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Banana mild mosaic virus (BanMMV) (Betaflexiviridae, Quinvirinae, unassigned species) is a filamentous virus belonging to the Betaflexiviridae family. It infects Musa spp. with a very wide geographic distribution. The genome variability of plant viruses, including the members of the Betaflexiviridae family, makes their molecular detection by specific primers particularly challenging. During routine indexing of the Musa germplasm accessions, a discrepancy was observed between electron microscopy and immunocapture (IC) reverse transcription (RT) polymerase chain reaction (PCR) test results for one asymptomatic accession. Filamentous viral particles were observed while molecular tests failed to amplify any fragment. The accession underwent high-throughput sequencing and two complete genomes of BanMMV with 75.3% of identity were assembled. Based on these sequences and on the 54 coat protein sequences available from GenBank, a new forward primer, named BanMMV CP9, compatible with Poty1, an oligodT reverse primer already used in diagnostics, was designed. A retrospective analysis of 110 different germplasm accessions from diverse origins was conducted, comparing BanMMCP2 and BanMMV CP9 primers. Of these 110 accessions, 16 tested positive with both BanMMCP2 and BanMMV CP9, 3 were positive with only BanMMCP2 and 2 tested positive with only BanMMV CP9. Otherwise, 89 were negative with the two primers and free of flexuous virions. Sanger sequencing was performed from purified PCR products in order to confirm the amplification of the BanMMV sequence for the five accessions with contrasting results. It is highly recommended to use the two primers successively to improve the inclusiveness of the protocol.

Viruses are important constraints to the movement and propagation of plant germplasm, especially for vegetatively propagated crops such as banana and plantain. Their control relies primarily on the use of virus-free plant material, whose production and certification requires sensitive and reliable detection methods. Two members of the family Flexiviridae infect Musa spp : Banana mild mosaic virus (BanMMV) and Banana virus X (BVX). BanMMV causes mild leaf chlorosis symptoms in single infection but mixed infections with Cucumber mosaic virus (CMV) or Banana streak virus (BSV) can lead to important leaf necrosis. BanMMV transmission occurs mainly through vegetative propagation although recent data showed that plant-to-plant transmission occurs at a low rate [1]. BanMMV has therefore become an important constraint to the conservation, movement and exchange of Musa germplasm. Banana virus X was recently identified in Guadeloupe [2]. No symptom can be associated to the presence of this virus and no prevalence study could be carried out due to the lack of a detection method. Therefore, an existing polyvalent reverse transcription degenerate oligonucleotide PCR assay (PDO RTPCR, [3]) was adapted to the specific detection of BanMMV and BVX from banana plants [4]. Polyvalent degenerate oligonucleotides (PDO) containing inosine residues were found to be well suited to the detection of BanMMV, despite its high molecular diversity [1], but not to that of BVX, for which species-specific primers were designed. Sampling and sample processing steps were optimized in order to avoid nucleic acid purification prior to the reverse transcription step. A polyclonal anti-BanMMV antiserum was raised and successfully used for the immunocapture (IC) of BanMMV viral particles from leaf extracts, leading to the development of a PDO-IC-RT-nested PCR assay. Although the anti-BanMMV antiserum could recognize to some extent BVX viral particles, direct binding (DB) was shown to be a more efficient method for processing BVX-infected samples and a PDO-DB-RT-nested PCR assay was developed for the detection of BVX from leaf extracts. (Texte intégral)

National audience; Deux membres de la famile des Flexiviridae infectent des espèces du genre Musa, le virus de la mosaïque atténuée du bananier (BanMMV) et le virus X du bananier (BVX). En infection simple, le BanMMV provoque des chloroses foliaires légères et transitoires sur les cultivars sensibles, et aucun symptôme sur les autres. Cependant, il est responsable d'importantes nécroses foliaires en infection mixte, notamment avec le CMV. Le BanMMV est majoritairement transmis par voie végétative. En conséquence, ce virus est devenu une contrainte importante pour la conservation, l'échange et la propagation des musacées. Le BVX a pour sa part été décrit récemment sur musacées en Guadeloupe. Aucun symptôme n'a pu être associé à sa présence. La mise au point d'outils sensibles et spécifiques de détection de ces virus est nécessaire à la certification du matériel végétal, notamment celui produit par micropagation. Un test de detection des Flexivirus par polyvalent degenerate oligonucleotide RT-PCR (PDORT-PCR) a été adapté avec succès à la détection du BanMMV et du BVX. L'utilisation pour les étapes de RT-PCR et de nested PCR d'amorces dégénérées contenant des bases inosine s'est avérée particulièrement adaptée au niveau de diversité moléculaire élevé du BanMMV. La même approche n'a pas permis la détection du BVX. Aussi, des amorces spécifiques ont-elles été dessinées et utilisées pour l'étape de nested PCR, permettant la détection spécifique de ce virus. Afin de simplifier la préparation des échantillons, un anticorps polyclonal dirigé contre le BanMMV a été obtenu. Il a permis de mettre au point un test de détection du BanMMV par immunocapture (IC) PDO-RT-PCR. En l'absence d'un réactif sérologique équivalent dirigé contre le BVX, un protocole de détection par direct binding (DB) PDO-RT-PCR a été mis au point pour la détection de ce virus. Ces tests de détection ont été validés à grande échelle lors de campagnes d'indexation de masse.

Publication Inra prise en compte dans l'analyse bibliométrique des publications scientifiques mondiales sur les Fruits, les Légumes et la Pomme de terre. Période 2000-2012. http://prodinra.inra.fr/record/256699; International audience; Viruses are important constraints to the movement and propagation of plant germplasm, especially for vegetatively propagated crops such as banana and plantain. Their control relies primarily on the use of virus-free plant material, whose production and certification requires sensitive and reliable detection methods. An existing polyvalent degenerate oligonucleotide RT-PCR (PDO-RT-PCR) assay was adapted to the detection of Banana mild mosaic virus (BanMMV) and Banana virus X, two Flexiviridae infecting Musa spp. PDO inosine-containing primers were found to be well suited to the detection of BanMMV, despite its high molecular diversity, but not to that of the highly conserved BVX, for which species-specific primers were designed. Sampling and sample processing steps were optimized in order to avoid nucleic acid purification prior to the reverse transcription step. A polyclonal anti-BanMMV antiserum was raised and successfully used for the immunocapture (IC) of BanMMV viral particles from leaf extracts, leading to the development of a PDO-IC-RT-nested PCR assay. Although the anti-BanMMV antiserum could to some extent recognize BVX viral particles, direct binding (DB) was shown to be a more efficient method for processing BVX-infected samples and a PDO-DB-RT-nested PCR assay was developed for the detection of BVX from leaf extracts.

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Le virus de la mosaïque atténuée du bananier (Banana mild mosaic virus, BanMMV), membre de la famille des Flexiviridae, est à l'origine de contraintes sanitaires importantes pour les échanges de germplasme bananier. Il cause peu de symptômes en infection simple mais peut provoquer des nécroses sévères lors d'infections mixtes. Peu de données sont actuellement disponibles sur la diversité génétique des populations de ce virus et sur son épidémiologie, notamment sur l'existence d'un vecteur biologique. Un test de détection par immunocapture-reverse transcription-nested PCR a été mis au point. Le fragment amplifié par PCR, qui correspond à une partie de l'ORF1 codant l'ARN polymérase ARN dépendante (RdRp) comportant les motifs III et IV conservés parmi les RdRp des virus à ARN de polarité positive, a été cloné pour 69 accessions de provenances géographiques variées. De 1 à 7 clones ont été sequencés pour chacune des accessions étudiées, générant un ensemble de 154 séquences. L'analyse de ces dernières a montré que la région de 310 nt étudiée présente un niveau de diversité très important, caractérisé par l'accumulation de mutations synonymes à un taux jusqu'alors inconnu chez les virus de plantes. Une analyse similaire a été effectuée pour une sélection de 10 des accessions étudiées, sur une partie de la séquence codante de l'ORF5, qui code la protéine de capside (CP), et sur la séquence 3' non codante (3'NCR). Elle a permis de constater que les niveaux de diversité des séquences codantes RdRp et CP sont équivalents mais que ceux mesurés dans la 3'NCR sont en revanche significativement inférieurs, montrant que les régions codantes et non codantes étudiées font l'objet de pressions de sélection différentes. Par ailleurs, ces travaux ont démontré une absence de structuration de la diversité par le génotype des accessions ou leur origine géographique. En revanche, l'analyse fine de la répartition physique des isolats de la collection de Musa du CIRAD Guadeloupe a fourni pour la première fois des données sur l'existence d'une transmission de plante à plante du BanMMV. Enfin, l'analyse des niveaux de diversité observés entre isolats infectant une même plante a montré l'existence de deux types de situations : soit la présence dans une plante de variants moléculairement très proches, soit une co-infection par des isolats très différents entre eux. L'implication possible de la diversité génétique et moléculaire observée dans l'échappement à des mécanismes de défense de la plante sera discutée. (Texte intégral)

A total of 154 partial nucleotide sequences within theBanana mild mosaic virus(BanMMV) ORF1, which encodes the viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), was obtained from 68 distinct infected banana accessions originating from various locations worldwide. The 310 nt sequences displayed a high level of variability with a mean pairwise nucleotide sequence divergence level of 20·4 %. This situation resulted essentially from a high rate of synonymous mutations. A similar analysis was performed for a limited selection of 10 banana accessions (30 sequences) on the region comprising approximately the last 310 nt of the BanMMV genome. This region corresponds to the 3′ end of ORF5, which encodes the coat protein (234 nt), and to the 3′ non-coding region. This analysis confirmed the high level of diversity observed in the RdRp dataset, characterized by a high level of synonymous mutations. Analysis of intra-host diversity indicated the existence of two distinct situations, with some plants containing only closely related sequence variants, whereas others contained widely divergent isolates. Analyses indicated that BanMMV genetic diversity is not structured by the geographical origin of the infectedMusaaccessions or by their genotype. This situation may be, in part, explained by the exchange of banana germplasm between different parts of the world and also by plant-to-plant transfer of virus isolates, the evidence for which is, for the first time, provided by this study.

International audience

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