Search

Trabajo presentado al: 6th International Meeting on Apicomplexan Parasites in Farm Animals. P-33. Berna (Suiza), 5-7 de octubre., This work was supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (PID2019- 104713RB-C22).

Trabajo presentado al: 6th International Meeting on Apicomplexan Parasites in Farm Animals. O-30. Berna (Suiza), 5-7 de octubre.

Trabajo presentado al: IV Congreso VetDoc. (León, 6-7 de Julio de 2017). Publicado en: Revista de Docencia Veterinaria, volumen 2(2): 151-152. ISSN: 2445-1754

El principal objetivo de este trabajo es conocer el inicio y el desarrollo de la docencia de Histología y Anatomía Patológica desde la incorporación de estas disciplinas al plan de estudios de la Escuela Especial de Veterinaria de León en 1912 hasta la transformación de la Escuela Superior de Veterinaria de León en Facultad en 1943. Se relacionan también los profesores y alumnos agregados a la Cátedra de Histología y Anatomía Patológica, así como los textos utilizados, cursos impartidos y emisión de informes anatomopatológicos.

Trabajo presentado a la XXVIII Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica (SEAPV). Córdoba, España, 8-10 junio, 2016.

Trabajo presentado a la XXVIII Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica (SEAPV). Córdoba, España, 8-10 junio, 2016., Entre 2006 y 2015, en el Servicio de Diagnóstico Anatomopatológico de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de León se estudió un total de 1516 ovejas y cabras mayores de un año de edad, que fueron remitidas por diferentes causas. El objetivo de este trabajo es dar a conocer cuáles son las principales lesiones macroscópicas encontradas en el aparato genital femenino en los animales necropsiados, que en un buen número de los casos no fueron el motivo principal que ocasionaba la remisión para su estudio. Los procesos inflamatorios fueron el hallazgo más frecuente: en 37 casos se diagnosticó una metritis, cuyo aspecto macroscópico variaba desde formas agudas, necróticas, hasta formas más purulentas; en cuatro casos se diagnosticó una vaginitis y en una oveja una salpingitis purulenta. En 26 animales se encontraron evidencias de un parto distócico, con presencia del feto en posiciones anómalas y una metritis gangrenosa asociada en 8 casos. Además, en 14 ovejas de este grupo se había llegado a producir la rotura del útero, con una peritonitis asociada, y en una oveja la fractura de los huesos de la región pélvica. En 19 casos se encontró una hidrómetra o mucómetra, con dilatación marcada de los cuernos uterinos y la presencia de abundante contenido aséptico seromucoso. En la mayor parte de estos casos el proceso se asociaba a la existencia de cuerpos lúteos persistentes en el ovario. En 16 casos se detectó la presencia de fetos muertos o incluso momificados en el útero, de los que en tres casos únicamente se observaron restos óseos. Se pudo observar retención placentaria en 9 animales, de parto reciente. En un total de 7 casos, la causa de muerte fue una torsión uterina. Dentro de las malformaciones, la existencia de quistes paraováricos fue el hallazgo más común, en 7 casos, mientras que en tres ovejas se diagnosticó una aplasia unilateral de los cuernos uterinos. Solamente se encontró un proceso neoplásico en un ovario, diagnosticado como un tumor de células de la granulosa. Finalmente, y aunque no relacionado directamente con lesiones en el aparato genital, en 132 animales que mostraban fetos a final de gestación en el útero, se realizó un diagnóstico de toxemia de gestación. Si bien las lesiones macroscópicas del aparato genital no muestran una elevada frecuencia, si constituyen un grupo de alteraciones a tener en cuenta en la patología de los pequeños rumiantes.

Trabajo presentado a la XXVIII Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica (SEAPV). Córdoba, España, 8-10 junio, 2016., El 22 de noviembre de 2015, en una granja (Granja 1) de pollos broiler de 13 semanas de edad, distribuidos en 2 naves de unos 2000 pollos/nave, se observaron signos de diarrea, con empeoramiento progresivo de los animales en días sucesivos. Los pollos con diarrea blanquecina aumentaron el consumo de agua (3 ó 4 veces más del consumo habitual) y se redujo el consumo de pienso. Los animales mostraron signos de decaimiento y postración. El 26 de noviembre se registraron 500 bajas. En otra granja (Granja 2) de 1500 pollos de la misma edad, el cuadro clínico fue similar pero con un menor número de bajas. En los días posteriores, a pesar de tratamiento instaurado, se registraron 1403 bajas en la Granja 1 y 15 bajas en la Granja 2. El día 21 de noviembre en la fábrica de pienso se produjo un fallo en la rasera de la tolva de dosificación de bicarbonato sódico. La primera partida de pienso, tras el incidente, fue destinada a la Granja 1 y la segunda partida a la Granja 2. En la necropsia realizada a 3 animales se observaron restos de deposiciones blandas en la región pericloacal, nefromegalia, color aclarado en ambos riñones y depósitos blanquecinos de aspecto cretáceo en sacos aéreos, pericardio y cápsula hepática. Histológicamente en los riñones destacó una grave necrosis tubular con presencia de abundantes depósitos amorfos eosinofílicos en luces tubulares, así como granulomas en tejido intersticial en torno a cristales aciculares de disposición radial delimitados por células gigantes, heterófilos y linfocitos. El bicarbonato sódico al 0,05% se emplea como aditivo en avicultura debido a sus efectos sobre el balance electrolítico y digestibilidad proteica, entre otros. En casos de intoxicación provoca graves lesiones renales y favorece la precipitación de uratos en los tejidos.

Trabajo presentado a la XXVIII Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica (SEAPV). Córdoba, España, 8-10 junio, 2016., El 27 de agosto de 2015 entraron 16320 pollitos broiler (machos y hembras) en una nave (Nave A) y 16116 en otra (Nave B). Las bajas durante la primera y segunda semana de vida fueron 364 en la nave A y 354 en la B. A partir del día 14 de vida (tercera semana) se incrementaron considerablemente las bajas (672 y 539) y en la cuarta y quinta semana se contabilizaron 628 y 438. A los 18 días de vida muchos de estos pollitos presentaban pododermatitis y edema en las alas, por lo que se decide remitir 6 animales para la necropsia. Macroscópicamente se observan hematomas en cuello y alas (dos animales) así como palidez de cresta y edema, erosiones y úlceras en almohadillas plantares en todos los animales. A la apertura se comprobó marcada atrofia de los lóbulillos tímicos y la médula ósea mostraba una coloración blanquecina. Microscópicamente todos los animales presentaron: depleción linfoide y pérdida de estructura normal del timo, depleción marcada de células hematopoyéticas en médula ósea, depleción linfoide e hialinosis extracelular en bazo y depleción linfoide en bolsa de Fabricio. En las almohadillas plantares se confirmó una dermatitis fibrinosa aguda con presencia de abundantes colonias bacterianas. Las lesiones observadas eran compatibles con anemia infecciosa aviar, causada por un circovirus, “chicken anemia virus” (CAV), diagnóstico que se confirmó mediante la detección de antígeno vírico en células del timo mediante tres anticuerpos policlonales (anti-VP1, VP2 y VP3), todos derivados de péptidos del CAV: VP1, VP2 y VP3. Los pollitos jóvenes (1-3 semanas) son los más susceptibles al efecto citotóxico del virus sobre células precursoras hematopoyéticas. Este efecto inmunosupresor favorece el desarrollo de infecciones secundarias.

Toxoplasmosis is a major opportunistic disease of immunocompromised patients. lt also represents a serious threat during pregnancy, causing severe foetal abnormalities or potentially leads to problems in childhood or later adult life.

La vacunación es el procedimiento más eficaz para el control de la paratuberculosis El objetivo de este estudio es valorar la eficacia de la vacunación tras su administración antes y después de la infección, en un modelo experimental en cabras. Se empleó un total de 35 cabritos de 1-2 meses de edad, ocho de los cuales fueron vacunados y posteriormente infectados con la cepa K-10 de Mycobacterium avium subsp paratuberculosis (Map). Parte de los animales se sacrificaron a los 150 días post-infección (dpi) para comprobar el establecimiento de la infección, y posteriormente 5 cabritos previamente infectados se vacunaron a los 180 dpi. A los 360 dpi se sacrificaron todos los animales, en los que se realizaron estudios histopatológicos, de valoración de la respuesta inmune periférica y aislamiento de Map de heces y tejidos. La vacuna indujo la producción de niveles elevados de IFN-γ, pero menores en los animales vacunados tras la infección (IV). Se observó una reducción en el número y gravedad de las lesiones en el grupo de cabras vacunadas antes de la infección (VI), que fue progresiva a lo largo del estudio. Sin embargo, los animales vacunados tras la infección (IV) mostraron una variabilidad individual marcada, apareciendo cabras sin lesiones, con formas focales e incluso una con lesión difusa, siendo en conjunto la intensidad lesional superior a la del grupo infectado. Solo se aisló Map de dos animales, uno del grupo IV y otro infectado. La vacunación frente a paratuberculosis tendría un efecto claramente protector en cabras si se aplica previamente a la infección, mientras que si se hace después, su efecto terapéutico no tendría lugar en todos los animales, existiendo diferencias individuales en la respuesta.

La toxoplasmosis ovina, causada por el protozoo Toxoplasma gondii, está asociada a la aparición de abortos o al nacimiento de corderos débiles, generando importantes pérdidas económicas en el sector ovino. A pesar de que se sabe que el momento de gestación en que ocurre la infección determinará las consecuencias de la misma, aún se desconocen cuáles son los mecanismos causantes de estas diferencias.

218 p. [ES] La Equinococosis quística (CE) o Hidatidosis es una zoonosis cosmopolita crónica causada por el metacéstodo de un complejo de especies crípticas pertenecientes a Echinococcus granulosus s.l., siendo Echinococcus granulosus s.s. la especie causante de la mayor parte de los casos de CE humana y se encuentra distribuida en todo el mundo. Esta cestodiasis es un importante problema de salud pública y económico para las poblaciones afectadas, principalmente en zonas rurales y ganaderas. En Sudamérica, Chile es uno de los países en donde la Equinococosis quística es endémica, a pesar de esto y a los programas de intervención para controlar esta parasitosis en regiones y provincias rurales en donde se practica la ganadería caprina y ovina, esta parasitosis sigue presente, siendo las regiones de Aysén, Magallanes, La Araucanía y Coquimbo, las que poseen los índices de prevalencia más altos. En este estudio se determinó la prevalencia de la equinococosis quística y sus posibles factores de riesgo en cuatro comunas de la provincia de Limarí, región de Coquimbo, entre los años 2016-2017 y se evaluó la diversidad genética de E. granulosus s.s. en tres regiones endémicas, Coquimbo, La Araucanía y Magallanes, mediante la secuencia de la subunidad 1 del gen mitocondrial de la de la citocromo oxidasa (cox1). Un total de 1221 personas entre 5 - 88 años fueron examinados con el método de ELISA. Los factores de riesgo fueron evaluados por medio de un cuestionario en 908 personas mayores de 18 años. Se utilizó el método de regresión logística para determinar la probabilidad de asociación entre la presencia de la infección equinococócica y los factores de riesgo; y la escolaridad y los factores de riesgo. La diversidad genética y la estructura poblacional de metacéstodos de E. granulosus s.s. fue evaluada en tres regiones endémicas de Chile, mediante la secuencia de la sub unidad 1 del gen mitocondrial de la citocromo oxidasa (cox1). Se secuenciaron 46 quistes, 6 de la región de Coquimbo, 18 de la Araucanía y 22 de Magallanes, aislados de distintos hospederos intermediarios, bovinos, caprinos, ovinos y seres humanos. De este modo se observó que la prevalencia general de CE en la población analizada fue de 7,9% (97/1221), 6,71% (21/313) de menores de 18 años y el 8,4% (76/908) de los adultos, no se observaron diferencias significativas entre los grupos etarios analizados. La comuna de Punitaqui presenta la mayor frecuencia relativa 13.33% (12/90) de CE. En el análisis de los factores de riesgo para la CE, el tener agua potable en las casas y el haber tenido equinococosis quística en alguna etapa de su vida se asociaron con la mayor probabilidad de presentar equinococosis quística. Los resultados de este estudio muestran una alta endemicidad de Equinococosis quística en la provincia de Limarí. Así también, todos los quistes hidatídicos analizados fueron identificados como E. granulosus s.s.. Predominó la cepa EG01, detectando 4 haplotipos, EG01, EG1A, EG1D, EgCLOM16, con una baja diversidad de haplotipos (Hd=0,461±0,00637) y una baja diversidad de nucleótidos (0,00181±0,00036). La red de parsimonia de cox1 en la población chilena mostró forma de estrella, en donde el haplotipo EG01 se encontró en el centro. Los índices de neutralidad Tajima`s D y F de Fu`s fueron negativos para las poblaciones de Coquimbo (D= -0,93302; Fs= -0,003) y Magallanes (D= -0,17406; Fs= -0,121), lo que indica un exceso de sitios polimórficos raros, expansión poblacional y una desviación significativa de la neutralidad. Los índices D de Tajima y Fs de Fu fueron positivos para la población de La Araucanía (D= 0,8695; Fs= 1,039), mostrando niveles bajos de alelos raros o falta de alelos raros. El índice de fijación de Fisher por pares (Fst), muestran valores negativos en las poblaciones Coquimbo- La Araucanía (-0,08761). El valor de Fst más alto y significativo fue entre las poblaciones de La Araucanía- Magallanes (0,10703), indicando diferencias entre estas poblaciones. Nuestros resultados muestran que la estructura genética poblacional de E. granulosus s.s es compleja, debido a la presencia de diferentes haplotipos en las diferentes regiones a lo largo de Chile, la cual posiblemente se complejice aún más si se utilizan secuencias más largas, que permitan estudiar la microdiversidad de E. granulosus s.s. en los diferentes hospederos. De esta forma, se sugiere que para diseñar futuros programas de control de la Equinococosis quística (CE), se deben tener en cuenta la variabilidad de la cepa en cada una de las regiones endémicas. [EN] Toxoplasmosis is a protozoan infectious disease caused by the parasite Toxoplasma gondii. It is an important disease in both in Europe and globally due to its zoonotic potential and the reproductive failure it triggers in livestock, mainly in sheep, which results in heavy economic losses. Despite the fact that there are multiple methods for controlling this disease, such as management, vaccination or treatment; toxoplasmosis is still a very relevant animal health and public problem. There are still many unknown mechanisms of the pathogenesis of ovine toxoplasmosis, mainly regarding the occurrence of abortions. On the other hand, there are evidences that the variability of T. gondii isolates could influence the pathogenesis of the disease in murine models and humans’ observational studies. However, little is known regarding the influence of this variation in sheep. Bearing in mind that extrapolation of results between species is not always possible, it is necessary to study how the genotypic and phenotypic variability of T. gondii isolates could influence the development of the disease in pregnant sheep. For this, it is essential to use an experimental model of pregnant sheep, as the placenta and fetus are the main targets of the parasite. In order to clearly identified lesions caused by the disease, a detailed analysis of the morphological and physiological findings in both placenta and fetuses is also necessary. Thus, the aim of this PhD Thesis is to analyze the influence of T. gondii isolates variability on parasite/host interaction in ovine toxoplasmosis and the consequences it may have on pregnant sheep. For this purpose, four studies have been conducted, focused in four specific objectives and based on two different experiments (Experiment 1 and 2). An in vitro assay with ovine macrophages derived from peripheral blood monocytes (OvMØs) was developed for the evaluation of the influence of isolates variability on these cells (Experiment 1). Then an in vivo experimental model with pregnant sheep was carried out, where the animals were orally infected with low doses of three genetic and phenotypically different T. gondii isolates (Experiment 2). Chapter I is based on Experiment 1 with the specific aim of developing an in vitro model of OvMØs and study the influence that genetic variability of different T. gondii isolates may have on their response (objective 1). In this study, OvMØs were infected with six T. gondii isolates, obtained from Spanish sheep. Afterwards, the subsequent cell infections rates and transcript expression of cytokines and iNOS were evaluated. TgShSp24 isolate (Type III, ToxoDB#2) had a higher internalization/infection rate, followed by TgShSp2 (Type II, ToxoDB#1); compared with the rest of type II isolates: TgShSp1, TgShSp3, TgShSp11 and TgShSp16 (Type II, ToxoDB#3). Moreover, these two isolates (i.e. TgShSp24 and TgShSp2) also exhibited increments in cytokines that favored inflammation by a M1 macrophages polarization. TgShSp1 and TgShSp3 (Type II, ToxoDB#3 isolated from abortions) exhibited highest levels of anti-inflammatory cytokines. Isolates coming from abortions (fetal brains) triggered a higher iNOS expression. These results show intra- and inter-genotypic differences in the parasite/macrophage relationship, proving that more genotypic and phenotypic traits must be evaluated for the study of the virulence of T. gondii isolates. Besides, macrophages polarization could be affected depending on the infecting isolate. Chapter II, III and IV are based in the results from Experiment 2, where seventy-three pregnant sheep were divided in four groups an orally inoculated at day 90 of gestation according to the following distribution: G1 infected with TgShSp1 isolate (type II, ToxoDB#3), G2 with TgShSp16 isolate (type II, ToxoDB#3), G3 with TgShSp24 isolate (type III, ToxoDB#2) and G4 of uninfected control sheep. Once inoculated clinical sings were evaluated and early and late abortions were noted. Five animals per group were culled at 14 and 28 dpi. The remaining sheep were left until delivery occurred (i.e. lambs or stillbirths). Specifically, Chapter II is based on the description of the main macroscopic and microscopic findings in healthy non-infected ovine placentas and fetal viscera from the control group, together with the evaluation of the main cell populations found in the placentomes (objective 2). In order to achieve this, control placentas and fetuses were examined macroscopically and microscopically by H-E. Besides, immunohistochemical evaluation of macrophages (Iba1, calprotectin), B (CD20) and T cells (CD3), Natural killer (NK) cells and caspase-3 was carried out on the placentomes. Macroscopically, the placentas showed placentomes with variations in terms of shape and size. The presence of amniotic plaques and allantoic calculi was fairly common too. Regarding histological evaluation, all placentomes showed hyalinization of caruncular septa and intracytoplasmic pigments in the trophoblasts at the hematomata arcade. Moreover, almost half of the placentomes evaluated showed hemorrhages, foci of cellular debris, protein extravasation and mineralization. Moderate levels of T cells and Iba1 positive macrophages, and scarce B cells were present in the interdigitating zone of the placentome. The most striking finding was the absence of NK cells in the placentome. Cellular debris and areas of hyalinization were not immunolabelled for caspase-3. In fetal organs the most common findings were hematopoiesis, lymphocyte infiltrates and vacuolation of the epithelial cells of the eye, esophagus, intestine and kidney. It is relevant to establish that all these macroscopic and histological findings are found under normal conditions, as they might lead to misinterpretations when analyzing samples from an experimental model of pregnant sheep. Chapter III is aimed to study the influence of the genetic and phenotypic variability of previously mentioned three T. gondii isolates on the development of toxoplasmosis in pregnant sheep at mid gestation (objective 3), and it is based on the examination of all the animals from Experiment 2. The isolates used in this experiment had shown intra- and inter-genotypic variations in previous in vitro and in vivo experimental studies. In this study, the clinical outcome of the infection up to the end of gestation was investigated, together with the occurrence of histological lesions, the parasite distribution and burden at 14 and 28 dpi. Reproductive failure including early or late abortions and stillbirths was similar for all the groups. However, the onset of fever and seroconversion occurred later for sheep infected with TgShSp1 Isolate compared with those infected with TgShSp16 isolate and TgShSp24 isolate. Regarding serial culling, T. gondii-DNA was only detected in few placentomes from TgShSp1 infected sheep at 14 dpi, while at 28 dpi, the parasite was detected in all the groups in at least one animal. However, at 28 dpi, parasite detection and burdens were higher for the TgShSp1 infected group, followed by the infected with TgShSp24. Histological lesions in placentomes and fetal lesions from euthanized animals were only detected at 28 dpi and were more frequent at the TgShSp1 infected group. Infection with TgShSp16 isolate was associated with the lower values of all of these phenotypic traits. Regardless the isolate inoculated into the sheep, vascular lesions (i.e. vasculitis and thrombi) previously unacknowledged in placentomes at 28 dpi were found. These findings suggest that the variability in the infecting isolates could influence the pathogenesis of the disease. However, the outcome of the disease (i.e. reproductive failure) is similar in all the groups, despite the isolate used for infection. Chapter IV is focused on the characterization of the histological lesions and the changes affecting the resident cell populations in the CNS of fetuses in ovine toxoplasmosis (objective 4). For this study, fetal brains from selected animals of Experiment 2 were used. Those fetal brains showing histological lesions consistent with T. gondii infection were characterized by digital analysis in H-E stained sections. Furthermore, the same region of the brain of five fetuses from each group was immunohistochemically labeled for the detection of neurons (NeuN), astrocytes (GFAP), macrophages and microglial cells (Iba1) and recently recruited macrophages (calprotectin). Together with the detection of apoptosis (caspase-3) and axonal damage (APP). Lesions caused by the TgShSp1 isolate in the brain were larger and more numerous and were associated to a larger percentage of damage area in the CNS. These lesions were mainly characterized by glial foci, with or without necrosis that together with the perivascular cuffs, were mainly formed by microglial cells. Moreover, histological lesions were also associated with a higher number of astrocytes, microglial cells and caspase-3 mediated apoptosis in the midbrain. These findings were accompanied by a reduction in the number of neurons. These results demonstrate that the variability of T. gondii isolates could influence the severity of the histological lesions in fetal brains. Besides, it seems that there is relation between the severity of histological lesions and the occurrence of microgliosis, astrocytosis, caspase-3 apoptosis and reduction in the number of neurons. Taken all together, the results of this PhD Thesis demonstrate that the inter- and intra-genotype variability inherent to recently obtained T. gondii isolates could influence the host/parasite relationship in ovine toxoplasmosis, and also that findings from experimental models in given species might not be directly extrapolated to others. An experimental model based on OvMØs has demonstrated to be adequate for the investigation of isolate virulence. Besides, macrophages polarization is influenced by the isolate of T. gondii. Furthermore, this PhD Thesis provides an advance in the understanding of ovine toxoplasmosis specially regarding abortions, as previously unknown vascular changes were observed early after infection (i.e. 28dpi) and, regarding fetal nervous lesions, as the previous information on brain lesions and resident cell population changes was scarce.

Tesis Doctoral de la Universidad de León.--Defendida el 4 de febrero del 2022., [EN] Paratuberculosis is a chronic disease of ruminants caused by the intracellular bacteria Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map). Currently, vaccination has been considered the most cost-effective control method that achieves a reduction on the onset of new clinical cases and the fecal shedding of bacilli. However, its protective effect is incomplete and how it influences the pathogenesis of the disease and the immune response of the host is still not fully understood. Furthermore, vaccination against paratuberculosis has been associated with a nonspecific protective effect against other infections, related or not to mycobacteria, a phenomenon that could be caused by the establishment of what is known as a trained immune response. This response is mediated by cells of the innate immune response, such as macrophages, the target cells cells of Map, or neutrophils. Bearing in mind the reduced number of works aimed at studying the characteristics of the protective response induced by paratuberculosis vaccination, the general objective of this Doctoral Thesis is to investigate its influence on the immune response of the host, attempting to clarify those factors related to protection. Subsequently, in order to carry out in vitro studies on the effect of vaccination on the activity of neutrophils and macrophages, the first study of this Thesis was aimed to the establishment of a standardized and effective protocol for the simultaneous isolation of mononuclear cells from peripheral blood (PBMCs) and neutrophils, as well as the purification of monocytes and the obtaining of monocyte-derived macrophages (MDMs) from peripheral blood of sheep and goats. For that purpose, different isolation or purification methods were compared, as well as culture conditions for the maturation of monocytes. The estimation of the yield of each protocol, the purity and the phenotypic characteristics of the cell populations obtained were determined by cell counting in a Neubauer chamber, microscopy and flow cytometry. The mixture of the buffy coat and red cell layers during the Lymphoprep™ separation allowed the isolation of a large number of PBMCs and neutrophils with a high purity from the same blood sample. Besides, it was observed that the immunomagnetic columns provide a high monocyte yield (number of monocytes/initial number of PBMCs) with high purity, also determined by the percentage of CD14+, MHC-II+ and CD11b+ cells. These values were higher than those found in adherence-purified monocytes, due to the presence of a greater number of contaminating lymphocytes using the latter, which, however, did not interfere in the maturation of monocytes to macrophages, since the final number of MDMs was higher in monocytes isolated by adherence. Subsequently, the supplementation of monocyte cultures with increasing concentrations of GM-CSF, proportionally increased the number of MDMs compared to the incubation with autologous serum. Therefore, following the protocol established in this study, it is possible to perform the simultaneous isolation of PBMCs and neutrophils with high efficiency and purity. Likewise, these PBMCs are suitable for the purification of monocytes and the obtaining of MDMs with any of the purification techniques analyzed, according to the needs of the experiment, and following the established maturation conditions. In this case, the adherence technique was chosen for the purification of monocytes as it was the one that provided a greater number of MDMs., The second study of the Thesis was focused on the assessment of the effect of the inactivated Silirum® vaccine on the immune response generated in macrophages one month after vaccination. CaMØs (goat MDMs) from goats vaccinated and non-vaccinated with Silirum® and infected in vitro with Map were used, whereupon the viability of Map and its quantification by bacteriological culture and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) were determined, respectively. In addition, the expression levels of different pro and anti-inflammatory cytokines and iNOS were also analyzed by reverse transcription (RT-qPCR), and the number of infected CaMØs, as well as the degree of infection, were estimated by immunofluorescence. These assays reflected a significant reduction in the viability of Map in the supernatants and CaMØs from vaccinated goats, which was accompanied by the presence of a higher percentage of infection and a higher number of internalized bacteria in the CaMØs of this same group in comparison with the non-vaccinated ones. In addition, CaMØs from vaccinated animals showed higher expression of iNOS (pro-inflammatory action) and IL-10 (anti-inflammatory), while only MIP-β (pro-inflammatory) expression was increased in non-vaccinated animals. These results suggest that vaccination against paratuberculosis modifies the response of CaMØs, so they increase their phagocytic and antimicrobial capacity against Map, which is associated with a greater production of cytokines with both pro and anti-inflammatory action., The purpose of the third study of the Thesis was to assess the effect of the administration of Silirum® on the generation of extracellular neutrophil traps (NETs) in response to in vitro infection with Map and other non-mycobacterial pathogens. For this reason, blood neutrophils from vaccinated and non-vaccinated sheep were isolated and infected in vitro with Map, Staphylococcus aureus and Escherichia coli. The formation of NETs was analyzed by visualization of DNA, myeloperoxidase and elastase by immunofluorescence microscopy and a quantification of extracellular DNA (PicoGreen™) was carried out by fluorimetry. These assays demonstrated that Map infection is able to stimulate the release of NETs, although to a lesser extent than S. aureus and E. coli. However, no differences were detected between vaccinated and non-vaccinated sheep, regardless of infection and post-vaccination days. These results suggest that the release of NETs would not play an important role in the protective immune response after vaccination against paratuberculosis, at least during the first month after vaccination., However, it is possible that other antimicrobial mechanisms developed by these cells and not analyzed in this study may be involved in this response. The objective of the fourth and last study was the evaluation of the effect of homologous (against paratuberculosis) or heterologous (against tuberculosis) vaccination on the immune response and protection in goat kids experimentally infected with Map, discerning the effect of each of the components of these vaccines. For this purpose, one-month-old kids were divided into several groups according to vaccination (Silirum®, HIMB-inactivated vaccine against Mbv or non-vaccinated), immunization (inactivated bacteria or adjuvants) and/or infection. At 45 days post-vaccination, animals were orally infected with Map and, subsequently, sacrificed at 190 days post-vaccination. Monthly, blood samples were collected for determination of peripheral immune response and the proportion of lymphocyte subpopulations by IFN-γ release test (IGRA), antibody detection (ELISA), and flow cytometry, respectively. In addition, after sacrifice, fecal samples (bacteriological culture) and intestinal tissue and associated lymph nodes were collected for the assessment of the local production of IFN-γ (IGRA), the detection of Map (qPCR and bacteriological culture), the study of lymphocyte subpopulations (flow cytometry) and histological examination. Granulomatous lesions were detected in all the infected groups, regardless of vaccination or immunization. However, in those vaccinated with Silirum® (against Map) or HIMB (against Mbv), a considerable reduction in the number and severity of these lesions was recorded, which was accompanied by a heightened cellular and peripheral humoral responses. There was also a decrease in the number of granulomas in the animals immunized with the vaccine strains and adjuvants compared to the non-vaccinated and infected group. It should be noted that this reduction was even greater in goats in which only the adyuvant was administered, compared to those that were immunized with vaccine strains. Besides, no differences were observed in the peripheral or local proportion of the different subpopulations of lymphocytes, nor in the local immune response, between the established groups. In the light of these results, both vaccination against paratuberculosis and tuberculosis induced homologous and heterologous protection, respectively, against Map infection. Furthermore, the animals immunized with the adjuvants experienced a reduction in the number of lesions, not associated with the presence of a specific immune response against Map, which could be mediated by a nonspecific immunity mechanism that needs to be elucidated., [ES] La paratuberculosis es una enfermedad crónica de los rumiantes causada por la bacteria intracelular Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (Map). Hasta el momento, la vacunación ha sido considerada el método de control con una mejor relación coste-beneficio, al reducir la aparición de nuevos casos clínicos y la excreción fecal de bacilos. No obstante, su efecto protector es incompleto y aún no se conoce en profundidad cómo influye sobre la patogenia de la enfermedad y la respuesta inmunitaria del hospedador. Además, la vacunación frente a paratuberculosis se ha asociado con un efecto protector inespecífico frente a otras infecciones, relacionadas o no con micobacterias, un fenómeno que podría ser causado por el establecimiento de lo que se conoce como respuesta inmunitaria entrenada. Esta respuesta esta mediada por células de la respuesta inmunitaria innata, como los macrófagos, células dianas de Map, o los neutrófilos. Teniendo en cuenta el número limitado de trabajos destinados a estudiar las características de la respuesta protectora tras la vacunación, el objetivo general de esta Tesis Doctoral consiste en investigar su influencia en la respuesta inmunitaria del hospedador, tratando de esclarecer aquellos factores relacionados con la protección. Para poder realizar posteriormente estudios in vitro sobre el efecto de la vacunación en la actividad de neutrófilos y macrófagos, el primer estudio de esta Tesis consistió en establecer un protocolo estandarizado y efectivo para el aislamiento simultáneo de células mononucleares a partir de sangre periférica (PBMCs) y neutrófilos, así como la purificación de monocitos y la obtención de macrófagos derivados de monocitos (MDMs), a partir de sangre periférica de ovejas y de cabras. Para ello, se compararon distintas técnicas de aislamiento o purificación, así como diversas condiciones de cultivo para la maduración de monocitos. La estimación del rendimiento de cada protocolo, la pureza y las características fenotípicas de las poblaciones celulares obtenidas se determinaron mediante recuento celular en cámara de Neubauer, microscopía y citometría de flujo. La mezcla de las capas de leucocitos y de células rojas durante la separación con Lymphoprep™ permitió aislar un gran número de PBMCs y neutrófilos con una elevada pureza a partir de la misma muestra de sangre. Por otro lado, se observó que las columnas inmunomagnéticas proporcionan un buen rendimiento (nº monocitos/nº inicial de PBMCs) en la obtención de monocitos con una elevada pureza, determinado también mediante el porcentaje de células CD14+, CMH-II+ y CD11b+. Estos valores fueron superiores a los encontrados en los monocitos purificados mediante adherencia, debido a la presencia de un mayor número de linfocitos contaminantes empleando esta última técnica que, sin embargo, no interfirió en la maduración de monocitos a macrófagos, ya que el número final de MDMs fue superior en los monocitos aislados mediante adherencia. Posteriormente, la suplementación de los cultivos de monocitos con concentraciones crecientes de GM-CSF incrementó de manera proporcional el número de MDMs en comparación con el suero autólogo. Por lo tanto, siguiendo el protocolo establecido en este estudio es posible realizar el aislamiento simultáneo de PBMCs y neutrófilos con una elevada eficiencia y pureza. Así mismo, estos PBMCs son aptos para la purificación de monocitos y la obtención de MDMs con cualquiera de las técnicas analizadas, según las necesidades del experimento y siguiendo las condiciones de maduración establecidas. En este caso, se eligió la técnica de adherencia para la purificación de monocitos por ser la que proporcionó un mayor número de MDMs., El segundo estudio de la Tesis se centró en estudiar el efecto de la vacuna inactivada Silirum® sobre la respuesta inmunitaria generada en los macrófagos un mes después de la vacunación. Se emplearon CaMØs (MDMs caprinos) procedentes de cabras vacunadas con Silirum® y sin vacunar, e infectadas in vitro con Map, tras lo cual se determinó la viabilidad de Map y su cuantificación mediante cultivo bacteriológico y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), respectivamente. Además, también se analizaron los niveles de expresión de distintas citoquinas pro y antiinflamatorias e iNOS mediante PCR con transcripción inversa (RT-qPCR) y se estimó el número de CaMØs infectados, así como el grado de infección, mediante inmunofluorescencia. Estas pruebas reflejaron una reducción significativa de la viabilidad de Map en los sobrenadantes y los CaMØs procedentes de las cabras vacunadas, que se acompañaba de un mayor porcentaje de infección y un mayor número de bacterias internalizadas en los CaMØs de este mismo grupo en comparación con los no vacunados. Además, los CaMØs procedentes de animales vacunados mostraban una mayor expresión de iNOS (acción proinflamatoria) e IL-10 (antiinflamatoria), mientras que solo la expresión MIP-β (proinflamatoria) se encontraba elevada en los animales no vacunados. Estos resultados sugieren que la vacunación frente a paratuberculosis modifica la respuesta de los CaMØs, de forma que aumentan su capacidad fagocítica y antimicrobiana frente a Map, lo que aparece asociado a una mayor producción de citoquinas con acción tanto pro como antiinflamatoria., El tercer estudio de la Tesis tuvo como fin valorar el efecto de la administración de Silirum® sobre la generación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) en respuesta a la infección in vitro con Map y otros patógenos no relacionados con micobacterias. Para ello, se utilizaron ovejas vacunadas y sin vacunar, a partir de las cuales se aislaron neutrófilos sanguíneos que fueron infectados in vitro con Map, Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Se analizó la formación de NETs por medio de la visualización mediante inmunofluorescencia del ADN, la mieloperoxidasa y la elastasa, y se llevó a cabo una cuantificación del ADN extracelular (PicoGreen™) mediante fluorimetría. Estas pruebas demostraron que la infección con Map es capaz de estimular la liberación de NETs, aunque en menor medida que S. aureus y E. coli. No obstante, no se detectaron diferencias entre las ovejas vacunadas y las no vacunadas, independientemente de la infección y del tiempo post-vacunación. Estos resultados sugieren que la liberación de NETs no jugaría un papel importante en la respuesta inmune protectora tras la vacunación frente a paratuberculosis, al menos durante el primer mes post-vacunación. No obstante, es posible que otros mecanismos antimicrobianos desarrollados por estas células y no analizados en este estudio, puedan estar implicados en esta respuesta., El cuarto y último estudio consistió en valorar el efecto que tiene la vacunación homóloga (frente a paratuberculosis) o heteróloga (frente a tuberculosis) sobre la respuesta inmunitaria y la protección en cabritos infectados de forma experimental con Map, y conocer el papel que puede jugar cada uno de los componentes de estas vacunas. Con este fin, se emplearon cabritos de un mes de edad divididos en varios grupos en función de la vacunación (Silirum®, HIMB-vacuna inactivada frente a Mbv o no vacunados), inmunización (bacterias inactivadas o adyuvantes) y/o infección. A los 45 días post-vacunación, los animales fueron infectados oralmente con Map y, posteriormente, sacrificados a los 190 días post-vacunación. Mensualmente, se recogieron muestras de sangre para la determinación de la respuesta inmunitaria periférica y la proporción de subpoblaciones linfocitarias mediante la prueba de liberación de IFN-γ (IGRA) o la detección de anticuerpos (ELISA), y citometría de flujo, respectivamente. Además, tras el sacrificio, se recogieron muestras de heces (cultivo bacteriológico) y de intestino y nódulos linfáticos asociados para la valoración de la producción local de IFN-γ (IGRA), la detección de Map (qPCR y cultivo bacteriológico), el estudio de las subpoblaciones linfocitarias (citometría de flujo) y el examen histológico. En todos los grupos de animales infectados se observaron lesiones granulomatosas, independientemente de la vacunación o la inmunización. Sin, embargo, los grupos vacunados con Silirum® (frente a Map) o HIMB (frente a Mbv) mostraron una considerable reducción del número y la gravedad de dichas lesiones, que se acompañaba de una elevada respuesta celular y humoral periféricas. También se observó una disminución del número de granulomas en los animales inmunizados con las cepas vacunales y los adyuvantes en comparación con el grupo no vacunado e infectado. Cabe destacar que esta reducción fue incluso mayor en las cabras a las que se les administró el adyuvante, en comparación con aquellas que fueron inmunizadas con cepas vacunales. Por otro lado, no se observaron diferencias en la proporción periférica o local de las diferentes subpoblaciones de linfocitos, ni en la respuesta inmunitaria local, entre los grupos establecidos. A la luz de estos resultados, tanto la vacunación frente a paratuberculosis como a tuberculosis ofreció una protección homóloga y heteróloga, respectivamente, contra la infección por Map. Además, los animales inmunizados con el adyuvante experimentaron una reducción del número de lesiones, no asociada a la presencia de una respuesta inmunitaria específica frente a Map detectable, que podría estar mediada por un mecanismo de inmunidad inespecífica que necesita ser esclarecido., El desarrollo de esta tesis doctoral se ha llevado a cabo en el Departamento de Sanidad Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de León (ULE) y en el Instituto de Ganadería de Montaña en Grulleros, León (IGM), centro mixto del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) y la ULE. Su realización ha sido posible gracias a la financiación del Ministerio de Ciencia e Innovación (Agencia Estatal de Investigación) a través del proyecto con referencia AGL2015-66540-C2-1-R y con título: “Respuesta inmune y marcadores de protección asociados a la vacunación en paratuberculosis”. Durante la realización de esta Tesis Doctoral la autora disfrutó de un contrato predoctoral (BES-2016-076513) para la formación de doctores otorgado por el Ministerio de Ciencia e Innovación., Arteche-Villasol, N., Benavides, J., Espinosa, J., Vallejo, R., Royo, M., Ferreras, M.C., Pérez, V., Gutiérrez-Expósito, D., 2020. Optimized in vitro isolation of different subpopulation of immune cells from peripheral blood and comparative techniques for generation of monocyte-derived macrophages in small ruminants. Vet. Immunol. Immunopathol. 230, 110131. http://dx.doi.org/10.1016/j.vetimm.2020.110131, Arteche-Villasol, N., Gutiérrez-Expósito, D., Vallejo, R., Espinosa, J., Elguezabal, N., Ladero-Auñon, I., Royo, M., Ferreras, MC., Benavides, J., Pérez, V., 2021. Early response of monocyte-derived macrophages from vaccinated and non-vaccinated goats against in vitro infection with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Vet. Res. 52, 69. http://dx.doi.org/10.1186/s13567-021-00940-y, Arteche-Villasol, N., Gutiérrez-Expósito, D., Elguezabal, N., Sevilla, I.A., Vallejo, R., Espinosa, J., Ferreras, M.C., Benavides, J., Pérez, V., 2021. Influence of heterologous and homologous vaccines, and their components, on the host immune response and protection against experimental caprine paratuberculosis. Front. Vet. Sci. 8, 744568. http://dx.doi.org/10.3389/fvets.2021.744568

323 p. La toxoplasmosis ovina es una enfermedad infecto-contagiosa causada por el protozoo parasitario Toxoplasma gondii (T. gondii), con una elevada incidencia en la ganadería ovina en todo el mundo, donde provoca importantes pérdidas económicas al estar asociada a fallo reproductivo, generalmente aborto. Aunque se sabe que el momento de gestación en el que ocurre la primoinfección de las ovejas gestantes determina las consecuencias clínicas de la enfermedad, no se conocen con exactitud los mecanismos patogénicos que explicarían esas diferencias. Uno de ellos podría ser la respuesta inmunitaria desarrollada tanto por la madre gestante como por el feto, a nivel periférico y de la placenta, pues éste es un factor clave en el control de la infección y multiplicación del parásito. De esta manera, el objetivo general de esta Tesis Doctoral es analizar cómo influye el momento de gestación en el que ocurre la infección con T. gondii sobre la respuesta inmunitaria materna y fetal, a nivel sistémico y local, y la posible relación con la aparición de abortos o transmisión vertical. Para su abordaje se han desarrollado tres estudios en los que además se pretende dar respuesta a objetivos de carácter más específico. Para ello, 36 ovejas gestantes, primíparas, de raza Churra y de la misma edad se distribuyeron al azar en 3 grupos experimentales, cada uno de ellos formado por 9 ovejas infectadas y 3 no infectadas. La reproducción experimental de la enfermedad se produjo empleando una misma dosis infectiva en todos los grupos, 50 ooquistes esporulados del aislado M4 de T. gondii (tipo II) administrados por vía oral. De esta manera, la infección se llevó a cabo a los 40 (G1), 90 (G2) y 120 (G3) días de gestación. Tras la inoculación, se planificó el sacrificio secuencial de 3 animales infectados y 1 control en los días 12, 19 y 26 post-infección (pi). El primero de los tres estudios de esta Tesis Doctoral se desarrolló con el objetivo concreto de esclarecer qué influencia ejerce el momento de gestación en el que se infecte a las ovejas gestantes sobre la clínica de la toxoplasmosis ovina, las lesiones fetales y placentarias y también sobre la colonización y multiplicación del parásito en estos tejidos. Para ello, tras la infección se realizó el seguimiento clínico de los animales, siendo posteriormente sacrificados, o bien en el momento en el que se produjeron abortos espontáneos o bien cuando estaba previsto su sacrificio secuencial. Tras la necropsia, se recogieron muestras fetales (suero o líquido torácico) para la detección de anticuerpos específicos frente a T. gondii. Además, se recogieron diferentes muestras tanto en el feto (encéfalo, hígado, corazón y pulmón) como en la placenta (5 placentomas seleccionados al azar) para su fijación en formol y posterior análisis histológico o bien su almacenamiento a -80ºC para después detectar y cuantificar, mediante qPCR, ADN de T. gondii analizando estadísticamente las diferencias entre grupos. La consecuencia clínica más destacable fue la aparición de abortos entre los días 6 y 26 pi que se clasificaron en dos categorías: abortos tempranos (entre los 6 y 16 días pi) o abortos tardíos (entre los días 17 y 26 pi). Los tempranos ocurrieron en los animales infectados de los tres grupos, por lo que en su aparición no influye el momento de gestación en que se produzca la infección de la madre gestante. Además, puesto que la detección de ADN parasitario en los fetos o placentas de los tres grupos fue muy esporádica y puntual en ese intervalo temporal y sucedió en un número muy escaso de muestras, se confirmó que estos abortos tempranos no estarían causados por la multiplicación del parásito en la placenta. Igualmente, la presencia del parásito tampoco es necesaria para la aparición de las lesiones características de este tipo de abortos, consistentes en trombosis e infartos en la placenta y áreas de leucomalacia fetal, observadas solamente en algunos de los encéfalos fetales estudiados. En resumen, el momento de gestación en que se infecta a las ovejas gestantes no ejerce ninguna influencia sobre la aparición de los abortos tempranos, ni sobre el tipo de lesiones fetales o placentarias asociadas o su gravedad, ni sobre la presencia del parásito en ellos. Sin embargo, al considerar los abortos tardíos, el tercio de gestación en el que se infectan las ovejas sí influye sobre la invasión de la placenta por el parásito, la aparición de lesiones y la consecución de estos abortos. La muerte fetal, con o sin aborto, entre los días 17 y 26 pi fue más frecuente en el grupo de animales infectados a final de la gestación (66,6%) que en los otros dos grupos (16,7% en ambos casos). El momento de gestación en que se produjo la infección de las ovejas gestantes también influyó sobre la colonización del parásito de la placenta y posterior multiplicación en este tejido y en el feto, así como en la aparición y gravedad de las lesiones asociadas. Tanto la llegada del parásito a la placenta tras la infección como la aparición de lesiones se detectaron antes, en el día 19 pi, en el G3 en comparación con los otros dos grupos experimentales, donde sólo se detectaron en el día 26 pi. Además, el aumento de carga parasitaria entre la tercera y cuarta semana pi fue muy brusco en los G1 y G2, mientras que en el G3 ese aumento fue muy leve. Dado que a lo largo de todo el experimento solamente se detectaron anticuerpos específicos frente al parásito en fluidos fetales del G2 y, principalmente, en el G3, es posible que la mayor maduración del sistema inmunitario fetal sea la causa de la aparición de estos anticuerpos y, a su vez, del menor incremento en la carga parasitaria observado en el G3, de forma que hubiera sido capaz de limitar en cierto modo la replicación del parásito y dificultar su diseminación hacia otros tejidos. Esta hipótesis también podría explicar que las lesiones de menor gravedad, tanto en la placenta como en el feto, correspondan a las muestras analizadas del G3. Por el contrario, las lesiones más graves y extensas se encontraron en las muestras procedentes de las ovejas infectadas a mitad de la gestación, detectándose en estos mismos animales las mayores cargas parasitarias de todo el experimento. Sin embargo, las características histológicas de las lesiones son muy similares, independientemente del tercio en el que se produzca la infección. Siempre se correspondieron con inflamaciones necróticas multifocales con infiltrados de macrófagos y linfocitos. Por otro lado, dado que siempre se detectó ADN de T. gondii en todas las muestras donde se encontró lesiones, parece claro que, en los abortos o transmisión fetal ocurridos más allá de la segunda semana pi, para el desarrollo de las lesiones es condición necesaria la colonización previa del parásito de estos tejidos. En conjunto, los resultados del primer estudio demuestran que el momento de gestación en que ocurra la infección de la oveja gestante determina claramente las consecuencias clínicas de la enfermedad, de influir en la llegada del parásito a la placenta y feto y posterior desarrollo de lesiones. En el segundo trabajo de esta Tesis Doctoral el objetivo concreto que se planteó fue analizar la respuesta inmunitaria, tanto periférica como a nivel de la placenta, de los mismos animales que los del anterior trabajo. Para ello, se cuantificaron los niveles circulantes de anticuerpos específicos frente a T. gondii en muestras de suero maternas y fetales, así como los de citoquinas de tipo Th1 (IFN-γ y TNF-α), Th2 (IL4) y Treg (IL10) en suero materno. También se analizaron los niveles de transcripción de ARNm de estas cuatro citoquinas, así como de IL12, a nivel de la placenta, mediante qPCR. Durante la fase inicial de la enfermedad, en concreto en los días 5 y 8 pi, se detectaron niveles séricos significativamente mayores de IFN-γ en todos los grupos experimentales con respecto al grupo control, aunque no existieron diferencias significativas entre los grupos infectados. Estos hallazgos confirman que en las fases iniciales de la enfermedad predomina una respuesta inmunitaria de tipo celular. Tras este aumento en la producción de IFN-γ, sus niveles circulantes decrecieron rápidamente coincidiendo con un incremento en la producción de anticuerpos específicos frente a T. gondii, así como de TNF-α e IL10. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos infectados más que en días concretos y de forma puntual. Sin embargo, los tres grupos infectados presentaron clara, y significativamente, una mayor cantidad de estas citoquinas que el grupo control. Por otro lado, no se detectaron niveles circulantes apreciables de IL4. Estos resultados en conjunto demuestran que el momento de gestación en que se produce la infección de las ovejas gestantes con T. gondii no influye sobre la respuesta inmunitaria periférica desarrollada por los animales, la cual se caracteriza por la producción de citoquinas tanto de tipo Th1 como de tipo Treg, sin que exista una polarización clara hacia uno u otro tipo de respuesta a medida que avanza la gestación. Al igual que a nivel periférico, la repuesta inmunitaria local estaba caracterizada por la producción de citoquinas de tipo Th1, Th2 y Treg. Es de destacar que, de manera similar a lo observado a nivel periférico, los mayores niveles de expresión de ARNm en la placenta correspondieron a IFN-γ. Sin embargo, aunque, salvo en el caso de IL12, se encontraron diferencias significativas entre los animales infectados y los controles, las diferencias entre grupos infectados sólo fueron significativas en el caso de IL4 e IL10. En concreto, los niveles de IL4 fueron mayores en los G1 y G2, mientras que los de IL10 fueron mucho más elevados en el G3. Estos resultados demuestran, por un lado que la respuesta inmunitaria periférica y local difieren a lo largo de la infección y que el momento de gestación en que se produce la infección no influye sobre los niveles séricos de las citoquinas estudiadas, pero sí sobre los niveles de expresión de IL4 e IL10 en la placenta, y por otro lado que a medida que avanza la gestación la respuesta inmunitaria desarrollada en la placenta frente a la infección por T. gondii sufre una modulación caracterizada principalmente por una mayor expresión de IL10. El tercer objetivo concreto de esta Tesis Doctoral fue analizar si el momento de gestación en que se produjo la infección de los animales con T. gondii influye sobre las poblaciones celulares concretas que constituyen los infiltrados inflamatorios observados en la placenta y la distribución del parásito en este órgano. Para ello, se utilizaron métodos inmunohistoquímicos mediante el empleo de anticuerpos específicos frente a diferentes antígenos: del parásito y de diferentes poblaciones celulares (células NK, B, T y macrófagos). No obstante, debido a la aparición de abortos tempranos en la fase aguda de la toxoplasmosis y de la expulsión de mortinatos en G3, las muestras de placenta de estos animales estaban muy autolíticas, lo que impedía su correcta valoración histológica. Debido a esta limitación en el número de muestras, no se tuvo en cuenta el momento de gestación en que se infectó a los animales y las comparaciones se realizaron entre tres grupos de ovejas: aquellas no infectadas, las que abortaron y las que fueron sacrificadas. Solamente se detectó antígeno parasitario mediante análisis inmunohistoquímico en las placentas de los animales sacrificados en la cuarta semana pi, pues en este momento, como se explicó anteriormente, es cuando se detectó no sólo ADN de T. gondii sino también lesiones en la placenta y vísceras fetales de todos los animales infectados. No obstante, la distribución de antígeno parasitario fue diferente en la parte materna y fetal: mientras que en aquella se encontraban restos de parásito, denominado antígeno particulado, asociados con áreas de infiltración de linfocitos y macrófagos y/o áreas de necrosis, en la parte fetal la morfología del parásito estaba más conservada, con una estructura semejante a las vacuolas parasitóforas, frecuentemente observado en el interior de trofoblastos y nunca se encontraba asociado a áreas de necrosis. Estos resultados plantean la posibilidad de que los trofoblastos fetales sean más susceptibles a la infección con T. gondii y que la respuesta inmunitaria fetal no sea tan efectiva a la hora de controlar la replicación del parásito, lo que favorecería su multiplicación, al contrario de lo que ocurriría en la parte materna de la placenta. Respecto a la distribución de los distintos subtipos celulares, un resultado muy destacado fue que el número de células NK+ y B+ fue muy reducido, no solamente en los animales infectados sino también en los controles. Esto parece demostrar que estas células no son importantes en la respuesta inmunitaria desarrollada en la placenta durante la toxoplasmosis ovina. Por el contrario, es de especial relevancia el hecho de que la positividad asociada a las células T y macrófagos, así como su distribución, estuviera condicionada por la presentación clínica de la enfermedad. En concreto, en las ovejas que sufrieron abortos tempranos se detectó una predominancia de macrófagos en el infiltrado inflamatorio siempre restringido a la carúncula materna. Por el contrario, en la placenta de las ovejas sacrificadas en la cuarta semana pi (en las que se había detectado la presencia del parásito por PCR e inmunohistoquímica), los infiltrados inflamatorios asociados con la multiplicación del parásito consistían tanto en linfocitos T como en macrófagos, restringidos siempre a las vellosidades fetales de la placenta. Además, en este último caso se demostró que, dada la ausencia de positividad asociada a la calprotectina, los macrófagos implicados en la respuesta inmunitaria local serían aquellos residentes de manera constitutiva en este tejido. En resumen, los resultados de esta Tesis Doctoral demuestran que la llegada de T. gondii a la placenta ovina y posterior multiplicación en este tejido y en el feto, así como la gravedad de las lesiones asociadas, están influidas por el momento de gestación en que ocurra la infección. Se demuestra también la importancia de la respuesta inmunitaria local, a nivel de la placenta, que presenta diferencias con respecto a la materna periférica, y cuyo infiltrado inflamatorio difiere en función de la presentación clínica de la enfermedad.

337 p. La paratuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa de carácter crónico que está causada por Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map). Está difundida por todo el mundo y causa importantes pérdidas económicas en la industria ganadera. Para su control, la única medida que se ha demostrado útil en términos coste-beneficio, es la vacunación. Sin embargo, posee una serie de desventajas, como es el hecho de que produce reacciones cruzadas con las pruebas de diagnóstico empleadas en las campañas de erradicación de la tuberculosis, o que la protección no es completa, ya que, aunque reduce la aparición de casos clínicos y la excreción de Map, esto no se consigue en todos los casos. Por otra parte, además de un efecto protector, hay evidencias en estudios de campo que sugieren que la vacunación podría tener un efecto terapéutico, que hasta el momento no se ha logrado demostrar. Existen, por lo tanto, muchas incógnitas sobre cuáles son los efectos de la vacunación, y ciertos aspectos relacionados con ella, sobre la patogenia de la paratuberculosis y la respuesta inmunitaria de los animales. Su esclarecimiento es el objetivo general de esta Tesis Doctoral. Para ello, se han desarrollado tres estudios, que además van a responder a varios objetivos de carácter más específico. El primer estudio tiene como objetivo evaluar el efecto de la vacunación, en función de la edad de los animales, sobre la respuesta inmunitaria y el control de la enfermedad, en una explotación caprina comercial con casos clínicos de la enfermedad. Para su logro, se planteó un estudio en un rebaño de cabras murciano-granadina, de producción lechera, donde se inmunizaron, con la vacuna inactivada Gudair®, cabras a tres edades diferentes: 39 cabras adultas (mayores de 1,5 años), dejándose 38 animales de la misma edad sin vacunar; 40 cabritas de 5 meses de edad, con otras 39 de edad similar como controles, y 19 animales de 1,5 meses y otras 15 sin vacunar. En todos los animales se tomaron muestras de sangre con periodicidad trimestral, hasta los 21 meses post-vacunación (mpv) para valorar la producción de IFN-γ mediante la técnica IGRA, empleando las PPD aviar y bovina, y los niveles de anticuerpos séricos empleando un ELISA indirecto. A los 6 y a los 18 mpv, se llevó a cabo la prueba de IDTB simple y comparada. También se controló el número de bajas, por cualquier razón, durante 21 meses, tanto en los grupos vacunados como no vacunados. En todos los grupos vacunados se observó un incremento significativo en la producción de IFN-γ, cuando se estimularon las muestras de sangre con PPD aviar desde los 3 mpv hasta los 18 mpv y con PPD bovina, entre los 3 y 21 mpv. Igualmente, también hubo un incremento significativo de los niveles de anticuerpos séricos entre los 3 y 21 mpv, en todos los grupos vacunados. También, se observaron diferencias según la edad de vacunación de forma que los niveles más elevados se encontraron en los animales vacunados a los 5 meses, y los menores en los individuos adultos. No se encontraron reaccionantes positivos a tuberculosis en las dos IDTB realizadas. Tampoco se detectaron bajas asociadas a paratuberculosis en ninguno de los grupos. Sin embargo, cuando se analizó el número de bajas totales, independientemente de su causa, se observó que era significativamente menor en los grupos vacunados (6,12 %) que en los no vacunados (14,13 %). Esto era especialmente evidente en el grupo de cabritos inimunizados con 1,5 meses, donde no ocurrió ninguna baja, mientras que en el grupo no vacunado mnurieron 3 animales durante el primer año por procesos neumónicos. Estos resultados sugieren que la vacunación de paratuberculosis, especialmente en animales jóvenes, induce una protección heteróloga frente a otros procesos infecto-contagiosos. El segundo estudio se planteó con el objetivo de valorar el efecto de la vacunación, previa o posterior a una infección experimental con Map, sobre la patogenia de la paratuberculosis, valorando el desarrollo de lesiones, la respuesta inmunitaria periférica y local o la colonización de Map en tejidos y heces. Se emplearon 35 cabritos de 1,5 meses de edad, que fueron separados en 6 grupos experimentales. Un grupo de 8 cabritos (VI) fue vacunado 30 días antes de que se les produjera el desafío oral con la micobacteria; 4 cabritos (VNI) permanecieron como animales control de esa vacunación; 9 cabritos fueron desafiados, pero no vacunados (NVI); 5 cabritos fueron desafiados y 150 días después fueron vacunados (IV); 2 cabritos permanecieron como controles de esa vacunación a los 150 dpi (NIV) y, por último, 7 cabritos permanecieron como animales sin vacunar ni infectar (NVNI). La inmunización se llevó a cabo con la vacuna inactivada Silirum® y para el desafío se empleó la cepa de referencia K-10 de Map. Se tomaron muestras de sangre con periodicidad mensual, entre los 0 y 360 días post-vacunación (dpv), para evaluar la respuesta inmunitaria periférica celular y humoral, con las mismas técnicas del primer estudio, y a los 120 dpv (90 dpi) se realizó la prueba de IDTB comparada, empleando PPD aviar y bovina. A los 120 días post-infección (dpi) y a los 330 dpi se llevaron a cabo sacrificios para evaluar el efecto de la vacunación sobre el desarrollo de las lesiones, la respuesta inmunitaria local y la presencia de micobacterias en tejidos. Durante la duración del estudio, se pudo comprobar cómo se producía un incremento significativo en la producción de IFN-γ tras la estimulación de la sangre con PPD aviar al mes de producirse la vacunación en los grupos vacunados a los -30 dpi, mientras que fue más tardía (60 dpv) en el caso de los grupos vacunados a los 150 dpi. Este incremento fue mucho más prolongado en el caso de la vacunación a los -30 dpi (6 mpv) que en el caso de la vacunación a los 150 dpi (3 mpv). Asimismo, se observó un patrón similar en la PPD bovina, donde se vieron incrementos significativos similares a los observados en el caso de la PPD aviar, aunque siempre inferiores. La posible interferencia de la vacunación en el diagnóstico de la tuberculosis, no se observó al hacer la IDTB comparada, pero si con la IDTB simple, ya que un 58,3 % de los cabritos vacunados fueron positivos. En ambos grupos vacunados, se detectaron niveles de anticuerpos significativamente más elevados, a los 60 dpv, que se mantuvieron durante 7 meses, en el caso del grupo VI y 3 meses en el grupo IV. Sin embargo, la vacunación no modificó los porcentajes de las poblaciones de linfocitos T CD4+, T CD8+, T δγ o B en sangre circulante, valorados mediante citometría de flujo. Se pudo comprobar que la vacunación no evitó la infección por Map de los animales, ya que en todos los grupos se pudieron identificar lesiones, así como ácidos nucleicos de esta micobacteria mediante PCR. Sin embargo, sí se pudo observar como la vacunación consiguió un efecto protector sobre los cabritos del grupo VI, ya que solo mostraron lesiones restringidas al tejido linfoide (de tipo focal o multifocal a) y, mediante el recuento del número de granulomas, se demostró que disminuyeron con el tiempo. Es de destacar que, a diferencia de los cabritos del grupo NVI, los granulomas del tejido linfoide mostraban un carácter regresivo, con un incremento en la cantidad de tejido conjuntivo. Sin embargo, no se pudo demostrar con claridad el posible efecto terapéutico de la vacunación, ya que se observó una gran variabilidad individual en las respuestas de los animales del grupo IV, con cabritos sin lesiones o lesiones focales, hasta un animal con una lesión difusa y gran cantidad de bacilos en el intestino, a pesar de mostrar una respuesta inmunitaria celular muy elevada y del que se consiguió aislar Map mediante el cultivo de sus tejidos. La existencia de este animal plantea la posibilidad de que la vacunación tras la infección pudiera exacerbar esta última en algunos animales. En cuanto a la respuesta inmunitaria local, la vacunación no indujo cambios en las subpoblaciones linfocitarias presentes en el tejido linfoide intestinal, nódulos linfáticos yeyunales o nódulo linfático preescapular. Sólo en esta última localización se detectaron niveles más elevados de IFN-γ tras la estimulación con PPD aviar de los linfocitos purificados a los 360 dpv en animales vacunados. Lo que no se observó en el resto de muestras estudiadas. El tercer objetivo de este trabajo de investigación fue analizar la respuesta inmunitaria celular mediante la técnica IGRA, desarrollada por animales sensibilizados frente Map cuando eran expuestos a nuevos antígenos específicos de M. bovis y Map. Para ello, se desarrolló un tercer ensayo, empleando animales del primer y segundo estudio, en muestreos realizados a diferentes días post-vacunación, empleando como antígenos para estimular la sangre la PPD aviar y bovina, la johnina, dos cócteles peptídicos (PC-EC y PC-HP) de M. bovis y los antígenos VK 055 y VK 067 de Map. No se observó producción específica de IFN-γ tras la estimulación de la sangre con los dos cócteles de M. bovis en ningún animal vacunado ni en ningún muestreo, mientras que sí se obtuvo cuando se empleó la PPD bovina, lo que apoya su posible uso en las campañas de erradicación de la tuberculosis al mejorar la especificidad de la PPD bovina. En cambio, los dos antígenos de Map probados en este estudio no mejoraron la sensibilidad de la johnina ni la PPD aviar en la detección de cabritos vacunados oinfectados por Map.