Search

Salmon louse, (Lepeophtheirus salmonis, Krøyer, 1838), is an ectoparasite that causes multiple health and economic problems in the farming of Atlantic salmon (Salmo salar L.), but also threatens wild salmonid species. The industry is struggling to identify proper measures for limiting lice infections, and to identify effective delousing treatments. One of the major production and management challenges, but interesting biological observations, is that each treatment, as seen for medicinal or chemical treatment, becomes less effective due to the development of resistance in salmon lice. This causes reduced fish health, large financial losses for the industry, and, so far, unsolvable challenges for the management of aquaculture. The current management regime assumes that salmon lice along the Norwegian coast is a panmictic population, despite it is known that delousing treatments act as strong selective agents that create phenotypes who display adaptive traits towards resistance. However, there is no prior research addressing the population genomics underlying this observation on smaller geographical scales through time. The objective of this study was to investigate within farm and among net pens genomic population structure of salmon lice within an aquaculture facility located in northern Norway through time. The results of the present study, based on whole genome sequencing, and analyses of 66,769 SNPs, revealed that a production of Atlantic salmon can be viewed as a continuum of genomic differentiation, where salmon lice colonize the hosts at the onset of production to developing weak, but significant, population structure among net pens and through time. The application of the random forest machine learning identified 107 SNPs and 260 SNPs discriminatory for genomic differences among net pens and timepoints, respectively. These two sets of SNPs increased significant differentiation among net pens, and significantly supported the development of genetic population differentiation over time of production. Overall, these findings show that salmon lice within aquaculture net pens evolve into genetically differentiated populations during production time.

Næringsdyroverførte parasitter er viktige i undersøkelsen av vertens diett og habitat over tid. Dibothriocephalus ditremus (fiskandmark) og D. dendriticus (måsemark) er en av de mest alvorlige parasitter hos fisk i arktiske innsjøer da de kan påføre fiskeverten store konsekvenser og i verste fall død. I Takvatn var disse en av årsakene til at det ble iverksatt et uttynningsfiske av røye på 1980-tallet. Uttynningen har gitt meget god kunnskap om røyepopulasjonen, mens innsjøens fiskepredator, ørret, har derimot ikke vært like godt studert. I denne studien vil jeg undersøke infeksjonen av D ditremus og D. dendriticus hos fiskeverten ørret i Takvatn. Totalt 823 ørret ble undersøkt for å finne forekomsten av overnevnte parasitter. Studien tar utgangspunkt i fiskeuttak foretatt i perioden 2001 til 2020. I studien ble det funnet en økt prevalens og abundans av begge Dibothriocephalus-artene med alder hos ørret. Dette kommer av at Dibothriocephalus spp. kan leve lenge i sin fiskevert og vil kunne akkumuleres over tid. Infeksjonen av Dibothriocephalus-artene var høyere hos stingsildspisere enn de med annet næringsvalg. En forklaring på dette kan være at plerocercoider fra stingsild kan re-etableres i ørret og at stingsild kan ha høye infeksjoner av Dibothriocephalus-artene, og spesielt D. ditremus. Hos de største ørretene virket ikke stingsildspising til å være en avgjørende faktor for høyere infeksjon. Dette kommer trolig av at stor ørret er blitt piscivore og vil kunne infiseres av røye også. Resultatet om en klar økning i abundans av Dibothriocephalus-artene hos ørret > 250 mm støtter den øvrige forklaringen ved at det trolig skjer et diettskifte hvor ørret blir piscivore i større grad. Det ble funnet en relativt stabil prevalens av begge Dibothriocephalus-artene hos ørret gjennom studieperioden. Dette kan skyldes at infeksjonspresset i innsjøen har vært stabil, og at stor ørret hindrer parasittene i å fullføre sin livssyklus fordi den blir for stor for sluttverten, fugl, å fange. I studien ble det funnet en signifikant økning i abundans og intensitet av D. dendriticus, noe som kan komme av at ørret har beitet mer på fisk, og spesielt på stingsild, da tettheten av denne kan ha økt de senere årene. Studien har gitt ny kunnskap om infeksjonen av Dibothriocephalus-artene hos ørret, noe som gir en bedre forståelse av parasitt-vert forholdet og populasjonsdynamikken i Takvatnet

CMS hos voksen laks i sjø skyldes piscint myokardittvirus (PMCV). På grunn av utbrudd rett før slakt, kan sykdommen gi store økonomiske problem. Ved forsøk med PMCV i laks, er viruset påvist flere ganger, men ved bruk av parr er det derimot ikke så mye data. Med tanke på smittemodeller ville det å kunne bruke parr i stedet for smolt, redusere vannmengde, tid og karplass. Det er derfor i samarbeid med VESO Vikan ønskelig å påvise PMCV i lakseparr, og dermed om mulig utvikle en smittemodell med PMCV i parr. I denne oppgaven ble det utført to delforsøk med kohabitantsmitte, hvor PMCV ble brukt som smitteagens. I det ene delforsøket ble det brukt 164 parr, mens i det andre ble det brukt 164 smolt. Det ble tatt vannprøver, blodprøver og uttak av organer til histologi og PCR, men det var kun histologi og PCR som ble brukt som analysemetoder. Prøveuttak ble foretatt hver uke i minst 12 uker etter smitte. En kohabitant fra smoltforsøket døde, uten påvisning av patologi. Adferden var normal, og det ble ikke notert ytre eller indre patologiske symptomer. Ved histologi ble det funnet fokale områder med betennelsesceller i atriet tidligst ved 6 uker etter smitte (wpc) hos parr shedder, og ved 8 wpc hos parr kohabitant. Hos smolt ble det funnet tidligst ved 6 wpc hos shedder, og ved 7 wpc hos kohabitant. Scoren varierte fra 0,5 – 2. Hos milt ble det ikke funnet pseudolobulering, men en del blødninger/stuvninger som ikke tydet på patologi. Det ble ikke funnet nekrose i lever, men vakuoler og fargeforandringer av hepatocytter rundt blodkar, dette ble heller ikke ansett som patologi. qPCR detekterte PMCV ved 7 wpc, 9 wpc (kun shedder) og 12 wpc hos parr, og ved 9 og 12 wpc hos smolt shedder. Det ble ikke detektert virus hos smolt kohabitant. Ct-verdiene og antall infiserte individ økte med antall uker etter smitte. Shedderne hadde lavest Ct-verdi. Av shedderne og kohabitantene var det parr som hadde flest infiserte individer. Noen individer hadde både histopatologiske tegn og påvist PMCV ved qPCR, mens noen hadde bare en av påvisningene. Etter forsøk med smittemodellen for smolt og analysemetodene histologi og qPCR, ble det påvist PMCV i lakseparr ved bruk av kohabitant smittemodell.

Norge er i verdenstoppen når det kommer til produksjon av oppdrettslaks der det avsettes betydelige mengder med ressurser til produksjon av rogn. Stamfisk er utvalgte individer som verdsettes på bakgrunn av fiskens egenskaper. For en eggprodusent kan det være ønskelig å kombinere kjønnsceller fra spesifikke individer på bakgrunn av deres kombinasjonspotensial. Dette kan gjennomføres hvis stamfisk er tilstrekkelig klar for gyting, ved samme tidspunkt. Egg- og spermceller fra stamfisk holder imidlertidig god kvalitet i en forholdsvis kort periode. Langtidslagring (dager) av ubefruktede egg vil kunne gi oppdretter en mulighet til å utvide perioden for å kunne kombinere gameter fra individer med ønskende egenskaper. Samtidig er det slik at ulike sykdomsagens kan overføres fra stamfisk til avkom via ovarievæske. Fjerning av ovarievæske, samtidig som egg kan lagres fram til at sykdomsstatus er avklart vil kunne hindre at slik smitte spres til andre deler av produksjonen. Hvordan sammensetning av ulike vaske- og lagringsmedier påvirker eggkvalitet over tid er derfor viktig å få undersøkt. I dette forsøket ble egg fra atlantisk laks (Salmo salar L.) behandlet med fire forskjellige medier (1; Ovarievæske, 2; 0,9 % NaCl løsning, 3; Cortland løsning og 4; Cortland løsning uten kalsium) og lagret ved fire forskjellige lagringstider (0, 24, 48 og 96 timer). Formålet med oppgaven var å se på hvordan mediesammensetning og lagring over tid ville påvirke eggkvalitet. Eggkvalitet ble målt som overlevelse til 120 døgngrader og til øyerognstadiet. En viktig del av oppgaven var å undersøke om eggkvalitet kunne relateres til uttrykk av maternale gener. Sammenheng mellom maternalt genuttrykk (mRNA i egg) og eggkvalitet ble undersøkt for fem ulike gener (IGF-2, IGF-3, Npm2, Zar1l og Cycklin B1a). Resultatene viste at ovarievæske gir det klart beste miljøet og ivaretar god eggkvalitet over tid (70 % overlevelse etter 96 timer lagring mot 83 % ved 0 timer). Alle medier hadde en relativ høy overlevelse (Ovarievæske; 83 %, NaCl; 64 %, Cortland; 86 % og Cortland uten kalsium; 66%), men der kvalitet gikk klart ned med økende lagringstid (24, 48 og 96 timer). Effekten av lagringstid var spesielt uttalt i egg lagret i NaCl- og Cortland løsning uten kalsium der lagring i 96 timer resultert lav (2% og 16%) overlevelse. Uttrykk av maternale gener viste ingen klar relasjon til eggkvalitet. Lagring i NaCl løsningen gav gjennomgående det høyeste uttrykket for de fleste genene som ble undersøkt. Samtidig gav lagring i NaCl den klart dårligste eggkvaliteten. Om det finnes en molekylær mekanisme som kan forklare et eventuelt inverst forhold mellom maternalt genuttrykk og eggkvalitet er uklart.

In the Spring of 2019, a harmful algal bloom (HAB) of Chrysochromulina leadbeateri decimated 14 500 tonnes of caged salmon in the Northern Norwegian coastal regions. C. leadbeateri is a natural part of the marine microbiome along the Norwegian coast, and similar events have happened in the past. To heighten our understanding of how these HABs develops, and capacity of the causal agent as a harmful species, we’ve assessed the environmental and enumeration data of C. leadbeateri density in Northern Troms, collected by Akvaplan Niva during the 2019 HAB, in concurrence with the assessment of several microbial isolation and genomic extraction techniques. The highest cell counts of C. leadbeateri existed in Balsfjorden, where, at most, an estimated ∼49 million cells/L resided at 3 m below the surface. Further, we found a temporal correspondence between an increase in C. leadbeateri cell counts and increased salmon mortality at a locality in Kattfjorden. Generally, there was a higher density of C. leadbeateri at 3, compared with 10 m. This discrepancy could plausibly be attributed to divergent water densities between the two measurement depths. The algal isolation and genomic extraction attempts proved largely unsuccessful. Thus, we provide a series of corrections to the techniques used, to ensure that future attempts may be more efficacious.

Huden og hornhinnen utgjør fiskens forsvarsbarrierer mot ytre påkjenninger. Begge har mobile celler kalt keratocytter. Dette er en av de mest bevegelige cellene som er kjent. Cellene gjenoppretter raskt barrieren hvis vevet skades ved å vandre ut fra sårkantene mot midten av såret. Sårhelingen effektiviseres ved at cellene bedriver fagocyttisk aktivitet av fremmedlegemer. Siden cellene er meget viktig i sårheling og som barriere overfor patogener og fremmedlegemer var ønsket å studere disse nærmere for å se hvordan cellene håndterte plastpartikler (polystyren i mikro- og nanostørrelse). Videre ble det observert interessante trekk med cellene, som kunne være mitokondrieutveksling, cellefusjonering og tunneldannelse. Dette ble undersøkt ved bruk av avanserte konfokalmikroskop av typen «GE Delta Vision Elite» og «NanoLive 3D Cell Explorer». Skjell og hornhinne ble høstet fra 22 stk. atlantisk laks (salmo salar L.). Fra prøvene vandret keratocyttlignende celler som var morfologisk ganske like, men hornhinnecellene varierte mer i størrelse. Cellene så ut som speilegg med en ellipseformet cellekropp som mobilitetsorganet lamellipodium strakk seg over 180° rundt i en kanofasong. Cellene kunne være sammenkoblet med celletunneler kalt «tunneling nanotube» (TNT). Den lengste TNT hos hudcellene ble målt til 381 μm (rundt 9,5 cellelengder) og 92 μm hos hornhinnecellene. Elleve ulike fluorescensfarger for visualisering av cellekomponenter ble testet på hudcellene. Tre farger fungerte tilfredsstillende; «MitoTracker Green» (MTG), «MitoTracker Orange» (MTO) og «LysoTracker Red» (LTR). Av disse ble MTG og LTR testet på hornhinnecellene, som så ut til å reagere på samme måte. Ved eksponering for polystyrenpartikler på henholdsvis 503 nm og 955 nm ble cellene farget med LTR. Målet var å se etter opptak av plastpartikler og dens interaksjon med lysosomer, som er kjent for å bryte ned fremmedlegemer. Dette kunne ikke verifiseres. Ut fra observasjoner kan det antas at celler fra både hornhinne og hud fusjonerte. Det ble også vist at hudcellene utveksler mitokondrier. Mitokondrie inne i TNT ble observert, men selve overføringen ble ikke observert.

Vi undersøkte effektene av en 30 sekunders behandling ved 34 °C på Atlantisk laks (Salmo salar L.) under kontrollerte omstendigheter i et laboratorium. Disse effektene ble så sammenliknet med en Thermolicer-behandling fra felt. Effektene som ble undersøkt var: makroskopiske velferdsindikatorer, histologiske endringer og endringer i genuttrykket til laksen før/etter og på tvers av behandlinger. Vi tok ut prøver av gjelle, thymus, nesehule, pseudobranch, hud m/muskel, øye og nyre. Det var ingen signifikante forskjeller i histologiske endringer, utenom i gjelle, i noen av gruppene. Det var en signifikant forskjell i velferdsindikatoren skjelltap før/etter Thermolicer-behandling. Det var ingen signifikante forskjeller i genuttrykk, de forskjellene som fantes ble diskutert.

I dette prosjektet har vi undersøkt om immunstimulantene kitosan, poly I:C, astragalus rotekstrakt, hyaluronsyre og imiquimod kunne ha effekt på transkripsjonen av en ni gener involvert i metabolisme. Nyklekkede plommesekklarver fra atlantisk laks (Salmo salar) ble delt inn i 6 grupper og badbehandlet en gang i 60 minutter i immunstimulantene. Seks plommesekklarver fra hver gruppe ble samplet for qPCR-analyse på dag 1, 2, 4, 9, 16, 32 og 45 etter badbehandling. Plommesekk og haleparti ble kuttet bort før mRNA-ekstraksjon. Fra RNAet ble det lagd cDNA som ble brukt i qPCR-analysene. Plommesekklarver badbehandlet med kitosan døde innen en time etter badbehandling. Badbehandling med poly I:C, astragalus og imiquimod induserte genreguleringer på samtlige av de undersøkte metabolismegenene, noe som indikerte at disse hadde effekt på metabolismen til plommesekklarver. Badbehandling med hyaluronsyre gav for usikre resultater til å trekke konklusjon om effekt på metabolismen til plommesekklarver.

Eggkvalitet er definert som evnen et egg har til å bli befruktet og utvikles til et normalt embryo. Dårlig eggkvalitet kan føre til problemer med aktivering/befruktning eller senere stoppe embryonalutviklingen. Eggkvalitet baseres i hovedsak på egenskaper fra moren (maternale faktorer), men ytre faktorer kan påvirke eggkvaliteten. I kommersiell stamfiskproduksjon av Atlantisk laks (Salmo salar L.) blir ovarievæsken vasket bort før befruktning pga. at den kan smittsomme agens som kan bli med en spermie inn i egget under befruktning. I dette forsøket ble ubefruktede egg fra Atlantisk laks lagret i ulike medier; ovarievæske, NaCl, Cortland-løsning og Cortland-løsning uten Ca2+. Oppgavens formål var å se hvordan sammensetning av ioner i medier påvirket embryonalutviklingen (eggkvalitet) etter lagring av ubefruktede egg. Ubefruktede egg ble lagret i de overnevnte mediene i 0, 24, 48 og 96 timer før de ble befruktet. For å se effekten av selve vaskeprosessen ble egg ved 0 timer lagring vasket i de ulike ioneløsningene. Indikatorer på eggkvalitet som ble undersøkt var svellegrad, befruktningsrate, celledeling, og overlevelse ved gastrulasjon og øyerognstadiet. Endring som følge av lagringstid i osmolalitet, pH og kalsiumkonsentrasjon ble også studert i de ulike lagringsmediene. Ubefruktede egg lagret i ovarievæske hadde høy overlevelse ved øyerognstadiet ved lagringstidene 0-48 timer (78-87%), og noe litt lavere ved 96 timer (64%). Denne høye overlevelsen var som forventet. Lagring av egg i ovarievæske hadde ingen negative påvirker på eggkvalitet. Ubefruktede egg vasket i NaCl og Cortland-løsning uten Ca2+ hadde lavere overlevelse ved øyerognstadiet (63%) sammenlignet med egg vasket i Cortland-løsning (82%). Ubefruktede egg lagret Cortland-løsning fram til 48 timer hadde høy (68-86%) overlevelse ved øyerognstadiet, og ingen negative påvirkninger på embryonalutvikling. Etter 96 timer lagring av egg i Cortland-løsning var overlevelsen ved øyerognstadiet betydelig lavere. Lagring av ubefruktede egg i NaCl i 24 timer ga nesten ingen overlevende egg ved øyerognstadiet. Lav pH og osmolalitet, og mangelen på ioner har hatt tydelig effekt på befruktningsevnen og embryonalutviklingen for egg lagret i NaCl i 24, 48 og 96 timer. Egg lagret i Cortland-løsning uten Ca2+ hadde en jevn nedgang i overlevelse ved øyerognstadiet utover lagringstidene. Fraværet av kalsium hadde påvirkning på embryonalutviklingen for egg lagret i 24, 48 og 96 timer i Cortland-løsning uten Ca2+.

I denne studien ble de fire komponentsamfunnene av tarmparasitter hos ørret og røye sammenlignet i de nærliggende innsjøene Takvatn og Fjellfroskvatn i Troms. I førstnevnte innsjø finnes i tillegg stingsild. Totalt 100 ørret og 90 røye ble undersøkt på ettersommeren 2018. Alle tarmparasittene ble registrert hos ørret og røye i begge innsjøene, unntatt ørretmark og røyemark som infiserte henholdsvis kun ørret og røye. Tarmparasittene ble kategorisert som hoppekrepsoverført (ørretmark, røyemark, Proteocephalus sp. og Dibothriocephalus spp.) eller bunndyroverført (marflomark og tarmikter). Det var forventet å finne forskjeller i komponentsamfunn hos ørret og røye grunnet ulik habitat- og beiteadferd hos fiskeartene. Videre var det forventet å finne likheter i komponentsamfunn mellom røyepopulasjonene siden de opprinnelig stammer fra samme populasjon og utnytter trolig de samme næringsressursene. Parasittsamfunnet hos røye hadde høyere diversitet enn hos ørret i begge innsjøene. Dette kan forklares med at røye er mer generalist og dermed har en bredere næringsnisje enn ørreten. Røyemark hadde den høyeste prevalensen hos røye i begge innsjøene, mens tarmikter hadde den høyeste prevalensen hos ørret i begge innsjøene. Dette kan være et resultat av beite på hoppekreps hos røye og beite på bunndyr hos ørret. Renkonens indeks viser en stor overlapp mellom parasittsamfunnene hos de to ørretpopulasjonene og en liten overlapp mellom røyepopulasjonene. En liten overlapp i parasittsamfunn hos røye kan være et resultat av ujevn fordeling av parasittartene i parasittsamfunnene. Dette kan være en følge av individuell næringsspesialisering hos røye eller abiotiske/biotiske forskjeller mellom innsjøene. Ørretmark og Dibothriocephalus spp. viste en større prevalens og abundans hos ørreten i Takvatn enn i Fjellfroskvatn. Disse parasittene kan reetableres hos ørreten som en følge av beite på fisk, da gjerne stingsild. Resultatene viste en liten grad til reetablering av disse parasittene hos ørret i Takvatn. Intraspesifikk konkurranse som oppstår i fisketarmen kan gi redusert vekst og nedsatt reproduksjon hos parasittene. Resultatene viste at gjennomsnittsvekten til røyemark avtok med økende intensitet av røyemark og som kan være en følge av intraspesifikk konkurranse.

Lumpfish (Cylcopterus lumpus) is increasingly used as cleaner fish in intensive farming of Atlantic salmon (Salmo salar) with an aim to control the infection of lice on the salmon. The lumpfish is itself exposed to a number of infections, both bacterial, viral, parasitic and fungal, and there is still a lack of knowledge regarding these infections and their impact on the fish. In order to assess the importance of infections on a host and in different types of tissues, a detailed knowledge of the normal histology is crucial. One of the aims of the FHF-project “Parasitic infection in Lumpfish: Nucleospora cyclopteri” (project number 901320) is to describe the normal histology of the lumpfish, and this MSc thesis contributes to that aim. 50 clinically healthy Lumpfish sized 48h). The organ samples were embedded in paraffine wax and sectioned in 5m sizes. Histological sections were made, and stained in Hematoxylin (Gill, Mayer and a variant of Harris) and Eosin (Y and G). In addition, different special dyes were used. AB-PAS staining was used in samples from skin, gills and pyloric caeca, MGG in head kidney and spleen and VG in skin and pancreatic tissue. Histological sections were analyzed using light microscope directly or on the computer after digital scanning of the stained sections. Results from the HE stains shows differences in lumpsucker skin, gills, heart ventricle and liver compared to Atlantic salmon. Lumpfish skin, liver and atrium shares similarities with cod (Gadus morhua). Results from special staining with AB-PAS shows numerous gill and pyloric caeca mucus cells, and some mucus cells in the lumpsucker skin. Vacuoles in lumpsucker skin did not take up any staining with AB-PAS. More research on the normal histology of organs in the lumpsucker is needed, but this thesis gives an introduction to the normal histology of several of the commonly used diagnostic organs.

[Embargodato endret etter ønske fra forfatter. 10.9.20 LL] Det har i flere år blitt rapportert om økte forekomster av bendelorm i oppdrettslaks i Norge. Det ble derfor etablert et prosjekt i 2017, FHF 901449. Denne studien utgjorde en del av dette prosjektet. Det har blitt satt spørsmål om tidspunkt for utsett av smolt og om størrelsen på fisken påvirker infestasjonsdynamikken til parasitten. Hensikten med denne studien var dermed å undersøke infestasjonen gjennom starten av produksjonssyklusene av laks ved ulike årstider, og se på hvordan infestasjonen utviklet seg over tid. Fire fiskegruppene var fordelt på to lokaliteter. Den ene lokaliteten hadde to fiskegrupper satt ut i sjøen høsten 2017, mens den andre hadde to fiskegrupper satt ut i sjøen våren 2018. Lokalitetene var lokalisert i Hordaland, og ble fulgt i perioden oktober 2017 – November 2018. Det ble undersøkt totalt 600 fisk fordelt på fiskegruppene. Den marine varianten, Eubothrium sp. følger en sesongmessig syklus, der det tilsynelatende observeres en høyere infestasjon om sommer og utover høsten/tidlig vinter, og en lavere infestasjon om våren. Dette hadde trolig sammenheng med tetthet av infiserte mellomverter gjennom året. Det ble ikke observert kontinuerlig infestasjon gjennom studien. Andelen unge stadier avtok, kombinert med et økt innsalg av store individer utover studieperioden. Det ble ikke påvist infestasjon i perioden mars- mai i vårutsettene. Fisk satt ut på våren hadde en klart mere begrenset infestasjon enn fisk satt ut på høsten. Fisk satt ut på høsten hadde høy prevalens og gjennomsnittlig abundans av parasitten allerede en måned etter utsett i sjø, og nådde en maksimal prevalens på rundt 100% løpet av studieperioden. Vårutsett nådde en prevalens på maks 60% og 87% gjennom studieperioden, men en betydelig lavere gjennomsnittlig abundans. Ved en høy infestasjon ble det observert et fall i gjennomsnittlig abundans, der intraspesifikk konkurranse trolig var årsaken, i tillegg til lav rekruttering av nye parasitter. Vekst og utvikling av Eubothrium sp. i fisken var relatert til antall parasitter i infrapopulasjonen. Det ble observert at de mest infiserte fiskene hadde primært unge stadier, men etterhvert som de ble færre og større økte likevel totalvekten av parasittene. Det ble påvist en negativ korrelasjon mellom laksen størrelse og bendelormens abundans i kraftige infestasjoner. Trolig var årsaken at små fisk er mer tilbøyelig til å beite mer på copepoder som var infisert med bendelormlarver. Korrelasjonen forsvant ettersom fisken vokste, som kunne relateres til at større fisk beiter mindre på copepoder, i tillegg til redusert rekruttering av nye parasitter gjennom året. Basert på resultatene i denne studien, synes det med hensyn til Eubothrium sp. infestasjon, gunstig å sette ut smolt om våren, da det kan føre til mere begrenset bendelorminfestasjoner.

Målsetningen med dette forsøket var å studere smoltutvikling, samt immunstatus og mottakelighet for sykdom etter utsett i sjø hos Atlantisk laks (Salmo salar L.) smoltifisert ved endring i fotoperiode eller ved bruk av fôr. Før og etter endt smoltstimulering ble fisk injisert med en multikomponent vaksine for å kvantifisere immunrespons i relasjon til smoltutvikling. Etter overføring til sjøvann ble begge gruppene smittet med infeksiøs lakseanemi (ILA) for å kvantifisere mottakelighet av sykdom i forhold til smoltkvalitet. Gjelle Na+/K+-ATPase aktivitet, samt osmolalitet- og kloridverdier i plasma etter sjøvannstester viste at begge gruppene oppnådde en god sjøvannstoleranse før overføring til sjøvann. I ferskvannsfasen vokste som ventet den fôrinduserte smolten som ble holdt kontinuerlig på lang dag best, mens den tradisjonelle, lysstyrte smolten presterte bedre i sjøvannsfasen. Analyser av uttrykk av immungener etter vaksinering ved real-time qPCR viste at den fôrinduserte smolten tenderte til en bedre immunkompetanse enn tradisjonell smolt underveis i smoltifiseringen. Dødelighetstallene etter smitte viste at tradisjonell smolt trolig har en marginalt større mottakelighet for ILA enn fôrindusert smolt. Resultatene indikerer at fôrindusert smoltifisering er et godt alternativ til tradisjonell lysstyring i norsk lakseoppdrett.

Pankreassykdom (PD) er en sykdom som forårsakes av salmonid alphavirus (SAV) og anses som en av de mest utbredte virussykdommene i dagens oppdrettsnæring. I tillegg til at sykdommen fører til store tap for næringa, utgjør sykdommen også et stort problem sett fra et fiskevelferds-perspektiv. Siden det ikke finnes behandling mot sykdommen ligger fokuset på forebyggende tiltak. Det er utviklet flere vaksiner med formål å redusere dødelighet og antall utbrudd knyttet til PD, men med suboptimale resultater. Virusvaksiner settes vanligvis intraperitonalt (ip) i bukhulen hos fisken og en viktig del av beskyttelsen er at de induserer nøytraliserende antistoffer i serum. Nøytraliserende antistoffer skilles ut av antistoff-sekreterende B-celler (ASC). Distribusjonen av og responsen til ASC før, under og etter en virusinfeksjon i bukhule og systemiske organer er lite studert i fisk. DNA-vaksiner med plasmider som koder for virusproteiner eller IFN-I er vist å stimulere antivirale prosesser i fisk, men mekanismene bak og virkemåte for disse responsene er også lite studert i fisk, både i eksperimentelle studier av levende fisk og i cellekultur. På bakgrunn av dette ble laks ip injisert med inaktivert eller levende SAV og B-celle responsene i bukhule og systemiske organer ble kartlagt over 10 uker etter injeksjon ved hjelp av et B-celle ELISpot assay for å måle antallet IgM-produserende celler. RT-qPCR ble brukt til å verifisere SAV-infeksjonen ved deteksjon av virustranskripter (nsP1) i hjerte, mens ELISA ble brukt til å måle SAV E2-spesifikk antistoffrespons i serum. I et separat forsøk ble naive leukocytter fra laks stimulert med ulike type I IFNer for å studere hvordan IFN-I påvirker antall IgM ASC i cellekultur. Allerede 3 uker etter smitte hadde frekvensen av IgM ASC økt betydelig i bukhule, men også i milt og baknyre, sammenlignet med kontrollfisken. Forhøyet frekvens IgM ASC i baknyre ble videre observert 6 uker etter smitte. Generelt var økningen av IgM ASC moderat i alle vev etter ip injeksjon av inaktivert SAV, men i baknyre var antallet forhøyet, sammenlignet med kontrollgruppen, allerede 3 uker etter injeksjon. Lave nivåer av virustranskripter ble observert 3 uker etter smitte og høyeste nivå ble målt i uke 6. Nedgangen i virustranskripter etter uke 6 knyttes til en signifikant økt SAV E2-spesifikk antistoffrespons 6 uker etter smitte. Det separate forsøket viste at IFNa og IFNb stimulering av leukocytter i kultur ikke øker antallet IgM ASC, men at IFNc gir en beskjeden effekt ved langtids inkubering av cellene. Disse funnene har bidratt til å belyse B-celle responser hos naiv og smittet laks i sjøvann, og effekten av IFN-I på naive lakseleukocytter i cellekultur, og er viktige oppdagelser for videre forskning.

Nye metoder for å smoltifisere lakseunger er stadig vanligere. Den klassiske metoden er å regulere daglengde for å simulere en naturlig sesongrytme, mens det i dag blir vanligere å tilføre salt i ferskvann- og/eller fôr for å stimulere smoltifisering. Samtidig vil aktører ha settefiskperioden lengere slik at smolten er større ved utsett. Bruk av disse metodene anses å bidra til raskere smoltifisering, redusert vekttap og en smolt som er mer robust og mindre mottakelig for sykdom ved utsett. Dette tenkes å redusere svinn i sjø. Det er i dag publisert litteratur med ulike konklusjoner om hvorvidt behandling med saltberiket fôr bidrar til fullstendig smoltifisering, og god nok sjøvannstoleranse for et liv i saltvann. I dette forsøket ble to størrelsesgrupper av Atlantisk lakseparr (Salmo salar L.) med startvekt 40 g og 130 g behandlet med daglengdemanipulasjon og saltberiket fôr for å stimulere smoltifisering, og deretter overført til sjøvann. I ferskvannsfasen var målet å studere utviklingen av sjøvannstoleranse basert på blodprøver fra sjøvannstester og genuttrykk/aktivitet av saltvannspumper i gjelle hos følgende behandlingsgrupper: kontinuerlig lys (LL) og LL avbrutt av et seks ukers opphold på kort daglengde (SP, 18:6t mørke/lys) på kontrollfôr, og samme behandlingsgrupper på saltberiket fôr (LL +salt og SP +salt). Ferskvannsperioden varte i fire måneder (februar – mai) med prøveuttak i februar (T1), mars (T2) og mai (T3). Blod fra fisk på sjøvanntester (24 t) og prøveuttak av gjellevev utgjorde det biologiske materialet for laboratorieanalyser og statistiske beregninger ble basert på resultater fra dette. Resultatene fra enzymaktiviteten, Na+/K+-ATPase (NKA), var noe uforventet ettersom det ikke var noen klar forskjell mellom behandlingsgruppene og heller ingen markant økning i løpet av ferskvannsfasen. Utviklingen av NKA genuttrykk viste at α1a isoformen (ferskvannsformen) ble redusert hos alle behandlingsgruppene, mens α1b (saltvannsformen) ble forsterket hos begge saltgruppene hos små fisk, samtidig som det ikke var klare forskjeller og endringer hos stor fisk. Plasma osmolalitet etter sjøvannstestene minket gradvis i løpet av ferskvannsperioden hos alle behandlingsgruppene, mens kloridkonsentrasjonene ikke endret seg vesentlig. Både osmolalitet- og kloridverdier var imidlertid innenfor det som forventes hos sjøvannsadaptert laks. På tross av få forskjeller mellom behandlingsgruppene i løpet av ferskvannsfasen, var det markante effekter av behandlingene på sjøvannsprestasjon. Gruppene som ikke ble gitt smoltstimulerende behandling i ferskvann (LL kontroll) hadde lav tilvekst mens SP kontroll (standard smoltifiseringsbehandling) hadde 3 til 6 ganger høyere tilvekst enn LL kontroll den første måneden i ferskvann. Tilveksten i LL +salt kom noenlunde likt ut med hensyn til tilvekst som SP kontrollgruppene, mens gruppene hvor lys- og saltbehandling ble kombinert kom best ut, særlig hos stor fisk. Konklusjonene er at saltberiket fôr gir en god tilvenning til et liv i saltvann mht. hypoosmoregulering, men at lysbehandling stimulerer egenskaper som forbedrer fiskens prestasjon i sjøen. Dette studiet kan ikke gi svar på hvilke, men hormonelle og metabolske tilpasninger kan være mulige kandidater.

Det er en økende bekymring for at antibiotikaene vi har tilgjengelige i dag ikke vil være effektive mot humane patogener grunnet resistensutvikling. WHO har uttalt at en pre-antibiotika tid der vanlige infeksjoner og mindre skader kan drepe, er en reell virkelighet i det 21. århundre. Havet dekker over 70% av jordoverflaten, og det er estimert at mellom 50 og 80% av alle arter lever i havet. Organismer som lever i havet er konstant utsatt for høye konsentrasjoner av bakterier og virus, slik at organismer som lever der trenger et velfungerende immunsystem. Pigghuder er for det meste bentiske organismer, som ikke viser den samme adaptive immunresponsen som vertebrater. De derfor avhengig av å produsere antimikrobielle forbindelser for å forhindre angrep fra patogener, og er derfor et interessant mål for å finne nye antitiotika

Fisk og annen sjømat inneholder sunt fett, viktige vitaminer og mineraler, og er i tillegg en god kilde til protein. Hovedgrunnen til anbefalinger om å spise fisk og annen sjømat er det naturlig høye innholdet av de langkjedede omega-3 fettsyrene eikosapentaensyre (EPA) og dokosaheksensyre (DHA). Norsk oppdrettsnæring har siden oppstarten på 1970-tallet vokst til å bli en av landets viktigste næringer, og oppdrett av atlantisk laks (Salmo salar) har vært den største bidragsyteren til denne suksessen. Tradisjonelt har produksjonen av fôr til atlantisk laks vært basert på marine råvarer som fiskemel og fiskeolje. En begrenset tilgjengelighet av disse råvarene har ført at en overgang til alternative lipid- og proteinkilder har vært nødvendig, noe som har ført til at deler av de marine råstoffene har blitt erstattet med ulike planteproteiner og planteoljer. Formålet med dette studiet var å sammenligne den biokjemiske sammensetningen i filet av oppdrettet laks med filet av villaks, med hovedvekt på fettinnhold og fettsyresammensetning. I tillegg skulle også proteininnholdet og innholdet av essensielle aminosyrer sammenlignes. Det skulle også undersøkes om økt mengde vegetabilske lipid- og proteinkilder i fiskefôret har ført til en endring av fettsyresammensetningen i filet av atlantisk laks sammenlignet med et tidligere studium som var gjort på laks slaktet i 2010. Resultatene viste at filet av oppdrettet atlantisk laks hadde ett fettinnhold på 19,5%, som var nesten det dobbelte sammenlignet med vill havlaks. Konsentrasjonen av de langkjedede omega-3 fettsyrene var høyere i villaks sammenlignet med oppdrettslaks. Imidlertid var den totale mengden av disse fettsyrene likt i filetene på grunn av forskjellene i totalt fettinnholdet. Forholdet mellom omega-6 og omega-3 fettsyrer i oppdrett- og villaks var henholdsvis 0.7 og 0.04. Fettsyresammensetningen i oppdrettet laks og fôret til laksen i 2017 var endret sammenlignet med i 2010. De endringene som ble observert i fôret reflekterte fettsyresammensetningen i fiskefileten. Man får i seg mer langkjedede omega-3 fettsyrer og mer omega-6 ved ett fiskemåltid i dag, sammenlignet med i 2010, og n-6/n-3 ratioen var økt med nesten 60%. Men ratioen var fremdeles under den anbefalte verdien på 5. Proteininnholdet var litt høyere i villaks enn i oppdrettslaksen med henholdsvis 17,3% og 15,4% proteininnhold.

Pankreassykdom utgjør et stort problem i norsk oppdrettsnæring, og forårsaker store økonomiske tap samt redusert fiskevelferd. Selv ved vaksinering med dagens kommersielle vaksiner er utbruddene fortsatt økende som antyder at dette er en fremtidig trussel og det kreves ytterligere tiltak for å få bukt med problemet. Inaktiverte helvirusvaksiner benyttet i dagens næring, har vist seg effektiv mot ekstracellulære patogener, men fremstår mindre effektiv mot intracellulære patogener. Imidlertid har nye vaksinestrategier vist seg lovende, hvor blant annet DNA-vaksiner har vist seg meget effektive mot enkelte virussykdommer. Det er antatt at DNA vaksinasjon induserer både cellulær og humoral immunrespons – som er viktig for beskyttelse mot virus. For å styrke den cellulære immun responsen kan molekylære adjuvanser benyttes. Transkripsjonsfaktorene T-bet, GATA-3 og Eomes har vist seg å være sentrale ved T-celle differensiering til ulike T-effektor celler, og preliminære resultater har vist at plasmider kodende for disse er kandidater for å øke vaksinerespons mot patogener. I dette studiet ble det til sammen testet 6 ulike vaksiner mot salmonid alphavirus (SAV-3), vaksinene var inaktiverte helvirusvaksiner, vaksiner med plasmid molekylære adjuvanser og DNA vaksine. De molekylære adjuvansene bestod av plasmid kodende for transkripsjonsfaktorene T-bet, GATA-3 og Eomes. Disse ble gitt i kombinasjon med inaktivert helvirusvaksine. Fisken injisert med vaksinene ble undersøkt i et immuniseringsforsøk og smitteforsøk, hvor fokus var tilvekst, antistoffrespons og histopatologiske endringer. Disse tre ble også benyttet som indikator på beskyttelse. Resultatene fra immuniseringsforsøket antydet at vaksinene ikke påvirket tilvekst etter immunisering, og noen vaksiner induserte god antistoff respons – spesielt vaksine basert på høy dose av inaktiverte helcellevirus. Tas alle indikatorene med, viste DNA vaksinen, og noen vaksiner med molekylære adjuvanser (Eomes og GATA-3) også god effekt.

Reactive oxygen species (ROS) production in macrophage-like cells is induced as an antimicrobial defence against invading pathogens. In this present study, we have explored how different stimuli and metabolic inhibitors affects the level of respiratory burst in Atlantic salmon (Salmo salar L.) head kidney macrophage-like cells. Cells stimulated in vitro by bacterial lipopolysaccharide (LPS) and ß-glucan showed increased production of ROS compared to unstimulated cells. Both stimulation and co-stimulation by curdlan (ß-glucan) induced a higher production of ROS compared to stimulation and co-stimulation by LPS. Metabolic inhibitors (developed for mammals) co-incubated with the stimulants did not, in most cases, perturb the level of ROS generation in the salmon macrophage-like cells. The NAD+ content as well as the NAD+/NADH ratio increased in curdlan, and LPS + curdlan stimulated cells compared to control cells, which indicated increased metabolic activity in the stimulated cells. Supporting these findings, gene analysis using SYBR green real-time quantitative PCR showed that the genes Arignase-1 and IL-1ß were highly expressed in the stimulated cells.

Interferonsystemet er den viktigste mekanismen i det medfødte immunforsvaret mot virus hos vertebrater. Celler som blir infisert av virus, produserer og sekreterer proteinet interferon (IFN) som i neste omgang stimulerer produksjon av antivirale proteiner som hemmer virusreplikasjonen. Mx-protein er et av de viktigste IFN-stimulerte antivirale proteinene. I dette mastergradsarbeidet har effekten av interferon, poly I:C og virussmitte på ekspresjon av Mx-gener hos atlantisk laks (Salmo salar L.) blitt undersøkt. Tidligere ekspresjonsstudier har blitt gjort av genene SsaMx1, SsaMx2 og SsaMx3 som befinner seg på kromosom 12. I dette studiet er ekspresjon av SsaMx1,2,3 sammenlignet med SsaMx4 og SsaMx5 på kromosom 25 og SsaMx9 på kromosom 9. Disse genene er nylig oppdaget gjennom publisering av laksegenomet i NBCI GenBank. Hovedmålet for oppgaven var å undersøke om de nyoppdagete Mx-genene hos laks også er typiske IFN-induserte gener. Ekspresjon av Mx-gener ble studert ved kvantitativ revers transkriptase PCR (RT-qPCR). I første del av oppgaven ble induksjon av Mx-gener i SSP-9 celler studert etter 24 og 48 timers extracellulær stimulering med IFNa, IFNc og poly I:C , et syntetisk totrådig RNA som imiterer virusinfeksjon. Cellene ble også stimulert med poly I:C intracellulært ved transfeksjon. Alle behandlinger ga induksjon av SsaMx1,2,3, SsaMx2, SsaMx4 og SsaMx5, men ikke av SsaMx9. Ved bruk av kvantitativ RT-PCR ble det vist at ILAV-smitte av ASK-celler induserte ekspresjon av Mx-genene på kromosom 12 og 25, men ikke av SsaMx9. Effekten av IFNa og poly I:C på ekspresjon av Mx1,2,3 hos erytrocytter ble også studert . Dette viste nedregulering av Mx-genene ved inkubasjon av erytrocyttene, og at poly I:C-stimulering ikke hadde noen effekt. Stimulering med IFNa viste seg å gjenopprette ekspresjonen av Mx-genene i erytrocytter. Til sist ble det sett på effekten av intramuskulær injeksjon av IFNc-plasmid på ekspresjonen av Mx-gener i fornyre, lever og pankreas. Kvantitativ RT-PCR viste at IFNc-plasmid induserte ekspresjon av SsaMx1,2,3, SsaMx4 og SsaMx5 i fornyre, men det ble ikke observert noen signifikant oppregulering av SsaMx9. Intramuskulær injeksjon av IFNc-plasmid viste ingen store forskjeller i ekspresjon av det antatt kjernelokaliserte SsaMx2 mellom lever og pankreas. Det ble derimot observert en større økning i relativ ekspresjon av både SsaMx1,2,3 og SsaMx2 i lever enn i pankreas etter injeksjon av IFNc-plasmid. Resultater fra dette mastergradsarbeidet indikerer at SsaMx1, SsaMx2, SsaMx3, SsaMx4 og SsaMx5 er typiske IFN-induserte gener, mens SsaMx9 ikke er det. Dette kan tyde på at SsaMx9 har utviklet andre funksjoner enn antiviral aktivitet.

Oppdrett av laks (Salmo salar L.) har utviklet seg til å bli en stor og viktig næring i Norge. Videre vekst i næringen er i dag først og fremst begrenset av problematikken rundt lakselus (Lepeophtheirus salmonis K.), og det er et økt behov for nye ikke-medikamentelle metoder for avlusing av laks i sjø. Bruken av oppdrettet rognkjeks (Cyclopterus lumpus L.) som lusespiser, er en metodene som har vist seg svært lovende, og som i økende grad har blitt tatt i bruk i næringen. Høy dødelighet for rognkjeks etter utsett i sjø, forårsaket av bakteriesykdommer som fisken i utgangspunktet er vaksinert mot, indikerer at dagens vaksiner ikke gir tilstrekkelig beskyttelse. I dette forsøket ble to nye injeksjonsvaksiner for rognkjeks, fra Vaxxinova Norway AS, undersøkt i forhold til immunrespons etter intramuskulær og intraperitoneal administrasjon. Begge vaksinene inneholdt antigen fra Aeromonas salmonicida (A-lag type 5 og 6), Vibrio anguillarum O1 og Moritella viscosa. Den eneste forskjellen mellom vaksinene var adjuvanten, som var basert på enten vegetabilsk- eller mineralolje. Resultatene viste signifikant lavere vaksinerespons for den vegetabilske olje-adjuvanten, sammenlignet med den mineralolje-baserte adjuvanten. Samtidig ble det vist høy akutt gruppedødelighet etter intramuskulær vaksinering med den mineralolje-baserte vaksinen, sammenlignet med vaksinen basert på vegetabilsk olje. Våre resultater indikerte at vaksiner basert på mineralolje, vil kunne gi økt fare for vesentlig helseskade hos rognkjeks etter intramuskulær injeksjon, eller ved feilstikk i muskel. Slike helseskader ble i langt mindre grad observert ved intramuskulær vaksinering med vegetabilske olje-adjuvanter i vårt forsøk, noe som indikerer at denne typen adjuvanter kan virke mildere på rognkjeks. Resultatene for fiskegrupper med intramuskulær og intraperitoneal vaksinering, ble ikke vist signifikant forskjellige, men variasjonen mellom lav- og høyrespondere ble vist større innad i intraperitonealt vaksinerte fiskegrupper. Lavrespondere i de intramuskulært vaksinerte gruppene viste høyere respons ved ELISA, sammenlignet med lavrespondere i intraperitonealt vaksinerte grupper. Reell beskyttelse av vaksiner og injeksjonsmetoder som ble undersøkt i vårt forsøk, må testes i et senere smitteforsøk, men våre resultater indikerer at intramuskulær vaksinering kan være gunstig for total gruppebeskyttelse etter vaksinering.

I denne oppgaven blir det sett på hvordan produksjonsindusert stress i form av mekanisk sjokking og/eller transport under embryogenesen (300-400 døgngrader etter befruktning (dgr)) ville påvirke overlevelse og uttrykk av immun- og stressrelaterte gener på plommesekkstadiet (740-900 dgr) etter en immunologisk utfordring - badsmitte med Yersinia ruckeri. Utvalgte immun- og stressrelaterte gener ble undersøkt med kvantitativ RT-PCR. Undersøkte immungener var: IFNa, IFNb, IFNc, IFNγ, IL-1b, Mx, SAA, iNOS, IgT og IgM (s). De stressrelaterte genene som ble undersøkt var: HSP70a og HSP90a4. Effektene av tidligere behandling ble i tillegg undersøkt ved å registrere dødelighet og analysere global DNA-metylering i form av en prosentvis 5-metylcytosin analyse. Mekanisk sjokking under embryogenesen førte til signifikant høyere dødelighet etter senere badsmitte av larver med Y.ruckeri. Transport i 48 timer under embryogenesen viste derimot ingen effekt på dødelighet. Sjokking alene eller i kombinasjon med transport under embryogenesen gav økt global 5-metylcytosin 475 dgr etter badsmitte med Y. ruckeri. Resultater fra forsøket viser at en kombinasjon av mekanisk sjokking og transport fører til 57 % høyere global 5-metylcytosin, noe som antyder økt inhibering av genuttrykk. Kun HSP70a var signifikant høyere uttrykt sammenlignet med usmittet kontroll 120 timer etter badsmitte med Y.ruckeri.

Sammendrag Fisk blir anbefalt til humant konsum i hovedsak grunnet det høye innholdet av de langkjedede omega-3 fettsyrene eikosapentaensyre (EPA, 20:5n-3) og dokosaheksaensyre (DHA, 22:6n-3). Disse fettsyrene er utgangspunktet for biologisk aktive molekyler (fettsyrehormoner) som virker dempende på betennelsesreaksjoner (inflammasjon). Vegetabilske oljer inneholder ikke EPA og DHA, men omega-6 fettsyrer som danner lignende fettsyrehormoner. Slike har imidlertid noe mer betennelsesfremmende aktiviteter. Oppdrett av fisk har økt kraftig over hele verden, inkludert i Norge, de siste par 10 år. Siden det er begrensede mengder fiskeolje tilgjengelig har det ført til at vegetabilske oljer (rapsolje) har erstattet store deler av fiskeoljen i fôr til oppdrettsfisk. Dette gjelder også ved produksjon av laks i Norge. I denne oppgaven har målet vært å studere effekten av endret fettsyresammensetning i laksefôr, og å undersøke hvilken påvirkning dette hadde på fettsyresammensetningen i filet, blod og hjerne. I oppgaven ble laks i ferskvann fôret med 4 ulike dietter som hadde forskjellig fettsyresammensetning. Fôringsforsøket varte i 84 dager og laksen økte i vekt fra cirka 40 gram til cirka 150 gram. De 4 fôrene inneholdt 100 % rapsolje, 100 % ansjosolje, en blanding av rapsolje (60 %) og ansjosolje (40 %) eller et EPA (30 %) og DHA (20 %) konsentrat (EPAX 6000 TAG) Resultatene viste at vekst og dødelighet av laksen ikke ble påvirket selv om fiskeoljen i fôret ble fullt ut erstattet med rapsolje eller EPA/DHA konsentrat. Samtidig så man at fettsyresammensetningen i filet ble mer og mer lik sammensetningen i de enkelte fôrene ut over i fôringsperioden. Fettsyresammensetningen i blod ble derimot mindre påvirket gjennom fôringen. Spesielt var det interessant å merke at et lavt innhold av EPA og DHA i fôret (rapsolje) ikke reduserte innholdet av disse 2 i blod. Ved høyt innhold av EPA og DHA i fôret (ansjosolje og EPA/DHA-konsentrat) så man imidlertid en økning i blodet. Fra starten til avslutning av fôringsforsøket ble bare små forandringer i hjernens fettsyresammensetning observert. Spesielt kan det nevnes at DHA-innholdet var cirka 30 % ved starten av forsøket og dette forble uforandret selv når innholdet i dietten var svært lavt. Dette viser at fettsyresammensetning og særlig da nivået av DHA, er spesielt sterkt regulert i hjernen.

Exposure to stress may have a profound impact on the physiology and health of an individual later in life. During a production cycle of Atlantic salmon eggs, the eggs are subjected to different kind of handling, e.g. shocking and transport. Handling of this extent would have elicited stress responses in adult fish. Stress responses can broadly be divided into primary, secondary and tertiary response. The primary stress response consists of two pathways where one of them, the hypothalamus-pituitary-interrenal (HPI) axis, results in elevations of circulating corticosteroids. On a cellular level, heat shock proteins (HSP) play an important role as a secondary response. In embryos, cortisol, which is the main corticosteroid in teleosts, is not synthesized before around hatching. However, genes that are central in the HPI-axis and HSP genes have been detected in fish embryos at several developmental stages. Even though the HPI-axis is not fully developed a stressor may alter the gene expressions. Based on this, eight genes central in the HPI-axis (crf1, crf2, pomcA1, pomcA2, pomcB, gr1, gr2 and mr) and two HSP genes (hsp70a and hsp90a4) were examined, in Atlantic salmon embryos subjected to shocking and transport. In addition, newly hatched larvae, and larvae at start feeding subjected to a stress challenge, were analysed to map the ontogeny of the genes, and to examine any possible long-term effects of the shocking and transport. Relative gene expression of whole-animal were analysed using reverse transcriptase real time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The results showed that all genes were present in all samples examined throughout the development. The HPI-axis genes showed an increased relative expression level during development, except for gr1 and gr2 that showed a delayed increase probably due to maternal transfer. The HSP genes, however, had a low expression level at start feeding compared embryos and newly hatched larvae. The relative expression of the HPI-axis genes did not show any specific short-term or long-term differences in relative gene expression after exposure to shocking and/or transport. The HSP genes, however, showed an acute upregulation after transport, but no long-term effects. The results of this study indicates that shocking and transport are not high enough stressors to alter the expression of the HPI-axis genes. They also indicate that the HSP genes may play an important role in cellular stress response during development.

Lakseparasitten lakselus (Lepeophtheirus Salmonis) er den største utfordringen norsk oppdrettsnæring i dag står ovenfor. Lakselusproblematikken er i hovedsak knyttet til påvirkning på ville laksestammer. Samtidig utgjør hyppig avlusing og behandling et potensielt fiskevelferdsproblem i lakseoppdrett. Resistensutvikling skaper store utfordringer, med mangel på fullgode metoder for å hindre eller redusere infeksjon av lakselus på oppdrettslaks. Et viktig innsatsområde for forebygging mot - og bekjempelse av lakselus er utvikling av ikke-medikamentelle metoder. Fluidpermeabelt luseskjørt (SalGardTM) er en ikke-medikamentelt metode som har vist god lakselusreduserende effekt. Det er imidlertid ikke gjort tilstrekkelig undersøkelse av luseskjørtets påvirkning på fiskens velferd. Denne masteroppgaven har hatt som hovedmål å belyse fluidpermeabelt luseskjørt sin påvirkning på fisken og da spesielt fiskens velferd. Sammenligningen av oksygenforhold og fiskevelferd i merder med og uten fluidpermeabelt luseskjørt ble utført på en lokalitet for kommersiell marin produksjon av atlantisk laks (Salmo salar) i Vesterålen. Seks merder med atlantisk laks inngikk i forsøket, hvor tre hadde fluidpermeabelt luseskjørt og tre hadde funksjon som kontroll. Vannkarakteristikk (oksygen, temperatur og saltholdighet) ble målt gjennom hele forsøket. Et referansepunkt, som var antatt upåvirket av produksjonsanlegget, ble valgt og de samme parameterne for vannkarakteristikk ble målt her. Kartlegging av fiskevelferd ble gjennomført med metoden Salmon Welfare Index Model 1.0 og 1.1 (SWIM 1.0/1.1). Resultatene viste at fluidpermeabelt luseskjørt hadde betydelig lakselusreduserende effekt i en periode med høyt infeksjonspress av lakselus. Abundans av lakselus i bevegelig stadium ble på det meste redusert med 83% og prevalens av lakselus i bevegelig stadium ble på det meste redusert med 86%. Bruk av fluidpermeabelt luseskjørt førte til reduserte oksygenverdier innenfor luseskjørtets volum, men ikke i tilstrekkelig grad til at det hadde negativ effekt på fiskens velferd. Undersøkelse av fiskevelferd med Salmon Welfare Index Model ga ikke redusert velferdsscore, med unntak av ett enkelt tidspunkt gjennom forsøksperioden.

Dødelighet hos smolt etter sjøutsett er et stort problem for lakseoppdrettsnæringen, og en betydelig del av all fisk som settes ut i havet når ikke konsum. Nøye overvåking og analysering av smolten gjøres for å sikre at den skal håndtere overgangen fra ferskvann til sjøvann på best mulig måte. Tross dette har man ikke klart å kartlegge nøyaktig hvorfor så mange fisk dør i starten av sjøfasen, og skylden legges ofte på ”dårlig smolt”. I vinterperioden før utsett vaksineres fisken mot de mest vanlige sykdommene som kan ramme norske oppdrettsanlegg. Disse har stort sett veldig god effekt og skal ha mye av æren for den kraftige veksten i næringen de siste fem-og-tjue årene. Riktig nok ser man fortsatt utbrudd av sykdommer som, med tanke på vaksineeffekten sett i laboratorieforsøk, burde vært tilnærmet utryddet. Én av disse er virussykdommen infeksiøs pankreas nekrose (IPN) som er utbredt hos laksefisk langs hele kysten av Norge og store deler av Europa. For å bedre kunne forstå hva som skjer immunologisk med laksen under smoltifiseringen, og hva som kan påvirke overlevelse etter sjøutsett, er det naturlig å se på hvordan vaksinert og uvaksinert fisk reagerer på sykdom i ulike stadier av smoltifiseringen. Dette kan bidra til økt forståelse for når i smoltifiseringsprosessen fisken er mest følsom for sykdom, og om smoltstatus påvirker responsen til vaksinen. I dette forsøket ble atlantisk laks (Salmo salar L.) utsatt for sommerstimuli i én, tre og seks uker før overføring til sjøvann. Disse tre smoltifiseringsregimene skulle framprovosere smolt med tre ulike grader av smoltifisering. Innenfor hvert regime var det to grupper: én uvaksinert gruppe og én gruppe vaksinert med en kommersielt tilgjengelig vaksine mot IPN. Fisken ble overført til sjøvann og smittet med infeksiøs pankreas nekrose virus (IPNV). Monitorering av dødelighet, samt prøvetaking av organer og blod, pågikk i syv uker etter smitte. Smoltindeks, osmolalitet- og kloridverdier i serum, vekstmålinger og Na+/K+ - ATPase aktivitet i gjellene viste at tre ulike grader av smoltifisering ble oppnådd. Dødelighetstallene viste at vaksinert fisk var godt beskyttet mot sykdommen, uavhengig av smoltstatus. For den uvaksinerte smolten var dødeligheten høyest hos den gruppen fisk som gjennomgikk antatt optimal smoltifisering og lavest hos den antatt dårligst smoltifiserte gruppen. Osmoregulatoriske problemer som følge av dårlig smoltifisering fører til økt stress og dårlig vekst hos fisken etter sjøutsett. Dette kunne man forvente ville økt mottakeligheten for IPN og dermed forhøyet dødeligheten hos antatt dårligst smoltifisert fisk, men resultatene viste det motsatte. Disse resultatene gir indikasjoner på at fysiologiske og immunologiske prosesser i laksen tidlig i smoltifiseringsprosessen beskytter den mot sykdom i større grad enn for antatt optimalt smoltifisert fisk. For å belyse årsakene til dette ble ELISA og real-time qPCR brukt for å måle antistoffrespons i blod, samt uttrykk av antivirale gener og tilstedeværelse av virus i hodenyre hos fisk fra alle forsøksgruppene.

Virussykdommer forårsaker i dag de største tapene i norsk lakseoppdrett og dagens tilgjengelige virusvaksiner er ikke effektive nok til å bekjempe virussykdommene. Den mest effektive virusvaksinen mot virussykdom hos laks i dag er DNA-vaksine mot rhabdoviruset infeksiøs hematopoetisk nekrose virus (IHNV), men det viruset finnes ikke i europeisk lakseoppdrett. Robertsen´s forskningsgruppe jobber med å bruke interferoner (IFN) som adjuvant i DNA-vaksiner mot virussykdommer. De har funnet ut at injeksjon av plasmid som inneholder IFN-gen sammen med plasmid som inneholder hemagglutininesterasegenet (HE) fra infeksiøs lakseanemivirus (ILAV) gir god beskyttelse mot ILAV-infeksjoner hos laks. IFN virker dermed som adjuvant i vaksinen. I dette mastergradsprosjektet skulle adjuvanteffekten av IFNa- plasmid (pIFNa) og IFNc-plasmid (pIFNc) studeres over et lengre tidsrom, opp til 22 uker. Effekten av pIFNa og pIFNc på antistoffresponsen ble sammenlignet. Effekten av pIFNc alene eller sammen med pHE på systemisk induksjon av Mx-protein ble målt. Det ble gjort forsøk på å måle om cytotoksiske celler kunne drepe muskelceller som uttrykket HE og det ble målt om vaksinering av IFN-plasmid alene eller sammen med HE-plasmid hadde hemmende effekt på vekst. Presmolt ble injisert intramuskulært (i.m). med pcDNA3.3- plasmid som inneholder gener av enten IFNa fra laks (pIFNa), HE fra ILAV4 (pHE), IFNc fra laks (pIFNc), pIFNa + pHE eller pIFNc + pHE. pcDNA3.3 uten innsatt gen ble brukt som kontrollplasmid. Henholdsvis 7, 10, 16 og 22 uker etter vaksinering ble det tatt blodprøver for antistoffmåling med ELISA og høstet leverprøver for måling av det antivirale Mx-proteinet med Western blotting. Effekt av cytotoksiske T-celler eller NK-celler ble forsøkt målt hos vaksinert fisk ved å reinjisere HE-plasmid i.m. og 7 dager senere ble muskelprøver høstet fra reinjeksjonsstedet for måling av genuttrykk av HE, CD8 og NK-cellemarkører med RT-qPCR. Ideen var at HE-ekspresjonen ville gå ned hos fisk vaksinert med HE+IFN sammenlignet med fisk injisert med kontrollplasmid. Fisken ble veid 0, 16 og 22 uker etter vaksinering for å sjekke effekten av vaksinene på vekst. Resultatene viste en økt antistoffrespons hos fisk vaksinert med pIFNc sammen med pHE 22 uker etter vaksinering. Det var også en overraskende forskjell i kinetikk mellom fisk vaksinert med pIFNc sammen med pHE og pIFNa sammen med pHE. Mx-protein ble detektert i leveren hos fisk vaksinert med pIFNc helt fram til 22 uker etter vaksinasjonen som indikerte at IFNc har en langtidseffekt. Fisk vaksinert med pIFNc sammen med HE hadde en reduksjon i Mx-protein 16 uker etter vaksinering som tydet på at HE er sett på som et fremmed antigen i fisken og at adaptive immunmekanismer deltar i tilintetgjørelsen av transfekterte muskelceller som uttrykker HE. Reinjeksjonen av HE var ikke en god nok modell for å analysere om CTL er involvert i beskyttelsen som pIFNc sammen med pHE gir mot ILAV. Imidlertid, reinjeksjon av pHE viste overraskende nok at IFNc aktiverte immunmekanismer som resulterte i en reduksjon i HE-transkripter. Totalt sett, ble det gjort flere nye oppdagelser om effekten av IFN som adjuvant i DNA-vaksine mot ILAV og dette kan forhåpentlig bidra til å oppnå bedre DNA-vaksiner til fisk.

Pankreassykdom (PD) forårsakes av salmonid alfavirus (SAV) og er den mest alvorlige virussykdommen for norsk lakseoppdrett. Sykdommen har de siste årene ført til store økonomiske tap i næringen, samt fiskevelferdsmessige problemer. Den viktigste faktoren for å bekjempe fiskesykdommer er forebyggende tiltak, der vaksinering av fisken er et av de viktigste tiltakene. I Norge finnes det godkjente virusvaksiner, også mot PD, men disse gir kun begrenset beskyttelse. Robertsen´s forskningsgruppe undersøker om interferoner (IFN) kan benyttes til å forebygge virusinfeksjoner hos atlantisk laks (Salmo salar L). IFN blir produsert og skilt ut fra virusinfiserte celler der de binder seg til reseptorer på andre celler, som initierer produksjon av antivirale proteiner. IFN hos laks har lav sekvenslikhet og binder seg til ulike reseptorer, dette tyder på at de har forskjellige funksjoner i fisken. Denne oppgaven hadde to hovedmål. Først ble det undersøkt om intramuskulær (i.m) injeksjon av IFN-plasmider (pIFN) kodet med gen for IFNa, IFNb eller IFNc førte til produksjon av antiviralt Mx-protein i eksokrin pankreas. Pankreas ble undersøkt da dette er et av målorganene for SAV. Videre ble det undersøkt om IFN-plasmidene ga beskyttelse mot SAV3-infeksjon hos laks. Det ble med kvantitativ RT-PCR (qPCR) vist at IFNb og særlig IFNc ga et økt uttrykk av Mx-mRNA i pankreas en og to uker etter i.m. injeksjon av p-IFN. Immunohistokjemi ble benyttet til å detektere Mx-protein i pankreas to og ti uker etter i.m. injeksjon av p-IFN. Kun IFNc induserte uttrykk av Mx-protein i eksokrine celler i pankreas to uker etter i.m. injeksjon. Ti uker etter injeksjon ble det detektert uttrykk av Mx-protein i eksokrine celler både fra fisk injisert i.m. med IFNb- eller IFNc-plasmid. IFNc ga et sterkere uttrykk av Mx–protein sammenlignet med IFNb. For å undersøke om p-IFN ga laks beskyttelse mot SAV-3 infeksjon ble kvantitativ virusmengde i blod målt med qPCR en uke etter infeksjon. I tillegg ble histopatologiske forandringer i virusets målorganer undersøkt tre uker etter infeksjon. IFNb og IFNc ga henholdsvis signifikant og meget signifikant lavere virusmengde i blod sammenlignet med kontrollgrupper. Alle fisker injisert med IFNa-plasmid eller IFNb-plasmid hadde uttalte forandringer i pankreas og hjerte etter SAV-infeksjon. I motsetning hadde majoriteten av fisk injisert med IFNc-plasmid bare moderate forandringer i hjerte og pankreas. Resultatene indikere at IFNc kan benyttes til å gi økt beskyttelse mot SAV-3 virus.

Atlantic salmon (Salmo salar L.) aquaculture is a relatively new industry in Norway, dating back to the 1960s. It has since then developed in to a profitable industry. Continuous improvement of hygiene control, knowledge of fish nutrition and health has been important for this development. Fish nutrition is a research field that has been increasingly focused on partly due to more use of plant raw materials as substitute for the less sustainable marine sources. The search for feed components meeting the nutritional requirements, improving fish health, growth and disease resistance is continuous. Feed producers produce functional feed by implementing functional ingredients that have positive effect on the fish. In this study, Atlantic salmon were fed a control diet and two different functional feeds during the parr-smolt transformation in freshwater and subsequently in seawater. The feed effects on the salmon gastrointestinal (GI) tract were investigated using light microscopy combined with a qualitative histological scoring system and real time polymerase chain reaction (PCR). Results from the histological analyses showed that feeding salmon with functional feeds produces less morphological changes to the GI tract compared to the control diet. The relative expression of pro- and anti-inflammatory genes was low during both periods. A mortality test using an Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) cohabitant challenge model revealed a significantly lower susceptibility and mortality in fish fed the functional diet. Numerous morphological observations were done during the histological examination from the feed- and challenge trial. Furthermore IPNV were detected by immunolabeling and transmission electron microscopy in pyloric caeca and distal intestine enterocytes. The results of this study showed that salmon fed a diet containing added vitamins, prebiotics, nucleotides and beta-glucans during the parr-smolt transformation period had significantly better gut status than the control diet two weeks post seawater transfer. The functional feed fed during the freshwater period contributed to significantly lower susceptibility to IPNV post seawater transfer.

Virussykdommer er en stor utfordring for dagens oppdrettsnæring, samtidig som virus og sykdom utgjør et stort problem ut fra et fiskehelseperspektiv. Forebyggende tiltak er i dag det beste redskapet for å bekjempe fiskesykdommer, og all settefisk i Norge vaksineres rutinemessig før utsett. Utfordringen so næringen har med virussykdommer viser likevel at vaksinene som finnes mot virus ikke er effektive nok. Atlantisk laks (Salmo salar) har i utgangspunktet et sterkt medført immunforsvar, og grunnforskning rettet mot å bedre forståelsen av virusforsvaret kan derfor være med på å effektivisere de forebyggende tiltak som i dag anvendes mot virus. Suppressors of cytokine signaling (SOCS) er proteiner som regulerer intracellulære cytokin-induserte signalkaskader, og er dermed regulatorer av interferoner, som er vist å ha en viktig rolle i laksens førstelinjeforsvar mot virus. Virus har vist seg å ha evne til å ta kontroll over SOCSene, og ved å overstyre cytokinsignaleringen utnytte SOCSene som en mekanisme for å unngå laksens immunforsvar. Siden SOCS bidrar i virusforsvaret, er det viktig å forstå bedre i hvilken grad og hvordan de er involvert i fiskens immunreaksjoner ved virusinfeksjoner. SOCS-proteinene er identifisert hos flere fiskearter, deriblant atlantisk laks, men mye gjenstår å undersøke. Jorunn Jørgensens forskningsgruppe har nylig identifisert 3 medlemmer av SOCS-protein familien, SOCS1, SOCS2 og CISH i atlantisk laks, og formålet med denne masteroppgaven har været å videre karakterisere disse. Den biologiske rollen til SOCSene hos fisk er lite undersøkt, og i denne masteroppgaven ble det etablert stabilt transfekterte cellelinjer som overuttrykker SOCS1 eller SOCS2. Resultatene viste, at overuttrykk av SOCS1 hemmet Mx, et antiviralt protein, etter stimulering med IFN1a. Lignende funn er gjort i pattedyr, og viser at funksjonen til SOCS1 er konservert mellom pattedyr og fisk. Rollen til SOCSene ved infeksjon med virus in vivo og in vitro ble også undersøkt i denne oppgaven. Resultatene viste at spesielt SOCS1 induseres ved virusinfeksjoner, men våre data gir ikke indikasjoner på at verken SAV3 eller IPNV utnytter SOCSene for å overstyre vertens immunforsvar. CpG og polyI:C er rapportert å ha potensiale som adjuvans i virusvaksiner, og stimulering av primærceller med disse immunostimulantene viste at begge induserer økning i SOCS-transkripter. Resultatene indikerer at SOCS1 og muligvis også CISH er involvert i differensiering av dendritiske celler hos atlantisk laks og dette kan være med på å forklare den effekten CpG og polyI:C har som adjuvans.

Virussykdommer er en av de største utfordringene innenfor oppdrett av Atlantisk laks (Salmo salar L.) og regnbueørret (Oncorhychus mykiss L.) i Norge i dag, og forårsaker store økonomiske og fiskevelferdsmessige problemer. De senere år har spesielt subtypene SAV3 og SAV2 av virussykdommen PD spredt seg til stadig ny deler av landet, hvor den forårsaker dødelighet både på settefiskanlegg og matfiskanlegg. Det er utviklet gode vaksiner mot de bakterielle sykdommen, men fremdeles er ikke gode vaksiner mot virussykdommene utviklet. Laks innehar i likhet med andre vertebrater et medfødt uspesifikt forsvar mot patogener som virus i tillegg til et spesifikt adaptivt immunforsvar som består av det cellulære og humorale gren. Hos teleoster består det humorale immunforsvaret av B lymfocytter som etter eksponering for antigen differensieres til plasmaceller og initierer utskillelse av IgM (antistoff) og fullstendig karakterisert hos mennesker. Imidlertid er de humorale adaptive immunresponsene hos teleoster generelt, laks og laks spesielt, utilstrekkelig karakterisert hos laks. En viktig årsak til dette er at få markører forbundet med modning og differensiering av B-celler er påvist hos laks, og at de i varierende grad lar seg påvise. Funksjon til transkripsjonsfaktorene Pax5, XbpI og Blimp-1 er imidlertid alle påvist og beskrevet i vertebrater. Det er også kjent fra regnbueørret at Pax5 uttrykkes i utviklende B-celle linjer men ikke i plasmaceller, men dette er ikke beskrevet hos laks . I denne oppgaven ble derfor antistoffer mot de nevnte transkripsjonsfaktorene benyttet ved Western blot, noe som førte til deteksjonen av et protein forenelig med Pax5 full-lengde i leukocytter fra laks. B-celler og plasmaceller fra lakseleukocytter ble derfor forsøkt adskilt ved hjelp av ulike perkoll-gradienter, og undersøkt med henhold på morfologi og Pax5 uttrykk. Leukocyttpopulasjoner ble dessuten stimulert in vitro med CpG ODN, og endringer av mIgM ble detektert ved RT-qPCR. Sekretorisk IgM og Pax5 ble detektert ved Western blot som indikator på at CpG har klart å initiert differensiering av B-celler. Pax5 ble også benyttet som markør på differensiering av B-celler etter in vivo immunisering av laks med SAV Ag, CpG og Poly I:C (C/P) og en kombinasjon av disse. Pax5 uttrykket alene var ikke tilstrekkelig for å kunne avgjøre om en adaptiv immunrespons var initiert, men økning av sekretorisk IgM indikerte en antigenrespons som følge av CpG stimulering, og at CpG dermed har en potensiell betydning som komponent i fremtidige vaksiner mot virussykdommer hos laks.

Yersiniose (rødmunnsyke) skyldes bakterien Yersinia ruckeri, og utbrudd av sykdommen er ofte forbundet med stress. De fleste tilfellene av Yersiniose blir påvist i settefiskfasen. Et av de beste forebyggende tiltakene mot sykdommen er vaksinering. Det er ikke praktisk å vaksinere små fisk, og derfor er immersjonsvaksienring det beste alternativet. I dette prosjektet utførte vi et forsøk der små yngel ble badevaksinert 2 ganger med en autogen ERM vaksine bestående av formaldehydinaktivert kultur av Yersinia ruckeri (serotype 01). Mellom 1. gangs og 2. gangs badevaksinering var det 500 døgngrader (vanntemperatur var 12-14°C gjennom forsøket). Formålet med dette forsøket var å undersøke om en lav dose Aqui-S (2.5mg/L isoeugenol) hadde en effekt på stressresponsen målt som kortisolnivå, og om en eventuell stressreduksjon forårsaket av Aqui-S kunne påvirke immunresponsen. Kortisolnivået ble målt før vaksinering (pre-stress), og opp til 48 timer etter vaksinering, både ved 1. og 2. gangs badevaksinering. Dette ble målt ved RIA (radioimmunoassay). Immunresponsen til badevaksineringen ble analysert som uttrykket av interleukinene IL-1β og IL-17α, samt produksjonen av spesifikke antistoffer for Yersinia ruckeri. Prøver av gjeller og hodenyre for RT-PCR (real time PCR) ble tatt 1 og 3 dager etter 1. gangs badevaksinering. Antistoffresponsen ble målt ved ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 500 døgngrader etter 2. gangs badevaksinering. Resultatene viser at en sedativ dose Aqui-S ikke har tilstrekkelig effekt på kortisolnivået hos lakseyngel. Det ble også vist at fisk som ikke ble sedatert med Aqui-S generelt hadde en høyere immunrespons.

Vaksinering av fisk er ansett som den sikreste og mest kostnadseffektive strategien for å forebygge smittsomme sykdommer. Dagens vaksiner er dessverre lite effektive mot intracellulære patogener og kan være gjenstand for bivirkninger av ulik grad. Det er derfor nødvendig å utvikle nye og bedre vaksiner. En måte å gjøre dette på, er å prøve ut nye adjuvanser med potensial til å øke immunogeniteten til et antigen. Urinsyre (US) er en liten organisk heterosyklisk komponent som kan være både i løselig og fast (krystallisk) form.. Forsøk gjort på pattedyr har vist at US og MSU innehar immunologiske adjuvansegenskaper. I dette arbeidet har US og MSU blitt utforsket som alternative adjuvanser i fiskevaksiner til atlantisk laks (Salmo salar L.).

Marin bioprospektering er definert som letingen etter og karakterisering av nye bioaktive forbindelser fra havets ressurser med hensikt å benytte denne kunnskapen kommersielt til utvikling av medisiner, helsekost eller stoffer med annen anvendelse. Verdenshavene dekker 70 % av jordas overflate, og innehar en enorm biodiversistet som er lite utforsket. Det er i dag et behov for å identifisere nye aktive komponenter for å supplementere eller erstatte allerede eksisterende konvensjonelle antibiotika på markedet. Marin bioprospektering er et lovende forskningsfelt for dette, og har derfor fått stor oppmerksomhet rundt om i verden. Dette studiet besto av ekstraksjon, og videre separasjon ved hjelp av fast-fase separasjon (SPE), av seks marine makroalger (Desmarestia aculeata, Fucus distichus, Alaria esculenta, Enteromorpha intestinalis, Cladophora rupestris, Palmaria palmata). Eluatene/ ekstraktene ble testet for antimikrobiell aktivitet mot fire terrestriske (Pseudomonasaeruginosa, Escherichia coli , Staphylococcus aureus og Corynebacterium glutamicum) og fire marine bakteriestammer (Aeromonas salmonicida og Listonella anguillarum, Carnobacterium divergens og Carnobacterium mobile). Det ble registrert antimikrobiell aktivitet i SPE- eluater fra alle de ulike makroalgene, men bare enkelte av de organiske ekstraktene. Noen av eluatene viste antimikrobiell aktivitet mot alle de 8 bakteriestammene. Aktive SPE- eluater ble videre fraksjonert ved hjelp av høytrykks- væskekromatografi (HPLC), og fraksjonene ble testet for antimikrobiell aktivitet. De aktive fraksjonene ble analysert med massespektrometri LC-MS. Det ble oppdaget antimikrobielle forbindelser i alle de utvalgte marine makroalgene. I HPLC-fraksjonene til Båetang, ble det karakterisert en rekke florotanniner innenfor i alle fall to av hovedgruppene; floroetholer og eckoler. I HPLC- fraksjoner fra Søl ble det funnet noe som kan tenkes å være mycopsorin-lignende aminosyrer som synes å være ukjente, da de ikke er beskrevet i litteratur, og det kan se ut som HPLC- fraksjoner fra Tarmgrønske inneholder nevrotoksinene anatoksin-a og homo-anatoksin-a. Videre analyse med mer følsomme maskiner må til for å bekrefte identiteten til forbindelsene funnet i dette studiet.

Hjerte- og skjelettmuskelbetennelse (HSMB) og infeksiøs pankreasnekrose (IPN) er utbredte sykdommer i norsk lakseoppdrett. IPN er forårsaket av Infeksiøs pankreasnekrose virus (IPNV) og HSMB er assosiert med tilstedeværelse av Piscine reovirus (PRV). Utbrudd av HSMB i oppdrettslaks er ofte observert like i etterkant av et IPN utbrudd, men hvordan en IPNV infeksjon påvirker utviklingen av HSMB er ikke kjent. I første del av oppgaven ble det gjennomført et smitteforsøk med Atlantisk laks, hvor det ble studert hvilken effekt IPNV og vaksinasjon har på utviklingen av HSMB in vivo. Det ble etablert en persistent infeksjon av IPNV etter smitte i ferskvann som varte gjennom hele forsøksperioden frem til 10 uker etter overføring av fisken til sjøvann. Det ble ikke påvist signifikante forskjeller i virusinnhold mellom vaksinert og uvaksinert fisk, noe som bekrefter at vaksinering ikke forhindrer at fisken blir smittet med IPNV og blir bærere av viruset. En reaktivering av bærertilstanden ble ikke påvist etter at fisken ble overført til sjøvann. HSMB ble indusert ved smitte med PRV positivt hjertehomogenat fra HSMB syk fisk ved sjøsetting. PRV (RNA) ble påvist i fisken 3 uker etter smitte, før diagnosen HSMB ble bekreftet. Det ble påvist en større mengde PRV i vaksinert fisk i forhold til uvaksinert fisk 7 og 10 uker etter smitte, noe som kan indikere at PRV etableres lettere i vaksinert fisk. 7 uker etter smitte ble likevel HSMB diagnostisert på basis av hjertehistologisk undersøkelse i alle testede fisk og det ble ikke påvist noen patologiske forskjeller mellom vaksinert og uvaksinert fisk. En bærertilstand av IPNV så ikke ut til å påvirke hverken innhold av PRV i fisken eller utvikling av patologiske forandringer forbundet med HSMB. Dyrking av virus i cellekultur er et essensielt verktøy blant annet forproduksjon av virus til bruk i vaksiner. Det finnes godt etablerte metoder for dyrking av IPNV in vitro, men frem til i dag er dette ikke kjent for PRV. I andre del av oppgaven ble det utarbeidet en protokoll for etablering og hold av primærcellekulturer fra laksehjerter in vitro. Arbeidet som ble utført inkluderte også observasjon og beskrivelse av utviklingen til cellene gjennom flere uker i kultur. PRV ble forsøkt dyrket i disse hjertecellekulturene og i en etablert hjertecellelinje fra Stillehavslaks. Resultater fra forsøkene gav ingen sikre svar på om virus ble oppformert. Det ble imidlertid gjort interessante funn, spesielt ved forsøk med hjertecellekulturene, som må studeres videre før man eventuelt kan bekrefte eller avkrefte om cellene er egnet for dyrking av PRV.

En metodikk for fangst, transport og gjennomføring av individforsøk på laboratoriet med naturlig lakselusinfisert vill smolt av laks og ørret ble utviklet. Effektene av luseinfeksjon ble deretter undersøkt på individnivå i to adskilte forsøk (ett med laksesmolt og ett med ørretsmolt). Her ble lusas effekt på fiskens vekst, appetitt, fysiologi og overlevelse undersøkt. Intensiteten av lus ble registrert på hver fisk ved forsøksstartstart, og siden de sto i individkar kunne forskjeller i lusas overlevelse mellom individer og arter studeres. Fisken ble fanget i ytre Hardanger og transportert til Havforskningsinstituttets forskningsstasjon på Matre. Her ble måling av lengde/vekt, lusetelling og gruppeinndeling utført før fisken ble weanet til tørrfôr. Gruppene var som følger: Lav infeksjon: < 0,1 lus/g fiskevekt, middels infeksjon: 0,1 - 0,3 lus/g fiskevekt, høy infeksjon: > 0,3 lus/g fiskevekt. I løpet av forsøksperioden på 5 uker ble appetitt hos ørret og dødelighet hos både laks og ørret registrert. Ved forsøksslutt ble det på nytt målt lengde/vekt, talt lus og tatt blodprøver for måling av plasmakortisol og plasmaklorid hos overlevende fisk. Utvikling av en metodikk for fangst, transport og laboratorieforsøk med naturlig infisert vill smolt av laks og ørret fungerte svært godt. Hos både laks og ørret var det jevnt over høyere dødelighet i gruppene med høy infeksjon enn gruppene med lav infeksjon, men kun gruppe høy infeksjon hos laks var signifikant forskjellig fra de to øvrige gruppene. Ørret døde tidligere og i løpet av et kortere tidsrom enn laksen. Samtidig hadde høyt infisert ørret best appetitt og dermed også høyest spesifikk vekstrate og størst økning i kondisjonsfaktor. Nivåene av kortisol indikerte at det var forskjeller mellom de ulike infeksjonsgruppene, med en økning i kortisol med økende intensitet av lus hos både laks og ørret. Nivåene av klorid viste ingen forskjeller mellom infeksjonsgruppene eller artene. Det ble funnet dødelighet av lakselus hos både laks og ørret, der intensiteten av lus sank mest der infrapopulasjonene var størst. Ørret hadde en større nedgang i metapopulasjonen av lus enn laks. Denne studien har vist det er mulig å suksessfullt fange inn, transportere og deretter gjennomføre individforsøk på laboratoriet med naturlig lakselusinfisert vill smolt av laks og ørret, som et supplement til kunstig infisert oppdrettssmolt i gruppeforsøk. Forsøkene bør gjentas med et høyere antall individer.

Virusinfeksjoner utgjør lakseoppdrettsnæringens største sykdomsproblem på landsbasis og forårsaker årlig store tap i form av dødelighet, redusert tilvekst, samt reduksjon i fiskehelse og - velferd. Dette til tross for omfattende smitteforebyggende tiltak og vaksinasjon. Interferonsystemet spiller en nøkkelrolle i det medfødte antivirale forsvaret hos pattedyr, hvor alarmproteinet interferon (IFN) produseres og skilles ut av virusinfiserte celler og videre induserer økt antiviralt forsvar i andre celler ved å binde reseptorer som resulterer i induksjon av antivirale gener. Laks har et velfungerende IFN-system som spiller en viktig rolle i fiskens medfødte virusforsvar. Det har blitt vist at IFN-stimulering kan gi økt genuttrykk av antivirale gener i fisk og studier om bruken av IFN som vaksineadjuvant har gitt lovende resultater hos pattedyr. Tidligere forskning i Børre Robertsens gruppe har vist at intramuskulær injeksjon av ekspresjonsplasmid for IFNc gir beskyttelse av laks mot ILAV både ved injeksjonssmitte og kohabitantsmitte. Injeksjon av ekspresjonsplasmider for IFNa1 eller IFNb ga imidlertid ingen beskyttende effekt. På bakgrunn av dette ble effekt av IFNc på genekspresjon hos laks studert videre i denne oppgaven. I første del av oppgaven ble induksjon av antivirale gener i fornyreleukocytter fra atlantisk laks studert etter stimulering med rekombinant IFNa1 og IFNc. Det ble ved kvantitativ RT-PCR vist at begge IFN ga en klar og relativt lik induksjon i genuttrykk av antivirale gener og reseptorer for viralt RNA. Det ble videre utført et forsøk hvor effekt av et ekspresjonsplasmid for IFNc på genuttrykk av antivirale gener og virusreseptorer hos presmolt av laks ble studert i en periode på åtte uker, for å undersøke mulige forklaringer på hvorfor i.m. injeksjon av IFNc-plasmid ga beskyttende effekt mot ILAV. Ved bruk av kvantitativ RT-PCR ble det vist at IFNc-plasmid induserer økt uttrykk av antivirale gener ved injeksjonsstedet i muskelen i hele forsøksperioden. I tillegg ble det observert en økning i genuttrykk av antivirale gener og virusreseptorer i fornyre ved samme periode, samt økte transkripter av Mx vFed indre organer én uke etter injeksjon. Disse resultatene samsvarte med og ble bekreftet av resultater fra Western blotting og immunhistokjemi som viste detekterbare proteinuttrykk av Mx i lever ved uke 1, 3 og 8 og hjerte ved uke 8. Resultater fra forsøkene utført i dette mastergradsarbeidet indikerer at IFNc kan benyttes til å øke medfødt antiviralt forsvar hos laks og følgelig kan ha potensiale til å benyttes som immunstimulant eller vaksineadjuvant for å forebygge virussykdommer i oppdrett.

DNA-vaksiner har vist seg meget effektive mot enkelte virussykdommer – som for eksempel mot infeksiøs hematopoietisk nekrose (IHN) og viral hemoragisk septikemi (VHS). Beskyttelsen er mest sannsynlig mediert av antistoffer og cytotoksisk antiviral respons. Det er også vist at antistoffer er viktig i beskyttelse mot ekstracellulære bakterier (for eksempel Vibrio sp.), mens både cytotoksiske og cellemedierte mekanismer er sentrale i beskyttelse mot intracellulære bakterier (for eksempel Piscirickettsia sp.). Ved å benytte plasmid DNA, inneholdende molekylære adjuvanser ønsket vi å undersøke immunologiske mekanismer for sykdomsbeskyttelse samtidig som vi ønsket å utvikle molekylære vaksiner. Målet var å vise at overekspresjon av T-bet og GATA-3 hos laks kan gi en bedre beskyttelse mot hhv. intra- og ekstracellulære bakterier, mens TGF-β resulterer i dårligere beskyttelse. Gener som kodet for transkripsjonsfaktorene T-bet, GATA-3 eller det immundempende cytokinet TGF-β ble klonet inn i pDNA (pTagRFP). Studiet ble utført både in vitro ved transfeksjon av cellekultur og in vivo ved i.m. injeksjon i atlantisk laks. Det ble bekreftet i cellekultur og muskelceller (injeksjonssted) tilstedeværelse av RFP ved fluorescensmikroskopisk analyse. Resultatene fra in vivo studiet viste at en ved rekombinant DNA teknologi med innsatte gener i ekspresjonsvektor fikk økt uttrykk av TGF-β, T-bet og GATA-3. Med få unntak ble ikke uttrykket av relaterte gener (IFN-γ, IL-4/13A og IL-17A) påvirket etter injeksjon av ekspresjonsvektorene. Det ble heller ikke vist økt sykdomsbeskyttelse mot hhv. ekstra- og intracellulær patogener ved overekspresjon av T-bet og GATA-3. Nøkkelord: Overekspresjon; pDNA; TGF-β; T-bet; GATA-3; Adaptiv immunitet; atlantisk laks; RFP

Infeksiøs lakseanemi (ILA) er en virussykdom som har innvirkning på, og fører til tap i den norske lakseoppdrettsindustrien. Det å kjenne til hvordan det influensaliknende infeksiøs lakseanemi viruset (ILAV) virker på laksens celler, og hvordan laksens immunforsvar fungerer for å hemme en infeksjon, er viktig for å kunne gjøre noe med denne sykdommen. Interferonsystemet spiller en viktig rolle i det medfødte immunforsvaret hos pattedyr, men også hos fisk. Det er tidligere undersøkt om interferon (IFNa1) kan hemme infeksjon av ILAV, noe det har vist seg å ikke kunne. I tidligere forsøk har hemming av et høyvirulent virusisolat (ILAV4) vært testet ut i TO-celler. I denne oppgaven var det derfor ønskelig å teste ut et mindre virulent virusisolat (ILAV7) i tillegg til det høyvirulente ILAV4. ASK- celler ble valgt til forsøkene siden jeg i en prosjektoppgave i 2010 klarte å vise hemming av ILAV i denne cellelinjen. Vi ønsket også å benytte flere subtyper av interferoner (IFNa1, IFNb og IFNc). Jeg fikk også i oppgave å sammenligne effekten av interferonene ved virusets optimumstemperatur på 15C med effekten ved 20C som hadde vært brukt til å påvise antiviral aktivitet i prosjektoppgaven min. Antiviral effekt ble studert ved Cytopatogen effektreduksjonsmetode, kvantitativ PCR, Western blotting og virustitrering. Det ble også utført forsøk for å sammenligne induksjon av de antivirale proteinene Mx og ISG15 ved infeksjon av ILAV4 og ILAV7. Resultatene viste at både ILAV4 og ILAV7 lar seg hemme av IFN i ASK-celler, og det er ingen signifikant forskjell på grad av hemming av de to isolatene. Det ble imidlertid vist at IFN kun har en forsinkende effekt på virusreplikasjon, og etter 3-5 dager ser viruset ut for å ha tatt igjen det tapte. Induksjonen av Mx og ISG15 var høyere hos ASK celler infisert med ILAV7 enn med ILAV4. Virusene replikerer lettere ved 15C enn ved 20C.

Sammendrag Partikler av polymerene poly (lactide-co-glycolide) acid (PLGA) og poly (lactide) acid (PLA) har vist seg å være effektive som adjuvanter/antigendepot i musemodeller, hvor de bidrar til å fremprovosere en robust og vedvarende antistoffrespons. Fremdeles er PLGA/PLA-partiklenes egenskaper som adjuvans i atlantisk laks lite kjent. Målet med dette studiet var å sammenlikne depotegenskapen til ulike PLGA/PLA-formuleringer, samt deres evne til å stimulere det adaptive (humorale) immunforsvaret til produksjon av spesifikke antistoffer. Til studiet har vi koinkapsulert et modellprotein (human gamma globulin, HGG) med β-glukan (laminaran) i formuleringer av PLGA og PLA med ulike fysio-kjemiske egenskaper (molekylvekt, partikkelstørrelse, melke:glykolsyre forhold). Partiklenes depoteffekt i atlantisk laks ble undersøkt 7 og 36 dager etter intraperitoneal injeksjon ved bruk av I125-merket HGG. Depot/biodistribusjon av HGG-I125 ble målt i organpakken (mage-tarmsystem, lever, milt), muskel, nyren og i hele fisken. I perioden 4-16 uker etter immunisering ble fisken blodtappet i intervaller på 2 uker for måling av spesifikke antistoffer mot HGG ved bruk av indirekte ELISA. In vitro inkubering av partikkelformuleringene viste at antigen ble frigjort raskere fra mikropartikler enn nanopartikler, samtidig var depoteffekten in vivo bedre for enkelte mikropartikkelformuleringer sammenliknet med nanopartikler. Akkumulering av antigen fra nanopartikler av polymer med høy molekylvekt ble observert i nyrene. Partikkelformuleringenes depoteffekt kunne ikke korreleres til nivået av HGG-spesifikke antistoffer. Funnene i dette studiet viser at partikkelformuleringene har ulike depotegenskaper og evne til å fremkalle antistoffrespons i atlantisk laks avhengig av polymerenes fysio-kjemiske egenskaper.

Parasittsamfunnene hos sjøørret (Salmo trutta) fisket i sjø i Hardanger og Steigen ble undersøkt vinter, sommer og høst med hensyn på om det var ulikheter mellom parasittsamfunnene, og endringer i samfunnene mellom de ulike årstidene. Totalt ble det registrert 14 parasittarter og parasittgrupper, der ni var marine og fem var fra ferskvann. De marine parasittsamfunnene var svært like hos sjøørret i Hardanger og Steigen, både med hensyn på artssammensetning, og prevalens og gjennomsnittlig intensitet av de ulike artene. Lepeophtheirus salmonis, Cryptocotyle lingua, Eubothrium sp. og Hemiurus spp. hadde høyest prevalens i begge områder. Echinorhynchus gadi var den eneste marine arten som hadde klart ulik forekomst ved at den var relativt vanlig i Steigen, men svært sjelden i Hardanger. Artssammensetningen i de marine parasittsamfunnene var for øvrig dominert av generalister i begge områder. Artssammensetningen i parasittsamfunnene fra ferskvann var også dominert av generalister, der Diplostomum spp. ble registrert hyppigst i begge områder med prevalens rundt 20 %. Av registrerte arter av ferskvannsparasitter ble samtlige registrert hos sjøørret i Hardanger, mens kun tre ble registrert i Steigen. Det er imidlertid usikkert om dette skyldes tilfeldigheter, nord-sør gradient eller landskapsøkologi. Prevalens og abundans av både parasittarter fra ferskvann og marine parasittarter endret seg mellom vinter, sommer og høst. Årsakene til dette var sannsynligvis ulike nærings- og habitatvalg kombinert med ulik tid tilbrakt i sjøen hos sjøørretene som ble fisket i de ulike årstidene.

Sammendrag Forekomsten av lakselus (Lepeophtheirus salmonis Krøyer) på vill sjøørret (Salmo trutta L.,), vill sjørøye (Salvelinus alpinus L.,) og laksesmolt (Salmo salar L.,) i burforsøk ble undersøkt i den oppdrettsintensive Altafjorden og den oppdrettsfrie Porsangerfjorden. Innsamling av data fant sted i de to respektive fjordene i juli til august 2010. Infeksjonen av lakselus på villfisken var lav i begge fjordene under hele prøvefiskeperioden, med den høyeste intensiteten i Altafjorden i september med 9 lus per infisert fisk. Generelt var chalimus det dominerende stadiet i begge fjordene, men en økende andel lus i preadult og adult- stadie utover i perioden. Det ble funnet en signifikant høyere prevalens og abundans for både villfisk og burfisk i den oppdrettsintensive Altafjorden enn i den oppdrettsfrie Porsangerfjorden. I Altafjorden ble det ikke funnet noen signifikant forskjell i infeksjon av lakselus på vill sjøørret og sjørøye mellom innsiden og utsiden av den nasjonale laksefjorden. Det ble derimot funnet signifikant mindre lus på laksesmolt i bur på innsiden enn på utsiden av vernesonen. For Porsangerfjorden var det signifikant høyere luseinfeksjon på vill sjøørret og sjørøye innenfor vernesonen enn utenfor, mens for laksesmolt i burforsøk ikke ble funnet noen forskjell i luseinfeksjon mellom vernesonene. Estimatene av luselarveproduksjonen på oppdrettsanleggene i Altafjorden viste at denne ikke var av betydning før i august. Dette betyr at utvandringen av laksesmolt i månedsskiftet juni/juli antakeligvis ikke blir påvirket negativt av luselarveproduksjonen. Det ble for Altafjorden og Porsangerfjorden ikke funnet noen sammenheng mellom produksjon av luselarver på anleggene og infeksjon på vill sjøørret og sjørøye. For sjøørret og sjørøye i de to fjordene viste resultatene at lusenivået representerte en lav risiko for populasjonsregulerende effekt for sommeren 2010.

Fiskeoppdrett er i dag en av Norges største og viktigste eksportnæringer. Dette er en suksesshistorie som ikke ville vært mulig uten vaksiner. Etter gjennombruddet med utviklingen av velfungerende vaksiner mot sentrale sykdommer på 80- og 90- tallet har ekspansjonen i næringen vært enorm og det sjøsettes i dag over 200 millioner smolt årlig. Men selv om de fleste bakteriesykdommer hos laksefisk i dag er under kontroll er bekjempelsen av virussykdommer fremdeles en stor utfordring. I dette forsøket ble en vaksine basert på PLGA nanopartikler administrert intraperitonealt til Atlantisk laks (Salmo salar). Det er ikke kjent hvorvidt partikulære vaksinebærere som PLGA kan indusere økt antistoffrespons hos fisk etter intraperitoneal injeksjon, ei heller om PLGA basert vaksine induserer transkriptresponser for ulik T-celle differensiering i fisk. For å undersøke dette ble det laget en PLGA NP basert vaksine der et haptenisert protein (TNP-LPH) og β-glukan (lamiran) ble benyttet som hhv antigen og adjuvans. Som kontroller ble antigen og adjuvans også administrert hver for seg og sammen fortynnet i PBS og i kombinasjon med freunds complete adjuvans (FCA). Etter 1 måned ble det administrert en boostinjeksjon bestående av kun TNP-LPH fortynnet i PBS. Spesifikk antistoffrespons mot haptenisert protein ble målt vha enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) fra serum 1, 2 og 3 måneder etter immunisering samt 1 og 2 måneder etter boostinjeksjon. Analysene vha ELISA viste ingen signifikant forskjell mellom de ulike gruppene. Etter forsøk på å optimalisere protokollen for gjennomføring av ELISA var resultatet uendret da en forventet høy spesifikk antistoffrespons i den positive kontrollen ble det konkludert med at det lå metodiske årsaker til grunn. Indikatorer på innat, cellulær og humoral immunrespons ble undersøkt ved å kvantitere mRNA-uttrykket av hhv IFNγ, T-bet og GATA-3 fra hodenyre og milt 1-8 dager etter immunisering. Det ble detektert en økning av IFNγ i hodenyre 2 dager etter immunisering, ved de øvrige tidspunkter ble det ikke detektert noen økning i mRNA transkripter. For GATA-3 og T-bet ble det ikke detektert signifikante økninger av mRNA transkripter.