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Orientadora : Profª Drª Rose Adele Monteiro Co-orientador : Prof. Dr. Ray Dixon Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 24/02/2015 Inclui bibliografia Resumo

Resumo: Herbaspirillum seropedicae e uma bacteria fixadora de nitrogenio da classe ƒÀ das Proteobacteria, encontrada em associacao com diferentes Poaceae, como trigo, arroz, sorgo e cana-de-acucar. O genoma de H. seropedicae (GENOPAR) possui tres genes homologos a fnr. As proteinas FNR sao reguladores transcricionais que agem como sensores do estado redox intracelular, regulando um grande numero de genes em resposta a mudancas nos niveis de O2. Neste trabalho, foram construidos sete mutantes por delecao, fnr1, fnr2, fnr3, fnr1fnr2, fnr1fnr3, fnr2fnr3 e fnr1fnr2fnr3. Estes mutantes foram deficientes no crescimento sob condicoes limitantes de oxigenio e o triplo mutante foi menos resistente a NO2 -. Nenhuma evidencia foi encontrada a respeito do envolvimento de FNR na utilizacao de ions amonio ou nitrato como fonte de nitrogenio. Resultados obtidos anteriormente mostraram que a proteina NifA de H. seropedicae, responsavel pela ativacao da expressao dos genes nif, e inativada em uma estirpe mutante de scherichia coli no gene fnr. Devido a esse resultado o possivel envolvimento de FNR na fixacao biologica de nitrogenio de H. seropedicae foi investigado. Os resultados obtidos mostraram que as proteinas FNR nao sao necessarias para a atividade da nitrogenase. Experimentos de determinacao da expressao genica mostraram que FNR reprime a expressao dos genes nifA e nifB de H. seropedicae, e tambem do operon fixNOQP. Experimentos realizados com fusoes entre os genes fnr1, fnr2 e fnr3 com o gene reporter lacZ mostraram que a expressao do gene fnr2 e dependente das proteinas FNR e que a expressao de fnr3 e reprimida pelas outras proteinas FNR. Por fim, os resultados obtidos mostram q e as proteinas FNR de H. seropedicae nao sao essenciais a fixacao biologica de nitrogenio, mas podem estar envolvidas em um fino mecanismo de regulacao da expressao de genes requeridos para fixacao de nitrogenio, permitindo que estes genes sejam expressos quando as concentracoes de oxigenio sao otimas para a fixacao biologica de nitrogenio.

Orientadora : Profª. Drª. Rose Adele Monteiro Coorientador : Profª. Drª. Maria Berenice R. Steffens Coorientador :Dr. Marcelo Bueno Batista Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 28/09/2016 Inclui referências : f. 71-81 Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria fixadora de nitrogênio, Gram negativa, pertencente à classe ? do filo Proteobacteria, encontrada associada a várias plantas de interesse econômico como milho (Zea mays), arroz (Oryza sativa), sorgo (Sorghum bicolor), trigo (Triticum aestivum), cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), entre outras. No genoma de H. seropedicae SmR1 foram anotados cinco genes possivelmente codificadores de globinas do tipo hemoglobinas truncadas (Hsero_0935, Hsero_1880, Hsero_2698, Hsero_2855 e Hsero_2872), sendo que dois deles (Hsero_2855 e Hsero_2872) estão dentro do cluster nif. A família das hemoglobinas truncadas (trHb) é constituída de pequenas hemeproteínas ligadoras de oxigênio, distribuídas em bactérias, plantas e eucariotos unicelulares, em concentração intracelular de nano a micromolar e, geralmente, contém 20 a 40 resíduos de aminoácidos a menos que as hemoglobinas de vertebrados. São classificadas em três grupos: I (N ou trHbN), II (O ou trHbO) e III (P ou trHbP), e recentemente sugeriram a existência de um pequeno grupo nomeado como IV (Q ou trHbQ). Alguns organismos que possuem trHbs apresentam propriedades patogênicas, realizam fotossíntese, fixam nitrogênio ou possuem capacidades metabólicas distintas. A análise in silico demonstrou que as globinas Hsero_1880 e Hsero_2855 pertencem ao grupo II das trHb e podem atuar no metabolismo de óxido nítrico. A ausência dos produtos dos genes Hsero_1880 e Hsero_2855 não influencia o perfil de crescimento de H. seropedicae, uma vez que os mutantes apresentaram tempo de duplicação semelhante ao da estirpe selvagem. Os genes Hsero_1880 e Hsero_2855 tem, aparentemente, efeito no metabolismo de nitrogênio, uma vez que a atividade de nitrogenase dos mutantes nos genes Hsero_1880 e Hsero_2855 foram de, aproximadamente, 50% e 30% da atividade da estirpe selvagem em 24 horas, respectivamente. O gene Hsero_2855 é expresso no início na colonização da planta. O gene Hsero_1880 é ativado em baixas concentrações de oxigênio, sugerindo que este pode ser ativado nas condições de fixação de nitrogênio e também pode estar relacionado com adaptação a baixas concentrações de O2. A concentração de nitrogênio, independente da fonte utilizada como amônio, glutamato e nitrato, não influencia na ativação do gene Hsero_1880. Palavras chave: H. seropedicae, globina truncada, fixação biológica do nitrogênio Abstract: Herbaspirillum seropedicae is a Gram-negative nitrogen-fixing bacterium belonging to the class ? of the Proteobacteria phylum, it is associated with several plants of economic value such as corn (Zea mays), rice (Oryza sativa), sorghum (Sorghum bicolor), wheat (Triticum Aestivum), sugarcane (Saccharum officinarum), among others. In the H. seropedicae SmR1 genome, five genes possibly encoder of the truncated hemogoblins (Hsero_0935, Hsero_1880, Hsero_2698, Hsero_2855 and Hsero_2872) were annotated, two of them (Hsero_2855 and Hsero_2872) are inside the nif cluster. The family of truncated hemoglobins (trHb) consists of small oxygen-binding hemeproteins, distributed in bacteria, plants and unicelular eukaryotes, in intracellular nano-to-micromolar concentration and generally contains 20 to 40 amino less than the vertebrate hemoglobins. They are classified into three groups: I (N or trHbN), II (O or trHbO) and III (P or trHbP), and recently a forth small group named IV (Q or trHbQ) was created. Some organisms that have trHbs present pathogenic properties, perform photosynthesis, fix nitrogen or have different metabolic capacities. The in silico analysis demonstrated that the globins Hsero_1880 and Hsero_2855 belong to the group II of the trHb and can act in the metabolism of nitric oxide. The absence of the products of the Hsero_1880 and Hsero_2855 genes does not influence the growth profile of H. seropedicae, since the mutants had duplication time similar to that of the wild strain. The Hsero_1880 and Hsero_2855 genes apparently have an effect on nitrogen metabolism, since the nitrogenase activity of the mutants in the Hsero_1880 and Hsero_2855 genes was approximately 50% and 30% of the wild type activity in 24 hours, respectively. The Hsero_2855 gene is expressed early in plant colonization. The Hsero_1880 gene is activated at low oxygen concentrations, suggesting that it can be activated under nitrogen fixation conditions and may also be related to adaptation to low O2 concentrations. The concentration of nitrogen, regardless of the source used as ammonium, glutamate and nitrate, does not influence the activation of the Hsero_1880 gene. Key words: H. seropedicae, truncated globin, biological nitrogen fixation