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The nucleus is a compartmentalized organelle of the eukaryotic cells with a dynamic morphology and containing distinct chromosomal domains and nuclear bodies. To link nuclear structure and function, we have developed a simple and user-friendly ImageJ plugin called NucleusJ to quantify in 3D the nuclear morphology as well as positioning and organization of nuclear domains. From confocal images, the workflow applies for a batch of images a modified Otsu thresholding method to segment the nuclear space and a 3D watershed algorithm to delimit chromatin domains by partitioning the nucleus. Quantitative parameters are computed including shape and size of nuclei as well as intra-nuclear objects such as chromatin domains and their position in respect to the nuclear periphery [Poulet et al., 2015]. New improvements have been added to NucleusJ and a new version has been released [Dubos et al., 2020]. First, the current version involves manual intervention to delimit a bounding volume including each considered nucleus. To overcome this limitation and automatically capture large numbers of nuclei at various depths in the original image, the so-called autocrop procedure has been implemented to automatically detect the nuclei from wide field images. Spatial positions of the cropped nuclei are then recorded in order to estimate distance maps as a new estimator of spatial distribution of the nuclei in a whole tissue context. Second, as the main step in our workflow is to delimit the nucleus or intra-nuclear objects from the background alternatives to the 3D watershed which cannot be fully automated have been explored. To this aim, we adapted convex hull algorithms in 3D such as the gift wrapping (Jarvis march) and the Graham scan methods based on discrete geometry and integrated into the NucleusJ workflow. Moreover, to get rid of the semi-automated step inherent to the 3D watershed step, NODeJ was developed to automatically segment high-intensity nuclear domains such as chromocenters by applying the gradient method on the mask of a nucleus to enhance the contrast of intra-nuclear objects and allow their segmentation. Finally, to improve the efficiency of our image analysis workflow and move to high-throughput image analysis, a new library called OMERO Service Client was designed in order to directly load NucleusJ on images stored in a well-organized manner within the OMERO platform while benefiting from the computing power of a remote server. These developments were collectively used in a proof-of-concept project to evaluate the relevance of nuclear morphology and chromatin organization traits computed by NucleusJ to predict the viability from human spermatozoa from large field images stored in OMERO. Finally, in a more exploratory phase, a U-Net model was trained using ground truth datasets gained from NucleusJ segmentation in order to explore new innovative methods to be implemented in the future. The developments presented in this manuscript have been designed to optimize the 3D image storage and analysis of nuclei and to move towards higher throughput analyses. Our workflow was designed with the aim to ensure a high standard of repeatability, reproducibility and accessibility. Such developments will open the way to a better description of the 3D nucleus that we hope will benefit the largest number of researcher in the field and advance our knowledge on the role of the nucleus in the regulation of gene expression., Le noyau est un organite essentiel des cellules eucaryotes qui présente une morphologie dynamique et dont le contenu est organisé en domaines. Nous avons développé le plugin ImageJ appelé NucleusJ pour le calcul de paramètres caractérisant la forme et la taille des noyaux ainsi que les objets intra-nucléaires tels que les domaines de chromatine et leur position par rapport à la périphérie nucléaire [Poulet et al., 2015]. Une nouvelle version complètement automatisée appelée NucleusJ2.0 a été publiée [Dubos et al., 2020] comportant de nouvelles fonctionnalités et des alternatives aux étapes manuelles. Une étape dite d’autocrop a été implémentée pour capturer automatiquement un grand nombre de noyaux à différentes profondeurs dans une pile d’images grand champ. Nous avons complété la méthode de segmentation du noyau, un seuillage Otsu modifié, en adaptant des algorithmes de définition de l’enveloppe convexe en 3D tels que le gift wrapping (marche de Jarvis) et la méthode du parcours de Graham avant de les intégrer dans NucleusJ2.0. Afin de s’affranchir d’une étape semi-automatique inhérente à l’étape de ligne de partage des eaux utilisée pour décrire le contenu en chromatine, NODeJ a été développé pour segmenter automatiquement les domaines nucléaires de forte intensité en appliquant la méthode du gradient. De plus, pour améliorer l’efficacité de notre flux d’analyse d’images, une nouvelle bibliothèque appelée Simple OMERO Client a été conçue afin d’utiliser NucleusJ2.0 directement sur des images stockées au sein de la plateforme OMERO tout en bénéficiant de la puissance de calcul d’un serveur distant. Tous ces développements ont été utilisés collectivement dans un projet de preuve de concept où la structure tridimensionnelle du spermatozoı̈de est évaluée comme indicateur de sa qualité. Enfin, dans une phase plus exploratoire, un modèle U-Net a été entraı̂né à l’aide d’images segmentées par NucleusJ2.0 afin d’explorer les nouvelles méthodes innovantes de deep learning. Les développements présentés dans ce manuscrit ont été conçus pour optimiser le stockage et l’analyse d’images 3D de noyaux et pour évoluer vers des analyses à plus haut débit avec le souhait d’assurer un haut niveau de répétabilité, de reproductibilité et d’accessibilité. De tels développements ouvriront la voie à une meilleure description du noyau en 3D et, nous l’espérons, bénéficieront au plus grand nombre de chercheurs dans le domaine de l’imagerie 3D dédiée à la microscopie afin de faire progresser nos connaissances sur le rôle du noyau dans la régulation de l’expression des gènes.

Fluorescent polymeric nanoparticles appear as important tools for real-time imaging of biological processes at the molecular and cellular level. The objective of my PhD project was to optimize fluorescent polymeric nanoparticles for biological imaging. First, by varying the chemistry of the polymers, we have been able to obtain a very good control of their size. This made it possible to highlight the importance of NPs size for intracellular applications with a maximum size of 23 nm for optimal distribution throughout the cytosol. Secondly, we have shown that simple adsorption of a PEGylated amphiphiles pluronic family allows the stabilization of nanoparticles in biological media. The number of incorporated molecules and their stability has been studied by combining FRET and FCS techniques. The best formulations result in nanoparticle stability in vivo, which allowed their imaging as individual particles in the blood vessels of the mouse brain. Third, energy transfer among different fluorophores encapsulated in NPs has been studied and optimized.; Les nanoparticules polymériques fluorescentes apparaissent comme des outils importants pour l'imagerie en temps réel des processus biologiques au niveau moléculaire et cellulaire. L’objectif de mon projet de doctorat a été d’optimiser les nanoparticules polymériques fluorescentes pour l’imagerie biologique. Premièrement, nous avons pu, en faisant varier la chimie des polymères, obtenir un très bon contrôle de leur taille. Ceci a permis de mettre en évidence l’importance de la taille des NPs pour des applications intracellulaires avec une taille maximale de 23 nm pour une distribution dans tout le cytosol. Deuxièmement, nous avons pu montrer que la simple adsorption d’un amphiphile PEGylé de type Pluronic permet la stabilisation des nanoparticules dans des milieux biologiques. Le nombre de molécules incorporées et leur stabilité ont été étudiés en combinant des techniques de FRET et de FCS. Les meilleures formulations résultent en une stabilité des nanoparticules in vivo, ce qui a permis leur imagerie en tant que particules individuelles dans les vaisseaux sanguins du cerveau de souris. Troisièmement, le transfert d’énergie entre différents fluorophores encapsulés dans les NPs a été étudié et optimisé.

Fluorescent polymeric nanoparticles appear as important tools for real-time imaging of biological processes at the molecular and cellular level. The objective of my PhD project was to optimize fluorescent polymeric nanoparticles for biological imaging. First, by varying the chemistry of the polymers, we have been able to obtain a very good control of their size. This made it possible to highlight the importance of NPs size for intracellular applications with a maximum size of 23 nm for optimal distribution throughout the cytosol. Secondly, we have shown that simple adsorption of a PEGylated amphiphiles pluronic family allows the stabilization of nanoparticles in biological media. The number of incorporated molecules and their stability has been studied by combining FRET and FCS techniques. The best formulations result in nanoparticle stability in vivo, which allowed their imaging as individual particles in the blood vessels of the mouse brain. Third, energy transfer among different fluorophores encapsulated in NPs has been studied and optimized., Les nanoparticules polymériques fluorescentes apparaissent comme des outils importants pour l'imagerie en temps réel des processus biologiques au niveau moléculaire et cellulaire. L’objectif de mon projet de doctorat a été d’optimiser les nanoparticules polymériques fluorescentes pour l’imagerie biologique. Premièrement, nous avons pu, en faisant varier la chimie des polymères, obtenir un très bon contrôle de leur taille. Ceci a permis de mettre en évidence l’importance de la taille des NPs pour des applications intracellulaires avec une taille maximale de 23 nm pour une distribution dans tout le cytosol. Deuxièmement, nous avons pu montrer que la simple adsorption d’un amphiphile PEGylé de type Pluronic permet la stabilisation des nanoparticules dans des milieux biologiques. Le nombre de molécules incorporées et leur stabilité ont été étudiés en combinant des techniques de FRET et de FCS. Les meilleures formulations résultent en une stabilité des nanoparticules in vivo, ce qui a permis leur imagerie en tant que particules individuelles dans les vaisseaux sanguins du cerveau de souris. Troisièmement, le transfert d’énergie entre différents fluorophores encapsulés dans les NPs a été étudié et optimisé.

National audience

This thesis focuses on the synthesis and the photophysical characterization of a series of luminescent neutral Pt(II) compounds containing a tridentate dianionic N-donor chromophoric ligand and a monodentate ancillary moiety. The compounds exhibited notable change of the photoluminescence properties upon self-assembly due to the establishment of weak non-covalent intermolecular interactions – metal-metal and π-π. We demonstrated how Pt(II) complexes can be self-assembled in a controlled and precise manner by playing with kinetic and thermodynamic factors and the morphology of the different assemblies investigated. Such approaches led to materials with enhanced and unique properties such as mechanochromism and polarized light absorption and emission. The investigated compounds and their assemblies were useful for the development of novel functional supramolecular materials in and out of the equilibrium as well as for bioimaging application.; Cette thèse porte sur la synthèse et la caractérisation photophysique d'une série de composés neutres luminescents de platine (II) contenant un ligand tridentate dianionique chromophore N-donneur et un ligand auxiliaire monodentate. Les composés montrent un changement notable des propriétés de photoluminescence selon l'auto-assemblage en raison de la formation d'interactions intermoléculaires non covalentes faibles telles que metal-metal et π-π. Nous avons démontré comment les complexes de Pt (II) peuvent être auto-assemblés d'une manière contrôlée et précise en jouant sur les facteurs cinétiques et thermodynamiques, ainsi que la morphologie des différents ensembles étudiés. Ces approches ont conduit à des matériaux avec des propriétés améliorées et uniques tels que le mécano-chromisme, ainsi que l'absorption et l'émission de la lumière polarisée. Les composés étudiés et leurs assemblages sont utiles non seulement pour le développement de nouveaux matériaux fonctionnels supramoléculaires en équilibre et hors- équilibre, mais aussi pour des applications en bio-imagerie.

My PhD work deals with the application of Compressed Sensing (or CompressiveSampling, CS) in fluorescence microscopy as a powerful toolkit for fundamental biologicalresearch. The recent mathematical theory of CS has demonstrated that, for aparticular type of signal, called sparse, it is possible to reduce the sampling frequencyto rates well below that which the sampling theorem classically requires. Its centralresult states it is possible to losslessly reconstruct a signal from highly incompleteand/or inaccurate measurements if the original signal possesses a sparse representation.We developed a unique experimental approach of a CS implementation in fluorescencemicroscopy, where most signals are naturally sparse. Our CS microscopecombines dynamic structured wide-field illumination with fast and sensitive singlepointfluorescence detection. In this scheme, the compression is directly integratedin the measurement process. Additionally, we showed that introducing extra dimensions(2D+color) results in extreme redundancy that is fully exploited by CS to greatlyincrease compression ratios.The second purpose of this thesis is another appealing application of CS forsuper-resolution microscopy using single molecule localization techniques (e.g.PALM/STORM). This new powerful tool has allowed to break the diffraction barrierdown to nanometric resolutions. We explored the possibility of using CS to drasticallyreduce acquisition and processing times., Mes travaux de thèse portent sur l’application de la théorie de l’échantillonnagecompressif (Compressed Sensing ou Compressive Sampling, CS) à la microscopie defluorescence, domaine en constante évolution et outil privilégié de la recherche fondamentaleen biologie. La récente théorie du CS a démontré que pour des signauxparticuliers, dits parcimonieux, il est possible de réduire la fréquence d’échantillonnagede l’information à une valeur bien plus faible que ne le prédit la théorie classiquede l’échantillonnage. La théorie du CS stipule qu’il est possible de reconstruireun signal, sans perte d’information, à partir de mesures aléatoires fortement incomplèteset/ou corrompues de ce signal à la seule condition que celui-ci présente unestructure parcimonieuse.Nous avons développé une approche expérimentale inédite de la théorie du CSà la microscopie de fluorescence, domaine où les signaux sont naturellement parcimonieux.La méthode est basée sur l’association d’une illumination dynamiquestructurée à champs large et d’une détection rapide à point unique. Cette modalitépermet d’inclure l’étape de compression pendant l’acquisition. En outre, nous avonsmontré que l’introduction de dimensions supplémentaires (2D+couleur) augmentela redondance du signal, qui peut être pleinement exploitée par le CS afin d’atteindredes taux de compression très importants.Dans la continuité de ces travaux, nous nous sommes intéressés à une autre applicationdu CS à la microscopie de super résolution, par localisation de moléculesindividuelles (PALM/STORM). Ces nouvelles techniques de microscopie de fluorescenceont permis de s’affranchir de la limite de diffraction pour atteindre des résolutionsnanométriques. Nous avons exploré la possibilité d’exploiter le CS pour réduiredrastiquement les temps d’acquisition et de traitement.Mots clefs : échantillonnage compressif, microscopie de fluorescence, parcimonie,microscopie de super résolution, redondance, traitement du signal, localisation demolécules uniques, bio-imagerie

In the past few years, the mathematical theory of compressed sensing (CS) has emerged as a new tool in the image processing field, leading to some progress in surpassing the limits stated by the Nyquist sampling theory. In particular, the CS theory establishes that a signal (image, video, etc.) can be reconstructed from a relatively small subset of non-adaptive linear random measurements, assuming that it presents a sparse structure. As this hypothesis actually holds for a large number of natural images, several imaging applications have already benefited from this theory in various aspects. The goal of the present PhD work is to investigate how the CS theory - and more generally the ideas and methods developed in relation with sparse signal reconstruction problematics - can be used to design efficient optical sensing devices with high spatial and temporal resolution for biological imaging applications. We first investigate some practical issues related to the post-processing stage required by CS acquisition schemes, and to the selection of sampling parameters. We then examine how CS can benefit to video sampling applications. Finally, with the application of CS methods for denoising tasks in mind, we focus on the error estimation issue in image denoising problems for low-light microscopy applications.; Ces dernières années, la théorie mathématique de l'échantillonnage compressé (CS) a émergé en tant que nouvel outil en traitement d'images, permettant notamment de dépasser certaines limites établies par la théorie de l'échantillonnage de Nyquist. En particulier, la théorie du CS établit qu'un signal (une image, une séquence vidéo, etc.) peut être reconstruit à partir d'un faible nombre de mesures linéaires non-adaptatives et aléatoires, pourvu qu'il présente une structure parcimonieuse. Dans la mesure où cette hypothèse se vérifie pour une large classe d'images naturelles, plusieurs applications d'imagerie ont d'ores-et-déjà bénéficié à des titres divers des résultats issus de cette théorie. Le but du travail doctoral présent est d'étudier comment la théorie du CS - et plus généralement les idées et méthodes en relation avec les problèmes de reconstruction de signaux parcimonieux - peuvent être utilisés pour concevoir des dispositifs d'acquisition optiques à haute-résolution spatiale et temporelle pour des applications en imagerie biologique. Nous étudions tout d'abord quelques questions pratiques liées à l'étape de reconstruction nécessairement associée aux systèmes d'acquisition exploitant le CS, ainsi qu'à la sélection des paramètres d'échantillonnage. Nous examinons ensuite comment le CS peut être utilisé dans le cadre d'applications d'échantillonnage de signaux vidéo. Enfin, avec dans l'idée l'utilisation dans des problèmes de débruitage de méthodes inspirées du CS, nous abordons la question de l'estimation d'erreur dans les problèmes de débruitage d'images acquises en conditions de faible luminosité, notamment dans le cadre d'applications de microscopie.