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Aim: To unveil a putative correlation between phage genome flexibility and virion morphogenesis yield. Materials & methods: A deeper analysis of the mechanical properties of three Pseudomonas aeruginosa lytic phage genomes was undertaken, together with full genome cyclizability calculations. Results & conclusion: A putative correlation was established among phage genome flexibility, eclipse timeframe and virion particle morphogenesis yield, with a more flexible phage genome leading to a higher burst size and a more rigid phage genome leading to lower burst sizes. The results obtained are highly relevant to understand the influence of the phage genome plasticity on the virion morphogenesis yield inside the infected bacterial host cells and assumes particular relevance in the actual context of bacterial resistance to antibiotics.

En esta tesis doctoral se usaron técnicas y metodologías de microbiología tradicional, moleculares y secuenciación de última generación para análisis de células, proteínas, ADN y ARN. La fagoterapia es una alternativa viable para controlar infecciones bacterianas, sin embargo, entender como la bacterias y fagos interactúan dependiendo del ambiente es crucial para tener un tratamiento efectivo. Muchas de las aplicaciones de fagos son realizadas sobre ambientes anaerobios (intestino, heridas), entonces entender el efecto de la falta o limitación de oxígeno en la interacción fago-hospedero se hace necesaria. Desde 1975 no se han publicado investigaciones para elucidar el efecto de la ausencia de oxígeno en el proceso de infección del fago. En este estudio nosotros reportamos este efecto en un modelo Salmonella sp.-fago, dada su importancia como patógeno y contaminante bacteriano en ambiente anaerobios, y el potencial de la fagoterapia para controlarla. Encontramos que el ciclo de replicación viral, la reducción de la población bacteriana por unidad de tiempo, y el desarrollo de resistencia son influenciadas por la anaerobiosis de la siguiente manera: a) el fago es afectado en la longitud de su ciclo de vida y en su capacidad para controlar la población bacteriana; b) se observó que el tamaño celular bacteriano está asociado a la cantidad de proteína FtsZ y que se altera la aparición de resistencia en contra del fago. Asimismo, los resultados de los análisis transcriptómicos sugieren que la infección en condiciones aeróbicas induce metabolismo anaerobio, específicamente nitrato reducción, y hay subexpresión de genes asociados con respiración aeróbica en la bacteria. En la infección anaeróbica no se observó cambios al metabolismo de generación de energía usado por la bacteria en crecimiento anaeróbico, pero sí se evidenció aumento en la transcripción de genes relacionados con el transporte de aceptores de electrones usados en anaerobiosis. Independiente la condición de oxígeno, los resultados mostraron que la mayoría de los genes con expresión diferencial en la infección fueron aquellos clasificados en la categoría de función desconocida o no pudieron ser anotados. Los resultados en conjunto dan un panorama de cómo la ausencia de oxígeno pude afectar la interacción fago-hospedero, y cuyas consecuencias deberían ser consideradas al momento de usar los fagos biotecnologicamente. Doctor en Ciencias - Biología Doctorado Bacteriófagos

Tese de doutoramento em Biomedical Engineering, Bloodstream infections (BSIs) are characterized by high incidence and mortality and thus can greatly impact healthcare systems. The prompt administration of antibiotics along with their de-escalation as early as possible are key elements for BSIs effective control. One of the main constraints that limit these actions is the difficulty in detecting the BSIs’ causative agents. The current diagnostic approaches suffer from low specificity, high costs, lack of portability, are time-consuming, and/or require trained personnel for their execution. Thus, it is of paramount importance the development of novel robust methods. Hence, to address this concern, the main goal of this work was to develop a bacteriophage-based lab-on-chip (LoC) platform for multiplex detection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus, which are highly prevalent isolates from BSIs cases. In order to achieve the goal, phage-based probes that present outstanding high specificity, sensitivity, and low-cost production were designed and fused with fluorescent proteins to be used as bacteria recognition elements. These were combined with the advantageous properties of microfluidic devices, such as miniaturization, low sample volume, and portability along with optical sensors due to their sensitivity and easy integration in LoC devices, allowing bacterial detection. In this scope, firstly, a reporter phage with a green fluorescent protein (GFP) for E. coli detection was successfully constructed, nonetheless, it showed a weak fluorescence signal, making unfeasible its use in further experiments. As a surrogate strategy, phage proteins, namely receptor-binding proteins (RBPs) and cell-wall binding domains (CBDs), were developed and fused with fluorescence proteins. Their functional analysis (binding efficiency, sensitivity, and specificity in whole blood) was evaluated using different techniques such as flow cytometry and spectrofluorimetry. In this sense, three recombinant proteins were built: a CBD fused with a GFP that showed to be efficient in the detection of 1-5 CFU/mL of S. aureus after blood culture; an E. coli RBP fused with mCherry that recognized cells in distinct viability states and detected bacteria in various human biological specimens; an RBP for P. aeruginosa fused with mAmetrine that revealed to be very specific. The RBPs for P. aeruginosa and E. coli were used as probes in a bead-based microfluidic assay for the multiplex detection of both pathogens in whole blood. This miniaturized assay detected 104 CFU/mL in 70 min without enrichment, showing bacterial quantitative capabilities. Lastly, an optical setup based on photodetectors was developed and combined with the phage-based microfluidic assay, allowing the detection of P. aeruginosa in whole blood. Noteworthy, this system presented high specificity, and fastness, and is amenable to being fully automated to be used as a point-of-care device for BSIs diagnosis in healthcare settings., As infeções no sangue (IS) são caracterizadas por uma elevada incidência e mortalidade, tendo por isso grande impacto nas unidades de saúde. A administração correta e atempada de antibióticos é um fator chave para o controle efetivo das IS. A dificuldade em detetar os agentes patogénicos responsáveis pelas IS é uma das principais limitações. As técnicas correntes são demoradas, apresentam baixa especificidade e elevado custo, não oferecem portabilidade, e requerem funcionários especializados. Deste modo, é de extrema importância, o desenvolvimento de novos métodos robustos para a deteção de IS. Para colmatar este problema, o principal objetivo deste trabalho foi desenvolver uma plataforma “lab-on-chip” (LoC) baseada em bacteriófagos para detetar simultaneamente três bactérias, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, as quais são frequentemente isoladas de casos de IS. Para atingir este objetivo, sondas baseadas em fagos, que apresentam uma especificidade excecional, sensibilidade, e baixo custo, foram desenhadas e fundidas com genes de fluorescência para serem empregues como elementos de reconhecimento bacteriano. Estas foram combinadas com as vantagens da microfluídica, tais como miniaturização, portabilidade, juntamente com sensores óticos, devido à sua elevada sensibilidade e fácil integração em dispositivos LoC. Neste contexto, primeiramente um fago repórter possuindo uma proteína fluorescente verde (PFV) foi obtido, no entanto, demonstrou um sinal instável e baixo, impossibilitando a sua utilização posterior. Alternativamente, proteínas de fagos foram desenvolvidas, nomeadamente as proteínas recetoras de ligação (PRL) e domínios de ligação à parede celular bacteriana (DLB), fundidas com genes de fluorescência distintos e caracterizadas funcionalmente (especificidade, sensibilidade, etc.) recorrendo a técnicas como citometria de fluxo e espetrofluorimetria. Neste sentido, três proteínas foram desenhadas: um DLB fundido com PFV, que mostrou ser eficiente em detetar 1-5 UFC/mL de S. aureus em culturas de sangue; uma PRL para E. coli, que demonstrou ser eficaz na deteção de diferentes estados celulares e bactérias em várias amostras humanas; e uma PRL para P. aeruginosa, que revelou elevada especificidade. Um ensaio de microfluídica baseado em esferas e nas PRL de E. coli e P. aeruginosa permitiu a deteção múltipla de 104 UFC/mL demorando 70 min sem enriquecimento, sendo quantitativo. Por último, um sistema ótico baseado em fotodetetores foi construído e juntamente com o ensaio de microfluídica, alcançou a deteção de P. aeruginosa em amostras de sangue com elevada especificidade. O sistema revelou-se rápido e é passível de ser totalmente automatizado com vista à deteção de IS em unidades de saúde.

Durante muchos años se ha asumido que los virus se transmiten como elementos individuales, en forma de partículas (viriones) que contienen un único genoma. En los últimos años, se ha incrementado sustancialmente la evidencia de que muchos virus son capaces de transmitirse en grupos de viriones, lo que les permite iniciar infecciones con más de un individuo, ya sea en un nuevo hospedador, o en una nueva célula, dentro de un organismo pluricelular. Concretamente, se han descrito multitud de estructuras, promovidas por genes virales, a las que se conoce como unidades de infección colectivas, que permiten el agrupamiento, transporte, y llegada conjunta de múltiples genomas o partículas virales. Independientemente de las características específicas de cada una de estas estructuras, lo común en todas ellas es que incrementan el número de genomas virales que inician una nueva infección. La transmisión colectiva abre la puerta a los virus a múltiples interacciones, las cuales pueden ser estudiadas desde el punto de vista de la evolución social, al igual que ocurre con otros microorganismos. En esta tesis estudiamos tres ejemplos de interacciones virales que, como demostramos, se pueden entender desde la óptica de la evolución social. For many years it has been assumed that viruses are transmitted as single elements, in the form of particles (virions) containing a single genome. In recent years, there has been substantially increasing evidence that many viruses are capable of transmitting in clusters of virions, allowing them to initiate infections with more than one individual, either in a new host, or in a new cell, within a multicellular organism. Specifically, a multitude of structures have been described, promoted by viral genes, known as collective infection units, which allow the clustering, transport, and joint arrival of multiple genomes or viral particles. Regardless of the specific characteristics of each of these structures, what is common to all of them is that they increase the number of viral genomes that initiate a new infection. Collective transmission opens the door for viruses to multiple interactions, which can be studied from the point of view of social evolution, as occurs with other microorganisms. In this thesis we study three examples of viral interactions that, as we demonstrate, can be understood from the point of view of social evolution.

Dissertação de mestrado em Biotecnologia, A Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa que prospera numa variedade de ambientes. Esta bactéria patogénica é um dos microrganismos mais frequentemente isolados do trato respiratório de pacientes em estado crítico e imunocomprometido. Para além disso, o seu frequente envolvimento numa ampla gama de doenças e a sua baixa suscetibilidade a uma ampla gama de antibióticos, torna P. aeruginosa um sério desafio terapêutico, que muitas vezes resulta em internamentos prolongados, aumento dos custos médicos e altas taxas de mortalidade. Face a isto, o desenvolvimento de abordagens alternativas ao uso destes antimicrobianos é de extrema importância e os bacteriófagos têm um elevado potencial no controlo de doenças bacterianas, mas geralmente exibem um espetro de ação limitado. Através da utilização de ferramentas de engenharia de fagos, é possível produzir fagos quiméricos com características desejáveis de forma a melhorar a deteção e/ou controlo de estirpes bacterianas num contexto clínico. Além disso, os fagos modificados podem codificar vários genes repórter, substituindo assim os métodos de cultura convencionais. O objetivo deste projeto assenta na engenharia do genoma de fagos de P. aeruginosa para melhorar as suas funcionalidades, assim como aumentar o seu espetro de ação para uma ampla gama de bactérias hospedeiras e obter uma ferramenta promissora para o diagnóstico e tratamento de pacientes com infeções resistentes a antibióticos. O primeiro passo deste trabalho consistiu em avaliar o potencial de um fago repórter previamente construído, contendo o gene da NanoLuc luciferase (PE3Δgp1–gp12:Nluc) para detetar células de P. aeruginosa. O limite de deteção deste fago repórter variou entre 620 e 9000 UFC/mL em apenas 7 h, sendo o limite de deteção mais baixo alcançado para a estirpe hospedeira do fago. Posto isto, este sistema de deteção baseado em fago constitui uma alternativa promissora aos métodos de cultura, já que permite um diagnóstico mais rápido. A fim de aumentar o espetro lítico deste fago, foi realizada uma análise genómica para os fagos de Pseudomonas phiIBB-PAA2 e vB_PaeP_PE3. Desta forma, foram identificadas e selecionadas potenciais Tail Fiber Proteins (TFPs). Sete proteínas codificadas nos genomas dos fagos foram selecionadas e de seguida clonadas, expressas e purificadas, mas apenas uma (pGFP_A2gp55) foi capaz de se ligar a células de P. aeruginosa PAO1. Com base nestes ensaios, foi usada uma ferramenta de engenharia de fagos baseada em levedura para inserir com sucesso a TFP funcional (gp55) do fago A2 no genoma do fago PE3Δgp1–gp12:Nluc. Ainda assim, este método não permitiu aumentar o espetro de hospedeiros do fago., Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative bacterium that thrives in a variety of environments. This bacterial pathogen is one of the most common microrganims frequently isolated from the respiratory tract of critically ill and immunocompromised pacients. In addition, its frequent involvement in a wide range of illnesses and its low susceptibility to a wide range of antibiotics, makes P. aeruginosa a serious therapeutic challenge, which often results in prolonged hospital stays, increased medical costs, and high mortality rates. Given this, the development of alternative approaches to the use of these antimicrobials is extremely important and bacteriophages have a tremendous potential against bacterial diseases but they usually exhibit a limited host range. Taking advantage of phage-engineering tools, it is possible to assemble chimeric phages with desirable features in order to improve the detection and/or control bacterial strains in clinical settings. In addition, engineered phages can encode numerous reporter genes, therefore replacing the conventional culture methods. The aim of this project relies on engineering the genome of P. aeruginosa phages to improve its performance by expanding their host range, in order to get a promising tool for the diagnosis and treatment of patients with antibiotic-resistant infections. This research's initial step was to evaluate how well a previously built reporter phage (PE3gp1-gp12:Nluc) could identify P. aeruginosa cells. The lowest detection limit for the phage host strain P. aeruginosa PAO1 was reached by this reporter phage, whose detection limit ranged from 620 to 9000 CFU/mL in only 7 hours. Nevertheless, because it enables quicker diagnosis, this phage-based detection technology is a possible replacement for culture approaches. To increase the host range of this phage, a genomic analysis was performed for the Pseudomonas phages phiIBB-PAA2 and vB_PaeP_PE3. This method allowed for the identification and selection of prospective Tail Fiber Proteins (TFPs). Seven selected proteins encoded in phage genomes were then cloned, expressed and purified, but only one (pGFP_A2gp55) was capable of binding to P. aeruginosa PAO1 cells. Based on these assays, the yeast-based phage-engineering tool was used to successfully insert the functional TFP (gp55) from A2 phage on PE3Δgp1–gp12:Nluc phage genome. However, this approach was unable to broaden the range of phage hosts., Este trabalho foi financiado por fundos nacionais através da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., no âmbito do projeto “PhageShaper – uma plataforma eficiente para editar fagos de P. aeruginosa para o controlo de doenças infecciosas” com a referência EXPL/EMD-EMD/1142/2021.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Citrus canker, which is caused by the bacteria Xanthomonas citri and Xanthomonas fuscans, is one of the main diseases that affect the citrus industry in Brazil. Disease control methods are available, but new methods are necessary. A possible way to combat citrus canker is biocontrol using bacteriophages, also called phages, which are viruses that infect bacteria and which have been proposed as an alternative to the use of other antibacterial methods for agriculture and human health. The objectives of this doctoral project were the isolation, sequencing and characterization of one or more phages capable of infecting Xanthomonas citri, as well as to assess their potential for biocontrol of citrus canker. From a soil sample collected in a citrus grove affected by citrus canker, we could isolate a phage capable of infecting X. citri, strain 306, also known as Xac 306. The phage has a 305,651-bp, dsDNA genome, with a GC content of 54.92% and three hundred ninety-four ORFs, for one hundred eighty-one of which it was possible to assign functions while two hundred and thirteen remained as hypothetical. Phylogenetic and microscopy analysis allowed the classification of the phage in the Myoviridae family and it was named vB_XciM_LucasX. LucasX infected twenty-one of the twenty-three strains of X. citri and X. fuscans against which it was tested. A pangenomic analysis with the strains whose genome is available indicated that a 40-kbp region is present in all susceptible strains, but absent in the resistant strain, and which must contain genes essential for phage infection. LucasX can be propagated in NB medium but not in LB medium, probably because it is not tolerant to NaCl. LucasX is stable up to 45oC, has a latent period of 90 min and a burst size of 40 PFU/infected cell, its optimal pH is 7 and it can be inactivated with 40% ethanol or by being exposed to UV light from a germicidal lamp. The phage yield in liquid medium was studied in three strains of Xanthomonas sp. and it was one order of magnitude higher in one of them relative to the strain used for isolation. Finally, an experiment with citrus trees kept in a greenhouse showed that LucasX is able to reduce the number of lesions caused by Xac 306 by up to 89%%, a reduction similar to that of a commercial bactericide used as a control, thus indicating its potential as a biocontrol agent for citrus canker. O cancro cítrico, causado pelas bactérias Xanthomonas citri e Xanthomonas fuscans, é uma das principais doenças que afetam a citricultura brasileira e mundial. Métodos de controle da doença estão disponíveis, mas novos métodos são necessários. Uma possível forma de combate ao cancro cítrico seria o controle biológico usando bacteriófagos, também chamados de fagos, que são vírus que infectam bactérias e que têm sido propostos como uma alternativa ao uso de outros métodos antibacterianos na agropecuária e na saúde humana. Os objetivos desse trabalho de doutorado eram isolar, sequenciar e caracterizar um ou mais fagos capazes de infectar Xanthomonas citri, bem como avaliar seu potencial para controle biológico do cancro cítrico. A partir de uma amostra de terra coletada em um laranjal acometido pelo cancro cítrico foi possível isolar um fago capaz de infectar X. citri, linhagem 306, também chamada de Xac 306. O fago tem um genoma de dsDNA de 305.651 pb, possui um conteúdo de GC de 54,92% e trezentas e noventa e quatro ORFs, para cento e oitenta e uma das quais foi possível atribuir funções enquanto duzentas e treze permaneceram como ORFs hipotéticas. As análises filogenética e de microscopia permitiram classificar o fago na família Myoviridae e ele foi denominado vB_XciM_LucasX. LucasX infectou vinte e uma das vinte e três linhagens de X. citri e X. fuscans contra as quais foi testado. Uma análise de pangenômica com as linhagens cujos genomas já foram sequenciados indicou que uma região de 40 kpb está presente em todas as linhagens suscetíveis, mas ausente na linhagem resistente, o qual deve conter genes essenciais à infecção pelo fago. LucasX pode ser propagado em meio NB mas não em meio LB, provavelmente por não ser resistente a NaCl. LucasX é estável até a 45oC, possui um tempo de latência de 90 min e um burst size de 40 UFP/célula infectada, seu pH ótimo é 7 e ele pode ser inativado em concentrações de etanol a partir de 40% ou ao ser exposto à luz UV de uma lâmpada germicida. O rendimento do fago ao ser propagado em meio líquido foi estudado em três linhagens de Xanthomonas sp. e foi uma ordem de grandeza maior em uma delas do que na linhagem usada no isolamento. Por fim, um experimento com mudas de laranjeira mantidas em estufa mostrou que LucasX é capaz de reduzir o número de lesões causadas pela infecção por Xac 306 em até 89%, valor equivalente ao de um bactericida comercial usado como controle, indicando seu potencial como agente de controle biológico do cancro cítrico. 88882.426704/2019-01

WHO predicts that, by 2050, infections caused by resistant bacteria will cause about 10 million deaths annually. Considered a public health crisis neglected worldwide, bacterial resistance (AMR) has been aggravated by the indiscriminate use of antimicrobials, which can be transmitted from one organism to another, favoring the emergence of pan-resistant bacteria. From this scenario, it is necessary to search for alternative treatment methodologies, such as phage therapy, which is based on the use of the natural replication mechanism of bacteriophages to cause bacterial cell lysis, which can be an excellent option for the treatment and control of infections caused by resistant bacteria. Therefore, this work aimed to highlight the potential of phage therapy in the fight against such infections, where this technique has shown positive and hopeful results in the fight against infections in several sites and by different routes of administration, even allowing the treatment of infections caused by biofilm-producing bacteria. It is, therefore, an extremely advantageous technique, using extremely specific viruses regarding the target microorganism, which ends up reducing the risks of toxicity, allergic reactions and dysbiosis. In addition, the combined use of bacteriophages and antibiotics presents synergistic results that allow the reduction of the antimicrobial loading dose and a greater effectiveness in the treatment. However, as phage therapy still does not have specific protocols for its use, further studies related to its implementation are needed, so that it is possible to enjoy this alternative treatment more in the future. La OMS predice que, para 2050, las infecciones causadas por bacterias resistentes causarán alrededor de 10 millones de muertes al año. Considerada una crisis mundial de salud pública desatendida, la resistencia bacteriana (RAM) se ha visto agravada por el uso indiscriminado de antimicrobianos, los cuales pueden transmitirse de un organismo a otro, favoreciendo la aparición de bacterias panrresistentes. A partir de este escenario, es necesario buscar metodologías alternativas de tratamiento, como la fagoterapia, que se basa en el uso del mecanismo de replicación natural de los bacteriófagos para provocar la lisis de las células bacterianas, que puede ser una excelente opción para el tratamiento y control de Infecciones causadas por bacterias resistentes. Por lo tanto, este trabajo tuvo como objetivo resaltar el potencial de la fagoterapia en la lucha contra este tipo de infecciones, donde esta técnica ha mostrado resultados positivos y esperanzadores en la lucha contra infecciones en varios sitios y por diferentes vías de administración, permitiendo incluso el tratamiento de infecciones causadas por bacterias productoras de biopelículas. Se trata, por tanto, de una técnica extremadamente ventajosa, utilizando virus extremadamente específicos respecto al microorganismo diana, lo que acaba reduciendo los riesgos de toxicidad, reacciones alérgicas y disbiosis. Además, el uso combinado de bacteriófagos y antibióticos presenta resultados sinérgicos que permiten la reducción de la dosis de carga antimicrobiana y una mayor efectividad en el tratamiento. Sin embargo, como la fagoterapia aún no cuenta con protocolos específicos para su uso, se necesitan más estudios relacionados con su implementación, de modo que se pueda disfrutar más de esta alternativa de tratamiento en el futuro. A OMS prevê que, até 2050, infecções causadas por bactérias resistentes causarão cerca de 10 milhões mortes anuais. Considerada uma crise de saúde pública negligenciada mundialmente, a resistência bacteriana (AMR) vem sendo agravada pelo uso indiscriminado dos antimicrobianos, podendo ser transmitida de um organismo ao outro, favorecendo o surgimento de bactérias pan-resistentes. A partir desse cenário, é necessária a busca de metodologias alternativas de tratamento, como a fagoterapia, que é baseada na utilização do mecanismo de replicação natural dos bacteriófagos para causar a lise da célula bacteriana, o que pode ser uma excelente opção para o tratamento e controle de infecções causadas pelas bactérias resistentes. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo destacar o potencial da fagoterapia no combate de tais infecções, onde tal técnica vem apresentando resultados positivos e esperançosos no combate de infecções em diversos sítios e por diferentes vias de administração, possibilitando até mesmo o tratamento de infecções causadas por bactérias produtoras de biofilme. Trata-se, portanto, de uma técnica extremamente vantajosa, utilizando vírus extremamente específicos quanto ao microrganismo alvo, o que acaba por diminuir os riscos de toxicidade, reações alérgicas e disbioses. Além disso, o uso combinado de bacteriófagos e antibióticos apresenta resultados sinérgicos que possibilitam a redução da dose de ataque dos antimicrobianos e uma maior eficácia no tratamento. Contudo, como a fagoterapia ainda não apresenta protocolos específicos para seu uso, são necessários maiores estudos relacionados à sua implementação, para que seja possível desfrutar de mais essa alternativa de tratamento no futuro.

Bacteria are microorganisms that cause relevant implications in humans, and there have been several attempts, over time, to promote their control. The most common and widespread form of control has been antibiotic drugs, which have been increasingly less effective, considering the mechanisms of adaptation and bacterial resistance, generating super-resistant bacteria. bacterial control. Among them, one that is especially relevant is the use of bacteriophages, viruses that infect specific bacteria, promoting cell lysis of these microorganisms. The objective of this study, therefore, is to analyze the application of the use of bacteriophages as a form of bacterial biocontrol, with emphasis on the applications of this form of control in the industry. Eleven articles from an initial sample of 3,460 were analyzed, which made it possible to evidence the applicability of the use of bacterial phages in agro-industry, in the food industry and in human health. Las bacterias son microorganismos que causan implicaciones relevantes en el ser humano, y ha habido varios intentos a lo largo del tiempo para promover su control. La forma de control más común y extendida han sido los fármacos antibióticos, que han resultado cada vez menos efectivos, considerando los mecanismos de adaptación y resistencia bacteriana, generando bacterias superresistentes. Entre ellos, uno que cobra especial relevancia es el uso de bacteriófagos, virus que infectan bacterias específicas, favoreciendo la lisis celular de estos microorganismos. El objetivo de este estudio, por tanto, es analizar la aplicación del uso de bacteriófagos como forma de biocontrol bacteriano, con énfasis en las aplicaciones de esta forma de control en la industria. Se analizaron once artículos de una muestra inicial de 3.460, lo que permitió evidenciar la aplicabilidad del uso de fagos bacterianos en la agroindustria, en la industria alimentaria y en la salud humana. As bactérias são microrganismos que causam implicações relevantes nos seres humanos, tendo havido várias tentativas, ao longo do tempo de promover seu controle. A forma de controle mais usual e difundida tem sido os medicamentos antibióticos, os quais tem sido cada vez menos eficazes, considerando os mecanismos de adaptação e resistência bacteriana, gerando bactérias super-resistentes. Assim, impõe-se que sejam investigadas novas formas de controle bacteriano. Dentre elas, uma que se mostra especialmente relevante é o uso dos bacteriófagos, vírus que infectam bactérias específicas, promovendo a lise celular desses microrganismos. O objetivo deste estudo, portanto, é analisar a aplicação do uso de bacteriófagos como forma de biocontrole bacteriano, com ênfase nas aplicações dessa forma de controle na indústria. Foram analisados 11 artigos de uma amostra inicial de 3.460, os quais permitiram evidenciar a aplicabilidade do uso de fagos bacterianos na agroindústria, na indústria alimentícia e na saúde humana.

Treball de fi de grau en Bioinformàtica. Curs 2021-2022 Tutor: Andreu Paytuví Anàlisi del microbioma intestinal amb tècniques d’Intel·ligència Artificial per tal de descobrir biomarcadors de la malaltia de Parkinson a través de diferències entre el microbioma intestinal de subjectes controls i pacients de Parkinson, mitjançant la identificació de tàxons candidats, famílies de gens i vies biològiques per conèixer variables que podrien arribar a ser importants per a la detecció precoç de la malaltia. Análisis del microbioma intestinal con técnicas de Inteligencia Artificial para el decubrimiento de biomarcadores en la enfermedad del Parkinson a través de diferencias entre el microbioma intestinal de sujetos controles y pacientes con Parkinson, mediante la identificación de taxones candidatos, familias de genes y vías biológicas para obtener información sobre variables importantes en la detección temprana de la enfermedad. Analysis of the gut microbiome with Artificial Intelligence techniques in order to discover biomarkers for Parkinson’s disease through differences between the gut microbiome of controls subjects and Parkinson patients, by identifying candidate taxa, gene families and pathways to get insight of some variables that could become important for the early detection of the disease.

Mestrado de dupla diplomação com a UTFPR - Universidade Tecnológica Federal do Paraná Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Pss) é a bactéria patogénica causal da doença tuberculose-da-oliveira, sendo uma das principais responsáveis pelas perdas significativas na produção e qualidade do olival em todo o mundo especialmente em países do Mediterrâneo. O seu ataque na oliveira ocorre na parte aérea, formando nódulos visíveis no tronco, caule, folhas e frutos, não existindo um tratamento específico e eficaz quando estabelecida no olival. Ocasionando a necessidade no desenvolvimento de ferramentas inovadoras, seguras e eficazes para o seu controlo. Assim, neste trabalho pretendeu-se identificar bacteriófagos com potencial de serem usados contra a tuberculose. Devido à elevada especificidade dos fagos, procedeu-se numa primeira fase ao estudo da comunidade bacteriana endofítica associada a tumores e a ramos de oliveira sem sintomas com o intuito de constituir uma coleção de estirpes de Pss que será útil no processo de seleção de bacteriófagos. O isolamento em cultura seguida pela identificação dos isolados bacterianos através da sequenciação da região 16S do rDNA permitiu identificar um total de 69 taxa, sendo Pantoea e Erwinia os géneros mais abundantes em caules assintomáticos, tendo destaque nos sintomáticos os géneros Pantoea e Curtobacterium. O método por maceração gerou uma maior diversidade taxonómica que no método de explante, sendo nos caules sintomáticos que verificou maior diversidade e abundância bacteriana relativamente aos caules assintomáticos. O isolamento de bacteriófagos em amostras de solo de olival permitiu identificar, pela primeira vez, um total de nove bacteriófagos com capacidade de causar a lise de Pss. A sua ação na luta contra a tuberculose deverá ser avaliada no futuro com ensaios in planta. Quando avaliada a eficiência dos bacteriófagos contra a Pss em fatias de cenoura biológica, não se obteve diferenças significativas, no entanto os resultados obtidos sugerem que os bacteriófagos podem ser considerados possíveis agentes de biocontrolo contra a multiplicação do patógeno, necessitando, porém, de estudos complementares. Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Pss) is a pathogenic bacterium that causes olive knot, being one of the main responsible for the significant loss in the production and quality of olive groves worldwide, especially in Mediterranean countries. The attack on the olive tree occurs in the aerial part, forming visible nodules on the trunk, stem, leaves and fruits, and there is no specific and effective treatment when established in the olive grove. Causing the development of innovative, safe and effective tools for its control. Thus, this work aimed to identify bacteriophages with the potential to be used against tuberculosis. Due to the high specificity of the phages, the study of the endophytic bacterial community associated with tumors and symptomless olive branches was carried out in a first phase, with the aim of constituting a collection of Pss strains that will be useful in the bacteriophage selection process. The isolation in culture followed by the identification of bacterial isolates through the sequencing of the 16S region of the rDNA allowed the identification of a total of 69 taxa, with Pantoea and Erwinia being the most abundant genera in asymptomatic stems, with emphasis on the symptomatic genera Pantoea and Curtobacterium. The maceration method generated a greater taxonomic diversity than the explant method, and the symptomatic stems showed greater bacterial diversity and abundance than the asymptomatic stems. The isolation of bacteriophages in olive grove soil samples allowed the identification, for the first time, of a total of nine bacteriophages capable of causing Pss lysis. Its action in the fight against tuberculosis should be evaluated in the future with in plant test. When evaluating the efficiency of bacteriophages against Pss in slices of biological carrot, no significant differences were obtained, however the results obtained suggest that bacteriophages can be considered possible biocontrol agents against the multiplication of the pathogen, requiring, however, additional studies. Este trabalho é financiado por fundos FEDER através do programa COMPETE (Programa Operacional Fatores de Competitividade), por fundos nacionais através da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, e Europeus (Horizon 2020) através do projeto PRIMA/0002/2018 (INTOMED - Innovative tools to combat crop pests in the Mediterranean).

Xylella fastidiosa (Xf) es una bacteria patógena que habita en el xilema de la planta hospedadora y el tracto digestivo de insectos que actúan como vectores. Afecta a un elevado número de especies vegetales, siendo una de las principales bacterias de cuarentena en la Unión Europea. Puesto que actualmente no existen medidas terapéuticas eficaces y los antibióticos están prohibidos en Europa, el control de Xf se basa principalmente en la erradicación de las plantas infectadas y el uso de compuestos químicos contra los vectores, pero estas medidas no son suficientes.

Esta tesis doctoral pertenece al Programa en Ciencia y Tecnología de la Salud de CEINDO - CEU Escuela Internacional de Doctorado. Esta tesis fue presentada en la modalidad de tesis por compendio de publicaciones. Estas son: 1. Lorenzo-Rebenaque, L., Malik, D.J., Catalá-Gregori, P., Marin, C. & Sevilla-Navarro, S. In vitro and in vivo gastrointestinal survival of non-encapsulated and microencapsulated salmonella bacteriophages: implications for bacteriophage therapy in poultry. Pharmaceuticals (2021), vol. 14, n. 5, art. 434. 2. Lorenzo-Rebenaque, L., Malik, D.J., Catalá-Gregori, P., Marin, C. & Sevilla-Navarro, S. Gastrointestinal dynamics of non-encapsulated and microencapsulated salmonella bacteriophages in broiler production. Animals (2022), vol.12, n. 2, art. 144. 3. Lorenzo-Rebenaque, L., Casto-Rebollo, C., Diretto, G., Frusciante, S., Rodríguez, J.C., Ventero, M.P. et al. Examining the effects of Salmonella phage on the caecal microbiota and metabolome fe Tesis - CEINDO - CEU Escuela Internacional de Doctorado, Universidad CEU Cardenal Herrera (Valencia), Facultad de Veterinaria, Departamento de Producción y Sanidad Animal, Salud Pública Veterinaria y Ciencia y Tecnología de los Alimentos, leída el 19-12-2022. Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 19-12-2023. Salmonella has been recognized as one of the most important zoonotic pathogens worldwide, being poultry derived products the main source of human infection. Among the most promising tools for Salmonella control at the field level in poultry production are included bacteriophages (or phages). However, little is known about the phage application impact on the rest of the gut microbiota. In this sense, new studies suggest that phage application may affects the gastrointestinal ecology homeostasis. Therefore, the general objective of this doctoral thesis was to apply bacteriophages for Salmonella control in broiler production, focusing on their effect on intestinal health, by means of genomic sequencing and metabolomic study. To achieve this goal, two different parts were performed. The first part studied the phage gastrointestinal dynamics in Salmonella-free broilers and its influence on microbiota and metabolome, meanwhile the second part studied the phage dynamics in Salmonella-infected broilers and its influence on microbiota and metabolome. The results aim to provide important insights into the use of phages as a preventative and biocontrol strategy against Salmonella infection from farm-to-fork. Salmonella es uno de los patógenos zoonóticos más importantes a nivel mundial, siendo los productos derivados avícolas la principal fuente de infección humana. Una de las herramientas más prometedoras para su control en avicultura son los bacteriófagos (o fagos). Sin embargo, se sabe poco sobre el impacto de la aplicación de fagos en la microbiota intestinal. Además, los nuevos estudios sugieren que su aplicación puede afectar a la homeostasis de la ecología gastrointestinal. Por ello, el objetivo general de esta tesis doctoral es estudiar el efecto de la aplicación de fagos para el control de Salmonella en la producción de pollos de engorde, centrándose en su efecto sobre la salud intestinal, mediante la secuenciación genómica y el estudio metabolómico. Para lograr este objetivo, se realizaron dos partes. En la primera se estudió la dinámica gastrointestinal de los fagos en pollos de engorde libres de Salmonella y su influencia en la microbiota y el metaboloma, mientras que en la segunda se estudió en pollos infectados con Salmonella. Los resultados pretenden aportar importantes conocimientos sobre el uso de fagos como estrategia preventiva y de biocontrol contra la infección por Salmonella desde la granja hasta el tenedor.

S. aureus fue declarado en 2017 por la OMS (Organización Mundial de la Salud) como un patógeno de preocupación por su alta tasa de resistencia a los antibióticos como meticilina y vancomicina, además, por presentar factores de virulencia que hacen de este microrganismo una amenaza para los sistemas de salud a nivel mundial. En la última década, se renovado el estudio de los Bacteriófagos o virus bacterianos como alternativa para el control de esta problemática. Sin embargo, el uso de estos virus puede representar un riesgo mayor ya que están implicados en la transferencia horizontal de genes entre bacterias. Es por esto, que recientes estudios se han centrado en proteínas derivadas de éstos, como enzimas líticas o las proteínas de unión al receptor (RBP). Éstas últimas, se encargan del reconocimiento y adhesión del virus a la bacteria anfitriona a través del ácido teicoico de la pared bacteriana. Este trabajo tiene como objetivo el análisis estructural de la proteína RBP del bacteriófago vB_SauS_BaqSau1, resultados podrían contribuir al desarrollo de nuevas aplicaciones para la industria alimentaria, clínica y/o veterinaria. S. aureus was declared in 2017 by the WHO (World Health Organization) as a pathogen of concern due to its high rate of resistance to antibiotics such as methicillin and vancomycin, as well as for presenting virulence factors that make this microorganism a threat to health systems worldwide. In the last decade, the study of Bacteriophages or bacterial viruses was renewed as an alternative to control this problem. However, the use of these viruses may represent a greater risk as they are involved in horizontal gene transfer between bacteria. For this reason, recent studies have focused on proteins derived from these, such as lytic enzymes or receptor binding proteins (RBPs). The latter are responsible for the recognition and adhesion of the virus to the host bacteria through the teichoic acid of the bacterial wall. The objective of this work is the structural analysis of the RBP protein of the bacteriophage vB_SauS_BaqSau1, the results could contribute to the development of new applications for the food, clinical and/or veterinary industry

[Resumen] Klebsiella pneumoniae es un patógeno nosocomial que empeora el pronóstico de la gran mayoría de pacientes inmunocomprometidos. En líneas generales, se trata de una bacteria patógena oportunista capaz de colonizar una gran variedad de ambientes, especialmente los hospitalarios. Pertenece al grupo de bacterias gram-negativas y, debido a su elevada patogenicidad, es capaz de provocar cuadros clínicos graves que aumentan las tasas de mortalidad y morbilidad. El creciente incremento del número de bacterias multirresistentes a antibióticos de amplio espectro, como β-lactámicos o carbapenémicos, ha supuesto la búsqueda de nuevos métodos para combatir estas bacterias. En este contexto, la experimentación con fagoterapia está despertando un gran interés, gracias a su eficacia y seguridad, que se traducen en un incremento de las tasas de supervivencia. Es por ello que el presente TFM se centra en la caracterización de la actividad antimicrobiana de dos fagos líticos vB_KpnS_VAC35 y vB_KpnM_VAC36, así como de la combinación de estos fagos con inhibidores del QS, mecanismo de comunicación bacteriano que favorece la resistencia a los fagos. Para el desarrollo de este trabajo, en primer lugar, se realizó un análisis del genoma de los fagos con el objetivo de asegurar la ausencia de genes potencialmente virulentos. En segundo lugar, se caracterizó la capacidad de infección de los fagos vB_KpnS_VAC35 y vB_KpnM_VAC36 frente a sus sus cepas huésped: K3574 y K3573. Para ello se ha determinó la familia a la que pertenecen los fagos mediante el estudio morfológico empleando la técnica de Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) y se han determinado diversos parámetros de infección, como el tiempo de adsorción, el tamaño de explosión (burst size) o el período de latencia. Por último, se realizó el ensayo de infección e inhibición de QS empleando la molécula furanona 4-Metoxi-2(5H) con el objetivo de aumentar la capacidad de infección de los fagos frente a K. pneumoniae y mejorar su potencial uso en fagoterapia. [Resumo] Klebsiella pneumoniae é un patóxeno nosocomial que empeora o pronóstico da gran maioría de pacientes inmunocomprometidos. En liñas xerais, trátase dunha bacteria patóxena oportunista capaz de colonizar unha gran variedade de ambientes, especialmente os hospitalarios. Pertenece ao grupo de bacterias gram-negativas e, debido a súa elevada patogenicidade, é capaz de provocar cadros clínicos graves que aumentan as tasas de mortalidade e morbilidade. O crecente incremento do número de bacterias multirresistentes a antibióticos de amplo espectro, como β-lactámicos ou carbapenémicos, supuxo a búsqueda de novos métodos para combater estas bacterias. Neste contexto, a experimentación con fagoterapia está despertando unha gran interese, grazas á súa eficacia e seguridade que se traduce nun incremento das taxas de supervivencia. É por isto que o presente TFM se centra na caracterización da actividade antimicrobiana dos fagos líticos vB_KpnS_VAC35 e vB_KpnM_VAC36, así como da combinación destes fagos con inhibidores do Quorum sensing, mecanismo de comunicación bacteriano que favorece a resistencia aos fagos. Para o desenvolvemento deste traballo, no primeiro lugar realizóuse unha análise do xenoma dos fagos co obxectivo de asegurar a ausencia de xenes potencialmente virulentos. En segundo lugar, caracterizóuse a capacidade de infección dos fagos vB_KpnS_VAC35 e vB_KpnM_VAC36 fronte as súas cepas huésped: K3574 e K3573. Para elo se determinou a familia á que pertencen os fagos mediante o estudio morfológico empregando a técnica de Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) e se han determinado diversos parámetros de infección, como o tempo de adsorción, o tamaño de explosión (burst size) o período de latencia. Por último, realizouse o ensayo de infección e inhibición de Quorum Sensing empregando a molécula furanona 4-Metoxi-2(5H) co obxectivo de aumentar a capacidade de infección dos fagos fronte a K. pneumoniae e mellorar o seu potencial uso en fagoterapia. [Abstract] Klebsiella pneumoniae is a nosocomial pathogen that worsens the prognosis of the vast majority of immunocompromised patients. In general, it is an opportunistic pathogenic bacterium capable of colonizing a wide variety of environments, especially hospital ones. It belongs to the group of gram-negative bacteria and, due to its high pathogenicity, is able to cause serious clinical conditions that increase mortality and morbidity rates. The growing number of multidrug-resistant antibiotic-resistant bacteria, such as β-lactams or carbapenems, has led to the search for new methods to combat these bacteria. In this context, experimentation with phage therapy.is arousing great interest, thanks to its effectiveness and safety which translate into an increase in survival rates. This is why the present TFM focuses on the characterization of the antimicrobial activity of two lytic phages vB_KpnS_VAC35 and vB_KpnM_VAC36, as well as the combination of these phages with inhibitors of Quorum sensing, a bacterial communication mechanism that promotes resistance to phages. For the development of this work, an analysis of the phage genome was first performed with the aim of securing the lack of potentially virulent genes. Second, the infection capacity of the phages vB_KpnS_VAC35 and vB_KpnM_VAC36 was characterized against their host strains: K3574 and K3573. To this end, the family to which the phages belong has been determined by morphological study using the technique of Transmission Electron Microscopy (TEM) and various infection parameters have been determined, such as adsorption time, burst size. or the latency period. Finally, the Quorum Sensing infection and inhibition assay was performed using the furanone 4-Methoxy-2 (5H) molecule with the aim of increasing the infectivity of phages against K. pneumoniae and improving their potential use in phage therapy. Traballo fin de mestrado (UDC.CIE). Bioloxía molecular, celular e xenética. Curso 2021/2022