properties (sweetening/fiber or flavoring, respectively), but also as a consequence of other functional properties such as, for example, health promoting benefits. The use of agro-industrial residues as substrates in biotechnological processes seems to be a valuable alternative in helping to overcome the high manufacturing costs of industrial fermentations. This manuscript reviews the most important advances in biotechnological production of bioflavors and oligosaccharides. The use of some agro-industrial residues in such processes is also cited and discussed, showing that this is a rising trend in biotechnology.Bioaromas e oligossacarídeos são duas classes de substâncias que podem ser produzidas biotecnológicamente por meio de bioprocessos microbiológicos. Estes compostos têm atraído o interesse das indústrias farmacêutica e de alimentos não só devido às suas propriedades tecnológicas (adoçantes/fibras ou aromatizantes, respectivamente), mas também como consequência de outras propriedades funcionais como, por exemplo, benefícios na promoção da saúde. O uso de resíduos agroindustriais como substrato em processos biotecnológicos parece ser uma alternativa valiosa para superar os altos custos de manufatura envolvidos nas fermentações industriais. Este manuscrito faz uma revisão dos mais importantes avanços na produção biotecnológica de bioaromas e oligossacarídeos. O uso de alguns resíduos agroindustriais nestes processos também são citados e discutidos, mostrando que esta é uma tendência crescente na biotecnologia.

Orientador: Gláucia Maria Pastore Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Este trabalho de doutorado teve como principal objetivo estudar a produção biotecnológica de compostos de aroma a partir da biotransformação de terpenos, analisando potenciais biocatalisadores, processos bioquímicos diferenciados e a otimização das condições de processo envolvidas na produção destes aromas naturais para possíveis aplicações industriais. Inicialmente, o trabalho prático foi direcionado para uma série de estudos com o fungo Fusarium oxysporum 152B, visando complementar os recentes avanços alcançados pelo grupo de pesquisa na caracterização e otimização da bioconversão de R-(+)-limoneno em ?-terpineol. Desta forma, os resultados foram promissores, demonstrando o grande potencial e versatilidade deste fungo para a área, sendo que este biocatalisador foi capaz de produzir diferentes metabólitos a partir dos substratos S-(?)-limoneno, ?-pineno, ?-terpineno e linalol. Na sequência, o trabalho visou avaliar a bioconversão de S-(?)-limoneno para limoneno-1,2-diol em maiores detalhes. A produção de limoneno-1,2-diol, em condições não otimizadas, chegou a 1,2 g.L-1, sendo que foi detectada a continuação desta via metabólica quando este produto foi posteriormente metabolizado a 1-hidroxi-2- oxolimoneno, sugerindo que o fungo Fusarium oxysporum 152B possui uma via de degradação de limoneno recentemente descoberta. O trabalho prático visou também a otimização da produção de limoneno-1,2-diol por meio de uma estratégia sequencial de experimentos. Com base nas análises estatísticas, a produção deste composto a partir da bioconversão de S-(?)-limoneno pelo fungo Fusarium oxysporum 152B chegou a 3,7 g.L-1, utilizando pH 6,5, 5 g.L-1 de substrato, a 28 oC e 250 rpm de agitação. Além disso, esta foi a primeira descrição da utilização do resíduo agroindustrial conhecido como manipueira, originada ao longo do processamento da mandioca, para a produção de biomassa deste fungo, bem como uma das maiores concentrações de limoneno-1,2-diol reportadas na literatura específica. Além disso, o trabalho conduzido visou realizar uma série de comparações práticas entre a biotransformação de R-(+)-limoneno a ?-terpineol e a bioconversão de S-(?)-limoneno a limoneno-1,2-diol, pela mesma linhagem. Adicionalmente, este foi o primeiro trabalho que analisou as diferenças ultraestruturais causadas no biocatalisador ao longo do processo de bioconversão destes substratos, por meio de microscopia eletrônica de varredura e transmissão. Finalmente, foi estudada a otimização da produção de ?-terpineol, a partir da biotransformação de limoneno, utilizando o biocatalisador reconhecido como Sphingobium sp. Após o trabalho prático e análise estatística dos dados, observou-se que as melhores condições para desenvolvimento deste processo foram pH 7,0, concentração de limoneno de 350 g.L-1, agitação de 200 rpm e 28 oC. Nestas condições, a produção deste álcool monoterpênico chegou a 500 g.L-1, que pode ser considerada como a maior concentração de ?-terpineol já relatada na bibliografia de processos biotecnológicos. Abstract: This work aimed to study the biotechnological production of aroma compounds from the biotransformation of terpenes, analyzing potential biocatalysts, biochemical processes and optimization of process conditions involved in the production of natural flavors for industrial applications. Initially, the practical work was directed to a series of studies with the fungal strain Fusarium oxysporum 152B, aiming to enhance the knowledge obtained in recent advances achieved by our research group in the characterization and optimization of the biotransformation of R-(+)-limonene into ?-terpineol. Thus, the results were promising, showing the great potential and versatility of this fungus to the specific area, and this biocatalyst was able to produce new metabolites from substrates S-(?)-limonene, ?-pinene, ?-terpinene and linalool. In the sequence, this study aimed at assessing the bioconversion of S-(?)-limonene into limonene-1,2-diol in greater detail. Thus, chapters 3, 4 and 5 were designed to a better characterization of this pathway. The production of this compound under non-optimized conditions, reached 1.2 gL-1, and the continuation of this pathway has been detected when this product was subsequently metabolized to 1-hydroxy-2-oxolimonene, suggesting that the fungus Fusarium oxysporum 152B might have a limonene degradation pathway only recently discovered. The practical work also conducted an extensive optimization of the production of limonene-1,2-diol by means of a sequential strategy. Based on statistical analyzes, the production of this compound from the bioconversion of S-(?)-limonene by the fungus Fusarium oxysporum 152B reached 3.7 gL-1, using pH 6.5, 5 gL-1 of substrate at 28 ° C and 250 rpm agitation. Moreover, this is the first description of the use of agroindustrial residue known as cassava wastewater, for the production of this fungal biomass, as well as one of the highest concentration of biotechnological limonene-1,2-diol reported in the specific literature. In addition, the research conducted aimed to perform a series of comparisons between practical conditions involved in the biotransformation of R-(+)-limonene into ?-terpineol, and the bioconversion of S-(?)-limonene into limonene-1,2-diol, for the same strain. Additionally, this is the first study that reported the ultrastructural differences along the bioconversion process of these substrates by means of scanning and transmission electron microscopy. Finally, this work evaluated the optimization of the production of ?-terpineol from the biotransformation of limonene using the biocatalyst recognized as Sphingobium sp. After the practical work and statistical analysis, it was observed that the best conditions for developing this process were pH 7.0, concentration of limonene 350 g L-1, agitation at 200 rpm and 28 oC. Accordingly, the production of the monoterpe alcohol reached 500 g.L-1, which can be considered as the highest concentration of ?-terpineol already reported in the literature for biotechnological processes. Doutorado Ciência de Alimentos Doutor em Ciência de Alimentos

Bioflavors and oligosaccharides are two classes of substances that may be produced biotechnologically through microbial bioprocesses. These compounds have attracted the interest of pharmaceutical and food industries not only due to their technological properties (sweetening/fiber or flavoring, respectively), but also as a consequence of other functional properties such as, for example, health promoting benefits. The use of agro-industrial residues as substrates in biotechnological processes seems to be a valuable alternative in helping to overcome the high manufacturing costs of industrial fermentations. This manuscript reviews the most important advances in biotechnological production of bioflavors and oligosaccharides. The use of some agro-industrial residues in such processes is also cited and discussed, showing that this is a rising trend in biotechnology. Bioaromas e oligossacarídeos são duas classes de substâncias que podem ser produzidas biotecnológicamente por meio de bioprocessos microbiológicos. Estes compostos têm atraído o interesse das indústrias farmacêutica e de alimentos não só devido às suas propriedades tecnológicas (adoçantes/fibras ou aromatizantes, respectivamente), mas também como consequência de outras propriedades funcionais como, por exemplo, benefícios na promoção da saúde. O uso de resíduos agroindustriais como substrato em processos biotecnológicos parece ser uma alternativa valiosa para superar os altos custos de manufatura envolvidos nas fermentações industriais. Este manuscrito faz uma revisão dos mais importantes avanços na produção biotecnológica de bioaromas e oligossacarídeos. O uso de alguns resíduos agroindustriais nestes processos também são citados e discutidos, mostrando que esta é uma tendência crescente na biotecnologia.