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La calcificación cardiovascular (CCV) afecta a arterias y válvulas comprometiendo su normal funcionamiento y aumentando el riesgo de sufrir accidentes cardiovasculares y de desarrollar hipertrofia cardíaca e insuficiencia cardiaca, entre otros. Actualmente no existen tratamientos eficaces que prevengan o reduzcan la CCV. Nuestro grupo había descrito la sobreexpresión del receptor nuclear NOR-1 en lesiones ateroscleróticas humanas y su inducción en células endoteliales y células musculares lisas vasculares (CMLVs) por estímulos que promueven disfunción endotelial y potencian la migración y proliferación de ambos tipos celulares. La Lisil Oxidasa (LOX) es una enzima que cataliza el entrecruzamiento de las fibras de colágeno y elastina en el proceso de maduración de la matriz extracelular (MEX). Nuestro grupo había caracterizado la implicación de LOX en la disfunción endotelial y el remodelado vascular, y cómo la actividad LOX contribuye al estrés oxidativo y a la rigidez vascular. En el presente trabajo hemos profundizado en el estudio de los mecanismos celulares y moleculares por los que NOR-1 y LOX participan en la CCV. Detectamos aumento de los niveles de expresión de NOR-1 tanto en válvulas aórticas como en lesiones ateroscleróticas humanas calcificadas, en las que colocalizó con marcadores de calcificación como RUNX2 (Runt-related transcription factor 2) y osteopontina (OPN). La expresión endógena de NOR-1 aumentó al incubar células instersticiales de válvula aórtica (VICs) o CMLVs humanas con un medio con alto contenido en fosfato que indujo calcificación. La sobreexpresión de NOR-1 en VICs expuestas a éste medio limitó la inducción de los marcadores de diferenciación osteoblástica/calcificación y la mineralización de la MEX. Además, al exponer a medio osteogénico CMLVs o anillos aórticos de ratones que sobreexpresan NOR-1 en las CMLVs (TgNOR-1CMLV) la expresión de los marcadores de calcificación y la mineralización de la MEX fue menor que en células o anillos a, Las lesiones ateroscleróticas de animales TgNOR-1CMLV eran de menor tamaño y tenían menor infiltrado inflamatorio; además, estaban menos calcificadas y presentaban menor expresión de marcadores osteogénicos, menor grado de entrecruzamiento del colágeno y menor contenido de glucosaminoglucanos que las de los animales control. Por lo tanto, NOR-1 reduce la calcificación de células en cultivo y la calcificación de la íntima asociada a la aterosclerosis. En relación al impacto de LOX en la CCV, observamos una mayor expresión de esta enzima tanto en válvulas aórticas calcificadas como en placas ateroscleróticas humanas en las que colocalizaba con RUNX2. Al inducir la calcificación de VICs con un medio rico en fosfato observamos un aumento de la secreción de la LOX que promovió la maduración de la MEX y su mineralización de forma dependiente de su actividad catalítica. Al inducir aterosclerosis mediante la administración de AAV-PCSK9D374Y y dieta aterogénica, los ratones que sobreexpresan LOX en las CMLVs de la pared vascular (TgLOXCMLV) presentaron mayor desarrollo de aterosclerosis en la aorta y mayor calcificación de las lesiones. Las lesiones ateroscleróticas de ratones TgLOXCMLV tenían más infiltrado inflamatorio y una cubierta fibrosa más rica en CMLVs y más engrosada. El análisis de la calcificación evidenció que las placas de ratones TgLOXCMLV estaban más calcificadas y presentaban mayor expresión de marcadores osteogénicos, mayor grado de entrecruzamiento de colágeno y mayor contenido de glucosaminoglucanos que las de los animales control. Por lo tanto, nuestro estudio proporciona evidencias tanto in vitro como in vivo del papel clave de la LOX en la CCV.

The mechanisms that control the inflammatory–immune response play a key role in tissue remodelling in cardiovascular diseases. T cell activation receptor CD69 binds to oxidized low-density lipoprotein (oxLDL), inducing the expression of anti-inflammatory NR4A nuclear receptors and modulating inflammation in atherosclerosis. To understand the downstream T cell responses triggered by the CD69-oxLDL binding, we incubated CD69-expressing Jurkat T cells with oxLDL. RNA sequencing revealed a differential gene expression profile dependent on the presence of CD69 and the degree of LDL oxidation. CD69-oxLDL binding induced the expression of NR4A receptors (NR4A1 and NR4A3), but also of PD-1. These results were confirmed using oxLDL and a monoclonal antibody against CD69 in CD69-expressing Jurkat and primary CD4 + lymphocytes. CD69-mediated induction of PD-1 and NR4A3 was dependent on NFAT activation. Silencing NR4A3 slightly increased PD-1 levels, suggesting a potential regulation of PD-1 by this receptor. Moreover, expression of PD-1, CD69 and NR4A3 was increased in human arteries with chronic inflammation compared to healthy controls, with a strong correlation between PD-1 and CD69 mRNA expression (r = 0.655 P < 0.0001). Moreover, PD-1 was expressed in areas enriched in CD3 infiltrating T cells. Our results underscore a novel mechanism of PD-1 induction independent of TCR signalling that might contribute to the role of CD69 in the modulation of inflammation and vascular remodelling in cardiovascular diseases.

Objetivo No existen fármacos que limiten la progresión y/o prevengan la rotura del aneurisma de aorta abdominal (AAA), enfermedad degenerativa que puede ser mortal. La vía de señalización de Wnt se reactiva en múltiples patologías y regula procesos relevantes en el AAA; sin embargo, se desconoce si juega un papel activo y puede ser una alternativa terapéutica en el AAA. Nuestro objetivo fue analizar si la vía de Wnt se activa en el AAA y si su inhibición previene su formación. Material y Métodos Se analizó el nivel de expresión (PCR/Western blot/inmunohistoquímica) de componentes de la vía de Wnt en la aorta abdominal de pacientes con AAA y controles, y en aortas de ratones ApoE-/- infundidos con angiotensina II para inducir AAA. En estos animales, se realizó seguimiento de la presión arterial (pletismografía), y del diámetro de la aorta y la función cardiaca (ecocardiografía) en grupos control y tratados con LGK974 (inhibidor de porcupina) o PRI-724 (que interfiere la interacción CBP/ß-catenina). Resultados En la pared aneurismática humana, no se modificaron los niveles de mRNA de ß-catenina, pero aumentó la ß-catenina transcripcionalmente activa, así como la expresión de WNT2, WNT5a y WNT5b. Asimismo, se alteró la expresión de SFRP2, SFRP4 y SFRP3. Un perfil similar se detectó en la aorta aneurismática de los animales ApoE-/-. El LGK974 redujo la expresión vascular de Axin2, confirmando la inhibición de la ruta Wnt, y la hipertrofia cardiaca, pero no afectó a la supervivencia, progresión, incidencia o severidad de los AAA. Análogamente, el PRI-724 también bloqueó la vía, retrasó ligeramente el aumento del diámetro aórtico y redujo la gravedad de los aneurismas, si bien no afectó a su formación. Conclusiones La vía Wnt está activada en el AAA, pero la inhibición de la porcupina o de la interacción CBP/ß-catenina no afecta a la formación del aneurisma experimental.

Objetivo Los mecanismos que controlan la repuesta inmune inflamatoria juegan un papel fundamental en la remodelación del tejido en las enfermedades cardiovasculares. El receptor de activación de células T CD69 une lipoproteínas de baja densidad oxidadas (oxLDL), induciendo la expresión de los receptores nucleares NR4A y modulando la inflamación en aterosclerosis. Sin embargo, los mecanismos subyacentes no se conocen. El objetivo principal de este trabajo es conocer las respuestas desencadenadas con la unión de las oxLDL a CD69 en los linfocitos T. Material y Métodos La línea celular Jurkat expresando CD69 de manera estable se incubó con oxLDL y se realizó un análisis de secuenciación masiva de ARN. Los resultados se comprobaron mediante PCR a tiempo real, citometría de flujo y empleando anticuerpos monoclonales anti-CD69. También se analizaron muestras humanas de arterias abdominales inflamadas mediante inmunohistoquímica, PCR y western-blot. Resultados El perfil de expresión génica mostró diferencias dependiendo de la presencia de CD69 y del grado de oxidación de las LDL. La unión oxLDL-CD69 indujo la expresión de NR4A1 y NR4A3 pero también de la molécula inmunorreguladora PD-1. La inducción de PD-1 y NR4A3 es dependiente del factor de transcripción NFAT. El silenciamiento de NR4A3 indujo un ligero aumento de PD-1, lo que sugiere una potencial regulación de PD-1 por NR4A3. Además, se identificó una elevada expresión de PD-1, CD69 y NR4A3 en muestras de arterias humanas con inflamación crónica en comparación con donantes sanos, encontrando una fuerte correlación entre la expresión de CD69 y PD-1 (r= 0.655 P<0.0001) Conclusiones Nuestros resultados evidencian un nuevo mecanismo de inducción de PD-1 independiente del TCR, señalización que podría contribuir al papel de CD69 en la modulación de la inflamación y el remodelado vascular en las enfermedades cardiovasculares.

Objetivo Los mecanismos implicados en la calcificación de arterias y válvulas (calcificación cardiovascular; CCV) no se conocen suficientemente. El receptor NOR-1 modula la diferenciación celular, la inflamación y el estrés oxidativo, mecanismos clave en la CCV. Nuestro objetivo fue analizar el papel de NOR-1 en la CCV. Material y Métodos Se cultivaron células musculares lisas vasculares (CMLV) de animales control (WT) y transgénicos de NOR-1 (TgNOR1-CMLV), y células intersticiales valvulares (VICs) humanas. La calcificación inducida con un medio osteogénico (OM) se cuantificó mediante tinción (Rojo de alizarina). NOR-1 se silenció o se sobreexpresó lentiviralmente. Se analizó la calcificación de anillos aórticos incubados ex vivo con OM. En animales WT y TgNOR1-CMLV se indujo aterosclerosis y calcificación mediante la administración de virus adenoasociados (AAV-PCSK9-D734Y) y una dieta aterogénica. Se cuantificó la calcificación de las aortas en fresco administrando una sonda fluorescente antes del sacrificio (OsteoSense 680 EX-sistema IVIS Spectrum). Se analizó la extensión de la aterosclerosis, la calcificación (Von Kossa) y la infiltración de células inflamatorias (análisis histológicos-inmunohistoquímicos), niveles de RNA/proteína (PCR/Western blot) y de marcadores circulantes de calcificación (ELISA). Resultados Las CMLVs transgénicas fueron menos propensas a calcificar que las control, y mostraban menor expresión de BMP2, ALPL, osteopontina y osteoprotegerina. El OM indujo NOR-1 de igual modo en ambas CMLV; sin embargo, en las transgénicas la inducción de los marcadores de calcificación fue menor. Los anillos aórticos de los animales transgénicos también calcificaron menos. Los animales TgNOR1-CMLV mostraron cierto grado de protección frente al desarrollo de aterosclerosis y sus lesiones presentaban una reducción de la calcificación y la inflamación. La expresión de NOR-1 en VICs aumentó al inducir calcificación, y su silenciamiento o sobreexpresión aumentó o

Pharmacological treatments for preventing abdominal aortic aneurysm (AAA) rupture or slowing aneurysm progression remain a challenge. It is increasingly recognized that sympathetic activity might play a role in the pathogenesis of AAA; however, the impact of this pathway remains unclear. Here, we show that the expression of tyrosine hydroxylase (TH), dopamine ß-hydroxylase (DBH), and the norepinephrine transporter SLC6A2 is upregulated in abdominal aorta samples from AAA patients and in the aneurysmal aorta from 2 animal models susceptible to Ang II (angiotensin II)¿induced AAA: the apolipoprotein E-deficient (ApoE¿/¿) model and a transgenic mouse that overexpresses the human nuclear receptor NOR-1 (neuron-derived orphan receptor-1) in the vascular wall (TgNOR-1VSMC). TH localizes to sympathetic nerves innervating the local vasculature, but also to inflammatory cells, and scattered vascular smooth muscle cell in human and mouse AAA. Interestingly, the preventive effect of doxycycline on AAA formation in Ang II¿treated TgNOR-1VSMC mice was associated to the normalization of vascular Th expression. Moreover, the TH specific inhibitor ¿-methyl-p-tyrosine protected against Ang II¿induced AAA formation, limiting the progressive increase in aortic diameter without affecting blood pressure. The drug normalized MMP2 (matrix metalloproteinase 2) expression and MMP activity, preserving elastin integrity, attenuated the Ang II¿mediated rise in vascular oxidative stress and inflammatory markers and reduced the inflammatory infiltrate. Finally, NOR-1, whose expression correlated with that of TH in human AAA, was able to drive human TH transcriptional activity in transient transfection assays. Therefore, the upregulation of the TH pathway could be critical in the pathophysiology of AAA, supporting the potential of pharmacological strategies targeting TH for AAA management.

The mechanisms committed in the activation and response of vascular and inflammatory immune cells play a major role in tissue remodeling in cardiovascular diseases (CVDs) such as atherosclerosis, pulmonary arterial hypertension, and abdominal aortic aneurysm. Cardiovascular remodeling entails interrelated cellular processes (proliferation, survival/apoptosis, inflammation, extracellular matrix (ECM) synthesis/degradation, redox homeostasis, etc.) coordinately regulated by a reduced number of transcription factors. Nuclear receptors of the subfamily 4 group A (NR4A) have recently emerged as key master genes in multiple cellular processes and vital functions of different organs, and have been involved in a variety of high‐incidence human pathologies including atherosclerosis and other CVDs. This paper reviews the major findings involving NR4A3 (Neuron‐derived Orphan Receptor 1, NOR‐1) in the cardiovascular remodeling operating in these diseases.